紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYB1及其載體、工程菌與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl及其載體、工程菌與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紅籌X Anthuriuin aWraea/?.)是世界性盆栽和鮮切花花奔。在我國高檔盆花種植中占有相當(dāng)重要的地位。然而，同其他大宗花卉一樣，我國在紅掌育種上也是處于較為落后的階段。傳統(tǒng)雜交育種必須要求有足夠的雜交親本和長期的經(jīng)驗(yàn)積累，但是隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用基因改良選擇性、定向培育紅掌新品種則成為可能。但是由于缺乏可選基因，所以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使紅掌獲得優(yōu)良性狀目前尚未實(shí)現(xiàn)，而其重要基因的發(fā)掘和功能驗(yàn)證是通過轉(zhuǎn)基因手段改良紅掌性狀的前提。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是提供一種紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl及其載體、工程菌與應(yīng)用，通過超量表達(dá)證明該轉(zhuǎn)錄因子具有提高植物合成花色苷的能力，可為培育花色、葉色更為豐富的新品種提供基因資源。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl，所述轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的完整預(yù)測氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；編碼基因如SEQ ID NO:2所示。
[0005]進(jìn)一步包括至少90%同源且具有相同功能的所述轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的衍生物，所述的衍生物包括氨基酸序列或核酸序列。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。由于核苷酸序列的特殊性，任何如SEQ ID NO:2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0006]一種含有所述的紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的編碼基因的重組載體。
[0007]一種含有所述的重組載體的重組基因工程菌。
[0008]一種根據(jù)所述的重組載體的重組基因工程菌的構(gòu)建方法，構(gòu)建含有轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的編碼基因的重組基因工程菌的菌體細(xì)胞。
[0009]—種根據(jù)所述的紅掌myb轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的應(yīng)用，通過過量表達(dá)，提高目標(biāo)植物的合成花色苷的能力。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明首次從紅掌中克隆MYB類調(diào)控花色苷合成的轉(zhuǎn)錄因子，即AaMYBl ;本發(fā)明通過與擬南芥等不同物種同類MYB轉(zhuǎn)錄因子序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其屬于第R2R3類MYB;通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)該基因具有明顯的提高植物合成花色苷的能力，證明其是一個(gè)非常有應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)錄因子。
【附圖說明】
[0011]圖1是來源于紅掌的轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl與其他物種同源基因的多序列比對(duì)結(jié)果； 圖2是轉(zhuǎn)基因煙草在不同生長階段表現(xiàn)；
圖3是轉(zhuǎn)基因和野生型煙草花器官比較，上部分示轉(zhuǎn)基因器官，下部分示野生型器官；圖4是轉(zhuǎn)基因和野生型煙草果實(shí)比較，A部分為去掉部分萼片的果實(shí)，B部分為去掉果皮的果實(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。
[0013]本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl是從紅掌中獲得的，它屬于具有顯著提高花色苷含量功能的眾多MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR，獲得了該基因的完整編碼框，隨后構(gòu)建超量表達(dá)載體并異源轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子具有明顯的提高煙草體內(nèi)花色苷含量的能力。
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0015]實(shí)施例1來源于紅掌的轉(zhuǎn)錄因子AaMYBl的獲得
于2013年5月取6年生紅掌品種“阿拉巴馬”的幼嫩苞片和葉片為材料，采用Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取總RNA，然后使用Promega公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行處理、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板。采用同源克隆法，設(shè)計(jì)兼并引物對(duì)Pl-GATCTCATCATCAGGCTGCATG (SEQ ID NO:3)，P2-GATTTCCTGGGACAACAGT (SEQ ID NO:4)，用上述模板進(jìn)行擴(kuò)增，該反應(yīng)程序?yàn)?5 0C I min, 94 °C 50 s, 56 V I min, 72 VI min, 36個(gè)循環(huán)，72 °C 5 min,所用試劑(LATaq酶)均購自大連寶生物公司，擴(kuò)增體系:LAtaq 酶(5 U/μΙ) 0.5 μ?，1XLAtaq buffer II 5 μ?，dNTP mixture 8 μ?，template Iμ1，ΡΙ I μ1，Ρ2 I μ?，滅菌蒸餾水32.5 μ?。經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得336 bp的中間片段。
[0016]bp的中間片段為參考，設(shè)計(jì)3’ RACE和5’ RACE引物；以紅掌幼嫩花芽為組織材料，按照述方法提取總RNA，參照CL0NTECH公司RACE試劑盒說明書(Cat.No (s).634858)分別進(jìn)行進(jìn)行3’ RACE和5’ RACE模板合成，備用。具體是，3’ RACE用到的引物對(duì):3’ f-GGGGAACCGGTGGTCTCTCATAG (SEQ ID NO:5)，3’r一CTAATAC GACTCAC TATAG GGC (SEQ IDNO:6)，擴(kuò)增體系:LAtaq 酶(5 U/μΙ) 0.5 μ?，1XLAtaq buffer II 5 μ?，dNTP mixture 8μ?，templat