一種人血白蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物制品和血液制品生產(chǎn)的技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及血液制品生產(chǎn)中人血白蛋白的分離純化方法，具體為一種人血白蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人血白蛋白的主要生理功能為調(diào)節(jié)人體滲透壓和在新陳代謝中充當(dāng)重要的物質(zhì)運(yùn)輸載體，其適應(yīng)癥非常廣泛，常用于治療因失血、創(chuàng)傷及燒傷等引起的休克、腦水腫及大腦損傷所致的顱內(nèi)壓增高，對(duì)防治低蛋白血癥以及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水有較好的療效。
[0003]目前由人血漿制備人血白蛋白的方法主要為基于Cohn-Oncley法或Kistler-Nit schmann法為主的低溫乙醇工藝?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)大多數(shù)血液制品生產(chǎn)廠家制備人血白蛋白的低溫乙醇工藝主要包括如專利申請(qǐng)?zhí)?01410146102.4或201310355272.9所描述的:血漿的合并與融化、組分FI分離、組分FII+III分離、組分FIV分離、組分FV沉淀制備、組分FV沉淀溶解和深層過(guò)濾、超濾和巴氏滅活，分裝；或者為專利申請(qǐng)?zhí)?01210013227.0所描述的:血漿的合并與融化、組分FI+II+III分離、組分FIV分離、組分FV沉淀制備、組分FV沉淀溶解和深層過(guò)濾、超濾和巴氏滅活，分裝。上述方法分離步驟多、分離周期長(zhǎng)、工藝復(fù)雜且全程要求低溫環(huán)境，而制品純度卻不高。以中國(guó)藥典規(guī)定的方法對(duì)國(guó)內(nèi)市售的人血白蛋白廣品進(jìn)彳丁檢測(cè)，純度在96%左右，多聚體含量在3%左右；而以更精準(zhǔn)的尚效液相色譜方法對(duì)國(guó)內(nèi)市售的人血白蛋白產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，純度均僅在90%左右，多聚體含量多6%。較低的純度會(huì)影響制品的穩(wěn)定性和臨床應(yīng)用的安全性，導(dǎo)致更多的用藥不良反應(yīng)。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外均在進(jìn)行人血白蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝優(yōu)化。最為普遍的低溫乙醇工藝的優(yōu)化方式為:先利用低溫乙醇工藝得到的不同組分，再將之與不同類型的層析方法相結(jié)合，生產(chǎn)白蛋白、免疫球蛋白和其它多種蛋白。國(guó)內(nèi)優(yōu)化工藝如專利申請(qǐng)?zhí)?01110030776.4所描述的:組分FV沉淀制備后，再將沉淀溶解，配合DEAE Sepharose Fast Flow柱層析，收集洗脫液。該方法將柱層析工藝添加在最后一步組分沉淀后，并沒有減少低溫乙醇沉淀的步驟，而且選擇白蛋白與凝膠結(jié)合后再洗脫的層析工藝，由于凝膠吸附白蛋白的載量極為有限，實(shí)際生產(chǎn)中所需的凝膠成本巨大。國(guó)外早在上世紀(jì)就已經(jīng)有相關(guān)低溫乙醇工藝與層析工藝聯(lián)合制備人血白蛋白的報(bào)道，如專利號(hào)為US5250662所描述的:組分沉淀制備后，再將沉淀溶解，配合陰離子凝膠吸附和添加硅藻土的深層過(guò)濾，調(diào)整PH值后加入陽(yáng)離子凝膠吸附，再進(jìn)行添加硅藻土的深層過(guò)濾。上述操作包含兩次層析步驟，并選擇了開放式的批式吸附操作，不僅工藝繁瑣，而且非常容易污染制品。又如專利號(hào)為US5346992A所描述的:組分FIV-4上清液或組分FV沉淀溶解液，均進(jìn)行DEAE-SPHERODEX和QMA-SPHER0SIL兩步柱層析。上述操作包含兩次層析步驟，工藝時(shí)間較長(zhǎng)。