回流提取lh，過(guò)濾;濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回流提 取;共提取三次，合并濾液，減壓濃縮得到水線草醇提物(粗提浸膏)2kg。
[0056] 2)將該水線草醇提物（粗提浸膏）分別依次用石油醚，、乙酸乙酯、正丁醇依次萃 取，收集正丁醇萃取部位，減壓濃縮，得精提浸膏〇.674kg。所述石油醚萃取為將步驟1)所得 水線草醇提物用石油醚萃取3次，所述水線草醇提物與石油醚的重量比例為1:4;萃取后保 留水部位；
[0057] 所述乙酸乙酯萃取為將石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3次，石油醚萃 取后所述水部位與乙酸乙酯的用量(重量)比例為1:4;萃取后保留水部位；
[0058]所述正丁醇萃取為將乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3次，乙酸乙酯萃 取后所述水部位與正丁醇的用量(重量)比例為1:4;萃取后保留正丁醇萃取部位；
[0059] 3)將該精提浸膏用用3倍重量的甲醇超聲溶解，過(guò)濾，去除濾渣，濾液硅膠拌樣經(jīng) 100-200目正相硅膠柱分別以氯仿：甲醇(體積比）7:1，5:1，3:1為洗脫劑進(jìn)行第一次梯度洗 脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液;然后再分別以氯仿：甲醇(體積比）12 :1，9:1，7:1，5:1， 3:1為洗脫劑進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液。
[0060] 4)將步驟3)第二次梯度洗脫所得氯仿：甲醇為7:1的洗脫液采用葡聚糖凝膠 (86口1^(1611^-20)柱層析分離純化，用氯仿：甲醇(體積比）為60:40為洗脫劑進(jìn)行洗脫 ；收 集洗脫液后再經(jīng)0DS反相柱(YMC GEL 50)用30%甲醇溶液(質(zhì)量濃度)等度洗脫，收集洗脫 液，制得雞矢藤苷甲酯2.6g。
[0061 ] 實(shí)施例2
[0062] 本實(shí)施例提供一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在 于，步驟4)采用制備液相分離法，即將步驟3)第二次梯度洗脫所得氯仿：甲醇為7:1的洗脫 液經(jīng)0.22wii微孔濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)制備液相，以25 %甲醇水為洗脫劑等度洗脫，使用LC-3000高效液相Thermo C18( 250*21.2mm)制備柱。以標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間比較接樣，最終得到化 合物雞矢藤苷甲酯2. lg。
[0063] 實(shí)施例3
[0064] 本實(shí)施例提供一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在 于，步驟4)所述0DS反相柱層析，用20-50%甲醇溶液(質(zhì)量濃度)梯度洗脫;制得雞矢藤苷甲 酯2.5g。
[0065] 實(shí)施例4
[0066] 本實(shí)施例提供一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在 于，步驟3)以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)為洗脫劑，即分別以二氯甲烷：甲醇(體積比）為12:1，9:1， 7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集二氯甲烷：甲醇為7:1的洗脫液;制得雞矢藤苷甲酯 2.2g〇
[0067] 實(shí)驗(yàn)例
[0068]以實(shí)施例1制得的雞矢藤苷甲酯為樣品，經(jīng)波譜解析和化學(xué)方法確定其化學(xué)結(jié)構(gòu) 式如式(I)所示;并且測(cè)得其純度為98.6% (面積歸一法）。圖1為雞矢藤苷甲酯紫外吸收?qǐng)D； 圖2為雞矢藤苷甲酯質(zhì)譜圖。
[0069]核磁共振(NMR)
[0070] 咕 NMR(400MHz，CD30D): 57.51 (d，J=lHz，1H，H_3)，55.80(t，J = 2Hz，lH，H-7)，S 5.20-5.19(d，J = 6Hz，lH，H-l)，S4.66(d，J = 8Hz，lH，H-r)，S4.55-4.53(dt，J = 2/5Hz，lH， H-6)，M. 35-4.32(br d，J=15Hz，lH，H-10b)，S4.20-4.16(br d，J=15Hz，lH，H-10a)，S 3.65-3.61(dd，J = 2/12，lH，H-6'a)，S3.88-3.85(dd，J = 2/12，lH，H-6'b)，S3.75(s，3H，-COOMe)，S3 ? 03-3 ? 01 (d，J = 2Hz，1H，H-9)，S3 ?0((!，J = lHz，lH，H-5)。
[0071] 13C Mffi(101MHz，CD30D):Sl72.80(s，C-ll)，Sl56.38(s，C-7)，Sl50.04(s，C-3)，S 132.60(s，C-7)，5113.32(s，C-4)，5102.80(s，C-l)，5100.81(s，C-l'），584.78(s，C-6)，S 80.93(s，C-3'），S80.38(s，C-5'），S77.29(s，C-2'），S74.04(s，C-4'），S65.20(s，C-6'），S 63.56(s，C-10)，S54.59(s，C-C00Me)，S49.64(s，C-9)，S48.11(s，C-5)。
[0072] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將水線草用醇溶劑進(jìn)行提取，得到水線草醇提物； 2) 將所得水線草醇提物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃??；取正丁醇萃取部 位，濃縮得精提浸膏； 3) 將所述精提浸膏用甲醇超聲溶解，過(guò)濾，濾液硅膠拌樣后經(jīng)正相硅膠柱層析，用洗脫 劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液;所述洗脫劑為氯仿-甲醇洗脫劑，和/或二氯甲烷-甲醇洗脫 劑； 4) 將步驟3)所述洗脫液采用柱層析分離法或制備液相分離法進(jìn)一步純化，制得雞矢藤 苷甲酯； 所述柱層析分離法包括將步驟3)所得洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層析，以氯仿-甲醇為 洗脫劑;收集洗脫液后經(jīng)ODS反相柱層析，以甲醇溶液等度洗脫或者梯度洗脫，收集洗脫液， 制得雞矢藤苷甲酯； 所述制備液相分離法包括將步驟3)所得洗脫液進(jìn)制備液相，以甲醇水為流動(dòng)相進(jìn)行洗 脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯；所述制備液相采用LC-3000高效液相Thermo C18， (250*21.2mm)制備柱柱。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)包括將水線草粉碎至60-80目， 加入8-15倍重量的70 %甲醇，攪勻，先超聲提取0.5-lh，然后回流提取l-3h，提取溫度為60-80°C ;過(guò)濾;濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回流提取;共提取三次，合并濾液，減壓濃 縮，得到水線草醇提物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述石油醚萃取為將步驟1)所 得水線草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水線草醇提物與石油醚的重量比例為1-3:4-6; 萃取后保留水部位； 所述乙酸乙酯萃取為將石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚萃取 后所述水部位與乙酸乙酯的重量比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位； 所述正丁醇萃取為將乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸乙酯萃取 后所述水部位與正丁醇的重量比例為1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部位。