S_Bl、P即S_B2、P即S_B3……pWS_B10表示第一次組裝所用的骨架質(zhì)粒圖譜簡(jiǎn)圖，如果 上述第二組有m(m取值為1~10)個(gè)識(shí)別模塊，則選用pWS_Bm作為骨架質(zhì)粒；（C)pLR-皿、 pLR-NG、pLR-NI和pLR-NN表示最后一個(gè)（實(shí)際上是半個(gè)）識(shí)別模塊質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜簡(jiǎn)圖， 其中NI、NG、皿和順?lè)謩e代表SEQIDNO;37~40的堿基序列。上述質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)addgene 質(zhì)粒庫(kù)中必。
[006引圖4示出了背景質(zhì)粒PTAL3的質(zhì)粒圖譜，Esp3I酶切位點(diǎn)位于LacZ編碼序列兩側(cè)。[0069] 5、TALE化表達(dá)載體的構(gòu)建具體操作過(guò)程如下，其中內(nèi)切酶Bsal和Esp3I購(gòu)自 Thermo F'ermentas公司，其余的酶購(gòu)自New lingland Biol油s(肥B)公司。
[0070] (1)準(zhǔn)備模塊質(zhì)粒
[0071] 按照識(shí)別位點(diǎn)序列挑選對(duì)應(yīng)的N個(gè)模塊，調(diào)整模塊質(zhì)粒濃度到15化g/μ1。
[007引似一次拼接組裝
[0073] (2. 1)首先，一次拼接組裝前10個(gè)模塊，連接體系如下：
[0074] ?-!0每…個(gè)撰塊質(zhì)粒 ]50!堪 妒US__A廣粒 .15細(xì)呂 寂sal 2 μ1 Τ4 DNA ligase 2μΙ i〇yT4 DN A ligase buffer 2μ] 補(bǔ)水至 20μL
[0075] (2. 2)酶切連接反應(yīng)程序和體系如下：
[0076] 運(yùn)行循環(huán)：
[0077] 10 循環(huán)X(37°C/5min+16°C/10min)+5(TC/5min+8(TC/5min
[0078] Plasmid-Safe nuclease (PSN)處理：
[0079] 準(zhǔn)備純化預(yù)混液（單倍）：
[0080] 25mMATP 1μ1
[0081]?ουPSN 1μ1
[0082] &0 3μ1
[0083] 向上述連接產(chǎn)物體系中加入純化預(yù)混液巧μ1/支），吹打混勻。
[0084] 37°C60min, 70°C30min進(jìn)行反應(yīng)。
[0085] (2. 3)然后，按照拼接組裝前10個(gè)模塊相同的方式對(duì)除最后一個(gè)模塊W外的剩余 模塊（11~（N-1))拼接組裝。其中，若有m(m=N-11，且m為110的整數(shù)）個(gè)剩余 模塊，則選用P即SJm作為骨架質(zhì)粒替代P即S_A質(zhì)粒，酶切連接及PSN處理步驟同2. 1與 2. 2。
[0086] (2. 4)轉(zhuǎn)化材料準(zhǔn)備；LB液體培養(yǎng)基，1. 5ml離必管，42°C水浴，冰浴，LB抗性（壯 觀霉素）固體培養(yǎng)基，37°C震蕩搖床（225巧m/min)，37°C恒溫培養(yǎng)箱。
[0087] 轉(zhuǎn)化操作過(guò)程；提前半小時(shí)開(kāi)UV滅菌，并將感受態(tài)細(xì)胞值冊(cè)α)取出，于冰浴融化 開(kāi)；將10μ1連接產(chǎn)物加入50μ1感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴30min;42°C水浴熱激50s;冰上 靜置2min;加入500μ1無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩（225巧m/min)培養(yǎng)比，復(fù)蘇； 300化pm離必5min，棄400μ1上清，余液吹打混勻；取60μ1菌液涂布LB抗性（壯觀霉素） 固體培養(yǎng)基，37Γ恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。
[008引做菌體PCR檢測(cè)
[008引準(zhǔn)備PCR預(yù)混液：
[0090] dNTP mix(2.5mM) ]μ1 PCRiOxlwffer 2μ! pCR8"Fl 0'5μΙ pCR8-Ri 0,5μΙ rTaq ?),5μ1 ddH.O !4.5μ1
[00川其中，菌體PCR引物序列如下：
[0092]檢測(cè)引物pCR8_Fl;TTGATGCCTGGCAGTTCCCT(SEQIDNO;41)
[0093]檢測(cè)引物pCR8_Rl;CGAACCGAACAGGCTTATGT(沈QIDNO;42)
[0094] 挑取過(guò)夜培養(yǎng)后的單菌落于抗性（壯觀霉素）培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)（連續(xù)短 線），劃線用的槍頭于PCR預(yù)混液中吹打，混勻。按照W下反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。
[0095] 94°C/3min巧8-35 循環(huán)X(94°C/30S+55°C/30S+72°C/lmin45s)+72°C/lOmi n+12°C/ °°。
[009引PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1 %~1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0097] (4)測(cè)J序檢測(cè)
[0098] 挑?。?)中檢測(cè)確認(rèn)有目的片段的單菌落劃線菌體進(jìn)行搖菌（至少6ml，W保證質(zhì) 粒提取，測(cè)序及保菌的使用量），使用質(zhì)粒提取試劑盒（Omega)提取質(zhì)粒，按照Sanger測(cè)序 儀的操作說(shuō)明準(zhǔn)備測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)（參考序列 為；模塊序列與載體質(zhì)粒序列）。