國(guó)際著名血液制品公司CSL公司報(bào)道的低溫乙醇結(jié)合柱層析生產(chǎn)人血白蛋白的工藝:血漿的合并與融化、組分FI+II+III沉淀和深層過(guò)濾，壓濾后的上清液超濾濃縮，DEAE Sepharose Fast Flow柱層析，55°C 3h熱處理沉淀脂蛋白，離心或過(guò)濾去除沉淀，再進(jìn)行Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾。但據(jù)報(bào)道該方法僅能處理13L上清液，無(wú)法在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。(Tanaka K, et al.Purificat1n of humanalbumin by the combinat1n of the method of Cohn with liquid chromatography.Braz J Med B1l Res.1998 Nov;31 (11):1383-8.)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于以健康人血楽上清為原料，采用Kistler-Nitchmann低溫乙醇法沉淀、分離組分FI+II+III和組分FIV，對(duì)組分FIV分離后上清液進(jìn)行脫醇處理后，再配合一步離子交換層析，超濾，加入適量的辛酸鈉作為穩(wěn)定劑，經(jīng)巴氏病毒滅活處理后得到人血白蛋白成品。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種人血白蛋白的制備方法，步驟如下:(1)組分FI+II+III分離；(2)組分FIV分離；
(3)組分FIV分離后上清液處理；(4)離子交換層析；(5)超濾和巴氏病毒滅活處理；
其中，(3)組分FIV分離后上清液處理
用1KDa的超濾膜包對(duì)組分FIV分離后的上清液進(jìn)行脫醇處理，超濾稀釋液為注射用水，超濾至上清液乙醇濃度彡10%，電導(dǎo)率彡5mS/cm,蛋白質(zhì)含量5~50mg/ml，用
0.1-0.3mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH4.0-9.0 ;得到精制的FIV分離后上清液；
(4)離子交換層析
將適量凝膠裝填在層析柱內(nèi)，柱床體積與上樣體積的比例為1:5~1:50，裝填好的層析柱使用含有枸櫞酸鈉< lOmmol/L、pH4.0-9.0的緩沖液平衡2~5個(gè)柱體積；精制的FIV分離后上清液經(jīng)過(guò)0.2 μ m的在線膜過(guò)濾后栗入層析柱；再使用含有枸櫞酸鈉< lOmmol/L、氯化鈉< 1.5mol/L、pH4.0-9.0的緩沖液洗滌層析柱，收集層析過(guò)程中的流穿液和洗滌液，得到層析混合液；最后用含有枸櫞酸鈉彡10mmol/L、2mol/L氯化鈉、pH4.0-9.0的緩沖液與0.3-0.5mol/L的氫氧化鈉溶液交替處理層析柱；20%乙醇保存。層析過(guò)程中控制流速60~240cm/ho
[0007]本發(fā)明的特點(diǎn)還有:
對(duì)于步驟(I)組分FI+II+III分離，具體如下:
投漿時(shí)控制化漿用罐循環(huán)水溫< 37°C，血漿溫度< 10°C ;血漿用生理鹽水稀釋蛋白質(zhì)濃度彡5%，使用0.5~3mol/L的醋酸緩沖液調(diào)整pH為5.8±0.3，補(bǔ)加乙醇至制品乙醇濃度為19± 1%，補(bǔ)加0.5~3mol/L醋酸緩沖液至pH為5.8±0.3，調(diào)整血漿溫度為_5°C ±2°C，靜置彡2h ；
向血漿中加珍珠巖、硅藻土攪拌均勻，深層過(guò)濾，沉淀即為組分FI+II+III，上清液為組分 FI+II+III 上清。
[0008]對(duì)于步驟(2)組分FIV分離，具體如下:
組分FI+II+III上清補(bǔ)加含有乙醇濃度19±1%，氯化鈉0.1-0.15mol/L的注射用水，進(jìn)一步稀釋蛋白質(zhì)濃度彡3%，補(bǔ)加乙醇至制品乙醇濃度為40 土 1% ;使用0.5~3mol/L的醋酸緩沖液調(diào)整制品pH為5.8 ±0.3，調(diào)整溫度為-5°C ±2°C，靜置彡2h ;
向制品中加珍珠巖、硅藻土攪拌均勻，深層過(guò)濾，沉淀即為組分FIV，上清液為組分FIV上清。
[0009]對(duì)于步驟(5)超濾和巴氏處理，具體如下: 用0.1-0.3mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)層析混合液pH6.9±0.5 ;用1KDa的超濾膜包超濾層析混合液，超濾稀釋液為生理鹽水，調(diào)整制品蛋白質(zhì)濃度多20%、pH6.9±0.5、鈉離子含量< 160mmo/L、殘余乙醇含量< 0.025%、電導(dǎo)率6~12mS/cm ;按超濾后溶液每克蛋白質(zhì)補(bǔ)加辛酸鈉0.140-0.180mmol，得到人血白蛋白制品溶液；
