背景tigit(含ig和itim結(jié)構(gòu)域的t細胞免疫受體)是一種共-抑制性受體蛋白，亦稱為wucam、vstm3或vsig9。tigit在對t細胞上特異性表達的蛋白的基因組研究中被發(fā)現(xiàn)，和具有免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和免疫受體酪氨酸抑制基序(itim)，和包含pvr蛋白家族的標記序列元件。其已知與脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(pvr;cd155)和與nectin2(cd112)相互作用。參見例如stengeletal.(2012)proc.nat’lacad.sci.(usa)19:5399;wo2006/124667;wo2009/126688。盡管pvr可與共活化受體dnam-1(cd226)相互作用以增強腫瘤殺傷，但高親和力tigit/pvr相互作用會抑制這樣的殺傷，可用于阻止也表達pvr的正常(自身)細胞的殺傷。stanietskyetal.(2009)proc.nat’lacad.sci.(usa)106:17858。這種抑制性相互作用的優(yōu)勢可能在抑制抗-自身免疫反應(yīng)中是重要的，但在腫瘤情況下其抑制腫瘤根除。同前。tigit通過促進成熟免疫調(diào)節(jié)性樹突細胞的產(chǎn)生來抑制t細胞活化。yuetal.(2009)nat.immunol.10:48。tigit和其它這樣的共-抑制性分子(例如，ctla-4、pd-1、lag3和btla)可在腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視中起作用。實驗表明，pvr/cd155在黑素瘤細胞上(inozumeetal.(2014)j.invest.dermatol.134:s121-abstract693)和在各種其它腫瘤上過表達?？赡艿氖?，tigit/pvr相互作用可通過抑制t和nk細胞的抗-腫瘤反應(yīng)，保護這樣的腫瘤細胞免于免疫介導(dǎo)的根除。stanietskyetal.(2009)proc.nat’lacad.sci.(usa)106:17858和lozanoetal.(2012)j.immunol.188:3869。其它實驗已鑒定了調(diào)節(jié)t細胞(tregs)的tigit+亞組，其選擇性抑制th1和th17反應(yīng)(jolleretal.(2014)immunity40:569)，表明抗-tigit抗體可增強抗-腫瘤免疫反應(yīng)的備選機制。類似于其它共-抑制性受體例如ctla-4、pd-1和btla，tigit可起“關(guān)閉”免疫反應(yīng)的作用。同前。靶向ctla-4(ipilimumab)和pd-1(nivolumab、pembrolizumab)的抗體已被批準用于治療人癌癥，證實了這種治療途徑。結(jié)合人tigit的抗體也可用于治療癌癥。參見例如wo2006/124667。在小鼠模型中，pd-l1和tigit二者的抗體阻斷導(dǎo)致協(xié)同提高cd8+t細胞介導(dǎo)的腫瘤排斥。groganetal.(2014)j.immunol.192(1)suppl.203.15;johnstonetal.(2014)cancercell26:1-15。在黑素瘤的動物模型中得到類似結(jié)果。inozumeetal.(2014)j.invest.dermatol.134:s121-abstract693。一些實驗表明，僅在與tigit競爭結(jié)合pvr/cd155的共活化受體dnam-1/cd226的存在下，tigit阻斷有效增強抗-腫瘤cd8+t細胞反應(yīng)。johnstonetal.(2014)cancercell26:1-15。最近的實驗證實了腫瘤內(nèi)細菌表達的fap2蛋白可通過結(jié)合tigit來抑制nk細胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷(guretal.(2015)immunity42:344)，表明清除這樣的細菌，阻斷tigit與fap2的相互作用，或總體上阻斷tigit的活性，可用于治療癌癥，例如，結(jié)腸直腸癌。hampton(2015)jama313:1305。對治療癌癥和慢性病毒感染的改進方法，和用于所述方法的藥物例如治療性單克隆抗體，存在需要。用于這樣的改進的治療方法的藥物可包含特異性結(jié)合tigit和逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)tigit-介導(dǎo)的抗-腫瘤或抗-病毒免疫反應(yīng)的抑制的抗體或抗體片段。發(fā)明簡述本發(fā)明提供用于癌癥和慢性病毒感染的改進的藥物和治療方法，其包含結(jié)合hutigit的抗體或其抗原-結(jié)合片段。本文提供了分離的抗體，例如單克隆抗體，特別是人單克隆抗體，其特異性結(jié)合hutigit和具有需要的功能性質(zhì)，例如特異性結(jié)合hutigit、結(jié)合猴tigit(例如，食蟹猴tigit)的高親和力，阻斷tigit與pvr和/或nectin-2的結(jié)合的能力，阻斷tigit與dnam的相互作用的能力，或這些性質(zhì)的任何組合。本發(fā)明進一步提供治療癌癥的改進方法和用于所述方法的治療性抗體，包括其中tigit-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)抑制抗-腫瘤免疫反應(yīng)的癌癥、其中tigit與共活化受體dnam-1/cd226相互作用抑制抗-腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤、其中表達tigit的調(diào)節(jié)t細胞抑制抗-腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤，或其中tigit否則會抑制抗-腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤。本發(fā)明還提供用于治療其中tigit抑制抗-病毒免疫反應(yīng)的慢性病毒感染的方法和治療性抗體。在另一個方面，本發(fā)明涉及與具有本文公開的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的抗體競爭結(jié)合hutigit和/或交叉阻斷具有本文公開的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的抗體與hutigit結(jié)合的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段增強抗-腫瘤免疫反應(yīng)，例如，抗原-特異性t細胞反應(yīng)。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷tigit介導(dǎo)的抑制性信號傳導(dǎo)，允許pvr/dnam共刺激nk細胞，以增加nk-介導(dǎo)的抗-腫瘤反應(yīng)殺傷。在又一實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段減少否則會抑制抗-腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤內(nèi)的調(diào)節(jié)t細胞群。在又一實施方案中，形式為igg1的本發(fā)明的抗-tigit抗體減少cd8+耗盡的t細胞和tregs，允許流入新的未耗盡cd8+t細胞。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段通過一種或多種上述機制起作用，因為這些機制不必然互相排斥。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段不結(jié)合活化fcγ受體(fcγr)，例如，在依賴于提高tigit-表達細胞的抗-腫瘤活性的實施方案中。在備選的實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合一種或多種活化fcγr，例如，在依賴于殺傷tigit-表達細胞，例如耗盡cd8+t細胞或tregs的實施方案中。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體(15a6)或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合hutigit和包含重鏈cdrh1、cdrh2和cdrh3序列(分別包含seqidno:14、15和16)和/或輕鏈cdrl1、cdrl2和cdrl3序列(分別包含seqidno:17、18和19)。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體(22g2)或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合hutigit和包含重鏈cdrh1、cdrh2和cdrh3序列(分別包含seqidno:20、21和22)和/或輕鏈cdrl1、cdrl2和cdrl3序列(分別包含seqidno:23、24和25)。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體(11g11)或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合hutigit和包含重鏈cdrh1、cdrh2和cdrh3序列(分別包含seqidno:26、27和28)和/或輕鏈cdrl1、cdrl2和cdrl3序列(分別包含seqidno:29、30和31)。本發(fā)明還進一步提供分離的單克隆抗體(10d7)或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合hutigit和包含重鏈cdrh1、cdrh2和cdrh3序列(分別包含seqidno:32、33和34)和/或輕鏈cdrl1、cdrl2和cdrl3序列(分別包含seqidno:35、36和37)。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合hutigit和包含以seqidno:2(或3、4、5)和6；seqidno:7(或8)和9；seqidno:10和11；和seqidno:12和13公開的可變重鏈和可變輕鏈序列。本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合hutigit和包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)包含與選自seqidno:2、3、4、5、7、8、10和12的氨基酸序列具有至少90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合hutigit和包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中輕鏈可變區(qū)包含與選自seqidno:6、9、11和13的氨基酸序列具有至少90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，(a)結(jié)合在hutigit上與15a6、22g2、11g11和/或10d7相同的表位，和/或(b)抑制15a6、22g2、11g11和/或10d7與hutigit的結(jié)合，如通過例如facs或elisa所測量的。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合包含hutigit(seqidno:1)的殘基e60、i109、l65、n70、f107、t117、i68、h76和n58的一個或多個或由其組成的表位(抗體22g2)、包含殘基g74、n70、h76、l65、l73、q56、i68、h111和p114的一個或多個或由其組成的表位(抗體11g11)，或包含殘基h76、g74、l65、n58、i68、q139、g135、l73、f107、n70、e60、h134、a132和i109的一個或多個或由其組成的表位(抗體15a6)。或者，本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合包含選自nweqqdqllaicnadlgwh(seqidno:38)和fciyhtypdgt(seqidno:39)(抗體22g2)，或選自qvnweqqdqllaicnadlgwh(seqidno:40)和htyp(seqidno:41)(抗體11g11)，或選自nweqqdqllaicnadlgwh(seqidno:38)、fci和aehgarfq(seqidno:43)(抗體15a6)的一個或多個序列或由其組成的表位。在還進一步的實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合hutigit(seqidno:1)上的包含殘基l65、i68、n70和h76的一個或多個或由其組成的核心表位；和/或包含llaicnadlgwh(seqidno:44)或由其組成的表位。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段還結(jié)合食蟹猴tigit。在各個實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段是人igg1、igg2、igg3或igg4抗體，或其變體。在某些實施方案中，包括但不限于阻斷“耗盡的”腫瘤-特異性t細胞中的tigit信號傳導(dǎo)或阻斷允許dnam-1/pvr-介導(dǎo)的共刺激的nk細胞上的抑制性信號的方法，或阻斷tigit與dnam-1/cd226相互作用以減少dnam-1同源二聚化的方法，抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段包含無效或幾乎無效的fc。這樣的fc區(qū)包括例如，人igg2或igg4，或人igg1的無效變體，具有一個或多個以下突變：l234a,l235e,g237a,a330s和p331s(eu編號)，包括包含所有5個所列突變的igg1.1f(seqidno:48)。在備選的實施方案中，包括但不限于耗盡tigit+調(diào)節(jié)t細胞的方法，抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段包含優(yōu)先結(jié)合活化fcγr(fcγri、fcγriia或fcγriiia)的fc，例如人igg1，或相對于野生型igg1fc，與活化fcγr的結(jié)合增強的序列變體。在涉及使用igg1形式的本發(fā)明的抗-tigit抗體以驅(qū)動tregs的減少的實施方案中，腫瘤內(nèi)注射可任選地用于將效果定位于腫瘤微環(huán)境，使由在周圍組織中的活性引起的潛在副作用最小化。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體的cdr區(qū)中的甲硫氨酸殘基(例如，seqidno:34，10d7的cdrh3中的m115)或其抗原-結(jié)合片段被不經(jīng)歷氧化的氨基酸殘基置換。在某些實施方案中，競爭結(jié)合、交叉阻斷或結(jié)合與15a6、22g2、11g11或10d7或其抗原-結(jié)合片段相同的表位的抗-hutigit抗體是人或人源化抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體不是美國專利申請公開號2009/0258013中描述的抗體，或不結(jié)合與美國專利申請公開號2009/0258013中描述的抗體相同的表位，例如，它們不結(jié)合與抗-hutigitmab10a7或1f4相同的表位。亦參見johnstonetal.(2014)cancercell26:1;yuetal.(2009)nat.immunol.10:48。在其它實施方案中，抗-hutigit抗體包含源自與本文公開的抗體相同的人v結(jié)構(gòu)域種系序列的可變結(jié)構(gòu)域，包括重鏈v結(jié)構(gòu)域v4-39、v4-61或v1-69。在更具體的實施方案中，抗-hutigit抗體包含源自與本文公開的抗體相同的人重鏈和輕鏈v結(jié)構(gòu)域種系序列的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，例如v4-39/va27(15a6)、v4-61/vl6(22g2)、v4-39/vl6(11g11)和v1-69/vl15(10d7)。在各種實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體以小于10nm、5nm、2nm、1nm、300pm或100pm的kd結(jié)合hutigit。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體以2nm-100pm的kd結(jié)合hutigit。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體基本上由抗體15a6、22g2、11g11和10d7的cdr的某種組合組成，或包含抗體15a6、22g2、11g11和10d7的cdr的某種組合，例如cdrh1(seqidno:14,20,26和32);cdrh2(seqidno:15,21,27和33);cdrh3(seqidno:16,22,28和34);cdrl1(seqidno:17,23,29和35);cdrl2(seqidno:18,24,30和36)；和cdrl3(seqidno:19,25,31和37)。在其它實施方案中，抗體基本上由抗體15a6、22g2、11g11和10d7的cdr序列的單獨的特定組合組成，或包含抗體15a6、22g2、11g11和10d7的cdr序列的單獨的特定組合。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體基本上由抗體15a6(seqidno:2-5和6),22g2(seqidno:7-8和9),11g11(seqidno:10和11)和10d7(seqidno:12和13)的重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或與這些公開的序列共有至少80%,85%,90%和95%序列同一性的序列組成，或包含所述序列。在還進一步的實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體基本上由包含抗體15a6(seqidno:2-5和6),22g2(seqidno:7-8和9),11g11(seqidno:10和11)和10d7(seqidno:12和13)的可變結(jié)構(gòu)域序列的重鏈和/或輕鏈，或與這些公開的序列共有至少80%,85%,90%和95%序列同一性的序列組成，或包含所述序列。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以雙特異性分子存在，其還包含特異性結(jié)合不同的免疫調(diào)節(jié)受體，包括但不限于pd-1、ctla-4或lag3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的核酸，包含所述核酸分子的表達載體，用所述表達載體轉(zhuǎn)化的細胞，和通過表達用表達載體轉(zhuǎn)化的細胞和回收抗體的而產(chǎn)生抗體方法。本發(fā)明還提供包含與試劑例如可檢測標記或細胞毒性劑連接的本文所述的抗-hutigit抗體的免疫綴合物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段和載體的藥物組合物。本文還提供了包含抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段和使用說明書的藥劑盒。在另一個方面，本發(fā)明提供增強抗原-特異性t細胞反應(yīng)的方法，包括使t細胞與本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，使得抗原-特異性t細胞反應(yīng)得到增強，例如，通過減少否則會抑制抗-腫瘤反應(yīng)的抑制性信號。在一些實施方案中，抗原-特異性t細胞是腫瘤-抗原特異性效應(yīng)t細胞，例如cd8+t細胞，和所述增強，例如通過阻斷tigit-介導(dǎo)的抑制性作用，導(dǎo)致抗-腫瘤活性增加。本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原-結(jié)合片段還可減少nk細胞中的抑制性信號，因此增加它們的抗-腫瘤活性。不意欲受理論的限制，本發(fā)明的抗-hutigit抗體通過阻斷tigit與pvr的結(jié)合，從而減少或消除否則會傳遞至細胞的抑制性信號，來增加效應(yīng)t細胞或nk細胞功能。或者，或另外，本發(fā)明的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段可抑制tigit和dnam-1/cd226之間的相互作用，其否則會減少dnam-1-介導(dǎo)的免疫活化。本發(fā)明還提供增加t細胞中的il-2和/或ifn-γ產(chǎn)生，和/或t細胞的增殖的方法，包括使t細胞與有效量的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在另一個方面，本發(fā)明提供減少或耗盡有需要的受試者的腫瘤中的tregs的方法，包括給予有效量的本發(fā)明的抗-hutigit抗體，其中所述抗體具有效應(yīng)子功能或增強的效應(yīng)子功能，以減少腫瘤中的tregs的數(shù)量。本發(fā)明提供在受試者中增強免疫反應(yīng)的方法，包括給予受試者有效量的本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段，使得受試者的免疫反應(yīng)得到增強。在某些實施方案中，受試者具有腫瘤，和針對腫瘤的免疫反應(yīng)得到增強。在另一個實施方案中，受試者具有病毒感染，和抗-病毒免疫反應(yīng)得到增強。本發(fā)明還提供了在受試者中抑制腫瘤生長的方法，包括給予受試者本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段，使得腫瘤生長得到抑制。本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法，例如通過免疫療法，包括給予有需要的受試者治療有效量的本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段，例如，作為藥物組合物，從而治療癌癥。在某些實施方案中，癌癥是膀胱癌、乳腺癌、子宮/宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食管癌、胃腸癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相關(guān)的癌癥。在某些實施方案中，癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥、難治性癌癥或復(fù)發(fā)性癌癥。在某些實施方案中，本文所述的調(diào)節(jié)免疫功能的方法和治療方法包括給予本發(fā)明的抗-hutigit抗體與一種或多種另外的治療劑的組合或作為含一種或多種另外的治療劑的雙特異性試劑給予，所述另外的治療劑例如抗-pd-1抗體、抗-pd-l1抗體、抗-lag3抗體、抗-gitr抗體、抗-ox40抗體、抗-cd73抗體、抗-cd40抗體、抗-cd137mab、抗-cd27mab、抗-csf-1r抗體和/或抗-ctla-4抗體、tlr激動劑或ido或tgfβ的小分子拮抗劑。在特定的實施方案中，抗-hutigit療法與抗-pd-1和/或抗-pd-l1療法，例如，用結(jié)合人pd-1的抗體或其抗原結(jié)合片段或結(jié)合人pd-l1的抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合。在一些實施方案中，篩選來自患者的樣品，例如，活檢樣品中t細胞或nk細胞上的dnam-1表達，以選擇最可能對抗-tigit療法有響應(yīng)的患者，其中t細胞上存在dnam-1表明在抗-tigit療法，例如，用本發(fā)明的抗-hutigit抗體或片段治療時患者將具有有益的抗-腫瘤反應(yīng)，和dnam-1的不存在鑒定不太可能自抗-tigit療法獲益的患者。在其它實施方案中，篩選來自患者的樣品中腫瘤細胞或腫瘤侵潤骨髓細胞上的pvr和/或nectin-2表達，以選擇最可能對抗-tigit療法有響應(yīng)的患者，其中存在pvr和/或nectin-2表明在抗-tigit療法，例如，用本發(fā)明的抗-hutigit抗體或片段治療時患者將具有有益抗-腫瘤反應(yīng)，和pvr和/或nectin-2/cd112的不存在鑒定不太可能自抗-tigit療法獲益的患者。在各個實施方案中，tigit、dnam、pvr和/或nectin-2的細胞-表面表達通過facs、ihc或lc-ms確定。在另一個方面，本發(fā)明提供治療有需要的受試者的方法，包括如本文所述確定tigit、dnam、pvr和/或nectin-2的細胞-表面表達，和優(yōu)先或排他地給予最可能獲得治療益處的那些受試者本發(fā)明的抗-tigit抗體。