一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription?Activator?Like?Effectors，TALE)-功能基團-雌激素受體(Estrogen?Receptor，ER)”功能蛋白及其應(yīng)用，所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和功能基團依次連接而成，或者由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、功能基團和雌激素受體依次連接而成。所述功能基團選自轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation?Domain，AD)、核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重組酶中的一種或兩種以上的組合。實際應(yīng)用的時候，通過在細胞質(zhì)中引入他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OH-TAM)來控制上述功能蛋白在特定時間進入細胞核。
【專利說明】—種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator LikeEffectors, TALE)-功能基團-雌激素受體(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白以及上述功能蛋白的應(yīng)用，特別涉及上述功能蛋白可控地進入細胞核中對特定基因進行操控的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在后基因組時代，我們迫切需要高效的基因操縱、合成等新型的生物工程技術(shù)。比如，我們常常需要抑制或沉默一個基因的表達。傳統(tǒng)的基因敲除(Gene Knockout)技術(shù)依賴于細胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率非常低，通常為10_6級；RNAi技術(shù)雖然簡單易行，但是又很難獲得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我們常常還需要針對特定基因，進行某幾個堿基，甚至某一段序列的修改。同樣只依賴于同源重組技術(shù)，很難獲得理想的效果。
[0003]TALE (Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)上發(fā)現(xiàn)的,特異性地結(jié)合到DNA,在該病原菌感染過程中對植物基因進行調(diào)控。TALE蛋白可以穿過核膜進入細胞核內(nèi)與特定的DNA結(jié)合域結(jié)合，調(diào)控植物基因組中與疾病和抵抗力相關(guān)基因的表達。簡單講，TALE是由4個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成，而每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(repeat variablediresidue,或者RVDs)。TALE識別DNA的機制在于DNA靶點上的一個核苷酸被一個重復(fù)序列上的RVD識別。
[0004]理論上，針對A、T、G、C任何一個堿基，都能找到與之特定結(jié)合的RVDs。因此，對任何一段DNA序列，我們可以方`便的設(shè)計、合成出對應(yīng)蛋白模塊組成的TALE。需要指出的問題是，I)雖然針對A、T、G、C都可以設(shè)計出對應(yīng)的RVD，但是，它們之間的對應(yīng)關(guān)系還有待于進一步優(yōu)化；2)設(shè)計合成的TALE能否高效地靶向結(jié)合基因組上的預(yù)期位置，還決定于很多其它因素；3)蛋白模塊的組成也有進一步優(yōu)化的空間。
[0005]雖然TALE還有很多問題有待于深入研究加以解決，但是這并不妨礙它的應(yīng)用。一個最大的應(yīng)用前景是TALEN。TALEN是一個融合蛋白，由與某段DNA序列特異性識別TALE與能在DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)的內(nèi)切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是異源二聚體分子(即兩單位的TALE-Nuclease共同作用)，能夠在兩個相隔較近的特異識別序列間切割DNA。
[0006]TALEN產(chǎn)生的DSB能夠通過以下兩種途徑進行修復(fù):1)非同源末端連接(NonHomologous End Joining, NHEJ):NHEJ是以自然修復(fù)機制,能被用來引入核苷酸缺失以便失活或敲除一個特異性的祀基因；2)同源重組(Homologous Recombination,HR):DSB促進同源重組，在一個DNA模版存在下，能夠產(chǎn)生特異性DNA序列改變，也能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因整合到DNA序列上。NHEJ途徑可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(Gene Knock-1n)。無論是哪種途徑,TALEN產(chǎn)生的修復(fù)與單純依賴于同源重組相比，基因發(fā)生重組的效率大大提高，這為我們從事基因組訂制化(genome customization)提供方便的技術(shù)手段，為開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向修飾技術(shù)帶來了新希望。
[0007]TALE 另外一個大的應(yīng)用前景是 TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)。TALEA是一個融合蛋白，將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64 Activation Domain)融合,可構(gòu)建成識別啟動子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA。該融合蛋白將結(jié)合基因啟動子附近的特異DNA序列，并通過VP64激活區(qū)域與Polymerase II結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了內(nèi)源目標基因的表達。在實際操作中，需在目標基因的啟動子上游選取靶序列(一般12-18個堿基)，構(gòu)建TALE識別模塊。 [0008]TALE技術(shù)已經(jīng)開始在生命科學領(lǐng)域嶄露頭角。2011年，法國和美國兩個小組合作，利用TALEN技術(shù)，在大鼠中敲除失活I(lǐng)gM功能，效率高達60 %。2011年，包括中國在內(nèi)的幾個小組，利用TALEN技術(shù)，在斑馬魚中，敲除失活hey2等基因，效率也達到了 30%以上。