[0099] 保存經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)質(zhì)粒序列正確的菌液，用于下一步的二次拼接組裝。
[0100] (5)二次拼接組裝
[0101] 取經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)序列正確的菌液（即連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物），提質(zhì)粒，（所得質(zhì)粒分別命 名為1~lOp即S_A組裝模塊質(zhì)粒、11~（N-l)p即SJm組裝模塊質(zhì)粒），測(cè)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行 二次拼接組裝。
[0102] 酶切連接體系：
[0103] ! 0 pFUS-A組裝模塊質(zhì)粒！50ng pFUSJBm組裝模塊質(zhì)粒 I50ng Esp 31 2μ.1 Τ4 DNA Ugase 2 μ! 14 DNA Hgase buffer 2μ} pLR__NG/HD/NFNN樸塊質(zhì)極 15艙g pTAL3 75ng 寺l·水至 2化ii
[0104] 酶切連接程序：
[010引 10 循環(huán)X(37°C/5min+16°C/10min)+37°C/15min+8(TC/5min+12°C/
[0106] 按照化4)所述的方法進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)篩選。
[0107] (6)菌體PCR及測(cè)序檢測(cè)
[010引按照（3)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌落PCR檢測(cè)，其中所用引物如下：
[0109] SeqTALEN日-1 ;catcgcgcaatgcactgac(SEQIDNO;43);
[0110] TAL_R2 ;ggcgacgaggtggtcgttgg(SEQIDNO;44)。
[01U] 菌落PCR的反應(yīng)體系與程序等與步驟（3)相同。
[0112]按照（4)所述的方法進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，并保存經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)質(zhì)粒序列正確的菌液。 [011引 （7)酶切連接
[0114] 選擇測(cè)序檢測(cè)正確的連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，使用質(zhì)粒提取試劑盒（Omega)提取質(zhì)粒，并 檢測(cè)質(zhì)粒濃度。
[0115] 將（6)中測(cè)序正確的PTAL3背景質(zhì)粒（載有組裝好的TALEN表達(dá)框）及 PCDNA3. 1 (-)表達(dá)載體進(jìn)行化〇1及Aflll雙酶切，分別回收TALEN表達(dá)框和PCDNA3. 1 (-) 背景質(zhì)粒載體片段，進(jìn)行連接。
[0116] 酶切體系：
[0117] NE投l)u瓶r2.i 2μL. Xhoi 0,5μ1 Aim 0.5μΙ 質(zhì)粒 化Ο 補(bǔ)齊至20μ1 巧?魏妨2如
[om] 連接體系：
[0119] T4 0ΝΛ liga.se 1μ1 Τ4 DNA ii辯se bu照r ΙμL pCDNAll(-)載體 1 μ;. ( 50ng) TALEN表達(dá)植 1.μ; ( 20執(zhí)：!g) 16 'C連接州。
[0120] 做轉(zhuǎn)化和測(cè)序驗(yàn)證
[0121] 按照化4)所述的方法進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，然后挑取單克隆菌體進(jìn)行雙酶 切驗(yàn)證，具體如下；挑單克隆菌體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，化〇1和AflII酶切驗(yàn)證，反應(yīng)體系同步驟 (7)中的酶切體系，酶切后用1%~1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。
[0122] (9)質(zhì)粒提取及保存
[0123] 將酶切驗(yàn)證正確的菌株提取質(zhì)粒，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>[0124] 經(jīng)上述構(gòu)建和驗(yàn)證得到的四組TALE化表達(dá)載體的表達(dá)框的編碼序列列表如下 (表 5):
[0125] 表 5
[0126]
[0127]
[0128] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)染及藥物篩選
[0129]U3T3-L1細(xì)胞系體外培養(yǎng)
[0130] (1)選用10%FBS的DF-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，必要時(shí)添加細(xì)胞因子FGF;
[0131] (2)細(xì)胞密度達(dá)到約80%傳代培養(yǎng)，忌細(xì)胞密度超過(guò)90%而出現(xiàn)接觸抑制；
[0132] (3)轉(zhuǎn)染之前，細(xì)胞密度在80 %左右為宜，且倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞應(yīng)邊緣清 晰、形態(tài)清楚、飽滿透亮。
[013引2、分別使用表4所列的四組表達(dá)載體質(zhì)粒和脂質(zhì)體（lipofectamine2000)共轉(zhuǎn) 染3T3-L1細(xì)胞化孔板）。
[0134](1)細(xì)胞換上2ml的新鮮培養(yǎng)基（含10%FBS的DF-12)，培養(yǎng)基預(yù)先預(yù)熱。
[0135] (2)在1. 5ml的EP管中，