在一個實施方案中，在考慮用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療的受試者中測量可溶性pvr和/或可溶性nectin-2(spvr、snectin-2)的水平，和只有顯示可溶性pvr和/或nectin-2升高的受試者用所述抗體治療。在一些實施方案中，在血清中通過elisa或lc-ms檢測spvr和/或snectin-2。本發(fā)明還提供在樣品中、在樣品內(nèi)的細胞上(例如，facs)或在細胞或組織的特定位置(例如，ihc)檢測tigit的存在的方法，或基于在細胞表面上tigit的存在或不存在來分選細胞的方法(例如，facs)，包括在允許在抗體或其抗原結(jié)合片段和tigit之間形成復(fù)合物的條件下使樣品與本發(fā)明的抗-hutigit抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，和檢測復(fù)合物的形成。在一些實施方案中，用于檢測的抗-tigit抗體與可檢測標記綴合。根據(jù)以下詳細描述和實施例(其不應(yīng)視為限制性的)，本公開內(nèi)容的其它特征和優(yōu)點將是明顯的。附圖簡述圖1顯示“框并(binning)”實驗的示意圖，其中配對測試了本發(fā)明的各種抗-hutigit抗體阻斷其它抗體與hutigit的結(jié)合的能力。結(jié)果表明抗體落入有限數(shù)量的類別或或“框”中。見實施例3。圖2a、2b和2c顯示hutigit序列變體分別與抗體22g2、11g11和15a6結(jié)合的酵母展示數(shù)據(jù)。在成熟hutigit中的各個氨基酸殘基的殘基編號沿橫坐標提供。殘基編號比seqidno:1的編號小21，因為該序列表包括未包括在圖中的信號肽。如實施例4所述的，展示hutigit的序列變體的酵母基于它們不能結(jié)合各自的抗體(22g2,11g11,15a6)而選擇。因此，沿hutigit序列的對于抗體結(jié)合是關(guān)鍵的位置以高頻率出現(xiàn)(即，在縱坐標上升起的條柱/線)，因為它們在未-結(jié)合酵母克隆庫中的過度表現(xiàn)。在各殘基處變體(非野生型)殘基出現(xiàn)的頻率在縱坐標上提供(對數(shù)標度)，每個殘基一個條柱(線)。將頻率數(shù)據(jù)標準化至在未選擇的文庫(即尚未基于不能結(jié)合本發(fā)明的抗-hutigit抗體進行選擇的文庫)中在各位置處變體殘基出現(xiàn)的頻率。參見實施例4。圖3顯示抗-tigitmab22g2對溶胞的作用，表示為表達人pvr的細胞被人nk細胞特異性溶胞的百分比。參見實施例5。對于各抗體，左條柱是野生型p815細胞和右條柱是表達人pvr的p815細胞。圖4a顯示健康人供體血液用抗原肽的混合物(cetf=來自cmv、ebv、流感和破傷風(fēng)的肽)處理誘導(dǎo)cd8+t細胞上pd-1和tigit的上調(diào)。“nostim”樣品未用ceft處理，而“stim”樣品用ceft處理。圖4b顯示抗-tigitmab和/或抗-pd-1mab對來自用cetf刺激的4份健康人供體血液樣品的ifnγ表達的作用。參見實施例6。圖5a和5b顯示在小鼠模型中抗-tigit抗體單獨或與其它免疫調(diào)節(jié)療法組合對腫瘤生長的作用。圖5a顯示用以下抗體處理的小鼠的ct26小鼠結(jié)腸癌模型的腫瘤體積(立方毫米)，其通過腫瘤寬度的平方乘以長度的一半來計算：具有效應(yīng)子功能激活的鼠igg2afc結(jié)構(gòu)域的抗-小鼠tigit抗體(“tigitg2a”)、具有效應(yīng)子功能缺陷的igg1d265afc結(jié)構(gòu)域的抗-小鼠tigit抗體(“tigitg1d265a”)、具有效應(yīng)子功能缺陷的igg1d265afc結(jié)構(gòu)域的抗-小鼠pd-1抗體(“pd-1g1d265a”)、其組合，或?qū)φ読gg1抗體。圖5b顯示抗-tigit單一療法以及與抗-pd-1和抗-ctla-4抗體的組合療法的作用。提供腫瘤體積以及實驗結(jié)束時各組10只小鼠中無腫瘤(tf)小鼠的數(shù)量。每條線代表一只小鼠。migg1同種型對照未得到無腫瘤小鼠，作為單一療法的抗-tigit也是如此?？?pd-1作為單一療法得到一只無腫瘤小鼠，當(dāng)與抗-tigit組合時得到五只?？?ctla-4作為單一療法得到三只無腫瘤小鼠，和當(dāng)與抗-tigit組合時得到六只。參見實施例7。圖6a和6b顯示癌癥組織中pvr表達升高。圖6a顯示各腫瘤類型中的pvrmrna表達，如在thecancergenomeatlas(tcga)數(shù)據(jù)集中檢測的。提供腎上腺皮質(zhì)癌(acc)、不染色腎細胞癌(kich)、肝臟肝細胞癌(lihc)、結(jié)腸和直腸腺癌(coad、read)、胰管腺癌(paad)、嗜鉻細胞瘤和神經(jīng)節(jié)細胞瘤(pcpg)、乳頭狀腎癌(kirp)、肺腺癌(luad)、頭頸鱗狀細胞癌(hnsc)、甲狀腺腺癌(prad)、子宮內(nèi)膜癌(ucec)、宮頸癌(cesc)、皮膚黑素瘤(skcm)、間皮瘤(meso)、尿道上皮膀胱癌(blca)、透明細胞腎癌(kirc)、肺鱗狀細胞癌(lusc)、子宮癌肉瘤(ucs)、肉瘤(sarc)、卵巢漿液性囊腺癌(ov)、乳頭狀甲狀腺癌(thca)、多形性成膠質(zhì)細胞瘤(gbm)、乳腺癌(brca)、輕度膠質(zhì)瘤(lgg)和彌散性大b-細胞淋巴瘤(dlbc)的數(shù)據(jù)。此處公開的結(jié)果整體上或部分基于tcgaresearchnetwork產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。圖6b顯示與正常結(jié)腸上皮組織相比，結(jié)腸腺癌組織中的人pvr，腺癌樣品中較深色區(qū)域指示pvr表達升高。參見實施例9。圖7顯示形式為igg1f(seqidno:45)或igg1.1f(seqidno:48)的抗-tigitmab22g2的fcγ受體結(jié)合，表示為理論最大受體結(jié)合值(rmax)的百分比。對于兩個不同批次的igg1.1f抗體(按所示以10μm和1μm使用)，提供6種不同的fcγ受體的數(shù)據(jù)。在各條柱群中，按左到右的順序提供fcγ受體的數(shù)據(jù)：hcd64(fcγri);hcd32a-h131(fcγriia-h131);hcd32a-r131(fcγriia-r131);hcd32b(fcγriib);hcd16a-v158(fcγriiia-v158);和hcd16b-na2(fcγriiib-na2，其中na2表示為同種異型變體)。盡管fcγ受體對以相同的條柱表示，但根據(jù)提供它們的順序，它們的身份是清楚的。對于與食蟹猴fcγ受體cd64、cd32a、cd32b和cd16(未顯示)的結(jié)合，觀察到相同的降低。詳細描述本發(fā)明公開了分離的抗體，特別是單克隆抗體，例如，人單克隆抗體，其特異性結(jié)合人tigit(“hutigit”)和阻斷與pvr/cd155結(jié)合，從而減少或消除否則會在tigit-表達細胞中發(fā)生的免疫抑制性信號。本發(fā)明還提供分離的抗體，特別是單克隆抗體，例如，人或人源化單克隆抗體，其特異性結(jié)合人tigit和阻斷否則會阻止dnam-1同源二聚化和因此阻止dnam-1-介導(dǎo)的共刺激的人tigit與dnam-1/cd226的相互作用。提供各種人抗-hutigit單克隆抗體的序列。在某些實施方案中，本文描述的抗體源自特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征例如包含特定的氨基酸序列的cdr區(qū)。本文還提供了制備這樣的抗體的方法，包含這樣的抗體或其抗原-結(jié)合片段的免疫綴合物和雙特異性分子，和經(jīng)配制以包含所述抗體或片段的藥物組合物。本文還提供了使用單獨或與其它免疫刺激劑(例如，抗體)和/或癌癥或抗-感染療法組合的所述抗體增強免疫反應(yīng)的方法。因此，本文描述的抗-hutigit抗體可在各種治療性應(yīng)用中用于治療，包括例如，抑制腫瘤生長和治療慢性病毒感染。定義為了本說明書可以更易于理解，首先定義某些術(shù)語。其它定義在整個詳細描述中闡明。tigit稱為"含ig和itim結(jié)構(gòu)域的t細胞免疫受體"，其為免疫球蛋白的pvr(脊髓灰質(zhì)炎病毒受體)家族的成員，其結(jié)合pvr/cd155和nectin-2/cd112。tigit亦稱為tigit、wucam、vstm3和vsig9。除非另外指明，或自上下文清楚的是，本文提及tigit是指人tigit(“hutigit”)，和抗-tigit抗體是指抗-人tigit抗體。人tigit還稱為geneidno:201633和mim(mendelianinheritanceinman):612859。包括21個氨基酸信號序列的人tigit(np_776160.2)的序列以seqidno:1提供。除非另外指明，或自上下文清楚的是，tigit的“抑制”是指阻斷pvr結(jié)合和信號傳導(dǎo)。本發(fā)明的抗-tigit抗體可通過抑制tigit信號傳導(dǎo)、阻斷tigit/dnam-1相互作用和/或其它機制，例如指導(dǎo)調(diào)節(jié)t細胞的減少來起作用。pvr(脊髓灰質(zhì)炎病毒受體)與tigit相互作用以產(chǎn)生免疫抑制性信號。pvr亦稱為pvs;hved;cd155;necl5;tage4;necl-5。除非另外指明，或自上下文清楚的是，本文提及pvr/cd155是指人pvr(“hupvr”)。人pvr還稱為geneidno:5817和mim:173850。存在四種已知的人pvr轉(zhuǎn)錄物變體：α(np_006496.4)、β(np_001129240.1)、γ(np_001129241.1)和δ(np_001129242.2)，其序列以seqidno:50–53提供。除非另外指明，提及pvr或人pvr涉及α轉(zhuǎn)錄物多肽。除非另外指明或自上下文清楚的是，本文使用的術(shù)語“抗體”可包括整個抗體和其任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原-結(jié)合部分”)或單一鏈。在一個實施方案中，“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接的至少兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合片段。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文簡稱為vh)和重鏈恒定區(qū)。在某些天然存在的igg、igd和iga抗體中，重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域，ch1、ch2和ch3。在某些天然存在的抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為vl)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域，cl。vh和vl區(qū)可進一步細分為超變性的區(qū)域，稱為互補決定區(qū)(cdr)，其與稱為框架區(qū)(fr)的較保守的區(qū)域交替。各vh和vl包含三個cdr和四個框架區(qū)(fr)，從氨基端至羧基端按以下順序排列：fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(clq)結(jié)合?？贵w通常以高親和力特異性結(jié)合它們的相關(guān)抗原，反映為10-7-10-11m或更小的離解常數(shù)(kd)。大于約10-6m的任何kd一般視為指示非特異性結(jié)合。如本文使用的，"特異性結(jié)合"抗原的抗體是指以高親和力結(jié)合抗原和基本上相同的抗原的抗體，其意思是具有10-7m或更小、優(yōu)選地10-8m或更小、甚至更優(yōu)選地5x10-9m或更小和最優(yōu)選地10-8m-10-10m或更小的kd，但不以高親和力結(jié)合不相關(guān)的抗原。如果抗原顯示與給定的抗原高程度的序列同一性，例如，如果抗原顯示與給定的抗原的序列至少80%、至少90%、優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少97%或甚至更優(yōu)選地至少99%序列同一性，則所述抗原與給定的抗原"基本上相同"。例如，特異性結(jié)合人tigit的抗體也可能與來自某些非人靈長類物種(例如，食蟹猴)的tigit交叉反應(yīng)，但可能與來自其它物種的tigit，或與并非tigit的抗原不交叉反應(yīng)?？贵w可顯示n-和/或c-末端氨基酸殘基的修飾。例如，本發(fā)明的抗體可自編碼例如重鏈上c-末端賴氨酸殘基的構(gòu)建體產(chǎn)生，但這樣的c-末端賴氨酸可在出售或給予的治療性抗體中部分地或全部地缺失?；蛘?，抗體可自明確不編碼c-末端賴氨酸殘基的構(gòu)建體產(chǎn)生，即使這樣的賴氨酸存在于治療性抗體所來源的親本抗體中。在另一個實例中，本發(fā)明的抗體中的n-末端谷氨酰胺或谷氨酸殘基可在出售或給予的治療性抗體中部分地或完全轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。抗體鏈的n-末端存在的任何形式的谷氨酰胺或谷氨酸，包括焦谷氨酸，包括在本文使用的術(shù)語“谷氨酰胺”內(nèi)。因此，本文提供的具有n-末端谷氨酰胺或谷氨酸殘基的抗體鏈序列包括不考慮焦谷氨酸形成水平的抗體鏈。除非另外指明，免疫球蛋白可來自任何通常已知的同種型，包括但不限于iga、分泌性iga、igg和igm。igg同種型在某些物種中分為亞類：在人中igg1、igg2、igg3和igg4，和在小鼠中igg1、igg2a、igg2b和igg3。免疫球蛋白，例如，人igg1，以若干同種異型存在，其在至多幾個氨基酸上彼此不同。除非另外指明，"抗體"可包括例如，單克隆和多克隆抗體；嵌合和人源化抗體；人和非-人抗體；全合成抗體；和單鏈抗體。本文使用的術(shù)語抗體的“抗原-結(jié)合部分”或“抗原結(jié)合片段”是指抗體的一個或多個片段，其保留特異性結(jié)合抗原(例如，人tigit)的能力。術(shù)語抗體的“抗原-結(jié)合部分/片段”內(nèi)包括的結(jié)合片段的實例包括(i)fab片段–由vl,vh,cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)f(ab')2片段–包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體的單臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段，和(v)由vh結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(wardetal.,(1989)nature341:544-546)。分離的互補決定區(qū)(cdr)或通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的cdr的組合，如果能夠結(jié)合抗原，則可包含抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。單鏈抗體構(gòu)建體也包括在本發(fā)明中。盡管fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh，由單獨的基因編碼，但它們可使用重組方法通過合成接頭連接，使它們能夠作為單一蛋白鏈制備，其中vl和vh區(qū)配對以形成稱為單鏈fv(scfv)的單價分子；參見例如，birdetal.(1988)science242:423-426;和hustonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原-結(jié)合部分/片段”內(nèi)。這些和其它可能的構(gòu)建體描述于chan&carter(2010)nat.rev.immunol.10:301。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，和以與完整抗體相同的方式篩選片段的功效?？乖?結(jié)合部分/片段可通過重組dna技術(shù)，或通過酶或化學(xué)裂解完整免疫球蛋白產(chǎn)生。除非另外指明，詞語“片段”當(dāng)涉及抗體而使用時，例如在權(quán)利要求中，是指抗體的抗原結(jié)合片段，使得“抗體或片段”與“抗體或其抗原結(jié)合片段”具有相同的含義?！半p特異性”或“雙功能抗體”是具有兩個不同的重鏈/輕鏈對的人工雜合抗體，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點，具有對不同的抗原的特異性。雙特異性抗體可通過各種方法產(chǎn)生，包括雜交瘤的融合或fab'片段的連接。參見例如，songsivilai&lachmann(1990)clin.exp.immunol.79:315;kostelnyetal.(1992)j.immunol.148:1547。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力的抗體，或其中所有抗體顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力的抗體組合物。通常，這樣的單克隆抗體源自單一細胞或編碼抗體的核酸，和在沒有有意引入任何序列改變的情況下傳代。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和任選的恒定區(qū)的單克隆抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體通過雜交瘤產(chǎn)生，例如通過融合獲自轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物(例如，具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠)的b細胞至永生細胞而獲得。本文使用的術(shù)語“重組人抗體”，包括通過重組方式制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如，小鼠)或從中制備的雜交瘤分離的抗體，(b)自經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達抗體的宿主細胞，例如，轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)自重組的組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)通過涉及人免疫球蛋白基因序列剪接至其它dna序列的任何其它方式制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體包含可變區(qū)和恒定區(qū)，其利用由種系基因編碼的特定的人種系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗體成熟期間發(fā)生的后續(xù)重排和突變。如本領(lǐng)域已知的(參見例如，lonberg(2005)naturebiotech.23(9):1117-1125)，可變區(qū)包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其由各種基因編碼，所述基因經(jīng)重排以形成對外源抗原特異性的抗體。除了重排之外，可變區(qū)可進一步通過多個單氨基酸變化被修飾(稱為體細胞突變或超突變)以增加抗體對外源抗原的親和力。恒定區(qū)將在對抗原的進一步反應(yīng)中變化(即，同種型變換)。因此，在對抗原的反應(yīng)中重排和體細胞突變的編碼輕鏈和重鏈免疫球蛋白多肽的核酸序列可與原始種系序列不同，而是基本上相同或類似(即，具有至少80%同一性)。"人"抗體(humab)是指具有可變區(qū)的抗體，其中框架區(qū)和cdr區(qū)二者均源自人種系免疫球蛋白序列。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包括并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或定點誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，本文使用的術(shù)語"人抗體"不意欲包括其中源自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的cdr序列已被移植到人框架序列的抗體。術(shù)語"人"抗體和"完全人"抗體同義使用。"人源化"抗體是指其中非人抗體，例如小鼠抗體的cdr結(jié)構(gòu)域外的一些、大部分或所有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相應(yīng)的氨基酸置換的抗體。在人源化形式的抗體的一個實施方案中，cdr結(jié)構(gòu)域外的一些、大部分或所有的氨基酸被來自人免疫球蛋白的氨基酸置換，而一個或多個cdr區(qū)內(nèi)的一些、大部分或所有的氨基酸未改變。氨基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾是允許的，只要它們不廢除抗體結(jié)合特定抗原的能力。"人源化"抗體保留類似于原始抗體的抗原特異性。"嵌合抗體"是指其中可變區(qū)源自一個物種和恒定區(qū)源自另一個物種的抗體，例如其中可變區(qū)源自小鼠抗體和恒定區(qū)源自人抗體的抗體?！半s合”抗體是指具有不同類型的重鏈和輕鏈的抗體，例如小鼠(親本)重鏈和人源化輕鏈，或反之亦然。如本文使用的，"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如，igg1,igg2,igg3,igg4,igm,iga1,iga2,igd和ige抗體)?！巴N異型”是指在特定的同種型組內(nèi)天然存在的變體，所述變體在一個或幾個氨基酸上不同。參見例如，jefferisetal.(2009)mabs1:1。短語"識別抗原的抗體"和"對抗原特異性的抗體"在本文可與術(shù)語"特異性結(jié)合抗原的抗體”互換使用。本文使用的“分離的抗體”是指基本上不含具有不同的抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合tigit的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合并非tigit抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合人tigit的表位的分離的抗體可具有與來自不同物種的其它tigit蛋白的交叉反應(yīng)性。如本文使用的，“抑制pvr與tigit結(jié)合”的抗體是指在本領(lǐng)域公認的方法中，例如，在基于facs的細胞-結(jié)合測定法中，以約1μg/ml或更小、例如約0.9μg/ml或更小、約0.85μg/ml或更小、約0.8μg/ml或更小、約0.75μg/ml或更小、約0.7μg/ml或更小、約0.65μg/ml或更小、約0.6μg/ml或更小、約0.55μg/ml或更小、約0.5μg/ml或更小、約0.45μg/ml或更小、約0.4μg/ml或更小、約0.35μg/ml或更小、約0.3μg/ml或更小、約0.25μg/ml或更小、約0.2μg/ml或更小、約0.15μg/ml或更小或約0.1μg/ml或更小的ec50抑制人pvr與人tigit結(jié)合的抗體。源自抗體fc區(qū)與某些fc受體的相互作用的"效應(yīng)子功能"，包括但不必然限于clq結(jié)合、補體依賴性細胞毒性(cdc)、fc受體結(jié)合、fcγr-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能例如adcc和抗體依賴性細胞-介導(dǎo)的吞噬(adcp)，和細胞表面受體(例如，b細胞受體;bcr)的減量調(diào)節(jié)。這樣的效應(yīng)子功能通常需要fc區(qū)與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合。"fc受體"或"fcr"是結(jié)合免疫球蛋白的fc區(qū)的受體。結(jié)合igg抗體的fcr包含fcγr家族的受體，包括這些受體的等位基因變體和可選剪接形式。fcγr家族由三種活化受體(在小鼠中fcγri、fcγriii和fcγriv；在人中fcγria、fcγriia和fcγriiia)和一種抑制受體(fcγriib或等同于fcγriib)組成。人fcγr的各種性質(zhì)概述于表1。大多數(shù)先天效應(yīng)細胞類型共表達一種或多種活化fcγr和抑制fcγriib，而天然殺傷(nk)細胞選擇性表達一種活化fc受體(在小鼠中fcγriii和在人中fcγriiia)，但在小鼠和人中不表達抑制fcγriib。人igg1結(jié)合大多數(shù)人fc受體，在其結(jié)合的活化fc受體的類型的方面被認為等同于鼠igg2a。表1人fcγr的性質(zhì)"fc區(qū)"(片段可結(jié)晶區(qū))或"fc結(jié)構(gòu)域"或"fc"是指抗體的重鏈的c-末端區(qū)，其介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括與位于免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)上的fc受體結(jié)合或與經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(c1q)結(jié)合。