一種依替巴肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種依替巴肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 依替巴肽，別名依非巴特、埃替非巴肽、依非巴肽，英文名為Eptifibatide。
[0003] 依替巴肽的結(jié)構(gòu)式如式I:
[0004]
[0005]分子式為：C35H49N1109S2
[0006] 依替巴肽（Eptifibatide)是一種人工合成的含一個(gè)巰基丙酸和六個(gè)氨基酸殘基 的環(huán)肽。它是一種具有特異針對(duì)性的血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受體拮抗劑，選擇性、可 逆性抑制血小板聚集的最終共同通路（血漿凝血因凝血因子I與GPIIb/IIIa結(jié)合），可逆 轉(zhuǎn)因血栓形成而導(dǎo)致的缺血狀態(tài)。依菲巴特（Eptifibatide)臨床上主要用于治療不穩(wěn)定 性心絞痛，急性心肌梗死，其主要的不良反應(yīng)是出血，大多數(shù)出血為輕中度出血，最主要的 出血部位為PCI時(shí)血管刺穿部位，腦出血少見(jiàn)。依菲巴特（Eptifibatide)最早由美國(guó)C0R Therapeuties公司研發(fā)，1998年7月以Integrelin為商品名在美國(guó)首次上市。
[0007] 中國(guó)專利CN102040652A報(bào)道了依替巴肽的一種固液合成法，采按照Fmoc法合成 五肽樹(shù)脂H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc) -Pro-Cys(Trt) -RinkAM，將Trt-Mpa-Har(Boc) 2-0H 和五肽樹(shù)脂鍵合得七肽樹(shù)脂Trt-Mpa-Har(Boc) 2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc) -Pro-Cys(Trt) -RinkAM，裂解后經(jīng)碘氧化得依替巴肽粗品，再經(jīng)離子交換樹(shù)脂純化后得依替巴肽。該反應(yīng) 周期長(zhǎng)，產(chǎn)品純度低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0008] 在中國(guó)專利CN102584944B中公開(kāi)了一種依非巴特的制備方法，其過(guò)程是在氨 基樹(shù)脂上通過(guò)固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸或片段，得到 依非巴特樹(shù)脂：X-Y-Trp(Rl) -Pro-Cys(R2)-氨基樹(shù)脂；其中X為Mpr(Trt)-Harg;Y為 Gly-Asp(OtBu)。在該專利中，將四個(gè)保護(hù)氨基酸按照順序位置關(guān)系形成兩個(gè)二肽片段。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)中，偶聯(lián)時(shí)需添加縮合試劑和活化試劑，縮合試劑選自N，N-二異丙基碳 二亞胺（DIC)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 磷（PyB0P)、2-(7-氮雜-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、 苯并三氮唑_N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU)或0-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)。
[0010]活化試劑選自1-羥基苯并三唑（HOBt)、N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑（HOAt)，優(yōu) 選的為1-羥基苯并三唑（HOBt)。
[0011] 在上述兩篇現(xiàn)有技術(shù)的專利文獻(xiàn)中，其粗品在純化前需要進(jìn)行濃縮，進(jìn)而減少純 化時(shí)間和降低生成成本，現(xiàn)有技術(shù)中將粗品置于水相中進(jìn)行環(huán)化和氧化，由于水相濃縮的 效率低，且不能夠在高溫下進(jìn)行濃縮，現(xiàn)有技術(shù)的方法會(huì)大大延長(zhǎng)生成時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種依替巴肽的制備方法，可以提高產(chǎn)品純度，縮短生成周 期。
[0013] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種依替巴肽的制備方法，包括以 下步驟：
[0014] (1)以Fmoc-Cys(Trt)樹(shù)脂為偶聯(lián)樹(shù)脂載體，使用脫保護(hù)試劑處理后，依次偶聯(lián)接 入Fmoc保護(hù)的氨基酸和保護(hù)氨基酸三肽片段；得到依替巴肽樹(shù)脂；其中氨基酸包括脯氨 酸、色氨酸和天冬氨酸；
[0015] 其中所述三肽片段為含有-Mpr-Har-Gly-基團(tuán)的肽片；
[0016] 所述的保護(hù)氨基酸和三肽片段的用量均為所投料樹(shù)脂總摩爾數(shù)的2~4倍；優(yōu)選 為3倍；
[0017] 依次偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束和脫去Fmoc保護(hù)后經(jīng)過(guò)KaiserTest檢測(cè)。脫去Fmoc保護(hù)的 脫保護(hù)試劑為PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺）混合溶液，混合溶液中含哌啶為20%~ 25% (V/V)。每克氨基樹(shù)脂使用脫保護(hù)試劑10ml~15mL。脫保護(hù)次數(shù)為兩次，第一次脫 10~15分鐘，第二次脫保護(hù)30~35分鐘。
[0018] 作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，偶聯(lián)試劑是DIC/H0BT、PyB0P/H0BT或者DIC/H0AT中的 一種；或者是DIC、三乙胺和N-乙基對(duì)甲苯胺混合溶液；該混合溶液中摩爾比DIC:三乙胺： N-乙基對(duì)甲苯胺為100:2~5:2~5 ;接單個(gè)保護(hù)氨基酸優(yōu)選的偶聯(lián)試劑為DIC/H0BT;接 三肽片段優(yōu)選的偶聯(lián)試劑是DIC/H0AT;偶聯(lián)試劑的用量為Fm〇C-Cys(Trt)載體樹(shù)脂摩爾數(shù) 的2~4倍；優(yōu)選的為3倍；所述偶聯(lián)反應(yīng)的溶劑是DMF、DCM中的一種；優(yōu)選為DMF;