[0009]TALE具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，包括氮端(N端)分泌信號、中央的DNA結(jié)合域、和核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)和碳端(C端)的激活域。DNA結(jié)合域中，幾乎所有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TALE蛋白都是有數(shù)量不同(12~30)、高度保守的重復(fù)單元組成，這些重復(fù)單元(一般含有33~35個氨基酸)中，除了第12和13位氨基酸不近相同之外，其他組成部分都十分保守。其中第12和13位可變的氨基酸被稱為重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基RVD (repeat variable d1-residues)。TALE主要是通過重復(fù)單兀中的RVD識別DNA序列。目前已經(jīng)報道的RVD共有14種。NI (氨基酸名稱)特異性識別A，HD(氨基酸名稱)特異性識別C，NN(氨基酸名稱)可以識別G和A，NK(氨基酸名稱)特異性識別G，NS(氨基酸名稱)可以識別G、A、C和T，NG (氨基酸名稱)特異性識別T，NH(氨基酸名稱)特異性識別G，N* (氨基酸名稱)可以識別T、C、G和A，NP (氨基酸名稱)可以識別T、A和C，HN(氨基酸名稱)可以識別G和A，NT (氨基酸名稱)可以識別G和A，SN(氨基酸名稱)特異性識別G，SH(氨基酸名稱)特異性識別G。
[0010]TALE技術(shù)的主要部分是在TALE蛋白碳端或者氮端融合進入功能分子，例如轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain, AD)核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重組酶等等。在TALE融合蛋白特異性識別DNA序列并結(jié)合之后，它碳端的功能集團發(fā)揮作用，從而達到對功能蛋白調(diào)控的效果?，F(xiàn)在有關(guān)TALE的相關(guān)技術(shù)應(yīng)用的報道中一般都是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒侵染或者注射信使的RNA的方法直接表達TALE融合蛋白，讓其發(fā)揮作用。但是在整個過程中，只要核酸導(dǎo)入到細胞里面之后，就沒有辦法對其進行相應(yīng)的控制，很多實驗中，例如核酸酶實驗或重組酶實驗，很多時候，需要在特定的時間，在特定的組織里表達TALE融合蛋白，讓其發(fā)揮作用，從而對特定的組織里顯現(xiàn)出特定的表性。這些實驗，現(xiàn)在的TALE技術(shù)沒有辦法達到這樣的效果。我們希望通過一些工程學的方法，來實現(xiàn)對TALE蛋白時間和空間上的控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的正是為了解決上述技術(shù)問題，希望通過工程設(shè)計對TALE蛋白進行一些改進，實現(xiàn)同時在時間和空間上對TALE蛋白的控制。
[0012]本發(fā)明中的“功能基團”是一種蛋白分子，這種蛋白分子能對基因產(chǎn)生特定的生物化學作用，例如，該“功能基團”可以是一種能促進啟動子表達的轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以是促進核酸水解的核酸酶，也可以是一種能阻止基因表達的阻抑蛋白，還可以是一種能甲基化核酸的甲基化酶，等等。
[0013]“多聚核苷酸(polynucleotide) ”是一類生物大分子物質(zhì),分脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類。
[0014]“他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者 4_ 羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)的衍生物”是指一系列結(jié)構(gòu)各異的化合物，能與雌激素受體結(jié)合，包括但不限制于包括 raloxifene、clomifene、droloxifene 等。
[0015]據(jù)報道，人的雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)蛋白功能域中有一個配基結(jié)合功能域，它在細胞中，會和細胞質(zhì)中的熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)結(jié)合,整個蛋白復(fù)合體會停留在細胞質(zhì)中，當有他莫昔芬(tamoxifen，ΤΑΜ)，或者4_羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0H-TAM)，或者衍生物存在的時候，他莫昔芬或4-羥基-他莫昔芬或衍生物會更強的與ER結(jié)合，此時ER就和熱休克蛋白分離開，處于游離狀態(tài)。如果ER蛋白上有核定位序列(Nuclear localization signal, NLS), ER蛋白就可以入核,并行使功能。
[0016]本發(fā)明中，我們將TALE融合蛋白和ER配基結(jié)合功能域結(jié)合，通過對ER蛋白入核的控制，來實現(xiàn)對TALE融合蛋白入核的控制，從而實現(xiàn)對TALE最后功能上的控制。在本發(fā)明的一個實施例中，我們在TALE的碳端融合加入轉(zhuǎn)錄激活因子(AD)，通過對AD功能結(jié)果的檢測來檢測ER的控制結(jié)果。
[0017]在實驗中，我們首先構(gòu)建了一個檢測體系，在人子宮頸癌細胞系(Hela)中，通過病毒侵染的方法整合到 基因組中，在整合的序列中，含有微型的啟動子序列，在啟動子之前含有TALE的結(jié)合位點。當有能識別對應(yīng)結(jié)合位點的TALE進入到細胞核內(nèi)結(jié)合在結(jié)合位點時，和TALE融合的轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用，增強啟動子后邊的報告基因的表達量。我們將ER配基結(jié)合功能域和TALE-AD蛋白融合，分別放在TALE-AD融合蛋白前面，TALE和AD之間，TALE-AD融合蛋白后邊。當沒有他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxi fen，4-0H-TAM)或者衍生物存在的時候，細胞質(zhì)中的熱休克蛋白會和整個融合蛋白會結(jié)合，阻止其入核；當有他莫昔芬(tamoxifen，ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物存在的時候,他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0H-TAM)或者衍生物具有比熱休克蛋白和ER更強的結(jié)合能力，所以它會和ER結(jié)合，此時，ER融合蛋白可以入核，發(fā)揮TALE的作用，從而達到對TALE的作用進行控制的目的。