因此，fc區(qū)包含抗體的恒定區(qū)，不包括第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(例如，ch1或cl)。在igg、iga和igd抗體同種型中，fc區(qū)包含抗體的兩條重鏈的每一條的ch2和ch3恒定結(jié)構(gòu)域；igm和igefc區(qū)包含在每條多肽鏈中的三個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch結(jié)構(gòu)域2-4)。對于igg，fc區(qū)包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域cγ2和cγ3和在cγ1和cγ2之間的鉸鏈。盡管免疫球蛋白重鏈的fc區(qū)的邊界可能不同，但人igg重鏈fc區(qū)通常定義為從位置c226或p230的氨基酸殘基(或這兩個氨基酸之間的氨基酸)延伸至重鏈的羧基-末端，其中編號根據(jù)eu索引，如kabat.kabatetal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md;亦參見美國專利申請公開號2008/0248028的圖3c-3f。人iggfc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域從約氨基酸231延伸至約氨基酸340，而ch3結(jié)構(gòu)域位于fc區(qū)中ch2結(jié)構(gòu)域的c-末端側(cè)，即，其從igg的約氨基酸341延伸至約氨基酸447(包括c-末端賴氨酸)。如本文所用的，fc區(qū)可以是天然序列fc，包括任何同種異型變體，或變體fc(例如，非-天然存在的fc)。fc還可以指隔離的這一區(qū)域，或在包含fc的蛋白多肽的情況下，例如“包含fc區(qū)的結(jié)合蛋白”，還稱為“fc融合蛋白”(例如，抗體或免疫粘合素)。除非另外指明，或自上下文清楚的是，抗體的fc區(qū)的氨基酸殘基編號根據(jù)eu編號協(xié)定，除了當(dāng)明確提及序列表中的序列的殘基時，其中字母編號必然是連續(xù)的。例如，關(guān)于fc區(qū)中氨基酸置換的影響的文獻資料通常使用eu編號，其允許通過相同的數(shù)字提及抗體的fc區(qū)中任何給定的殘基，不管它所連接的可變結(jié)構(gòu)域的長度如何。在少見的情況下，可能需要參考經(jīng)引用以證實所提及的準確的fc殘基的文件。“天然序列fc區(qū)”或“天然序列fc”包含與自然中發(fā)現(xiàn)的fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人fc區(qū)包括天然序列人igg1fc區(qū)；天然序列人igg2fc區(qū)；天然序列人igg3fc區(qū)；和天然序列人igg4fc區(qū)以及其天然存在的變體。天然序列fc包括fc的各種同種異型。參見例如，jefferisetal.(2009)mabs1:1。術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原(例如，tigit)上免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的位點。蛋白抗原內(nèi)的表位可自連續(xù)氨基酸(通常為線性表位)或通過蛋白的三級折疊而并置的非連續(xù)氨基酸(通常為構(gòu)象表位)形成。自連續(xù)氨基酸形成的表位通常但不總是在暴露于變性溶劑時得到保持，而通過三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時丟失。表位通常包括呈獨特的空間構(gòu)象的至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15個氨基酸。術(shù)語"表位作圖"是指參與抗體-抗原識別的抗原上的分子決定簇的鑒定過程。確定給定抗體結(jié)合的表位的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，和包括例如，免疫印跡和免疫沉淀測定，其中測試重疊或連續(xù)的肽(例如，來自tigit)與給定抗體(例如，抗-tigit抗體)的反應(yīng)性；x-射線結(jié)晶照相術(shù)；2-維核磁共振；酵母展示(參見本文的實施例4)；和hdx-ms(參見例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,vol.66,g.e.morris,ed.(1996))。涉及兩種或更多種抗體的術(shù)語"結(jié)合相同的表位"意指抗體結(jié)合相同區(qū)段的氨基酸殘基，如通過給定的方法確定的。確定抗體是否與本文所述的抗體結(jié)合"tigit上相同的表位"的技術(shù)包括例如，表位作圖方法，例如抗原:抗體復(fù)合物的晶體的x-射線分析，其提供表位的原子解析，和氫/氘交換質(zhì)譜(hdx-ms)。其它方法監(jiān)測抗體與抗原片段(例如，蛋白水解片段)或與抗原的突變變體的結(jié)合，其中由于抗原序列內(nèi)氨基酸殘基的修飾導(dǎo)致的結(jié)合喪失通常被視為表位組分的指示，例如丙氨酸掃描誘變(cunningham&wells(1985)science244:1081)或突變靶序列變體的酵母展示(參見本文的實施例4)。此外，用于表位作圖的計算機組合方法也可使用。這些方法依賴于目的抗體從組合噬菌體展示肽文庫親和分離特定的短肽的能力。預(yù)期具有相同或密切相關(guān)的vh和vl或相同的cdr序列的抗體結(jié)合相同的表位?！芭c另一種抗體競爭結(jié)合靶標”的抗體是指抑制(部分地或完全)其它抗體與靶標的結(jié)合的抗體。兩種抗體是否彼此競爭結(jié)合靶標，即一種抗體是否抑制其它抗體與靶標的結(jié)合或其程度，可使用已知的競爭實驗來確定。在某些實施方案中，抗體與另一抗體競爭結(jié)合靶標，和抑制這種結(jié)合達至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或100%。抑制或競爭的水平可以不同，這取決于哪種抗體是“阻斷抗體”(即，首次與靶標孵育的冷抗體)。競爭測定法可按所述進行，例如edharlow和davidlane,coldspringharb.protoc.;2006;doi:10.1101/pdb.prot4277或edharlow和davidlane,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,usa1999的“usingantibodies”的第11章。競爭抗體結(jié)合相同的表位、重疊表位或臨近表位(例如，如通過空間位阻所證明的)。其它競爭結(jié)合測定法包括：固相直接或間接放射免疫測定法(ria)、固相直接或間接酶免疫測定法(eia)、夾心競爭測定法(參見stahlietal.(1983)methodsinenzymology9:242)；固相直接生物素-親和素eia(參見kirklandetal.(1986)j.immunol.137:3614)；固相直接標記測定法、固相直接標記夾心測定法(參見harlow和lane(1988),antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborpress)；使用i-125標記的固相直接標記ria(參見moreletal.(1988)mol.immunol.25(1):7)；固相直接生物素-親和素eia(cheungetal.(1990)virology176:546)；和直接標記ria(moldenhaueretal.(1990)scand.j.immunol.32:77)。如本文所用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指結(jié)合預(yù)定抗原而非其它抗原上的表位的抗體。通常，抗體(i)當(dāng)在biacore?2000表面等離子體共振儀器上使用預(yù)定的抗原，例如重組人tigit作為分析物和抗體作為配體，通過例如，表面等離子體共振(spr)技術(shù)，或通過抗體與抗原陽性細胞結(jié)合的scatchard分析測定時，以大約小于10-7m、例如大約小于10-8m、10-9m或10-10m或甚至更低的平衡離解常數(shù)(kd)結(jié)合；和(ii)以其對于結(jié)合并非預(yù)定抗原或密切相關(guān)的抗原的非特異性抗原(例如，bsa、酪蛋白)的親和力至少2倍的親和力結(jié)合預(yù)定抗原。因此，“特異性結(jié)合人tigit”的抗體是指以10-7m或更小、例如大約小于10-8m、10-9m或10-10m或甚至更低的kd結(jié)合可溶性或細胞結(jié)合的人tigit的抗體。“與食蟹猴tigit交叉反應(yīng)”的抗體是指以10-7m或更小、例如大約小于10-8m、10-9m或10-10m或甚至更低的kd結(jié)合食蟹猴tigit的抗體。如本文所用的，術(shù)語"kassoc"或“ka”是指特定抗體-抗原相互作用的締合速率常數(shù)，而如本文所用的，術(shù)語"kdis"或“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的離解速率常數(shù)。如本文所用的，術(shù)語“kd”是指平衡離解常數(shù)，其獲自kd與ka的比率(即kd/ka)和表示為摩爾濃度(m)?？贵w的kd值可使用本領(lǐng)域充分確立的方法確定。確定抗體的kd的優(yōu)選方法包括生物層干涉(bli)分析，優(yōu)選地使用fortebiooctetred裝置；表面等離子體共振，優(yōu)選地使用生物傳感器系統(tǒng)例如biacore?表面等離子體共振系統(tǒng)(參見例如實施例2)；或流式細胞術(shù)和scatchard分析。如本文所用的，對于igg抗體的術(shù)語“高親和力”是指對靶抗原具有10-8m或更小、更優(yōu)選地10-9m或更小和甚至更優(yōu)選地10-10m或更小的kd的抗體。然而，對于其它抗體同種型，“高親和力”結(jié)合可改變。例如，對于igm同種型，“高親和力”結(jié)合是指具有10-7m或更小、更優(yōu)選地10-8m或更小的kd的抗體。在使用抗體或其抗原結(jié)合片段的體外或體內(nèi)測定法的情況下，術(shù)語“ec50”是指引起反應(yīng)的抗體或其抗原-結(jié)合片段的濃度，所述反應(yīng)是最大反應(yīng)的50%，即，最大反應(yīng)和基線之間的一半。術(shù)語“結(jié)合固定的tigit”是指本文所述的抗體結(jié)合tigit，例如在細胞表面上表達或連接至固體支持物的tigit的能力。如本文所用的，術(shù)語“交叉反應(yīng)”是指本文所述的抗體結(jié)合來自不同物種的tigit的能力。例如，本文所述的結(jié)合人tigit的抗體還可結(jié)合來自其它物種的tigit(例如，食蟹猴tigit)。如本文所用的，交叉反應(yīng)性可通過檢測在結(jié)合測定法(例如，spr、elisa)中與純化抗原的特定反應(yīng)性，或與生理表達tigit的細胞的結(jié)合或以其它方式與生理表達tigit的細胞功能相互作用來測量。測定交叉反應(yīng)性的方法包括本文所述的標準結(jié)合測定法，例如通過使用biacore?2000spr儀器(biacoreab,uppsala,sweden)的biacore?表面等離子體共振(spr)分析，或流式細胞術(shù)技術(shù)。本文使用的術(shù)語“天然存在的”，在應(yīng)用于對象時，是指對象可在自然中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，可自天然來源分離和未在實驗室中人工有意修飾的生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。"多肽"是指包含至少兩個連續(xù)連接的氨基酸殘基的鏈，鏈的長度沒有上限。蛋白中的一個或多個氨基酸殘基可包含修飾，例如但不限于，糖基化、磷酸化或二硫鍵。"蛋白"可包含一個或多個多肽。如本文所用的，術(shù)語“核酸分子”意欲包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，和可以是cdna。還提供了對本文提供的抗體序列的“保守序列修飾”，即沒有廢除由核苷酸序列編碼或包含氨基酸序列的抗體與抗原的結(jié)合的核苷酸和氨基酸序列修飾。例如，修飾可通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)引入，例如定點誘變和pcr-介導(dǎo)的誘變。保守序列修飾包括保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被替換為具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，抗-tigit抗體中的預(yù)測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被來自相同的側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替換。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守置換的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，brummelletal.,biochem.32:1180-1187(1993);kobayashietal.proteineng.12(10):879-884(1999);和burksetal.proc.natl.acad.sci.usa94:412-417(1997))?；蛘撸诹硪粋€實施方案中，突變可沿所有或部分的抗-tigit抗體編碼序列隨機引入，例如通過飽和誘變，和可篩選得到的修飾的抗-tigit抗體的改進結(jié)合活性。對于核酸，術(shù)語“基本同源性”表示兩個核酸或其指定的序列，當(dāng)最佳比對和比較時，至少約80%的核苷酸、通常至少約90%-95%和更優(yōu)選地至少約98%-99.5%的核苷酸是相同的，具有適當(dāng)核苷酸插入或缺失?；蛘撸?dāng)區(qū)段在選擇性雜交條件下雜交至互補鏈時存在基本同源性。對于多肽，術(shù)語“基本同源性”表示兩個多肽或其指定的序列，當(dāng)最佳比對和比較時，至少約80%的氨基酸、通常至少約90%-95%和更優(yōu)選地至少約98%-99.5%的氨基酸是相同的，具有適當(dāng)氨基酸插入或缺失。兩個序列之間的百分比同一性是當(dāng)序列最佳比對時，所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，%同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)x100)，根據(jù)空位數(shù)和各空位的長度來確定最佳比對，它們需要引入以最佳比對兩個序列。兩個序列之間的序列比較和百分比同一性的確定可使用數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)，如下文的非限制性實例中所述的。兩個核苷酸序列之間的百分比同一性可使用gcg軟件包中的gap程序確定，使用nwsgapdna.cmp矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性還可使用并入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller的算法確定(cabios,4:11-17(1989))，使用pam120權(quán)重殘基表，空位長度罰分12和空位罰分4。此外，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可使用并入gcg軟件包中的gap程序的needleman和wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法確定，使用blossum62矩陣或pam250矩陣，和空位權(quán)重16、14、12、10、8、6或4，和長度權(quán)重1、2、3、4、5或6。本文所述的核酸和蛋白序列可進一步用作“詢問序列”以進行對公眾數(shù)據(jù)庫的檢索，以例如鑒定相關(guān)的序列。這樣的檢索可使用altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-10的nblast和xblast程序(版本2.0)進行。blast核苷酸檢索可用nblast程序進行，評分=100，字長=12，以獲得與本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白檢索可用xblast程序進行，評分=50，字長=3，以獲得與本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得有空位的比對用于比較目的，使用gappedblast，如altschuletal.(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述。當(dāng)使用blast和gappedblast程序時，可使用各程序(例如，xblast和nblast)的默認參數(shù)。核酸可以完整細胞、細胞裂解物或部分純化或基本純化形式存在。當(dāng)通過標準技術(shù)，包括堿/sds處理、cscl分帶、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù)，從其它細胞組分或其它雜質(zhì)，例如，其它細胞核酸(例如，染色體的其它部分)或蛋白中純化時，核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見f.ausubel,etal.,ed.currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork(1987)。如本文所用的，術(shù)語“載體”意指能夠運輸它所連接的另一核酸的核酸分子。一個類型的載體是“質(zhì)粒”，其是指環(huán)狀雙鏈dna環(huán)，其中可連接另外的dna區(qū)段。另一類型的載體是病毒載體，其中另外的dna區(qū)段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如，具有細菌復(fù)制起點的細菌載體，和游離哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離哺乳動物載體)當(dāng)引入宿主細胞時可整合至宿主細胞的基因組，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作連接的基因的表達。這樣的載體在本文稱為“重組表達載體”(或簡稱“表達載體”)。一般而言，用于重組dna技術(shù)的表達載體通常為質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常使用的載體形式。然而，還包括其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起同等的功能。如本文所用的，術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)意指包含并非天然存在于細胞中的核酸的細胞，和可以是其中引入了重組表達載體的細胞。應(yīng)理解，這樣的術(shù)語不僅意指特定的主題細胞，而且意指所述細胞的后代。因為某些修飾可在后續(xù)傳代中由于突變或環(huán)境影響而發(fā)生，這樣的后代實際上可能與親代細胞不同，但仍包括在本文使用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)?！懊庖叻磻?yīng)”是指針對外源因素在脊椎動物內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)，所述反應(yīng)保護生物體對抗這些因素和由它們引起的疾病。免疫反應(yīng)通過免疫系統(tǒng)的細胞(例如，t淋巴細胞、b淋巴細胞、天然殺傷(nk)細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、樹突細胞或中性粒細胞)和由任何這些細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用介導(dǎo)，其導(dǎo)致選擇性靶向、結(jié)合、損壞、破壞和/或從脊椎動物體消除侵入的病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌性或其它異常細胞，或者在自身免疫或病理性炎癥的情況下，正常的人細胞或組織。免疫反應(yīng)包括例如，活化或抑制t細胞，例如，效應(yīng)t細胞或th細胞，例如cd8+或cd4+t細胞，或抑制或消耗treg細胞?！皌效應(yīng)”(“teff”)細胞是指具有溶胞活性的t細胞(例如，cd4+和cd8+t細胞)以及t輔助(th)細胞，其分泌細胞因子和活化和指導(dǎo)其它免疫細胞，但不包括調(diào)節(jié)t細胞(treg細胞)。如本文所用的，術(shù)語“t細胞-介導(dǎo)的反應(yīng)”是指由t細胞，包括效應(yīng)t細胞(例如，cd8+細胞)和輔助t細胞(例如，cd4+細胞)介導(dǎo)的反應(yīng)。t細胞介導(dǎo)的反應(yīng)包括例如，t細胞的細胞毒性和增殖。如本文所用的，術(shù)語“細胞毒性t淋巴細胞(ctl)反應(yīng)”是指由細胞毒性t細胞引起的免疫反應(yīng)。ctl反應(yīng)主要通過cd8+t細胞介導(dǎo)?！懊庖哒{(diào)節(jié)劑(immunomodulator)”或“免疫調(diào)節(jié)劑(immunoregulator)”是指試劑，例如，信號傳導(dǎo)途徑的組分，其可參與調(diào)節(jié)、調(diào)控或改變免疫反應(yīng)?！罢{(diào)節(jié)”、“調(diào)控”或“改變”免疫反應(yīng)是指免疫系統(tǒng)的細胞或這樣的細胞(例如，效應(yīng)t細胞)的活性的任何改變。這樣的調(diào)節(jié)包括刺激或抑制免疫系統(tǒng)，其可表現(xiàn)為各種細胞類型的數(shù)量的增加或減少，這些細胞的活性的增加或減少，或可在免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的任何其它變化。已經(jīng)鑒定了抑制性和刺激性免疫調(diào)節(jié)劑二者，其中的一些可在腫瘤微環(huán)境中具有增強的功能。在優(yōu)選的實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑位于t細胞表面上?！懊庖哒{(diào)節(jié)靶標”是被物質(zhì)、試劑、部分、化合物或分子靶向結(jié)合，和其活性通過物質(zhì)、試劑、部分、化合物或分子的結(jié)合而改變的免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)靶標包括例如，細胞表面上的受體(“免疫調(diào)節(jié)受體”)和受體配體(“免疫調(diào)節(jié)配體”)?！懊庖忒煼ā笔侵竿ㄟ^包括誘導(dǎo)、提高、抑制或以其它方式改變免疫反應(yīng)的方法，治療患有疾病、或有風(fēng)險感染疾病或患有疾病復(fù)發(fā)的受試者?！懊庖叽碳く煼ā被颉懊庖叽碳ば辕煼ā笔侵笇?dǎo)致增加(誘導(dǎo)或提高)受試者的免疫反應(yīng)的療法，以例如，治療癌癥?！霸鰪妰?nèi)源免疫反應(yīng)”意指增加受試者的已有免疫反應(yīng)的功效或效力。功效和效力的這種增加可例如通過克服抑制內(nèi)源宿主免疫反應(yīng)的機制或通過刺激增強內(nèi)源宿主免疫反應(yīng)的機制實現(xiàn)。如本文所用的，術(shù)語“連接”是指兩個或更多個分子的締合。連接可以是共價或非-共價的。連接也可以是遺傳的(即，重組融合的)。這樣的連接可使用各種公認的技術(shù)實現(xiàn)，例如化學(xué)綴合和重組蛋白產(chǎn)生。如本文所用的，"給予"是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和遞送系統(tǒng)的任何一種，將包含治療劑的組合物物理引入受試者。對于本文所述的抗體，優(yōu)選的給予途徑包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、脊柱或其它胃腸外給予途徑，例如通過注射或輸注。本文使用的短語"胃腸外給予"意指并非腸內(nèi)和局部給予的給予方式，通常通過注射，和包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、淋巴管內(nèi)、病灶內(nèi)、囊內(nèi)、眼內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注，以及體內(nèi)電穿孔?；蛘?，本文所述的抗體可經(jīng)過非胃腸外途徑給予，例如局部、表皮或粘膜給予途徑，例如鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。給予還可進行例如一次、多次和/或經(jīng)一個或多個長期的時期。