[0019] (2)將依替巴肽樹(shù)脂使用裂解劑裂解，得到還原型依替巴肽；
[0020] (3)將還原型依替巴肽在乙腈水溶液中使用氧化劑氧化，得到依替巴肽粗品，并將 依替巴肽粗品減壓濃縮，得到依替巴肽粗品濃縮液；
[0021 ] (4)將所述依替巴肽粗品濃縮液純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到依替巴肽精品。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例中，偶聯(lián)樹(shù)脂載體為Fmoc-Cys(Trt)載體樹(shù)脂。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例中，三肽片段為Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly;或 Mpr(trt) -Har-Gly或Mpr-Har-Gly或Mpr-Har(pbf)-Gly中的一種。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例中，裂解劑為三氟醋酸、1，2-乙二硫醇、三異丙基硅烷和水的 混合溶劑；混合溶劑中含有TFA90%~95%、EDT1%~4%和TIS1%~4%。每克依替巴肽 樹(shù)脂消耗的裂解劑用量為10~15ml;優(yōu)選的，每克依替巴肽樹(shù)脂需要10mL裂解劑。裂解 時(shí)間為室溫條件下2~6小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例中，在氧化步驟中，氧化劑為飽和碘/甲醇溶液。乙腈水溶液 的濃度為40%~80%;還原型依替巴肽的溶液濃度為0. 5~5mg/ml;氧化反應(yīng)時(shí)間為2~ 5小時(shí)；用HPLC監(jiān)控至反應(yīng)終點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例中，依替巴肽粗品濃縮液采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，所 述純化的色譜柱為十八烷基鍵合硅膠；流動(dòng)相分別為醋酸銨溶液和乙腈溶液。轉(zhuǎn)鹽步驟采 用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動(dòng)相系統(tǒng)為1 %醋酸/水溶液-乙腈溶液。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 1、本發(fā)明方法直接使用含保護(hù)氨基酸片段制備依非巴特，直接避免了 [+lGly]_依非巴特、[_lGly]_依非巴特等雜質(zhì)的產(chǎn)生，使純化難度大幅度減低，保證了產(chǎn) 品純度，所得大于產(chǎn)品純度99. 5%，單一雜質(zhì)較小，與已有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝具有反應(yīng) 操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫等特點(diǎn)，具有廣泛的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0029] 2、本發(fā)明采用已工業(yè)化生產(chǎn)的Fmoc-Cys(Trt)載體樹(shù)脂為起始原料來(lái)生產(chǎn)，無(wú)需 自己通過(guò)樹(shù)脂脫Fmoc基團(tuán)與Fmoc-Cys(Trt)-〇H偶聯(lián)來(lái)制備載體樹(shù)脂，縮短了生產(chǎn)依替巴 肽的生產(chǎn)工藝步驟，降低了生產(chǎn)成本。
[0030] 3、本發(fā)明采用已工業(yè)化生產(chǎn)的三肽片段作為偶聯(lián)反應(yīng)的原料，避免了現(xiàn)有技術(shù)中 在合成前需要單獨(dú)將三肽片段偶聯(lián)后進(jìn)行二次反應(yīng)，縮短了生產(chǎn)依替巴肽的生產(chǎn)工藝步 驟，降低了生產(chǎn)成本。
[0031] 4、由于氧化反應(yīng)需要在較低的還原型依替巴肽溶液濃度中進(jìn)行，成環(huán)反應(yīng)完成以 后，反應(yīng)產(chǎn)物需要濃縮才能進(jìn)行純化。、本發(fā)明在乙腈水溶液中對(duì)還原型依替巴肽進(jìn)行碘/ 甲醇溶液氧化成環(huán)反應(yīng)。乙腈可以在40°C下通過(guò)減壓快速的濃縮除去，而避免了產(chǎn)品降解， 縮短了生產(chǎn)周期。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0033] 本發(fā)明所使用的縮寫(xiě)的含義列于下表中。
[0034]

[0038] 依替巴肽的具體合成路線為：
[0039] 連接第一個(gè)氨基酸Pro的反應(yīng)：
[0040]
[0048] 將肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，同時(shí)去氨基酸側(cè)鏈保護(hù)：
[0049]
[0052] 實(shí)施例1
[0053]步驟 1Fmoc-Pro-Cys(Trt)樹(shù)脂的制備
[0054] 將Fmoc-Cys(Trt)載體樹(shù)脂（0. 45mmol/g，50mmol)加入反應(yīng)器中，用DMF洗滌一 次，用DCM溶脹30分鐘后。溶脹結(jié)束，用20 %PIP/DMF溶液脫Fmoc保護(hù)2次，經(jīng)檢測(cè)脫完保 護(hù)后，DMF洗滌 3 次，DCM洗 3 次。將 50. 6gFmoc-Pro_0H、（150mmol)，20. 3gH0Bt(150mmol)， 19gDIC溶于DMF中，加入固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)3h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn)），反 應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌3次，DCM洗3次。
[0055]步驟2Fomc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)樹(shù)脂的制備
[0056] 在