[0018]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。
[0019]一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)-功能基團-雌激素受體(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白，其特征在于所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和功能基團依次連接而成，或者由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、功能基團和雌激素受體依次連接而成。優(yōu)選地，所述功能基團選自轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD)、核酸酶、阻抑蛋白、甲基化酶、去甲基化酶、重組酶中的一種或兩種以上的組合。
[0020]上述功能蛋白具有這樣的特性:我們可以通過他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物來控制該功能蛋白在特定的時刻進入細胞核。具體操作方法如下:在細胞質(zhì)中引入所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，由于細胞質(zhì)中存在的熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)會和功能蛋白中的雌激素受體(Estrogen Receptor, ER)結(jié)合,阻止上述功能蛋白進入細胞核；當我們希望功能蛋白進入細胞核發(fā)揮其作用的時候，可以在細胞質(zhì)中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，上述物質(zhì)具有比熱休克蛋白和ER更強的結(jié)合能力，所以它們會和雌激素受體(ER)結(jié)合，此時，結(jié)合了 TAM或者4-0H-TAM或者衍生物的功能蛋白(雌激素受體(ER)融合蛋白)可以入核，發(fā)揮功能蛋白的作用。該“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白同時具有轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、功能基團、雌激素受體三者的作用，雌激素受體的作用很明顯，就是可以與他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)或者衍生物一起控制上述功能蛋白進入細胞核；而轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(TALE)的作用是定位，通過它可以識別特定的DNA并與之結(jié)合，通過TALE定位完成以后，功能基團就可以發(fā)揮其自身的作用了，例如，如果該功能基團是核酸酶，它就可以促進與之結(jié)合的核酸的分解，如果它是甲基化酶，它就可以促進與之結(jié)合的核酸的甲基化。
[0021]特別的，當功能基團是一種轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain, AD)的時候,可以利用上述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白在特定時間促進細胞核中特定基因表達:所述功能基團為轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain, AD),所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain, AD)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-AD，在細胞質(zhì)中引入TALE-ER-AD，然后，在預(yù)先設(shè)定的時間，在細胞質(zhì)中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)或者衍生物或它們的混合物，則TALE-ER-AD將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-AD上的轉(zhuǎn)錄激活因子AD將促進目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。上述技術(shù)方案中，雌激素受體ER和轉(zhuǎn)錄激活因子AD的連接順序可以顛倒，變?yōu)門ALE-AD-ER。
[0022]特別的，當功能基團是一種核酸酶(nuclease)的時候,可以利用“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激`素受體”功能蛋白在特定時間剪切細胞核中特定基因:所述功能基團為核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和核酸酶(nuclease)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-nuclease,在細胞質(zhì)中引入TALE-ER-nuclease,然后,在預(yù)先設(shè)定的時間,在細胞質(zhì)中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則TALE-ER-nuclease將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)將對目標DNA進行剪切。上述技術(shù)方案中，雌激素受體ER和核酸酶(nuclease)的連接順序可以顛倒，變?yōu)門ALE-nuclease-ER。