如本文所用的，術(shù)語“抑制”或“阻斷”(例如，涉及抑制/阻斷細胞上pvr與tigit的結(jié)合)可互換使用，和包括部分和完全抑制/阻斷二者達例如至少約50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%或100%。如本文所用的，"癌癥"是指一組廣義的疾病，特征為體內(nèi)異常細胞的不受控制的生長。不受調(diào)節(jié)的細胞分化可導(dǎo)致形成惡性腫瘤或細胞，其侵襲臨近組織和可通過淋巴系統(tǒng)或血流轉(zhuǎn)移至身體的遠端部分。"血液惡性腫瘤"包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴惡性腫瘤，以及脾和和淋巴結(jié)的癌癥。實例性的淋巴瘤包括b細胞淋巴瘤和t細胞淋巴瘤二者。b-細胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大多數(shù)非-霍奇金淋巴瘤。b細胞淋巴瘤的非限制性實例包括彌散性大b-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、粘膜相關(guān)的淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞淋巴瘤(與慢性淋巴細胞性白血病重疊)、套細胞淋巴瘤(mcl)、burkitt淋巴瘤、縱膈大b細胞淋巴瘤、waldenstr?m巨球蛋白血癥、結(jié)節(jié)邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、血管內(nèi)大b-細胞淋巴瘤、原發(fā)性彌散性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病。t細胞淋巴瘤的非限制性實例包括結(jié)節(jié)外t細胞淋巴瘤、皮膚t細胞淋巴瘤、惡性大細胞淋巴瘤和血管免疫母細胞t細胞淋巴瘤。血液惡性腫瘤還包括白血病，例如但不限于繼發(fā)性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和急性成淋巴細胞性白血病。血液惡性腫瘤還包括骨髓瘤，例如但不限于，多發(fā)性骨髓瘤和郁積性多發(fā)性骨髓瘤。其它血液和/或b細胞-或t-細胞-相關(guān)的癌癥包括在術(shù)語血液惡性腫瘤范圍內(nèi)。如本文所用的，術(shù)語“治療”是指在受試者上或給予受試者活性劑時進行的任何類型的干預(yù)或過程，其目的是逆轉(zhuǎn)、緩解、改善、抑制或減慢或阻止癥狀、并發(fā)癥、病況或與疾病有關(guān)的生物化學(xué)指標的進展、發(fā)生、嚴重性或復(fù)發(fā)。預(yù)防是指給予未患有疾病的受試者以預(yù)防疾病發(fā)生或?qū)⑵溆绊懽钚』?如果發(fā)生的話)。術(shù)語“有效劑量”定義為足以實現(xiàn)或至少部分實現(xiàn)所需效果的量。藥物或治療劑的"治療有效量"或"治療有效劑量"是任何量的藥物，其當(dāng)單獨或與另一治療劑組合使用時，促進疾病消退，通過以下證明：疾病癥狀的嚴重性降低，無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加，或阻止由于疾病痛苦導(dǎo)致的損害或失能。藥物的"預(yù)防有效量"或"預(yù)防有效劑量"是藥物的量，其當(dāng)單獨或與另一治療劑組合給予有風(fēng)險發(fā)生疾病或患有疾病復(fù)發(fā)的受試者時，抑制疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)。治療劑或預(yù)防劑促進疾病消退或抑制疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)的能力可使用技術(shù)人員已知的各種方法評價，例如在臨床試驗期間在人受試者中，在預(yù)測在人中的功效的動物模型系統(tǒng)中，或通過在體外測定中測定所述試劑的活性。例如，抗癌劑是在受試者中減慢癌癥進展或促進癌癥消退的藥物。在優(yōu)選的實施方案中，治療有效量的藥物促進癌癥消退至消除癌癥的點。"促進癌癥消退"意指單獨或與抗-腫瘤劑組合給予有效量的藥物，導(dǎo)致腫瘤生長或大小減少，腫瘤壞死，至少一種疾病癥狀的嚴重性降低，無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加，阻止由于疾病痛苦導(dǎo)致的損害或失能，或以其它方式改善患者的疾病癥狀。藥理學(xué)有效性是指藥物促進患者的癌癥消退的能力。生理學(xué)安全性是指給予藥物引起的在細胞、器官和/或生物體水平上可接受的低水平的毒性，或其它不良生理學(xué)效果(副作用)。例如，對于治療腫瘤，相對于未治療的受試者，藥物的治療有效量或劑量優(yōu)選地抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%，更優(yōu)選地至少約40%，甚至更優(yōu)選地至少約60%，和還更優(yōu)選地至少約80%。在最優(yōu)選地實施方案中，藥物的治療有效量或劑量完全抑制細胞生長或腫瘤生長，即，優(yōu)選地抑制細胞生長或腫瘤生長達100%?；衔镆种颇[瘤生長的能力可使用下文描述的測定法評價。腫瘤生長的抑制可能不緊接治療后發(fā)生，和可能僅在一段時間后或在重復(fù)給予后發(fā)生?；蛘?，組合物的這種性質(zhì)可通過檢查化合物抑制細胞生長的能力來評價，這樣的抑制可通過技術(shù)人員已知的測定法體外測量。在本文所述的其它優(yōu)選的實施方案中，可觀察到腫瘤消退，和可持續(xù)至少約20天、更優(yōu)選地至少約40天或甚至更優(yōu)選地至少約60天的時間。除非另外指明或自上下文清楚的是，如本文所用的“組合”療法意欲包括以配合的方式給予兩種或更多種治療劑，和包括但不限于同時給藥。具體而言，組合療法包括共給予(例如，給予共制劑或同時給予單獨的治療性組合物)和連續(xù)或序貫給予，條件是一種治療劑的給予在一定程度上以另一治療劑的給予為條件。例如，一種治療劑可僅在已給予不同的治療劑并允許作用規(guī)定的一段時間后給予。參見例如，kohrtetal.(2011)blood117:2423。術(shù)語“患者”和“受試者”是指接受預(yù)防性或治療性治療的任何人或非-人動物。例如，本文所述的方法和組合物可用于治療具有癌癥的受試者。術(shù)語“非-人動物”包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，例如非-人靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。本文所述的各個方面在以下子部分中更詳細地描述。i.抗-tigit抗體本申請公開了具有所需性質(zhì)的全人抗-hutigit抗體，用作治療疾病例如癌癥的治療劑。這些性質(zhì)包括以下一項或多項：以高親和力結(jié)合人tigit的能力、結(jié)合食蟹猴tigit的能力、阻斷pvr結(jié)合(因此阻斷信號傳導(dǎo))的能力，和可能減少抗體的化學(xué)穩(wěn)定性的序列責(zé)任(sequenceliabilities)的缺失。本文通過序列公開的抗-tigit抗體結(jié)合人tigit上的特定表位，如實施例4所述確定的和圖2a–2c所示的。確定表位的三種特異性抗體在人tigit的類似區(qū)域結(jié)合，但不同之處在于接觸的特定氨基酸殘基。抗體共有以高親和力結(jié)合人tigit的性質(zhì)和具有阻斷pvr結(jié)合的能力。因此，結(jié)合相同或密切相關(guān)的表位的其它抗體可能會共有這些需要的性質(zhì)，和可通過競爭實驗發(fā)現(xiàn)。此外，抗體22g2以與結(jié)合人tigit基本上相同的親和力結(jié)合食蟹猴tigit，當(dāng)為支持使用抗體作為人治療劑的監(jiān)管批準而需要進行毒性研究時，這是方便的。結(jié)合與15a6和22g2相同或類似的表位的其它抗-tigit抗體可能共有結(jié)合食蟹猴tigit的這一有利性質(zhì)。結(jié)合類似的表位的抗體可通過進行競爭實驗或通過直接確定其表位而發(fā)現(xiàn)。與本文公開的抗-hutigit抗體競爭的抗-tigit抗體與本發(fā)明的抗體競爭結(jié)合hutigit的抗-hutigit抗體，例如15a6和22g2，可使用類似于本文描述的免疫方案(實施例1)產(chǎn)生。與本文描述的抗-hutigit抗體競爭結(jié)合的抗體也可通過用人tigit或包含其細胞外結(jié)構(gòu)域(seqidno:1;np_776160.2的殘基22-141)的構(gòu)建體免疫小鼠，或通過用包含本文公開的抗-hutigit抗體所結(jié)合的表位(例如，15a6,22g2和11g11)的人tigit的片段免疫產(chǎn)生?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如在elisa中阻斷與tigit的細胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的結(jié)合，或阻斷結(jié)合在其表面上表達hutigit的細胞的能力，例如，通過facs，篩選得到的抗體阻斷15a6或22g2與人tigit結(jié)合的能力。在各個實施方案中，在加入15a6或22g2之前、同時或之后，將試驗抗體與tigit-fc融合蛋白(或與在其表面上表達hutigit的細胞)接觸。例如，可進行“框并”實驗(實施例3)以確定抗體是否落入與抗體15a6或22g2相同的“框”中，在所述實驗中抗體15a6或22g2被稱為“參比”抗體，和測試的抗體被稱為“試驗”抗體。減少15a6和/或22g2與tigit(作為fc融合物或在細胞上)的結(jié)合的抗體，特別是以粗略的化學(xué)計量濃度，可能在相同、重疊或臨近表位結(jié)合，和因此可共有15a6和22g2的需要的功能性質(zhì)。競爭抗體還可使用本領(lǐng)域已知的其它方法鑒定。例如，可使用標準elisa測定法或競爭elisa測定法，其中重組人tigit蛋白構(gòu)建體固定在板上，加入各種濃度的未標記試驗抗體，將板洗滌，加入標記的參比抗體，洗滌和測量結(jié)合的標記的量。如果增加濃度的未標記試驗抗體抑制標記的參比抗體的結(jié)合，則試驗抗體被認為抑制參比抗體與板上的靶標的結(jié)合，或被認為與參比抗體競爭結(jié)合。另外或備選地，biacore?spr分析可用于評價抗體競爭的能力。試驗抗體抑制本文所述的抗-hutigit抗體與tigit的結(jié)合的能力證實了試驗抗體可與參比抗體競爭結(jié)合tigit。因此，本文提供了抑制本文所述的抗-hutigit抗體與細胞(例如，活化的t細胞)上的tigit結(jié)合達至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的抗-tigit抗體，和/或其與細胞(例如，活化的t細胞)上的tigit的結(jié)合被抑制達至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，例如，通過elisa或facs測定的，例如通過使用以下段落中描述的測定法。確定試驗抗體是否阻斷參比抗體的結(jié)合(即，與參比抗體“競爭”)的實例性的競爭實驗可如下進行：活化的人t細胞如下制備：外周血單核細胞(pbmc)自人全血使用ficoll梯度分離和用10μg/ml植物凝集素(pha-l)(usbiol#p3370-30)和200iu/ml重組il-2(peprotech#200-02)活化3天。活化的t細胞重懸于facs緩沖液(含5%胎牛血清的pbs)和以105個細胞/樣品孔接種在96孔板。未綴合的試驗抗體以范圍0-50μg/ml的濃度(自最高濃度50μg/ml開始，三倍滴定)加入板中。不相關(guān)的igg可用作試驗抗體的同種型對照，和以相同的濃度(自最高濃度50μg/ml開始，三倍滴定)加入。用50μg/ml未標記的參比抗體預(yù)孵育的樣品可作為完全阻斷的陽性對照(100%抑制)包括在內(nèi)，和在初始孵育中沒有抗體的樣品可用作陰性對照(無競爭；0%抑制)。孵育30分鐘后，無需洗滌，將標記的，例如，生物素化的參比抗體以每孔2μg/ml的濃度加入。樣品孵育另外30分鐘。未結(jié)合的抗體通過用facs緩沖液洗滌細胞而除去。細胞-結(jié)合的標記參比抗體用檢測標記的試劑(例如，用于檢測生物素的pe綴合的鏈霉抗生物素(invitrogen,catalog#s21388))檢出。在facscaliburflowcytometer(bd,sanjose)上獲得樣品和用flowjo軟件(treestar,inc,ashland,or)分析。結(jié)果可表示為%抑制(即，從100%減去各濃度的標記的量除以沒有阻斷抗體時獲得的標記的量)。通常，然后反向進行相同的實驗，即，試驗抗體是參比抗體和參比抗體是試驗抗體。在某些實施方案中，抗體至少部分地(例如，至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%或90%)或完全(100%)阻斷其它抗體與靶標，例如，人tigit或其片段的結(jié)合，和不管當(dāng)一種或其它抗體是試驗抗體時抑制是否發(fā)生。當(dāng)抗體以兩種方式，即，在其中試驗抗體首先加入的競爭實驗中和在其中參比抗體首先加入的競爭實驗中彼此競爭時，試驗和參比抗體彼此“交叉阻斷”與靶標的結(jié)合。當(dāng)以粗略相等的濃度存在時，例如在如實施例3中描述的競爭實驗中，如果它們抑制15a6和/或22g2與人tigit的結(jié)合達至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或100%，抗-hutigit抗體被認為與本文公開的抗-hutigit抗體競爭。除非另外指明，當(dāng)以與選擇的抗體粗略相等的摩爾濃度使用時，如果其減少選擇的抗體與人tigit的結(jié)合達至少20%，抗體將被認為與選自本發(fā)明的抗-hutigit抗體的抗體競爭，如在競爭elisa實驗中測量的，如前述兩個段落中概述的。結(jié)合相同的表位的抗-tigit抗體結(jié)合與本文公開的抗體相同或類似的表位的抗-hutigit抗體可使用類似于本文描述的免疫方案(實施例1)產(chǎn)生?？珊Y選得到的抗體與人tigit的高親和力結(jié)合(實施例2)。然后可在酵母展示測定法中研究選擇的抗體，其中hutigit的序列變體呈現(xiàn)在酵母細胞表面上(實施例4)以測定抗體結(jié)合的準確表位?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法進行表位確定。本文公開的表位通過酵母展示確定，如實施例4中所述和圖2a-2c所示的。在各個實施方案中，抗-hutigit抗體被認為與本文公開的抗-hutigitmab，例如，15a6和/或22g2結(jié)合相同的表位，如果它們與15a6或22g2所接觸的hutigit的至少一個區(qū)域內(nèi)的一個或多個相同的殘基接觸的話；如果它們與15a6或22g2所接觸的hutigit的至少一個區(qū)域內(nèi)的大部分殘基接觸的話；如果它們與15a6或22g2所接觸的hutigit的每個區(qū)域內(nèi)的大部分殘基接觸的話；如果它們與15a6或22g2所接觸的hutigit的整個長度的大部分接觸點接觸的話；如果它們與15a6或22g2所接觸的人tigit的所有不同的區(qū)域接觸的話；如果它們與15a6或22g2所接觸的人tigit的任何一個區(qū)域的所有相同的殘基接觸的話；或如果它們與15a6或22g2所接觸的所有區(qū)域的所有殘基接觸的話。表位“區(qū)”是沿抗體15a6或22g2所接觸的一級序列的殘基簇，例如，以seqidno:38–44提供。確定與本文所述的抗體結(jié)合"tigit上相同的表位"的抗體的技術(shù)包括抗原:抗體復(fù)合物的晶體的x-射線分析，其提供表位的原子解析。其它方法監(jiān)測抗體與抗原片段或抗原的突變變體的結(jié)合，其中由于抗原序列內(nèi)氨基酸殘基的修飾導(dǎo)致的結(jié)合喪失被認為是表位組分的指示。方法還可依賴于目的抗體自組合噬菌體展示肽文庫或自蛋白酶消化的靶蛋白親和分離特定短肽(天然三維形式或變性形式)的能力。然后所述肽被視為定義對應(yīng)于用于篩選肽文庫的抗體的表位的引導(dǎo)。對于表位作圖，還已開發(fā)計算算法，其已顯示對構(gòu)象不連續(xù)表位作圖。表位或包含表位的區(qū)域還可通過篩選與跨越tigit的一系列重疊肽的結(jié)合來鑒定?；蛘撸琷espersetal.(1994)biotechnology12:899的方法可用于指導(dǎo)具有與本文所述的抗-tigit抗體相同的表位和因此具有類似性質(zhì)的抗體的選擇。使用噬菌體展示，首先抗-tigit抗體的重鏈與(優(yōu)選地，人)輕鏈庫配對以選擇tigit-結(jié)合抗體，然后新的輕鏈與(優(yōu)選地，人)重鏈庫配對以選擇具有與本文所述的抗-hutigit抗體相同的表位或表位區(qū)的(優(yōu)選地，人)tigit-結(jié)合抗體?；蛘?，本文所述的抗體的變體可通過編碼抗體的重鏈和輕鏈的cdna的誘變來獲得。丙氨酸掃描誘變，如cunningham&wells(1989)science244:1081所述，或tigit的氨基酸殘基的點誘變的一些其它形式(例如實施例4提供的酵母展示方法)，也可用于確定抗-tigit抗體的功能表位。特異性抗體所結(jié)合的表位或表位區(qū)(“表位區(qū)”是一個包含表位或與表位重疊的區(qū)域)也可通過評價抗體與包含tigit片段的肽的結(jié)合來確定。一系列包含序列tigit(例如，人tigit)的重疊肽可被合成和例如，在直接elisa、競爭elisa(其中評價肽阻止抗體與結(jié)合至微量滴定板的孔的tigit結(jié)合的能力)中或在芯片上篩選結(jié)合。這樣的肽篩選方法可能不能檢測一些不連續(xù)的功能表位，即包括沿tigit多肽鏈的一級序列不是連續(xù)的氨基酸殘基的功能表位。表位也可通過基于ms的蛋白指紋，例如氫/氘交換質(zhì)譜(hdx-ms)和蛋白的快速光化學(xué)氧化(fpop)來鑒定。hdx-ms可進行，例如，進一步描述于weietal.(2014)drugdiscoverytoday19:95，該方法通過引用明確地結(jié)合到本文中。fpop可按所述進行，例如，hambley&gross(2005)j.americansoc.massspectrometry16:2057，該方法通過引用明確地結(jié)合到本文中?？?tigit抗體結(jié)合的表位還可通過結(jié)構(gòu)方法確定，例如x-射線晶體結(jié)構(gòu)測定(例如，wo2005/044853)、分子建模和核磁共振(nmr)光譜，包括當(dāng)游離時和當(dāng)以復(fù)合物與目的抗體結(jié)合時tigit的不穩(wěn)定酰胺氫的h-d交換速率的nmr測定(zinn-justinetal.(1992)biochemistry31:11335;zinn-justinetal.(1993)biochemistry32:6884)。關(guān)于x-射線結(jié)晶照相術(shù)，結(jié)晶可使用本領(lǐng)域任何已知的方法進行(例如，giegeetal.(1994)actacrystallogr.d50:339;mcpherson(1990)eur.j.biochem.189:1)，包括微批量(例如，chayen(1997)structure5:1269)、懸滴蒸汽擴散(例如，mcpherson(1976)j.biol.chem.251:6300)、接晶種和透析。合乎需要的是，使用具有至少約1mg/ml和優(yōu)選地約10mg/ml-約20mg/ml的濃度的蛋白制備物。結(jié)晶可在包含聚乙二醇1000-20,000(peg;平均分子量范圍約1000-約20,000da)、優(yōu)選地約5000-約7000da、更優(yōu)選地約6000da，范圍約10%-約30%(w/v)的濃度的沉淀劑溶液中最佳進行。還合乎需要的是，包括蛋白穩(wěn)定劑，例如，范圍約0.5%-約20%的濃度的甘油。合適的鹽，例如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉，也可能在沉淀劑溶液中是合乎需要的，優(yōu)選地濃度范圍為約1mm-約1000mm。沉淀劑優(yōu)選地被緩沖至ph約3.0-約5.0，優(yōu)選地約4.0?？捎糜诔恋韯┤芤旱木唧w的緩沖液可改變，并且是本領(lǐng)域眾所周知的(scopes,proteinpurification:principlesandpractice,thirded.,(1994)springer-verlag,newyork)?？捎玫木彌_液的實例包括但不限于，hepes、tris、mes和乙酸鹽。晶體可在寬范圍的溫度下生長，包括2°c,4°c,8°c和26°c?？贵w:抗原晶體可使用眾所周知的x-射線衍射技術(shù)進行研究，和可使用計算機軟件例如x-plor(yaleuniversity,1992,由molecularsimulations,inc.發(fā)布；參見例如blundell&johnson(1985)meth.enzymol.114&115,h.w.wyckoffetal.,eds.,academicpress;u.s.patentapplicationpublicationno.2004/0014194)和buster(bricogne(1993)actacryst.d49:37-60;bricogne(1997)meth.enzymol.276a:361-423,carter&sweet,eds.;roversietal.(2000)actacryst.d56:1313-1323)精修，其公開內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合到本文中。以高親和力結(jié)合的抗-tigit抗體在一些實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體以高親和力結(jié)合hutigit，如同本文公開的抗-hutigit抗體，增加其作為有效的治療劑的可能性。在各種實施方案中本發(fā)明的抗-hutigit抗體以小于10nm,5nm,2nm,1nm,300pm,100pm或60pm的kd結(jié)合hutigit。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體以2nm-60pm的kd結(jié)合hutigit。評價抗體與hutigit的結(jié)合能力的標準測定法包括elisa、ria、蛋白質(zhì)印跡、生物層干涉測量(bli)和biacore?spr分析(參見實施例2)?？?tigit抗體序列變體本文公開的抗體序列的一些可變性可耐受和仍保持需要的抗體性質(zhì)。cdr區(qū)使用kabat系統(tǒng)描述(kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。因此，本發(fā)明進一步提供包含cdr序列的抗-hutigit抗體，所述cdr序列與本文公開的抗體(例如，15a6,22g2和11g11)的cdr序列具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。本發(fā)明還提供包含重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的抗-hutigit抗體，所述可變結(jié)構(gòu)域序列與本文公開的抗體(例如，15a6,22g2和11g11)的重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%同一性。源自相同的種系的抗-tigit抗體鑒于抗原-結(jié)合特異性主要由cdr決定，與本文公開的抗體(例如，15a6,22g2和11g11)共有cdr序列的抗體可能共有其需要的性質(zhì)。此外，本文公開的選擇的抗體(15a6,22g2和11g11)結(jié)合沿hutigit的一級序列的類似區(qū)域，和一些重鏈和輕鏈源自相同的種系序列。因此，組合(“混合和匹配”)來自抗體15a6,22g2和11g11的cdr區(qū)的抗體也可預(yù)期結(jié)合hutigit和保留其需要的性質(zhì)。具有等同于或優(yōu)于本文公開的特異性抗體的結(jié)合親和力、生物學(xué)活性和/或其它性質(zhì)的“混合和匹配”的抗體可選擇用于本發(fā)明的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體包含源自特定的人種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定的人種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)?？贵w15a6具有源自人種系v4-39,d6-19和jh4b的重鏈，和源自種系va27和jk2的輕鏈。抗體22g2具有源自人種系v4-61,d3-10和jh6b的重鏈，和源自種系vl6和jk3的輕鏈。抗體11g11具有源自人種系v4-39,d3-10和jh4b的重鏈，和源自種系vl6和jk2的輕鏈。抗體10d7具有源自人種系v1-69,d6-13和jh6b的重鏈，和源自種系vl15和jk5的輕鏈。結(jié)合人tigit和源自一些或全部這些種系序列的其它抗體可能在序列上密切相關(guān)，特別是源自相同的v-區(qū)基因的那些，和因此預(yù)期共有相同的所需性質(zhì)。