600CUOh滅活病毒:嚴(yán)格控制人血白蛋白制品溶液溫度59.50C -60.5°C，自溫度升至59.5°C計(jì)時(shí)，維持1h0
[0010]所述的步驟(4)中，采用的凝膠為陰離子交換凝膠FractogelTMAE或者CaptoDEAE0
[0011]所述的步驟(3)中，超濾稀釋液為濃度< 10mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液。
[0012]所述的步驟(3)中，用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)超濾后上清液pH4.0-9.0。
[0013]所述的步驟(5)中，用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)層析混合液pH6.9±0.5。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明制備人血白蛋白的方法先采用兩步低溫乙醇沉淀工藝處理血漿，即進(jìn)行組分FI+II+III和組分FIV的沉淀，然后直接以精制的FIV分離后上清液為原料進(jìn)行柱層析處理。與傳統(tǒng)的低溫乙醇沉淀工藝比較，減少了后續(xù)組分FV低溫乙醇沉淀和深層過(guò)濾，組分FV沉淀溶解和深層過(guò)濾兩步分離步驟，工藝時(shí)間縮短24~48h，且減少了沉淀、深層過(guò)濾和溶解工藝過(guò)程中引起的人血白蛋白收率損失。
[0015](2)本發(fā)明的制備方法與其他文獻(xiàn)及生產(chǎn)工藝相比較，僅通過(guò)一步層析即可提高制品純度。組分FIV分離后的上清液經(jīng)過(guò)超濾可去除多種小分子雜質(zhì)蛋白，便于減少柱層析的雜蛋白載量負(fù)荷。凝膠Fractogel TMAE或Capto DEAE可以去除制品中的多種大分子及小分子雜質(zhì)蛋白。經(jīng)該方法處理的最終人血白蛋白通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)，純度彡99%，多聚體含量< 1%，極大地提高了臨床應(yīng)用的安全性。
[0016](3)本發(fā)明的制備方法可使人血白蛋白制品的收率比低溫乙醇法提高l~2g/L血漿。
[0017](4)本發(fā)明的制備方法中柱層析采用人血白蛋白流穿法，由于組分FIV深層過(guò)濾后的上清液中雜質(zhì)蛋白含量已經(jīng)較少(彡10%)，因此通過(guò)調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)使人血白蛋白流穿層析柱，可極大的提高凝膠對(duì)料液的處理量，達(dá)到100L凝膠的層析規(guī)模即可處理相當(dāng)于
1.0-2.0噸的血漿原料，完全可放大于實(shí)際生產(chǎn)。而其他文獻(xiàn)及專利所報(bào)道的使用凝膠吸附人血白蛋白而使制品中雜質(zhì)流穿層析柱的方法，每100L凝膠最多僅能吸附20kg人血白蛋白，相當(dāng)于0.1-0.3噸血漿，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)凝膠的成本將非常巨大，基本沒有可行性。
[0018](5)本發(fā)明的制備方法中組分FIV上清液超濾后，即可將制品轉(zhuǎn)入常溫生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行生產(chǎn)操作，節(jié)能降耗并方便生產(chǎn)人員操作。
[0019]總之，本發(fā)明的人血白蛋白制備工藝，以健康人血漿為原料，通過(guò)血漿的合并與融化、組分FI+II+III分離、組分FIV分離，對(duì)組分FIV分離后上清液進(jìn)行處理，結(jié)合一步層析工藝，即可制備高純?nèi)搜椎鞍?，?00L凝膠的層析規(guī)模即可處理相當(dāng)于1.0~2.0噸的血漿原料，完全可放大于實(shí)際生產(chǎn)。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)該工藝制備的人血白蛋白的純度^ 99%，多聚體含量彡1%，收率達(dá)到28~30g/L血漿。制品的純度更高，雜蛋白含量更低，使得