[0023]特別的，當功能基團是一種阻抑蛋白(repressor)的時候,可以利用“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白在特定時間抑制細胞核中特定基因的表達:所述功能基團為阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和阻抑蛋白(repressor)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-repressor,在細胞質(zhì)中引入TALE-ER-repressor,然后,在預(yù)先設(shè)定的時間,在細胞質(zhì)中引入他莫昔芬(tamoxifen,ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則TALE-ER-repressor將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-repressor上的阻抑蛋白(repressor)將抑制目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。上述技術(shù)方案中，雌激素受體ER和阻抑蛋白(repressor)的連接順序可以顛倒,變?yōu)門ALE-repressor-ER。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1本發(fā)明的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白檢測體系原理圖。首先，為了建立檢測體系，通過病毒侵染的方法，把含有TALE結(jié)合位點的序列整合到目的細胞的基因組上(實際應(yīng)用的時候，也可以在知道目標基因序列的前提下，選取目標基因中的一段序列，根據(jù)該序列設(shè)計合成與該序列結(jié)合的TALE)，在這段序列上，TALE結(jié)合位點后面緊接著微型啟動子，在沒有激活域(即轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD))刺激的情況下，下游報告基因的表達水平很低。然后我們平行做了兩個實驗，第一步同時轉(zhuǎn)染含有ER-TALEa (即同時含有TALE、ER和AD的融合蛋白)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染之后6小時，把一個實驗組的培養(yǎng)液換成含有IOOnM的4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0H-TAM)的細胞生長培養(yǎng)液，另外一個實驗組換成普通的細胞生長培養(yǎng)液。沒有4-羥基-他莫昔芬的實驗組里，細胞質(zhì)里的熱休克蛋白會和表達出來的ER-TALEa蛋白結(jié)合，阻止其入核，ER-TALEa就不能和細胞核里基因組上的結(jié)合位點結(jié)合，不能行使功能。在有4-羥基-他莫昔芬的實驗組里，4-羥基-他莫昔芬比起熱休克蛋白，具有和ER-TALEa更強的結(jié)合能力，所以它會和ER-TALEa結(jié)合，ER-TALEa就可以入核，結(jié)合到基因組上的結(jié)合位點上，行使功能，在此檢測體系里 ，就是增強下游基因的表達。
[0025]圖2熒光顯微鏡拍攝的經(jīng)過48小時的檢測結(jié)果。圖中的陽性對照組是指TALE上沒有融合ER基因，它本是可以行使功能的。加上ER基因是為了達到對TALE進入細胞核行使其功能的控制。圖中亮點區(qū)域越多、亮點亮度越大，表示目標基因的表達越多。
[0026]圖3把圖2中的顯微鏡的拍攝結(jié)果通過軟件計算熒光強度分析的結(jié)果。
[0027]圖4把檢測體系中的激活域換成具有酶切活性的蛋白結(jié)合域(即核酸酶，nuclease),用 ER 來控制 TALEn (TALE-nuclease)的作用效果。
[0028]圖5把檢測體系中的激活域換成具有抑制基因表達的蛋白結(jié)合域(即阻抑蛋白，repressor),用 ER 來控制 TALEr (TALE-repressor)的作用效果。
[0029]圖6把檢測體系中的激活域換成具有甲基化核酸的蛋白結(jié)合域(methylase)，用ER來控制TALEm (TALE-methylase)的作用效果。
[0030]圖7把檢測體系中的激活域換成具有整合酶的蛋白結(jié)合域(integrase)，用ER來控制 TALEi (TALE-1ntegrase)的作用效果。
【具體實施方式】
[0031]以下將通過具體的實施例說明本發(fā)明，但是這些具體的實施例不應(yīng)當理解為對本發(fā)明的限制，對某些細節(jié)進行修改將仍然落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例中使用的TALE氨基酸序列、被上述TALE識別的目標DNA中的片段的序列、以及ER的氨基酸序列如核苷酸序列表所示。核苷酸序列表中列出了 3組TALE氨基酸序列和能被上述TALE識別的DNA序列，實驗中使用的TALE氨基酸序列和對應(yīng)的被TALE識別的DNA序列是同一組的，但是并不限于某一個特定的組。在實際應(yīng)用的時候，一般是知道目標DNA序列后，選取目標DNA序列中的一段作為TALE的識別位點，然后根據(jù)該目標DNA片段合成出能識別該片段的TALE。
[0032]實施例1原理如圖1所示，實驗結(jié)果如圖2和圖3所示。實驗過程如下:首先，為了建立檢測體系，通過病毒侵染的方法，把含有TALE結(jié)合位點的序列整合到目的細胞的基因組上，這樣做是出于操作方便的考慮，在實際應(yīng)用的時候，可以在知道目標基因序列的前提下，選取目標基因中的一段序列，根據(jù)該序列設(shè)計合成與該序列結(jié)合的TALE。在這段序列上，TALE結(jié)合位點后面緊接著微型啟動子，在沒有激活域(即轉(zhuǎn)錄激活因子(ActivationDomain7AD))刺激的情況下，下游報告基因的表達水平很低。然后我們平行做了兩個實驗，第一步同時轉(zhuǎn)染含有ER-TALEa (即同時含有TALE、ER和AD的融合蛋白)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染之后6小時,把一個實驗組的培養(yǎng)液換成含有IOOnM的4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)的細胞生長培養(yǎng)液，另外一個實驗組換成普通的細胞生長培養(yǎng)液。沒有4-羥基-他莫昔芬的實驗組里，細胞質(zhì)里的熱休克蛋白會和表達出來的ER-TALEa蛋白結(jié)合，阻止其入核，ER-TALEa就不能和細胞核里基因組上的結(jié)合位點結(jié)合，不能行使功能。在有4-羥基-他莫昔芬的實驗組里，4-羥基-他莫昔芬比起熱休克蛋白，具有和ER-TALEa更強的結(jié)合能力，所以它會和ER-TALEa結(jié)合，ER-TALEa就可以入核，結(jié)合到基因組上的結(jié)合位點上，行使功能，在此檢測體系里，就是增強下游基因的表達。