如本文所用的，如果抗體的可變區(qū)獲自使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)，人抗體包含“源自”特定的種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)，和抗體序列與該種系足夠相關(guān)，因為它比任何其它種系更可能源自該給定的種系。這樣的系統(tǒng)包括用目的抗原免疫帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或用目的抗原篩選在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫?？贵w序列從中“來源”的人種系免疫球蛋白序列可通過比較人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列和選擇與人抗體的序列在序列上最接近的(即，最大的%同一性)人種系免疫球蛋白序列來鑒定。由于例如，天然存在的體細胞突變或有意引入定點突變，“源自”特定的人種系免疫球蛋白序列的人抗體可包含與該種系序列相比的氨基酸差異。然而，選擇的人抗體通常在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列(例如，v區(qū))具有至少90%同一性，和當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠種系序列)相比，包含鑒定人抗體為人的氨基酸殘基。在某些情況下，與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列(例如，v區(qū))相比，人抗體可具有至少95%或甚至至少96%,97%,98%或99%氨基酸序列同一性。通常，源自特定人種系序列的人抗體將顯示與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列(例如，v區(qū))不超過10個氨基酸差異。在某些情況下，人抗體可顯示與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列(例如，v區(qū))不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個氨基酸差異。ii.工程改造和修飾的抗體vh和vl區(qū)還提供了工程改造和修飾的抗體，其可使用具有一個或多個本文公開的vh和/或vl序列的抗體作為起始材料制備，以工程改造修飾的抗體，所述修飾的抗體可具有與起始抗體不同的性質(zhì)?？贵w可通過修飾一個或兩個可變區(qū)(即，vh和/或vl)內(nèi)，例如一個或多個cdr區(qū)內(nèi)和/或一個或多個框架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基進行工程改造。另外或備選地，抗體可通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基進行工程改造，例如以改變抗體的效應(yīng)子功能。可進行的一個類型的可變區(qū)工程改造是cdr移植。這樣的移植特別用于人源化非-人抗-tigit抗體，其與本文公開的抗-hutigit抗體競爭結(jié)合，和/或結(jié)合與本文公開的抗-hutigit抗體相同的表位。抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(cdr)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此原因，在單個抗體之間cdr內(nèi)的氨基酸序列比cdr外的序列更具有變化。因為cdr序列負責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，可通過構(gòu)建包括移植到來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的框架序列上的來自特定參比抗體的cdr序列的表達載體，表達模擬特定參比抗體的性質(zhì)的重組抗體(參見例如，riechmann,l.etal.(1998)nature332:323-327;jones,p.etal.(1986)nature321:522-525;queen,c.etal.(1989)proc.natl.acad.see.u.s.a.86:10029-10033;winter的美國專利號5,225,539和queenetal.的美國專利號5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。這樣的框架序列可獲自包括種系抗體基因序列的公開的dna數(shù)據(jù)庫或出版的參考文獻。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列可見于"vbase"人種系序列數(shù)據(jù)庫，以及kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242;tomlinson,i.m.,etal.(1992)"therepertoireofhumangermlinevhsequencesrevealsaboutfiftygroupsofvhsegmentswithdifferenthypervariableloops"j.mol.biol.227:776-798;和cox,j.p.l.etal.(1994)"adirectoryofhumangerm-linevhsegmentsrevealsastrongbiasintheirusage"eur.j.immunol.24:827-836；其各自的內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。用于本文描述的抗體的優(yōu)選框架序列是結(jié)構(gòu)上類似于本文描述的抗體使用的框架序列的那些序列。vhcdr1,2和3序列和vlcdr1,2和3序列，可移植到框架區(qū)上，所述框架區(qū)具有與框架序列所來源的種系免疫球蛋白基因中存在的序列相同的序列，或cdr序列可移植到框架區(qū)上，所述框架區(qū)包含與種系序列相比至多20個，優(yōu)選地保守的氨基酸置換。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下，使框架區(qū)內(nèi)的殘基突變以保持或增強抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見例如，queenetal的美國專利號5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。本文所述的工程改造的抗體包括其中已對vh和/或vl內(nèi)的框架殘基進行修飾，例如，以改進抗體的性質(zhì)的那些。通常，進行這樣的框架修飾以減少抗體的免疫原性。例如，一種方法是“回突變”一個或多個框架殘基至相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細胞突變的抗體可包含不同于抗體所來源的種系序列的框架殘基。這樣的殘基可通過比較抗體框架序列與抗體所來源的種系序列進行鑒定。為了使框架區(qū)序列回到它們的種系結(jié)構(gòu)，體細胞突變可通過例如定點誘變或pcr-介導(dǎo)的誘變，“回突變”至種系序列。這樣的“回突變的”抗體也意欲包括在內(nèi)。另一類型的框架修飾包括突變框架區(qū)內(nèi)，或甚至一個或多個cdr區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基，以除去t細胞表位，從而減少抗體可能的免疫原性。這種方法也被稱為“去免疫”和更詳細地描述于carretal的美國專利申請?zhí)?0030153043。另一類型的可變區(qū)修飾是突變cdr區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，以改進目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如，親和力)?？蛇M行定點誘變或pcr-介導(dǎo)的誘變以引入突變和對抗體結(jié)合的作用，或其它目的功能性質(zhì)。優(yōu)選地，引入保守修飾。突變可以是氨基酸添加、缺失，或優(yōu)選地置換。此外，通常cdr區(qū)內(nèi)不超過1個、2個、3個、4個或5個殘基被改變。抗體的cdr的甲硫氨酸殘基可被氧化，導(dǎo)致可能的化學(xué)降解，因此降低抗體的效力。因此，還提供了重鏈和/或輕鏈cdr中的一個或多個甲硫氨酸殘基被不經(jīng)歷氧化降解的氨基酸殘基置換的抗-tigit抗體。類似地，脫酰胺化位點可自抗-tigit抗體除去，特別是在cdr中?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的可能的糖基化位點優(yōu)選地被消除，以防止糖基化，其可干擾抗原結(jié)合。參見例如，美國專利號5,714,350。靶向抗原結(jié)合在各個實施方案中，本發(fā)明的抗體經(jīng)修飾以在其中抗原結(jié)合是有害的組織和環(huán)境中選擇性阻斷抗原結(jié)合，但在其是有益的情況下允許抗原結(jié)合。在一個實施方案中，產(chǎn)生阻斷肽“掩蔽”，其特異性結(jié)合抗體的抗原結(jié)合表面和干擾抗原結(jié)合，所述掩蔽通過肽酶可裂解接頭連接至抗體的每個結(jié)合臂。參見例如，cytomx的美國專利號8,518,404。這樣的構(gòu)建體可用于治療癌癥，其中與非腫瘤組織相比在腫瘤微環(huán)境中蛋白酶水平極大增加。在腫瘤微環(huán)境中選擇性裂解可裂解接頭允許離解掩蔽/阻斷肽，使得能夠在腫瘤中選擇性抗原結(jié)合，而非在其中抗原結(jié)合可能導(dǎo)致不需要的副作用的外周組織中?；蛘撸谙嚓P(guān)的實施方案中，開發(fā)了包含兩個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二價結(jié)合化合物(“掩蔽配體”)，其結(jié)合(二價)抗體的兩個抗原結(jié)合表面和干擾抗原結(jié)合，其中兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域掩蔽通過可裂解接頭彼此連接(而非抗體)，例如通過肽酶可裂解。參見例如，tegopharmcorp的國際專利申請公開號wo2010/077643。掩蔽配體可包含或源自抗體意欲結(jié)合的抗原，或可獨立地產(chǎn)生。這樣的掩蔽配體可用于治療癌癥，其中與非腫瘤組織相比在腫瘤微環(huán)境中蛋白酶水平極大增加。在腫瘤微環(huán)境中選擇性裂解可裂解接頭允許彼此離解兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域，減少對抗體的抗原-結(jié)合表面的親合力。產(chǎn)生的掩蔽配體與抗體的離解使得能夠在腫瘤中選擇性地抗原結(jié)合，而非在其中抗原結(jié)合可能導(dǎo)致不需要的副作用的外周組織中。fcs和修飾的fcs除了自抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原的結(jié)合產(chǎn)生的治療性抗體的活性之外(例如，在拮抗劑抗體的情況下相關(guān)配體或受體蛋白的阻斷，或在激動劑抗體的情況下引起的信號傳導(dǎo))，抗體的fc部分還通常以復(fù)合物方式與免疫系統(tǒng)相互作用以引發(fā)任何量的生物效應(yīng)。效應(yīng)子功能，例如免疫球蛋白的fc區(qū)負責(zé)需要重要的抗體功能，例如抗原-依賴性細胞的細胞毒性(adcc)、補體依賴性細胞毒性(cdc)和抗體-依賴性細胞-介導(dǎo)的吞噬(adcp)，導(dǎo)致殺傷靶細胞，雖然通過不同的機制。重鏈恒定區(qū)存在5個主要類型或同種型(iga,igg,igd,ige,igm)，各自具有特征性的效應(yīng)子功能。這些同種型可進一步細分為亞型，例如igg分為4個亞型，稱為igg1,igg2,igg3和igg4。igg分子與對igg類型的抗體特異性的三類fcγ受體(fcγr)相互作用，即fcγri,fcγrii和fcγriii。igg與fcγr受體的結(jié)合的重要序列已報道位于ch2和ch3結(jié)構(gòu)域中?？贵w的血清半壽期受抗體結(jié)合新生fc受體(fcrn)的能力影響。本發(fā)明的抗體可包含本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域與包含不同的fc區(qū)的恒定結(jié)構(gòu)域的組合，所述fc區(qū)基于對于預(yù)期用途的抗體的生物學(xué)活性(如果有的話)進行選擇。salfeld(2007)nat.biotechnol.25:1369。人igg，例如，可分類為4個亞類，igg1,igg2,igg3和igg4，和其各自包含具有結(jié)合一種或多種fcγ受體(活化受體fcγri(cd64)、fcγriia、fcγriic(cd32)；fcγriiia和fcγriiib(cd16)和抑制受體fcγriib)和補體的第一組分(c1q)的獨特特征的fc區(qū)。人igg1和igg3結(jié)合所有fcγ受體；igg2結(jié)合fcγriiah131，和具有對fcγriiar131fcγriiiav158較低的親和力；igg4結(jié)合fcγri,fcγriia,fcγriib,fcγriic和fcγriiiav158；和抑制性受體fcγriib具有與所有其它fcγ受體相比，對igg1,igg2和igg3更低的親和力。bruhnsetal.(2009)blood113:3716。研究表明fcγri不結(jié)合igg2，和fcγriiib不結(jié)合igg2或igg4。同上。一般而言，關(guān)于adcc活性，人igg1≧igg3?igg4≧igg2。因此，可選擇例如igg1恒定結(jié)構(gòu)域，而非igg2或igg4，用于藥物，其中adcc是需要的；如果活化表達fcγriiia的nk細胞、單核細胞或巨噬細胞，可選擇igg3；和如果抗體用于使過敏患者脫敏，可選擇igg4。如果期需抗體缺少所有的效應(yīng)子功能，也可選擇igg4。本文所述的抗-tigit可變區(qū)可連接(例如，共價連接或融合)至fc，例如，igg1,igg2,igg3或igg4fc，其可具有任何同種異型或異同種異型，例如，對于igg1:g1m,g1m1(a),g1m2(x),g1m3(f),g1m17(z);對于igg2:g2m,g2m23(n);對于igg3:g3m,g3m21(g1),g3m28(g5),g3m11(b0),g3m5(b1),g3m13(b3),g3m14(b4),g3m10(b5),g3m15(s),g3m16(t),g3m6(c3),g3m24(c5),g3m26(u),g3m27(v)。參見例如，jefferisetal.(2009)mabs1:1)。同種異型的選擇可受潛在的免疫原性顧慮的影響，例如，以使抗-藥物抗體的形成最小化。在某些實施方案中，本文所述的抗-tigit可變區(qū)連接至結(jié)合一個或多個活化fc受體(fcγri/cd64,fcγriia/cd32或fcγriiia/cd16)的fc，和從而刺激adcc和可導(dǎo)致t細胞耗盡。在某些實施方案中，本文所述的抗-tigit可變區(qū)連接至人igg1或igg3fc，即，抗體具有igg1或igg3同種型。在某些實施方案中，抗-tigit抗體是耗盡抗體，特別是，它們在腫瘤微環(huán)境中耗盡treg細胞，而非teff細胞(從而增強抗-腫瘤活性)，但不顯著耗盡腫瘤微環(huán)境外，例如，在外周中的treg和teff細胞。在某些實施方案中，抗-tigit抗體具有天然存在的或非-天然存在的同種型(例如，包括突變)，其刺激腫瘤位點的treg細胞耗盡或消除和同時活化teff細胞。在某些實施方案中，抗-tigit抗體導(dǎo)致腫瘤位點的teff與treg比率升高，這表明有效的抗-腫瘤活性，優(yōu)選地沒有顯著耗盡腫瘤微環(huán)境外，例如，在外周中的treg和teff細胞。在其它實施方案中，抗-tigit抗體阻斷tregs的免疫抑制性活性。在某些實施方案中，抗-tigit抗體具有fc，且fcr結(jié)合減少或消除，例如對活化fcr的結(jié)合減少。本文描述的抗-tigit可變區(qū)可連接至非-天然存在的fc區(qū)，例如，無效應(yīng)或大部分無效應(yīng)fc(例如，人igg2或igg4)，或者，具有與一種或多種活化fc受體(fcγri,fcγriia或fcγriiia)的結(jié)合增強的fc，例如以增強腫瘤環(huán)境中的treg耗盡。本文所述的可變區(qū)可連接至包含一種或多種修飾的fc，通常以改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，例如血清半壽期、補體固定、fc受體結(jié)合和/或抗原-依賴性細胞的細胞毒性。此外，本文所述的抗體可經(jīng)化學(xué)修飾(例如，一個或多個化學(xué)部分可連接至抗體)或其可經(jīng)修飾以改變其糖基化，以改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。每個這些實施方案在下文更詳細地描述。fc區(qū)的殘基編號根據(jù)kabat的eu索引。本文公開的序列變體參照殘基號提供，后面是代替天然存在的氨基酸而置換的氨基酸，任選地前面是該位置處天然存在的殘基。在給定的位置可存在多個氨基酸的情況下，例如，如果在天然存在的同種型之間序列不同，或如果在該位置多個突變可被置換，它們通過斜線分開(例如，“x/y/z”)。例如，可在fc區(qū)進行修飾以產(chǎn)生fc變體，相對于親本fc，其具有(a)增加或降低的抗體-依賴性細胞-介導(dǎo)的細胞毒性(adcc),(b)增加或降低的補體介導(dǎo)的細胞毒性(cdc),(c)增加或降低的對c1q的親和力和/或(d)增加或降低的對fc受體的親和力。這樣的fc區(qū)變體通常包含在fc區(qū)的至少一個氨基酸修飾。認為組合氨基酸修飾是特別需要的。例如，變體fc區(qū)可在其中，例如，在其中鑒定的特定fc區(qū)位置包括2、3、4、5個等的置換。本文公開了實例性的fc序列變體，和還提供在美國專利號5,624,821;6,277,375;6,737,056;6,194,551;7,317,091;8,101,720;pct專利公開wo00/42072;wo01/58957;wo04/016750;wo04/029207;wo04/035752;wo04/074455;wo04/099249;wo04/063351;wo05/070963;wo05/040217,wo05/092925和wo06/020114。減少效應(yīng)子功能adcc活性可通過修飾fc區(qū)而減少。在某些實施方案中，影響與fc受體結(jié)合的位點可被除去，優(yōu)選地并非補救受體結(jié)合位點的位點。在其它實施方案中，fc區(qū)可經(jīng)修飾以除去adcc位點。adcc位點是本領(lǐng)域已知的，關(guān)于igg1的adcc位點，參見例如,sarmayetal.(1992)molec.immunol.29(5):633-9。在一個實施方案中，人igg1的g236r和l328r變體有效地消除fcγr結(jié)合。hortonetal.(2011)j.immunol.186:4223和chuetal.(2008)mol.immunol.45:3926。在其它實施方案中，與fcγrs結(jié)合降低的fc包含氨基酸置換l234a,l235e和g237a。grossetal.(2001)immunity15:289。cdc活性也可通過修飾fc區(qū)而減少。igg1位置d270,k322,p329和p331的突變，特別是丙氨酸突變d270a,k322a,p329a和p331a，顯著減少相應(yīng)的抗體結(jié)合c1q和激活補體的能力。idusogieetal.(2000)j.immunol.164:4178;wo99/51642。igg1的位置331的修飾(例如，p331s)已表明減少補體結(jié)合。taoetal.(1993)j.exp.med.178:661和canfield&morrison(1991)j.exp.med.173:1483。在另一個實例中，氨基酸位置231-239內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基被改變從而減少抗體固定補體的能力。wo94/29351。在一些實施方案中，補體固定減少的fc具有氨基酸置換a330s和p331s。grossetal.(2001)immunity15:289。對于其中效應(yīng)子功能被完全避免的應(yīng)用，例如，當(dāng)抗原結(jié)合單獨足以產(chǎn)生需要的治療益處，和效應(yīng)子功能僅導(dǎo)致(或增加風(fēng)險)不需要的副作用時，可使用igg4抗體，或可設(shè)計缺少fc區(qū)或其大部分的抗體或片段，或fc可經(jīng)突變以完全消除糖基化(例如，n297a)?；蛘撸呀?jīng)產(chǎn)生人igg2(ch1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū))和人igg4(ch2和ch3結(jié)構(gòu)域)的雜合構(gòu)建體，其避免效應(yīng)子功能，缺少結(jié)合fcγrs(如同igg2)的能力和不能活化補體(如同igg4)。rotheretal.(2007)nat.biotechnol.25:1256。亦參見muelleretal.(1997)mol.immunol.34:441;labrijnetal.(2008)curr.op.immunol.20:479(總體上論述了fc修飾以減少效應(yīng)子功能)。在其它實施方案中，fc區(qū)通過替換至少一個氨基酸殘基為不同的氨基酸殘基來改變，以減少抗體的整體效應(yīng)子功能。例如，選自氨基酸殘基234,235,236,237,297,318,320和322的一個或多個氨基酸可替換為不同的氨基酸殘基，使得抗體對效應(yīng)配體親和力降低，但保留親本抗體的抗原-結(jié)合能力。親和力改變的效應(yīng)配體可以是例如，fc受體(殘基234,235,236,237,297)或補體的c1組分(殘基297,318,320,322)。winteretal的美國專利號5,624,821和5,648,260。一個早期的專利申請?zhí)嶙h在iggfc區(qū)的修飾以降低對fcγri的結(jié)合，來減少adcc(234a;235e;236a;g237a)或阻斷對補體組分c1q的結(jié)合以消除cdc(e318a或v/k320a和k322a/q)。wo88/007089。亦參見duncan&winter(1988)nature332:563;chappeletal.(1991)proc.nat’lacad.sci.(usa)88:9036;和sondermannetal.(2000)nature406:267(論述了這些突變對fcγriii結(jié)合的影響)。減少效應(yīng)子功能的fc修飾還包括位置234,235,236,237,267,269,325和328的置換、插入和缺失，例如234g,235g,236r,237k,267r,269r,325l和328r。fc變體可包含236r/328r。減少fcyr和補體相互作用的其它修飾包括置換297a,234a,235a,237a,318a,228p,236e,268q,309l,330s,331s,220s,226s,229s,238s,233p和234v。這些和其它修飾論述于strohl(2009)currentopinioninbiotechnology20:685-691。通過突變在位置233–236和327–331的一個或多個的igg殘基，例如igg1中的e233p,l234v,l235a,任選地g236?,a327g,a330s和p331s；igg4中的e233p,f234v,l235a,任選地g236?；和igg2中的a330s和p331s，可減少效應(yīng)子功能(adcc和補體活化二者)，同時保持新生fcr結(jié)合(保持半壽期)。參見armouretal.(1999)eur.j.immunol.29:2613;wo99/58572。減少效應(yīng)子功能的其它突變包括igg1的l234a和l235a(alegreetal.(1994)transplantation57:1537);igg2的v234a和g237a(coleetal.(1997)j.immunol.159:3613;亦參見美國專利號5,834,597);和igg4的s228p和l235e(reddyetal.(2000)j.immunol.164:1925)。人igg1中減少效應(yīng)子功能的另一突變組合包括l234f,l235e和p331s。oganesyanetal.(2008)actacrystallogr.d.biol.crystallogr.64:700?？傮w上參見labrijnetal.(2008)curr.op.immunol.20:479。發(fā)現(xiàn)在fc(igg1)融合蛋白(abatacept)的情況下降低效應(yīng)子功能的另外的突變是c226s,c229s和p238s(eu殘基編號)。davisetal.(2007)j.immunol.34:2204。具有減少的adcc和/或cdc的其它fc變體公開于glaesneretal.(2010)diabetesmetab.res.rev.26:287(igg4中的f234a和l235a以減少adcc和adcp);hutchinsetal.(1995)proc.nat’lacad.sci.(usa)92:11980(igg4中的f234a,g237a和e318a);anetal.