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)將所述精提浸膏用3-5倍重量的 甲醇超聲溶解，再進(jìn)行過(guò)濾。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)所述梯度洗脫包括以氯仿-甲醇 為洗脫劑，分別以氯仿：甲醇體積比為7:1，5:1，3:1進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為 7 :1的洗脫液;再以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別以氯仿：甲醇體積比為12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1 進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液;或者以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，分 別以二氯甲烷：甲醇體積比為12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集二氯甲烷： 甲醇為7:1的洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)采用100-200目正相硅膠柱層 析。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟4)所述葡聚糖凝膠柱層析，以氯 仿：甲醇體積比60:40為洗脫劑進(jìn)行洗脫;所述0DS反相柱層析，以30 %甲醇溶液進(jìn)行等度洗 脫或者以20-50%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟4)所述制備液相分離法先將步驟 3)所得洗脫液經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過(guò)濾，再取濾液進(jìn)制備液相。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟4)所述制備液相分離法中所述洗脫劑 為25%甲醇水。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將水線草粉碎至60-80目，加入8-15倍重量的70 %甲醇，攪勻，先超聲提取0.5-lh，然 后回流提取l_3h，提取溫度為60-80°C;過(guò)濾；濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回流提 取;共提取三次，合并濾液，減壓濃縮，得到水線草醇提物； 2) 將所得水線草醇提物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；取正丁醇萃取部 位，濃縮得精提浸膏； 所述石油醚萃取為將步驟1)所得水線草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水線草醇提 物與石油醚的重量比例為1 -3:4-6;萃取后保留水部位； 所述乙酸乙酯萃取為將石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚萃取 后所述水部位與乙酸乙酯的重量比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位； 所述正丁醇萃取為將乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸乙酯萃取 后所述水部位與正丁醇的重量比例為1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部位； 3) 將所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超聲溶解，過(guò)濾，濾液硅膠拌樣后經(jīng)100-200目 正相硅膠柱層析，用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液； 具體地，所述梯度洗脫以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別以氯仿：甲醇體積比為7:1，5:1，3:1 進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液;再以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別以氯 仿：甲醇體積比為12:1，9:1，7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗 脫液;或者以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，分別以二氯甲烷：甲醇體積比為12 :1，9:1，7:1，5:1， 3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集二氯甲烷：甲醇為7:1的洗脫液； 4) 將步驟3)所述第二次梯度洗脫液采用柱層析分離法或制備液相分離法進(jìn)行進(jìn)一步 純化，制得雞矢藤苷甲酯； 所述柱層析分離法包括將步驟3)所得第二次梯度洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層析，用氯 仿：甲醇體積比為60:40的洗脫劑進(jìn)行洗脫;收集洗脫液后經(jīng)ODS反相柱層析，用30%甲醇溶 液等度洗脫或者20-50%甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯； 所述制備液相分離法包括將步驟3)所得第二次梯度洗脫液經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過(guò)濾，取 濾液進(jìn)制備液相，以25 %甲醇水為洗脫劑等度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，包括將水線草用醇溶劑進(jìn)行提取，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃??；濃縮得精提浸膏；甲醇超聲溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)正相硅膠柱層析，然后采用柱層析分離法或制備液相分離法進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到雞矢藤苷甲酯。本發(fā)明方法分離水線草中雞矢藤苷甲酯成分的產(chǎn)率高，方法簡(jiǎn)便快捷，純度高；所得雞矢藤苷甲酯可用于制成抗腫瘤的輔助藥物，為研發(fā)抗癌藥物提供一定的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C07H17/04, C07H1/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105713056
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610105418
【發(fā)明人】林麗美, 廖端芳, 夏伯候
【申請(qǐng)人】湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月29日
【申請(qǐng)日】2016年2月25日