[0033]實驗定性結(jié)果見附圖2，在陽性對照結(jié)果中，由于沒有在TALE上融合ER蛋白(直接將AD與TALE融合)，因此不論加與不加4-羥基-他莫昔芬，TALE-AD蛋白都可以自由進入細胞核發(fā)揮其功能。由圖2可見，不論有沒有4-羥基-他莫昔芬存在，目標蛋白都大量表達，說明TALE-AD在兩種情況下都進入了細胞核，并通過TALE識別了目標DNA，而且TALE-AD上的AD蛋白正常發(fā)揮了其促進目標DNA表達的功能。ER-TALE-AD的實驗結(jié)果中，加與不加4-羥基-他莫昔芬的熒光強度相差不多，這表明ER、TALE、AD順序連接得到的功能蛋白實驗效果并不太好；TALE-ER-AD的實驗結(jié)果中，不加4-羥基-他莫昔芬的熒 光強度比加入4-羥基-他莫昔芬的熒光強度要低很多，這表明不加4-羥基-他莫昔芬的情況下，TALE-ER-AD功能蛋白并沒有大量進入細胞核，而加入4-羥基-他莫昔芬的情況下，TALE-ER-AD功能蛋白大量進入了細胞核，并發(fā)揮了促進目標DNA表達的功能，表現(xiàn)為熒光強度增加。TALE-AD-ER的實驗結(jié)果與TALE-ER-AD的類似，只不過兩者熒光強度的差別更加明顯了，表明與TALE-ER-AD相比，TALE-AD-ER可控效果更好。結(jié)論就是，TALE-ER-AD和TALE-AD-ER兩種功能蛋白都可以通過4-羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-AD-ER的可控性更好。
[0034]圖3是將圖2的實驗結(jié)果定量化而得到的。從圖3可以得出與圖2相同的結(jié)論:TALE-ER-AD和TALE-AD-ER兩種功能蛋白都可以通過4-羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-AD-ER的可控性更好；而可控的原因就在于功能蛋白中融合了 ER蛋白。
[0035]實施例2實驗過程與實施例1類似，只是將AD蛋白換為了核酸酶(nuclease)，我們在基因組上選取了一個基因進行實驗(不需要把目的序列通過病毒的方法整合到基因組上)。實驗結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，TALE-ER-nuclease和TALE-nuclease-ER兩種功能蛋白都可以通過4-羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-nuclease-ER的可控性更好。[0036]實施例3實驗過程與實施例1類似，只是將AD蛋白換為了阻抑蛋白Oppressor)，跟實施例2類似，選取了基因組上的一個基因進行實驗。實驗結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，TALE-ER-repressor和TALE-repressor-ER兩種功能蛋白都可以通過4-羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-r印ressor-ER的可控性更好。
[0037]實施例4實驗過程與實施例1類似，只是將AD蛋白換為了甲基化酶(methylase)，跟實施例2類似，選取了基因組上的一個基因進行實驗。實驗結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，TALE-ERnethylase和TALE-methylase-ER兩種功能蛋白都可以通過4_羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-methylase-ER的可控性更好，而且與前面3個實驗結(jié)果橫向相比，TALE-methylase-ER的可控性更優(yōu)于TALE-repressor-ER、TALE-nuclease-ER 以及 TALE-AD-ER。
[0038]實施例5實驗過程與實施例1類似，只是將AD蛋白換為了整合酶(integrase)，跟實施例2類似，選取了基因組上的一個基因進行實驗。實驗結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，TALE-ER-1ntegrase和TALE-1ntegrase-ER兩種功能蛋白都可以通過4-羥基-他莫昔芬對其進入細胞核的行為進行控制，而TALE-1ntegrase-ER的可控性更好。
[0039]由上述實施例的結(jié)果可以看出，4-羥基-他莫昔芬或他莫昔芬控制“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白進入細胞核與上述功能蛋白中的功能基團種類無關(guān)，只要是功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和功能基團依次連接而成，或者由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、功能基團和雌激素受體依次連接而成就行，至于功能基團發(fā)生變化，帶來的影響只是可控的效果稍好一點或者稍差一點，不會對可控性帶來根本的影響。
[0040]核苷酸序列表: [0041](I)
[0042]TALE 識別序列(ATCACCGAACTACTACT)
[0043]TALE氨基酸序列:
[0044]MAPKKKRKVYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGSYPYDVPDYAAHGTVDLRTLGYSQQQQEKI
[0045]KPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVG
[0046]KQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNL
[0047]TPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPV
[0048]LCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALET
[0049]VQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHD
[0050]GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQ
[0051]VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQA
[0052]HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQR
[0053]LLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQ
[0054]ALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIA
[0055]SNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT
[0056]PAQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHA
[0057]PALIKRTNRRIPERTSHRVA
[0058](2)
【權(quán)利要求】
1.一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)-功能基團-雌激素受體(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白，其特征在于所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和功能基團組成，各個單元之間不分前后順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和功能基團依次連接而成，或者由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、功能基團和雌激素受體依次連接而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白可以是由多聚核苷酸轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團選自轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD)、核酸酶、阻抑蛋白、甲基化酶、去甲基化酶、重組酶中的一種或兩種以上的組合。
5.一種控制權(quán)利要求1-4任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于在動物或細胞中引入所述“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，然后，在特定需要時間，在動物體內(nèi)或細胞生長的環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白能夠進入細胞核。
6.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD),所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-AD，在特定需要時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)的TALE-ER-AD將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活因子AD將促進目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。
7.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD),所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain,AD)和雌激素受體依次連接而成，簡稱為TALE-AD-ER，在特定需要時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者上述兩者的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)的TALE-AD-ER將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活因子AD將促進目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。
8.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn) 錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和核酸酶(nuclease)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-nuclease，在特定需要的時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)的TALE-ER-nuclease將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)將對目標DNA進行剪切。
9.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、核酸酶(nuclease)和雌激素受體依次連接而成，簡稱為TALE-nuclease-ER，在特定需要的時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)的TALE-nuclease-ER將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)將對目標DNA進行剪切。
10.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、雌激素受體和阻抑蛋白(^pressor)依次連接而成，簡稱為TALE-ER-repressor,在特定需要的時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)的TALE-ER-1^pressor將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-ER-repressor上的阻抑蛋白(repressor)將抑制目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。
11.一種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子-功能基團-雌激素受體”功能蛋白，其特征在于所述功能基團為阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子、阻抑蛋白(^pressor)和雌激素受體依次連接而成，簡稱為TALE-repressor-ER,在特定需要的時間，當在動物體內(nèi)或細胞生長環(huán)境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羥基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它們的混合物，則細胞質(zhì)內(nèi)TALE-repressor-ER將進入細胞核，TALE將識別目標DNA并與其結(jié)合，TALE-repressor- ER上的阻抑蛋白(repressor)將抑制目標DNA的轉(zhuǎn)錄和表達。
【文檔編號】C12N15/00GK103772506SQ201210401364
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】莊峰鋒, 李娟
申請人:北京唯尚立德生物科技有限公司