(2009)mabs1:572和美國專利申請公開號2007/0148167(igg2中的h268q,v309l,a330s和p331s);mcearchernetal.(2007)blood109:1185(igg1中的c226s,c229s,e233p,l234v,l235a);vafaetal.(2014)methods65:114(igg2中的v234v,g237a,p238s,h268a,v309l,a330s,p331s)。在某些實施方案中，選擇基本上沒有效應(yīng)子功能的fc，即，對fcγr的結(jié)合減少和補體固定減少。實例性的無效應(yīng)的fc，例如，igg1fc，包含以下5個突變：l234a,l235e,g237a,a330s和p331s。grossetal.(2001)immunity15:289。這5個置換可與n297a組合以同樣消除糖基化。提高效應(yīng)子功能或者，adcc活性可通過修飾fc區(qū)而增加。關(guān)于adcc活性，人igg1≧igg3?igg4≧igg2，因此可選擇igg1恒定結(jié)構(gòu)域，而非igg2或igg4，用于藥物，其中adcc是需要的。或者，通過修飾以下位置的一個或多個氨基酸，fc區(qū)可經(jīng)修飾以增加抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)和/或增加對fcγ受體的親和力：234,235,236,238,239,240,241,243,244,245,247,248,249,252,254,255,256,258,262,263,264,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,299,301,303,305,307,309,312,313,315,320,322,324,325,326,327,329,330,331,332,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,433,434,435,436,437,438或439。seewo2012/142515;亦參見wo00/42072。實例性的置換包括236a,239d,239e,268d,267e,268e,268f,324t,332d和332e。實例性的變體包括239d-332e,236a-332e,236a-239d-332e,268f-324t,267e-268f,267e-324t和267e-268f-324t。例如，包含g236a變體的人igg1fcs，其可任選地與i332e組合，已表明增加fcγriia/fcγriib結(jié)合親和力比率大約15倍。richardsetal.(2008)mol.cancertherap.7:2517;mooreetal.(2010)mabs2:181。提高fcyr和補體相互作用的其它修飾包括但不限于置換298a,333a,334a,326a,247i,339d,339q,280h,290s,298d,298v,243l,292p,300l,396l,305i和396l。這些和其它修飾論述于strohl(2009)currentopinioninbiotechnology20:685-691。特別是，通過igg1的位置e333的變化，例如，e333a，adcc和cdc二者可增強。shieldsetal.(2001)j.biol.chem.276:6591。在igg1中使用p247i和a339d/q突變以增強效應(yīng)子功能公開于wo2006/020114，和d280h,k290s±s298d/v公開于wo2004/074455。已經(jīng)表明人igg1中k326a/w和e333a/s變體，和igg2中的e333s，增加效應(yīng)子功能。idusogieetal.(2001)j.immunol.166:2571。特別是，人igg1上對fcγr1,fcγrii,fcγriii和fcrn的結(jié)合位點已經(jīng)作圖，和已經(jīng)描述了具有改進的結(jié)合的變體。shieldsetal.(2001)j.biol.chem.276:6591-6604。位置256,290,298,333,334和339的特定突變表明改進對fcγriii的結(jié)合，包括組合突變體t256a-s298a,s298a-e333a,s298a-k224a和s298a-e333a-k334a(具有增強的fcγriiia結(jié)合和adcc活性)。已經(jīng)鑒定對fcγriiia結(jié)合強力增強的其它igg1變體，包括具有s239d-i332e和s239d-i332e-a330l突變的變體，其顯示對fcγriiia的親和力最大增加，fcγriib結(jié)合降低，和在食蟹猴中強的細胞毒性活性。lazaretal.(2006)proc.nat’lacad.sci.(usa)103:4005;awanetal.(2010)blood115:1204;desjarlais&lazar(2011)exp.cellres.317:1278。引入三重突變至抗體例如阿侖單抗(cd52-特異性的)、曲妥單抗(her2/neu-特異性的)、利妥昔單抗(cd20-特異性的)和西妥昔單抗(egfr-特異性的)轉(zhuǎn)化為體外極大增強的adcc活性，和s239d-i332e變體顯示在猴中增強的耗盡b細胞的能力。lazaretal.(2006)proc.nat’lacad.sci.(usa)103:4005。此外，已經(jīng)鑒定了包含l235v,f243l,r292p,y300l,v305i和p396l突變的igg1突變體，其在表達人fcγriiia的轉(zhuǎn)基因小鼠中在b細胞惡性腫瘤和乳腺癌模型中顯示增強的對fcγriiia的結(jié)合和同時增強的adcc活性。stavenhagenetal.(2007)cancerres.67:8882;美國專利號8,652,466;nordstrometal.(2011)breastcancerres.13:r123。不同的igg同種型還顯示不同的cdc活性(igg3>igg1>>igg2≈igg4)。dangletal.(1988)emboj.7:1989。對于其中需要增強的cdc的應(yīng)用，引入增加對c1q結(jié)合的突變也是可能的。募集補體(cdc)的能力可通過igg2中k326和/或e333的突變，例如k326w(其減少adcc活性)和e333s增強，以增加對c1q，補體級聯(lián)中的第一組分的結(jié)合。idusogieetal.(2001)j.immunol.166:2571。引入s267e/h268f/s324t(單獨或以任何組合)至人igg1增強c1q結(jié)合。mooreetal.(2010)mabs2:181。natsumeetal.(2008)cancerres.68:3863(其中的圖1)的igg1/igg3雜合同種型抗體“113f”的fc區(qū)也提供增強的cdc。亦參見michaelsenetal.(2009)scand.j.immunol.70:553和redpathetal.(1998)immunology93:595?？稍黾踊蚪档托?yīng)子功能的另外的突變公開于dall’acquaetal.(2006)j.immunol.177:1129。亦參見carter(2006)nat.rev.immunol.6:343;presta(2008)curr.op.immunol.20:460。盡管與本發(fā)明的拮抗劑抗-tigitmab沒有必然關(guān)聯(lián)，但增強對抑制性受體fcyriib的親和力的fc變體可增強凋亡誘導(dǎo)或輔助活性。li&ravetch(2011)science333:1030;li&ravetch(2012)proc.nat’lacad.sci.(usa)109:10966;美國專利申請公開號2014/0010812。這樣的變體可提供具有與fcyriib+細胞，包括例如b細胞和單核細胞有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)活性的抗體。在一個實施方案中，相對于一種或多種活化受體，fc變體提供選擇性增強的對fcyriib的親和力。改變對fcyriib結(jié)合的修飾包括選自234,235,236,237,239,266,267,268,325,326,327,328和332的位置(根據(jù)eu索引)的一種或多種修飾。提高fcyriib親和力的實例性的置換包括但不限于234d,234e,234f,234w,235d,235f,235r,235y,236d,236n,237d,237n,239d,239e,266m,267d,267e,268d,268e,327d,327e,328f,328w,328y和332e。實例性的置換包括235y,236d,239d,266m,267e,268d,268e,328f,328w和328y。提高對fcyriib結(jié)合的其它fc變體包括235y-267e,236d-267e,239d-268d,239d-267e,267e-268d,267e-268e和267e-328f。特別是，人igg1的s267e,g236d,s239d,l328f和i332e變體，包括s267e-l328f雙重變體在特異性提高對抑制性fcyriib受體的親和力中具有特別的價值。chuetal.(2008)mol.immunol.45:3926;美國專利申請公開號2006/024298;wo2012/087928。對fcγriib增強的特異性(與fcγriiar131不同)可通過加入p238d置換和其它突變(mimotoetal.(2013)protein.eng.des.&selection26:589;wo2012/115241)，以及v262e和v264e(yuetal.(2013)j.am.chem.soc.135:9723和wo2014/184545)而獲得。半壽期延長在某些實施方案中，抗體經(jīng)修飾以增加其生物半壽期。各種方法是可能的。例如，這可通過增加fc區(qū)對fcrn的結(jié)合親和力進行。在一個實施方案中，在ch1或cl區(qū)內(nèi)改變抗體以包含獲自igg的fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)的補救受體結(jié)合表位，如描述于prestaetal的美國專利號5,869,046和6,121,022。增加對fcrn結(jié)合和/或改進藥代動力學(xué)性質(zhì)的其它實例性的fc變體包括位置259,308和434的置換，包括例如259i,308f,428l,428m,434s,434h,434f,434y和434m。增加fc對fcrn的結(jié)合的其它變體包括：250e,250q,428l,428f,250q/428l(hintonetal.,2004,j.biol.chem.279(8):6213-6216,hintonetal.2006journalofimmunology176:346-356),256a,272a,305a,307a,311a,312a,378q,380a,382a,434a(shieldsetal,journalofbiologicalchemistry,2001,276(9):6591-6604),252f,252y,252w,254t,256q,256e,256d,433r,434f,434y,252y/254t/256e,433k/434f/436h(dall’acquaetal.journalofimmunology,2002,169:5171-5180,dall’acquaetal.,2006,journalofbiologicalchemistry281:23514-23524)。參見美國專利號8,367,805。iggfc中某些保守殘基(i253,h310,q311,h433,n434)的修飾，例如n434a變體(yeungetal.(2009)j.immunol.182:7663)已經(jīng)提議作為增加fcrn親和力，從而增加循環(huán)中抗體的半壽期的一種方式。wo98/023289。包含m428l和n434s的組合fc變體已經(jīng)表明增加fcrn結(jié)合和增加血清半壽期至多5倍。zalevskyetal.(2010)nat.biotechnol.28:157。包含t307a,e380a和n434a修飾的組合fc變體也延長igg1抗體的半壽期。petkovaetal.(2006)int.immunol.18:1759。此外，包含m252y-m428l,m428l-n434h,m428l-n434f,m428l-n434y,m428l-n434a,m428l-n434m和m428l-n434s變體的組合fc變體也已表明延長半壽期。wo2009/086320。此外，包含m252y,s254t和t256e的組合fc變體增加半壽期接近4倍。dall’acquaetal.(2006)j.biol.chem.281:23514。提供增加的fcrn親和力但降低的ph依賴性的相關(guān)的igg1修飾(m252y-s254t-t256e-h433k-n434f)已用于產(chǎn)生igg1構(gòu)建體(“mst-hnabdeg”)，用作競爭物以阻止其它抗體與fcrn的結(jié)合，導(dǎo)致其它抗體(內(nèi)源igg(例如，在自身免疫情況下)或其它外源(治療性)mab)的清除率增加。vaccaroetal.(2005)nat.biotechnol.23:1283;wo2006/130834。增加fcrn結(jié)合的其它修飾描述于yeungetal.(2010)j.immunol.182:7663-7671;6,277,375;6,821,505;wo97/34631;wo2002/060919。在某些實施方案中，雜合igg同種型可用于增加fcrn結(jié)合，和潛在地增加半壽期。例如，igg1/igg3雜合變體可通過在兩種同種型不同的位置處，置換ch2和/或ch3區(qū)中的igg1位置為來自igg3的氨基酸構(gòu)建。因此，可構(gòu)建雜合變體igg抗體，其包含一個或多個置換，例如，274q,276k,300f,339t,356e,358m,384s,392n,397m,422i,435r和436f。在本文描述的其它實施方案中，igg1/igg2雜合變體可通過在兩種同種型不同的位置處，置換ch2和/或ch3區(qū)中的igg2位置為來自igg1的氨基酸構(gòu)建。因此，可構(gòu)建雜合變體igg抗體，其包含一個或多個置換，例如，一個或多個以下氨基酸置換：233e,234l,235l,–236g(涉及在位置236插入甘氨酸)和327a。參見美國專利號8,629,113。已產(chǎn)生igg1/igg2/igg4雜合序列，其據(jù)稱增加血清半壽期和改進表達。美國專利號7,867,491(其中的序列號18)。本發(fā)明的抗體的血清半壽期也可通過聚乙二醇化而增加?？贵w可經(jīng)聚乙二醇化，以例如增加抗體的生物學(xué)(例如，血清)半壽期。為了將抗體聚乙二醇化，抗體或其片段通常與聚乙二醇(peg)試劑，例如peg的活性酯或醛衍生物在其中一個或多個peg基團與抗體或抗體片段連接的條件下反應(yīng)。優(yōu)選地，聚乙二醇化通過與活性peg分子(或類似的活性水-可溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進行。如本文所用的，術(shù)語“聚乙二醇”意欲包括用于衍生其它蛋白的任何形式的peg，例如單(c1-c10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，待聚乙二醇化的抗體是未糖基化抗體。用于聚乙二醇化蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，可應(yīng)用于本文描述的抗體。參見例如nishimuraetal的ep0154316和ishikawaetal的ep0401384?；蛘撸谝恍┣闆r下，可能需要降低本發(fā)明的抗體的半壽期，而不是增加。人igg1的fc中的修飾例如i253a(hornicketal.(2000)j.nucl.med.41:355)和h435a/r,i253a或h310a(kimetal.(2000)eur.j.immunol.29:2819)可降低fcrn結(jié)合，從而降低半壽期(增加清除率)，其在其中快速清除是優(yōu)選的情況，例如醫(yī)學(xué)成像下使用。亦參見kenanovaetal.(2005)cancerres.65:622。增強清除率的其它方式包括將本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域格式化為缺少結(jié)合fcrn的能力的抗體片段，例如fab片段。這樣的修飾可將抗體的循環(huán)半壽期從數(shù)周減少至大約數(shù)小時。如果需要的話，抗體片段的選擇性聚乙二醇化然后可用于細微調(diào)節(jié)(增加)抗體片段的半壽期。chapmanetal.(1999)nat.biotechnol.17:780?？贵w片段還可與人血清白蛋白融合，例如在融合蛋白構(gòu)建體中，以增加半壽期。yehetal.(1992)proc.nat’lacad.sci.89:1904?；蛘?，雙特異性抗體可用本發(fā)明的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和結(jié)合人血清白蛋白(hsa)的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建。參見國際專利申請公布wo2009/127691和其中引用的專利文獻?；蛘?，專門的多肽序列可加入抗體片段以增加半壽期，例如，“xten”多肽序列。schellenbergeretal.(2009)nat.biotechnol.27:1186;國際專利申請公布wo2010/091122。另外的fc變體當(dāng)使用igg4恒定結(jié)構(gòu)域時，通常優(yōu)選包括置換s228p，其模擬igg1中的鉸鏈序列，從而使igg4分子穩(wěn)定，例如，在治療的患者中減少治療性抗體和內(nèi)源igg4之間的fab-臂交換。labrijnetal.(2009)nat.biotechnol.27:767;reddyetal.(2000)j.immunol.164:1925。igg1構(gòu)建體的鉸鏈中的潛在的蛋白酶裂解位點可通過d221g和k222s修飾而消除，增加了抗體的穩(wěn)定性。wo2014/043344。fc變體對其配體(fc受體)的親和力和結(jié)合性質(zhì)可通過本領(lǐng)域已知的各種體外測定法(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的測定法)測定，包括但不限于平衡方法(例如，酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)或放射免疫測定法(ria))或動力學(xué)(例如，biacore?spr分析)，和其它方法，例如間接結(jié)合測定法、競爭性抑制測定法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)、凝膠電泳和色譜(例如，凝膠過濾)。這些和其它方法可使用檢查的一個或多個組分上的標記和/或使用各種檢測方法，包括但不限于發(fā)色、熒光、發(fā)光或同位素標記。結(jié)合親和力和動力學(xué)的詳細描述可見于paul,w.e.,ed.,fundamentalimmunology,4thed.,lippincott-raven,philadelphia(1999)，其聚焦于抗體-免疫原相互作用。在仍其它的實施方案中，抗體的糖基化經(jīng)修飾以增加或降低效應(yīng)子功能。例如，可制備未糖基化的抗體，其通過突變位置297的保守的天冬酰胺殘基(例如，n297a)，因此廢除補體和fcγri結(jié)合，缺少所有的效應(yīng)子功能。boltetal.(1993)eur.j.immunol.23:403。亦參見tao&morrison(1989)j.immunol.143:2595(使用igg1中的n297q以消除位置297的糖基化)。盡管未糖基化抗體通常缺少效應(yīng)子功能，但可引入突變以恢復(fù)該功能。未糖基化抗體，例如，自n297a/c/d/或h突變產(chǎn)生或在不將蛋白糖基化的系統(tǒng)(例如大腸桿菌)中產(chǎn)生的那些，可進一步突變以恢復(fù)fcγr結(jié)合，例如，s298g和/或t299a/g/或h(wo2009/079242)，或e382v和m428i(jungetal.(2010)proc.nat’lacad.sci.(usa)107:604)。另外，具有增強的adcc的抗體可通過改變糖基化制備。例如基于改進的對fcγriiia的結(jié)合，從重鏈asn297-連接的寡糖除去巖藻糖已經(jīng)表明增強adcc。shieldsetal.(2002)jbc277:26733;niwaetal.(2005)j.immunol.methods306:151;cardarellietal.(2009)clin.cancerres.15:3376(mdx-1401);cardarellietal.(2010)cancerimmunol.immunotherap.59:257(mdx-1342)。這樣的低巖藻糖抗體可，例如，在缺少巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fut8)的敲除中國倉鼠卵巢(cho)細胞中(yamane-ohnukietal.(2004)biotechnol.bioeng.87:614)，或在產(chǎn)生無巖藻糖化抗體的其它細胞中產(chǎn)生。參見例如，zhangetal.(2011)mabs3:289和lietal.(2006)nat.biotechnol.24:210(均描述了在糖工程改造的巴斯德畢赤酵母中的抗體產(chǎn)生)；mossneretal.(2010)blood115:4393;shieldsetal.(2002)j.biol.chem.277:26733;shinkawaetal.(2003)j.biol.chem.278:3466;ep1176195b1。adcc還可按pct公開號wo03/035835中所述增強，其公開了使用變體cho細胞系，lec13，其將巖藻糖連接至asn(297)-連接的糖的能力降低，也導(dǎo)致在宿主細胞中表達的抗體的低巖藻糖化。亦參見shields,r.l.etal.(2002)j.biol.chem.277:26733-26740。或者，在抗體產(chǎn)生期間巖藻糖類似物可加入培養(yǎng)基，以抑制摻入巖藻糖至抗體上的糖。wo2009/135181。增加抗體-連接的寡糖的二等分glcnac結(jié)構(gòu)也增強adcc。umanaetal的pct公開號wo99/54342描述了細胞系經(jīng)工程改造以表達糖蛋白-修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰基葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶iii(gntiii))，使得工程改造細胞系上表達的抗體顯示增加的二等分glcnac結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的adcc活性增加(亦參見umanaetal.(1999)nat.biotech.17:176-180)。已開發(fā)了另外的糖基化變體，其缺乏半乳糖、唾液酸、巖藻糖和木糖殘基(所謂的gngn糖型)，其顯示增強的adcc和adcp但降低的cdc，以及缺乏唾液酸、巖藻糖和木糖(所謂的g1/g2糖型)的其它變體，其顯示增強的adcc、adcp和cdc。美國專利申請公開號2013/0149300。具有這些糖基化模式的抗體任選地在遺傳修飾的n.benthamiana植物中產(chǎn)生，其中內(nèi)源木糖基和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因已被敲除。糖工程改造還可用于通過改變fc區(qū)的asn297連接的糖鏈的α2,6唾液酸含量，修飾igg構(gòu)建體的抗-炎性質(zhì)，其中增加比例的α2,6唾液酸化形式導(dǎo)致增強的抗-炎效果。參見nimmerjahnetal.(2008)ann.rev.immunol.26:513。相反，在其中不需要抗-炎性質(zhì)的情況下可使用降低的比例具有α2,6唾液酸化糖的抗體。修飾抗體的α2,6唾液酸化含量的方法，例如通過選擇性純化α2,6唾液酸化形式或通過酶修飾，在美國專利申請公開號2008/0206246中提供。在其它實施方案中，fc區(qū)的氨基酸序列可經(jīng)修飾以模擬α2,6唾液酸化的作用，例如通過包含f241a修飾。wo2013/095966。iii.抗體物理性質(zhì)本文所述的抗體可在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含一個或多個糖基化位點。這樣的糖基化位點可導(dǎo)致抗體的免疫原性增加或由于改變的抗原結(jié)合導(dǎo)致的抗體pk改變(marshalletal.(1972)ann.rev.biochem.41:673-702;gala和morrison(2004)j.immunol.172:5489-94;wallicketal.(1988)j.exp.med.168:1099-109;spiro(2002)glycobiology12:43r-56r;parekhetal.(1985)nature316:452-7;mimuraetal.(2000)mol.immunol.37:697-706)。已知糖基化發(fā)生在包含n-x-s/t序列的基序中。在一些情況下，優(yōu)選具有不包含可變區(qū)糖基化的抗-tigit抗體。這可通過選擇在可變區(qū)中不包含糖基化基序的抗體或通過將糖基化區(qū)內(nèi)的殘基突變實現(xiàn)。在某些實施方案中，本文所述的抗體不包含天冬酰胺異構(gòu)位點。天冬酰胺的脫酰胺可發(fā)生在n-g或d-g序列上，導(dǎo)致產(chǎn)生異天冬氨酸殘基，這將扭結(jié)(kink)引入至多肽鏈和降低其穩(wěn)定性(異天冬氨酸作用)。各抗體具有獨特的等電點(pi)，其通常落入6-9.5的ph范圍。igg1抗體的pi通常落入7-9.5的ph范圍和igg4抗體的pi通常落入6-8的ph范圍。推測pi在正常范圍外的抗體可在體內(nèi)條件下具有一定的解折疊和不穩(wěn)定性。因此，優(yōu)選具有包含落入正常范圍的pi值的抗-tigit抗體。這可通過選擇pi在正常范圍內(nèi)的抗體或通過突變帶電荷的表面殘基實現(xiàn)。各抗體具有特有的解鏈溫度，較高的解鏈溫度指示較大的體內(nèi)整體穩(wěn)定性(krishnamurthyr和manningmc(2002)currpharmbiotechnol3:361-71)。通常，優(yōu)選tm1(初始解折疊溫度)大于60℃，優(yōu)選地大于65℃，甚至更優(yōu)選地大于70℃?？贵w的熔點可使用差異掃描量熱法(chenetal(2003)pharmres20:1952-60;ghirlandoetal.(1999)immunollett.68:47-52)或圓二色性(murrayetal.(2002)j.chromatogr.sci.40:343-9)測量。在優(yōu)選的實施方案中，選擇不快速降解的抗體。抗體的降解可使用毛細管電泳(ce)和maldi-ms(alexanderaj和hughesde(1995)analchem.67:3626-32)測量。在另一優(yōu)選的實施方案中，選擇具有最小聚集作用的抗體，聚集作用可導(dǎo)致觸發(fā)不需要的免疫反應(yīng)和/或改變或不利的藥代動力學(xué)性質(zhì)。一般而言，具有25%或更小、優(yōu)選地20%或更小、甚至更優(yōu)選地15%或更小、甚至更優(yōu)選地10%或更小和甚至更優(yōu)選地5%或更小的聚集的抗體是可接受的。聚集可通過數(shù)種技術(shù)測量，包括大小排阻柱(sec)、高效液相色譜(hplc)和光散射。iv.核酸分子本文描述的另一方面涉及編碼本文所述的抗體的核酸分子。核酸可以全細胞、細胞裂解物或部分純化或基本純化形式提供。當(dāng)自其它細胞組分或其它雜質(zhì)，例如，其它細胞核酸(例如，其它染色體dna，例如，與分離的dna天然連接的染色體dna)或蛋白中通過標準技術(shù)，包括堿/sds處理、cscl分帶、柱色譜、限制性酶、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù)純化時，核酸是"分離的"或"基本上純的"。參見f.ausubel,etal.,ed.(1987)currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork。本文所述的核酸可以是例如dna或rna，和可以或可以不包含內(nèi)含子序列。在某些實施方案中，核酸是cdna分子。本文所述的核酸可使用標準分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對于雜交瘤表達的抗體(例如，自帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤，如下文進一步描述的)，編碼由雜交瘤制備的抗體的輕鏈和重鏈的cdna可通過標準pcr擴增或cdna克隆技術(shù)獲得。對于獲自免疫球蛋白基因文庫的抗體(例如，使用噬菌體展示技術(shù))，編碼抗體的核酸可自文庫回收。一旦獲得編碼vh和vl區(qū)段的dna片段，這些dna片段可通過標準重組dna技術(shù)進一步操作，例如以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、fab片段基因或scfv基因。在這些操作中，編碼vl或vh的dna片段可操作連接至編碼另一蛋白，例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭的另一dna片段。在此情況下使用的術(shù)語"可操作連接"意指兩個dna片段經(jīng)連接，使得由兩個dna片段編碼的氨基酸序列仍符合讀框。編碼vh區(qū)的分離的dna可通過可操作連接編碼vh的dna與編碼重鏈恒定區(qū)(鉸鏈,ch1,ch2和/或ch3)的另一dna分子，轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，kabat,e.a.,elal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)和包含這些區(qū)域的dna片段可通過標準pcr擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是igg1,igg2,igg3,igg4,iga,ige,igm或igd恒定區(qū)，例如igg1區(qū)。對于fab片段重鏈基因，編碼vh的dna可操作連接至僅編碼重鏈ch1恒定區(qū)的另一dna分子。編碼vl區(qū)的分離dna可通過可操作連接編碼vl的dna至編碼輕鏈恒定區(qū)cl的另一dna分子轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)和包含這些區(qū)域的dna片段可通過標準pcr擴增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scfv基因，編碼vh和vl的dna片段可操作連接至編碼柔性接頭，例如，編碼氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段，使得vh和vl序列可作為相鄰的單鏈蛋白表達，其中vl和vh區(qū)通過柔性接頭連接(參見例如，birdetal.(1988)science242:423-426;hustonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883;mccaffertyetal.,(1990)nature348:552-554)。v.抗體產(chǎn)生本發(fā)明的各種抗體，例如，與本文公開的抗-人tigit抗體競爭或結(jié)合相同的表位的那些，可使用各種已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如kohler和milstein,nature256:495(1975)描述的標準體細胞雜交技術(shù)。盡管體細胞雜交程序是優(yōu)選的，但原則上，也可使用產(chǎn)生單克隆抗體的其它技術(shù)，例如，b淋巴細胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化，使用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。小鼠中雜交瘤產(chǎn)生是充分建立的程序。免疫方案和分離免疫的脾細胞用于融合的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合配對細胞(例如，鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也是已知的。本文所述的嵌合或人源化抗體可基于按上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna可使用標準分子生物學(xué)技術(shù)獲自目的鼠雜交瘤和經(jīng)工程改造以包含非-鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，鼠可變區(qū)可使用本領(lǐng)域已知的方法連接至人恒定區(qū)(參見例如，cabillyetal.的美國專利號4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，鼠cdr區(qū)可使用本領(lǐng)域已知的方法插入人框架(參見例如，winter的美國專利號5,225,539和queenetal.的美國專利號5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。在一個實施方案中，本文所述的抗體是人單克隆抗體。這樣的針對tigit的人單克隆抗體可使用帶有人免疫系統(tǒng)的一部分而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠制備。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括本文分別稱為humab小鼠和km小鼠的小鼠，和在本文中統(tǒng)稱為“人ig小鼠”。humab小鼠?(medarex,inc.)包含人免疫球蛋白基因微基因座，其編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列，以及滅活內(nèi)源μ和κ鏈基因座的靶向突變(參見例如，lonberg,etal.(1994)nature368(6474):856-859)。因此，小鼠顯示降低的小鼠igm或κ表達，和在對免疫的反應(yīng)中，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和力人iggκ單克隆(lonberg,n.etal.(1994),同上;綜述于lonberg,n.(1994)handbookofexperimentalpharmacology113:49-101;lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.13:65-93,和harding,f.和lonberg,n.(1995)ann.n.y.acad.sci.764:536-546)。humab小鼠的制備和用途，和所述小鼠帶有的基因組修飾，進一步描述于taylor,l.etal.(1992)nucleicacidsresearch20:6287-6295;chen,j.etal.(1993)internationalimmunology5:647-656;tuaillonetal.(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:3720-3724;choietal.(1993)naturegenetics4:117-123;chen,j.etal.(1993)emboj.12:821-830;tuaillonetal.(1994)j.immunol.152:2912-2920;taylor,l.etal.(1994)internationalimmunology6:579-591;和fishwild,d.etal.(1996)naturebiotechnology14:845-851，所有的內(nèi)容通過引用以其整體明確結(jié)合到本文中。還參見lonberg和kay的美國專利號5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;和5,770,429;suranietal.的美國專利號5,545,807;lonberg和kay的pct公開號wo92/03918,wo93/12227,wo94/25585,wo97/13852,wo98/24884和wo99/45962;和kormanetal.的pct公開號wo01/14424。在某些實施方案中，本文所述的抗體使用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上帶有人免疫球蛋白序列的小鼠產(chǎn)生，例如帶有人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠。這樣的小鼠，在本文稱為“km小鼠”，詳細描述于ishidaetal的pct公開號wo02/43478。還另外地，表達人免疫球蛋白基因的可選的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，和可用于產(chǎn)生本文描述的抗-tigit抗體。例如，可使用稱為xeno小鼠(abgenix,inc.)的可選的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；這樣的小鼠描述于例如kucherlapatietal.的美國專利號5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963。此外，表達人免疫球蛋白基因的可選的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，和可用于產(chǎn)生本文描述的抗-tigit抗體。例如，可使用稱為“tc小鼠”的帶有人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；這樣的小鼠描述于tomizukaetal.(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:722-727。此外，帶有人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述(kuroiwaetal.(2002)naturebiotechnology20:889-894)和可用于產(chǎn)生本文所述的抗-tigit抗體。本領(lǐng)域描述的用于產(chǎn)生人抗體，例如，人抗-tigit抗體的另外的小鼠系統(tǒng)包括(i)velocimmune?小鼠(regeneronpharmaceuticals,inc.)，其中內(nèi)源小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)已通過同源重組被替換為人重鏈和輕鏈可變區(qū)，其可操作連接至內(nèi)源小鼠恒定區(qū)，使得在小鼠中產(chǎn)生嵌合抗體(人v/小鼠c)，然后隨后使用標準重組dna技術(shù)轉(zhuǎn)化為全人抗體；和(ii)memo?小鼠(merusbiopharmaceuticals,inc.)，其中小鼠包含未重排的人重鏈可變區(qū)，但包含單一重排的人共同輕鏈可變區(qū)。這樣的小鼠，和其用于產(chǎn)生抗體的應(yīng)用，描述于例如wo2009/15777,us2010/0069614,wo2011/072204,wo2011/097603,wo2011/163311,wo2011/163314,wo2012/148873,us2012/0070861和us2012/0073004。本文描述的人單克隆抗體還可使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備。在本領(lǐng)域中確立了這樣的用于分離人抗體的噬菌體展示方法。參見例如：ladneretal.的美國專利號5,223,409;5,403,484;和5,571,698;doweretal.的美國專利號5,427,908和5,580,717;mccaffertyetal的美國專利號5,969,108和6,172,197;和griffithsetal的美國專利號5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081。本文所述的人單克隆抗體還可使用scid小鼠制備，人免疫細胞已在其中重構(gòu)，使得在免疫時可產(chǎn)生人抗體反應(yīng)。這樣的小鼠描述于例如wilsonetal.的美國專利號5,476,996和5,698,767。免疫為了產(chǎn)生對人tigit的全人抗體，包含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠(例如，hco12,hco7或km小鼠)可用tigit抗原和/或表達tigit的細胞的純化或富集制備物免疫，如對于其它抗原所述，例如lonbergetal.(1994)nature368(6474):856-859;fishwildetal.(1996)naturebiotechnology14:845-851和wo98/24884?；蛘撸∈罂捎镁幋a人tigit的dna免疫。優(yōu)選地，在首次輸注時小鼠是6-16周齡。例如，重組tigit抗原的純化或富集制備物(5-50μg)可用于腹膜內(nèi)免疫humab小鼠。在使用tigit抗原的純化或富集制備物進行免疫不產(chǎn)生抗體的情況下，小鼠還可用表達tigit的細胞免疫，例如，細胞系，以促進免疫反應(yīng)。實例性的細胞系包括過表達tigit的穩(wěn)定cho和raji細胞系。用各種抗原的積累經(jīng)驗表明，當(dāng)腹膜內(nèi)(ip)或皮下(sc)用ribi佐劑中的抗原初始免疫，接著每隔一周用ribi佐劑中的抗原ip/sc免疫(最多共10次)時，humab轉(zhuǎn)基因小鼠響應(yīng)最好。在免疫方案期間監(jiān)測免疫反應(yīng)，其中血漿樣品通過后眼眶采血獲得。血漿可通過elisa和facs(如下文所述)篩選，和具有足夠效價的抗-tigit人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。處死和取出脾臟和淋巴結(jié)之前3天，小鼠可用抗原靜脈內(nèi)加強免疫。預(yù)期各免疫可需要進行2-3次融合。對各抗原通常免疫6-24只小鼠。通常，使用hco7,hco12和km品系。此外，hco7和hco12轉(zhuǎn)基因二者可一起繁育成具有兩種不同的人重鏈轉(zhuǎn)基因的單一小鼠(hco7/hco12)。產(chǎn)生tigit的單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生為了生成產(chǎn)生本文所述的單克隆抗體的雜交瘤，來自免疫小鼠的脾細胞和/或淋巴結(jié)細胞可經(jīng)分離和融合至合適的永生細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系?？珊Y選得到的雜交瘤中抗原-特異性抗體的產(chǎn)生。例如，來自免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液可用50%peg融合至sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(atcc,crl1581)。細胞以大約2x105個在平底微量滴定板中鋪板，接著在包含10%胎牛血清、18%"653"條件培養(yǎng)基、5%origen(igen)、4mml-谷氨酰胺、1mm丙酮酸鈉、5mmhepes、0.055mm2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和1xhat(sigma)的選擇性培養(yǎng)基中兩周孵育。大約2周后，細胞在其中hat替換為ht的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過elisa篩選各個孔中的人單克隆igm和igg抗體。一旦廣泛的雜交瘤生長發(fā)生，可通常在10-14天后觀察培養(yǎng)基。分泌雜交瘤的抗體可重新鋪板，再次篩選，如果對于人igg仍然是陽性，則可將單克隆抗體通過有限稀釋亞克隆至少2次。然后可將穩(wěn)定的亞克隆體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的抗體用于表征。為了純化單克隆抗體，選擇的雜交瘤可在2升旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長用于單克隆抗體純化。上清液可過濾和濃縮，然后用蛋白a-sepharose(pharmacia,piscataway,n.j.)進行親和色譜。洗脫的igg可通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查，以確保純度。緩沖液溶液可交換成pbs，和濃度可通過od280使用1.43消光系數(shù)確定?？傻确謫慰寺】贵w并在-80?c貯存。vi.抗體制備產(chǎn)生tigit的單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，包括兩種提供序列的特異性抗體和另外的相關(guān)抗-tigit抗體，可在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中使用例如重組dna技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合產(chǎn)生，如本領(lǐng)域眾所周知的(morrison,s.(1985)science229:1202)。例如，為了表達抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈和重鏈的dna可通過標準分子生物學(xué)技術(shù)獲得(例如，pcr擴增或cdna克隆，使用表達目的抗體的雜交瘤)和dna可插入表達載體，使得基因可操作連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在該背景下，術(shù)語"可操作連接"意指抗體基因連接至載體，使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。表達載體和表達控制序列經(jīng)選擇以與使用的表達宿主細胞相容。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可插入單獨的載體或兩個基因插入相同的表達載體?？贵w基因通過標準方法插入表達載體(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補限制性位點，或如果不存在限制性位點，則平端連接)。本文所述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可通過將它們插入已經(jīng)編碼所需要的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體，使得在載體內(nèi)vh區(qū)段可操作連接至ch區(qū)段和在載體內(nèi)vl區(qū)段可操作連接至載體內(nèi)的cl區(qū)段，用于產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因。另外或備選地，重組表達載體可編碼信號肽，其促進自宿主細胞分泌抗體鏈?？蓪⒖贵w鏈基因克隆至載體，使得信號肽符合讀框地連接至抗體鏈基因的氨基末端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異質(zhì)信號肽(即，來自非-免疫球蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因外，重組表達載體還可帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意欲包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列描述于例如goeddel(geneexpressiontechnology.methodsinenzymology185,academicpress,sandiego,ca(1990))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，表達載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可依賴于例如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、需要的蛋白表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括在哺乳動物細胞中指導(dǎo)高水平蛋白表達的病毒元件，例如源自巨細胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(admlp)和多瘤的啟動子和/或增強子?；蛘?，可使用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛素啟動子或β-珠蛋白啟動子。還進一步，調(diào)節(jié)元件包含來自不同來源的序列，例如srα啟動子系統(tǒng)，其包含來自sv40早期啟動子和人t細胞白血病病毒1型的長末端重復(fù)序列的序列(takebe,y.etal.(1988)mol.cell.biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，重組表達載體還可帶有另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點)和可選擇性標記基因?？蛇x擇性標記基因促進載體所引入的宿主細胞的選擇(參見例如，axeletal.的美國專利號4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，通?？蛇x擇性標記基因賦予載體所引入的宿主細胞抗藥性，例如g418、潮霉素或甲氨蝶呤。優(yōu)選的可選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因(在dhfr-宿主細胞中用于甲氨蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用于g418選擇)。對于輕鏈和重鏈的表達，編碼重鏈和輕鏈的表達載體通過標準技術(shù)轉(zhuǎn)染至宿主細胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式意欲包括通常用于引入外源dna至原核或真核宿主細胞的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上在原核或真核宿主細胞中表達本文所述的抗體是可能的，但在真核細胞、最優(yōu)選地哺乳動物宿主細胞中表達抗體是最優(yōu)選的，因為這樣的真核細胞和特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能裝配和分泌適當(dāng)折疊的和免疫活性的抗體。已報道抗體基因的原核表達對于產(chǎn)生高收率的活性抗體是無效的(boss,m.a.和wood,c.r.(1985)immunologytoday6:12-13)。本發(fā)明的抗體也可在酵母巴斯德畢赤酵母的糖工程改造的菌株中產(chǎn)生。lietal.(2006)nat.biotechnol.24:210。用于表達本文所述的重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(cho細胞)(包括dhfr-cho細胞，描述于urlaub和chasin,(1980)proc.natl.acad.sci.usa77:4216-4220，用于dhfr可選擇性標記，例如，描述于r.j.kaufman和p.a.sharp(1982)mol.biol.159:601-621)、nso骨髓瘤細胞、cos細胞和sp2細胞。特別是，對用于nso骨髓瘤細胞，另一優(yōu)選的表達系統(tǒng)是公開于wo87/04462,wo89/01036和ep338,841的gs基因表達系統(tǒng)。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞時，抗體通過培養(yǎng)宿主細胞足以允許抗體在宿主細胞中表達、或更優(yōu)選地分泌抗體至宿主細胞生長的培養(yǎng)基的一段時間產(chǎn)生?？贵w可自培養(yǎng)基使用標準蛋白純化方法回收。由于通常觀察到的翻譯后修飾，本發(fā)明的抗體多肽鏈的n–和c–末端可不同于預(yù)期的序列。例如，c–末端賴氨酸殘基通常自抗體重鏈丟失。dicketal.(2008)biotechnol.bioeng.100:1132。n–末端谷氨酰胺殘基，和更少程度上為谷氨酸殘基，通常在治療性抗體的輕鏈和重鏈中轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸殘基。dicketal.(2007)biotechnol.bioeng.97:544;liuetal.(2011)jbc28611211;liuetal.(2011)j.biol.chem.286:11211。本發(fā)明的各種激動劑抗-hutigit抗體的氨基酸序列在序列表中提供，其概述于表5。因為上述原因，對于重鏈或重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，c-末端賴氨酸不包括在序列表的任何序列中。然而，在備選的實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體的各重鏈，和/或編碼這樣的抗體或其重鏈或輕鏈的遺傳構(gòu)建體，在重鏈的c-末端包括這種另外的賴氨酸殘基。vii.測定法可通過例如標準elisa測試本文所述的抗體與tigit的結(jié)合。簡言之，微量滴定板用在pbs中1-2μg/ml的純化的tigit包被，然后用在pbs中的5%牛血清白蛋白封閉。稀釋的抗體(例如，來自tigit免疫小鼠的稀釋的血漿)加入各孔，和在37oc孵育1-2小時。將板用pbs/tween洗滌和然后用例如，對于人抗體或另外具有人重鏈恒定區(qū)的抗體的第二試劑，與辣根過氧化酶(hrp)綴合的山羊-抗-人iggfc-特異性多克隆試劑在37oc孵育1小時。洗滌后，將板用abts底物(mossinc,產(chǎn)品:abts-1000)顯色和通過分光光度計在od415-495分析。然后通過流式細胞術(shù)進一步篩選來自免疫小鼠的血清中與表達人tigit的細胞系，但不與不表達tigit的對照細胞系的結(jié)合。簡言之，抗-tigit抗體的結(jié)合通過用1:20稀釋的抗-tigit抗體孵育表達tigit的cho細胞評價。洗滌細胞和用pe-標記的抗-人iggab檢測結(jié)合。使用facscan流式細胞儀(bectondickinson,sanjose,ca)進行流式細胞術(shù)分析。優(yōu)選地，產(chǎn)生最高效價的小鼠用于融合。如果小鼠抗-hutigit抗體被檢出，可使用抗-小鼠檢測抗體進行類似的實驗。上述elisa測定法可用于篩選與tigit免疫原顯示陽性反應(yīng)性的抗體，因此，篩選產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤。產(chǎn)生優(yōu)選地以高親和力結(jié)合tigit的抗體的雜交瘤然后可被亞克隆和進一步表征。來自各雜交瘤的一個克隆，其保留親本細胞的反應(yīng)性(通過elisa)，然后可選擇用于制備細胞庫和用于抗體純化。為了純化抗-tigit抗體，選擇的雜交瘤可在2升旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長用于單克隆抗體純化。上清液可經(jīng)過濾和濃縮，然后用蛋白a-sepharose(pharmacia,piscataway,nj)進行親和色譜。洗脫的igg可通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查以確保純度。緩沖液溶液可交換成pbs，和可通過od280使用1.43消光系數(shù)測定濃度?？傻确謫慰寺】贵w并在-80°c貯存。為了確定選擇的抗-tigit單克隆抗體是否結(jié)合獨特的表位，各抗體可使用市售可得的試劑(pierce,rockford,il)被生物素化。生物素化的mab結(jié)合可用鏈霉親和素標記的探針檢測。使用未標記的單克隆抗體和生物素化的單克隆抗體的競爭研究可使用tigit包被的-elisa板進行，如上所述。為了確定純化抗體的同種型，同種型elisa可使用對特定同種型的抗體特異性的試劑進行。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，微量滴定板的各孔可用1μg/ml的抗-人免疫球蛋白在4?c包被過夜。在用1%bsa封閉后，將板與1μg/ml或更少的試驗單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度下反應(yīng)1-2小時。然后將各孔與人igg1或人igm-特異性堿性磷酸酶綴合的探針反應(yīng)。將板顯色和分析，如上所述。為了測試單克隆抗體與表達tigit的活細胞的結(jié)合，可使用流式細胞術(shù)，如實施例中所述。簡言之，表達膜結(jié)合tigit的細胞系(在標準生長條件下生長)與各種濃度的單克隆抗體在包含0.1%bsa的pbs中在4°c混合1小時。洗滌后，將細胞與藻紅蛋白(pe)-標記的抗-igg抗體在與第一抗體染色相同的條件下反應(yīng)。樣品可通過facscan儀器使用光和側(cè)散射性質(zhì)分析，以門控單細胞，和測定標記的抗體的結(jié)合。除了或代替流式細胞術(shù)測定法，可使用備選的使用熒光顯微鏡的測定法。細胞可完全按上所述染色，和通過熒光顯微鏡檢查。該方法允許單個細胞的可視化，但根據(jù)抗原密度可具有降低的敏感性。可通過蛋白質(zhì)印跡進一步測試抗-tigit抗體與tigit抗原的反應(yīng)性。簡言之，可制備來自表達tigit的細胞的細胞提取物，對其進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用20%小鼠血清封閉，和用測試的單克隆抗體探查。igg結(jié)合可使用抗-igg堿性磷酸酶檢測，和用bcip/nbt底物片劑顯色(sigmachem.co.,st.louis,mo)。用于分析各種抗-tigit抗體的結(jié)合親和力、交叉反應(yīng)性和結(jié)合動力學(xué)的方法包括本領(lǐng)域已知的標準測定法，例如，生物層干涉測定(bli)分析和biacore?表面等離子體共振(spr)分析，使用biacore?2000spr儀器(biacoreab,uppsala,sweden)。在一個實施方案中，抗體特異性結(jié)合人tigit的細胞外區(qū)域。抗體可特異性結(jié)合tigit的細胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)域(例如，功能結(jié)構(gòu)域)。在特定的實施方案中，抗體特異性結(jié)合pvr結(jié)合的tigit上的位點。在某些實施方案中，抗體特異性結(jié)合人tigit的細胞外區(qū)域和食蟹猴tigit的細胞外區(qū)域。優(yōu)選地，抗體以高親和力結(jié)合人tigit。viii.雙特異性分子本文所述的抗體可用于形成雙特異性分子?？?tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段可衍生或連接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白(例如，受體的另一抗體或配體)以產(chǎn)生雙特異性分子，其結(jié)合至少2個不同的結(jié)合位點或靶分子。本文所述的抗體事實上可衍生或連接至超過1個其它功能分子以產(chǎn)生多特異性分子，其結(jié)合超過2個不同的結(jié)合位點和/或靶分子；這樣的多特異性分子也旨在包括在本文使用的術(shù)語“雙特異性分子”的范圍內(nèi)。為了產(chǎn)生本文所述的雙特異性分子，本文所述的抗體可功能連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價締合或其它方式)至一個或多個其它結(jié)合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，使得產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本文提供了至少包含一個對tigit的第一結(jié)合特異性(bindingspecificity)和對第二靶表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。在本文所述的其中雙特異性分子是多特異性的一個實施方案中，分子可進一步包括第三結(jié)合特異性。在一個實施方案中，本文所述的雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段，包括例如，fab、fab'、f(ab')2、fv或單鏈fv作為結(jié)合特異性。抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，例如fv或單鏈構(gòu)建體，描述于ladneretal美國專利號4,946,778，其內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。盡管優(yōu)選人單克隆抗體，但可用于本文所述的雙特異性分子的其它抗體是鼠、嵌合和人源化單克隆抗體。本文所述的雙特異性分子可使用本領(lǐng)域已知的方法通過綴合組分結(jié)合特異性制備。例如，雙特異性分子的各結(jié)合特異性可單獨產(chǎn)生，然后彼此綴合。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白或肽時，可使用各種偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價綴合。交聯(lián)劑的實例包括蛋白a、碳二亞胺、n-琥珀酰亞胺基-s-乙?；?硫代乙酸酯(sata)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、鄰-亞苯基二馬來酰亞胺(opdm)、n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)和磺基琥珀酰亞胺基4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸酯(磺基-smcc)(參見例如，karpovskyetal.(1984)j.exp.med.160:1686;liu,maetal.(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:8648)。其它方法包括描述于paulus(1985)behringins.mitt.no.78,118-132;brennanetal.(1985)science229:81-83),和glennieetal.(1987)j.immunol.139:2367-2375)中的那些。優(yōu)選的綴合劑是sata和磺基-smcc，二者可獲自piercechemicalco.(rockford,il)。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時，它們可通過兩條重鏈的c-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合綴合。在特別優(yōu)選的實施方案中，鉸鏈區(qū)經(jīng)修飾以包含奇數(shù)的巰基殘基，優(yōu)選地一個，然后綴合?；蛘撸瑑蓚€結(jié)合特異性可在相同的載體中編碼和在相同的宿主細胞中表達和裝配。當(dāng)雙特異性分子是mabxmab,mabxfab,fabxf(ab')2或配體xfab融合蛋白時，這種方法特別有用。本文所述的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。制備雙特異性分子的方法描述于例如美國專利號5,260,203;美國專利號5,455,030;美國專利號4,881,175;美國專利號5,132,405;美國專利號5,091,513;美國專利號5,476,786;美國專利號5,013,653;美國專利號5,258,498;和美國專利號5,482,858。雙特異性分子與其特異性靶標的結(jié)合可使用本領(lǐng)域公認的方法證實，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)、放射免疫測定法(ria)、facs分析、生物測定法(例如，生長抑制)或蛋白質(zhì)印跡測定法。這些測定法的每一種通常通過使用對目的復(fù)合物特異性的標記試劑(例如，抗體)，檢測特別感興趣的蛋白-抗體復(fù)合物的存在。ix.組合物還提供了組合物，例如，藥物組合物，包含本文所述的抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段，其與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。這樣的組合物可包括本文所述的一種抗體或(例如，兩種或更多種不同的)抗體的組合，或免疫綴合物或雙特異性分子。例如，本文所述的藥物組合物可包含抗體的組合(或免疫綴合物或雙特異性)，其結(jié)合靶標抗原上的不同的表位或具有互補的活性。在某些實施方案中，組合物包含濃度為至少1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml,150mg/ml,200mg/ml或1-300mg/ml或100-300mg/ml的抗-tigit抗體。本文所述的藥物組合物還可在組合療法中給予，即，與其它試劑組合。例如，組合療法可包括本文所述的抗-tigit抗體與至少一種其它抗-癌癥和/或t-細胞刺激(例如，活化)劑組合?？捎糜诮M合療法的治療劑的實例更詳細描述于下文中本文所述的抗體的用途的章節(jié)。在一些實施方案中，本文公開的治療性組合物可包括用于治療癌癥的其它化合物、藥物和/或試劑。這樣的化合物、藥物和/或試劑可包括，例如化學(xué)治療藥物、小分子藥物或刺激對給定的癌癥的免疫反應(yīng)的抗體。在一些情況下，治療性組合物可包括，例如抗-ctla-4抗體、抗-pd-1抗體、抗-pd-l1抗體、抗-cd40抗體、抗-ox40(亦稱為cd134,tnfrsf4,act35和/或txgp1l)抗體、抗-lag-3抗體、抗-cd73抗體、抗-cd137抗體、抗-cd27抗體、抗-csf-1r抗體、tlr激動劑或ido或tgfβ的小分子拮抗劑的一種或多種。如本文所用的，"藥學(xué)上可接受的載體"包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細菌和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱或表皮給藥(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，活性化合物，即抗體、免疫綴合物或雙特異性分子，可被材料包被，以保護化合物免于酸和可滅活化合物的其它天然條件的作用。本文所述的藥用化合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽。"藥學(xué)上可接受的鹽"是指保留母體化合物的需要的生物學(xué)活性和不產(chǎn)生任何不需要的毒性作用的鹽(參見例如，berge,s.m.,etal.(1977)j.pharm.sci.66:1-19)。這樣的鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源自無毒無機酸的那些，例如鹽酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、亞磷酸鹽等，以及來自無毒有機酸的那些，例如脂肪族單-和二羧酸、苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸等。堿加成鹽包括源自堿土金屬的那些，例如納、鉀、鎂、鈣等，以及來自無毒有機胺的那些，例如n,n'-二苯基乙二胺、n-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。本文所述的藥物組合物還可包括藥學(xué)上可接受的抗-氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實例包括：(1)水可溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫納、偏亞硫酸氫納、亞硫酸鈉等；(2)油-可溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥基茴香醚(bha)、丁羥基甲苯(bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒疚乃龅乃幬锝M合物的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合適的混合物，植物油，例如橄欖油，和可注射有機酯，例如油酸乙酯?？衫缤ㄟ^使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持需要的粒徑，和通過使用表面活性劑，保持合適的流動性。這些組合物還可包含輔助劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。防止存在微生物可通過上述滅菌程序和通過包含各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等確保。組合物中還可需要包括等張劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可注射藥用形式的長期吸收可通過包含延遲吸收的試劑實現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁和明膠。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液，和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。這樣的介質(zhì)和試劑對藥用活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，考慮其在本文所述的藥物組合物中的應(yīng)用。補充的活性化合物也可摻入組合物中。治療性組合物通常在制造和貯存條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。組合物可作為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)配制。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物?？衫缤ㄟ^使用包衣料例如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持需要的粒徑和通過使用表面活性劑，保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谠S多情況下，優(yōu)選組合物包括等張劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠實現(xiàn)。無菌注射溶液可通過將需要量的活性化合物摻入含一種上述成分或其組合(按需要)的合適的溶劑中，接著無菌微過濾制備。通常，分散液通過將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和需要的上述其它成分的無菌溶媒制備。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其得到活性成分加來自其之前的無菌過濾溶液的任何另外需要的成分的粉末?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)治療的受試者和具體的給藥方式而不同?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量通常是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以百分比來計算，該量范圍為約0.01%-約99%的活性成分，優(yōu)選地約0.1%-約70%，最優(yōu)選地約1%-約30%的活性成分，其與藥學(xué)上可接受的載體組合。給藥方案經(jīng)調(diào)整以提供最佳需要的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可給予單次推注，可隨時間給予若干分開的劑量，或根據(jù)治療情況的緊急指示，劑量可按比率減少或增加。配制容易給予和劑量均勻的劑量單位形式的胃腸外組合物是特別有利的。本文所用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于治療的受試者的物理離散單位；每個單位包含預(yù)定量的活性化合物，其經(jīng)計算以與需要的藥用載體結(jié)合產(chǎn)生需要的治療效果。本文所述的劑量單位形式的規(guī)格由以下規(guī)定并直接取決于它們：(a)活性化合物的獨特特征和要實現(xiàn)的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域配制這樣的活性化合物以處理個體敏感性的固有限制。對于給予抗體，劑量范圍為約0.0001-100mg/kg和更通常0.01-5mg/kg的宿主體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或1-10mg/kg的范圍內(nèi)。實例性的治療方案需要給予每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每3個月一次或每3-6個月一次。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗-tigit抗體每兩周給予。對于本文所述的抗-tigit抗體，其它優(yōu)選的劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg,3mg/kg或5mg/kg體重，其中抗體使用以下給藥方案之一給予：(i)每4周，持續(xù)6個劑量，然后每3個月；(ii)每3周；(iii)3mg/kg體重一次，接著每3周1mg/kg體重。在一些方法中，兩種或更多種具有不同的結(jié)合特異性的單克隆抗體同時給予，在該情況下給予的各抗體的劑量落入指示的范圍內(nèi)。治療性抗體通常多次給予。單次劑量之間的間隔可以是例如，每周、每月、每3個月或每年。間隔也可以是無規(guī)律的，如通過測量患者的靶抗原的抗體的血液水平所指示的。在一些方法中，劑量經(jīng)調(diào)整以實現(xiàn)約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度和在一些方法中約25-300μg/ml?？贵w可作為持續(xù)釋放制劑給予，在此情況下，需要較少頻率給予。劑量和頻率根據(jù)患者中抗體的半壽期而不同。通常，人抗體顯示最長的半壽期，接著是人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。給予的劑量和頻率可根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，相對低的劑量以相對不頻繁的間隔給予一段長期的時間。一些患者在他們的余下生命中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時需要以相對短的間隔的相對高的劑量，直到疾病進展被減少或終止，和優(yōu)選地直到患者顯示疾病癥狀的部分或完全改善。此后，患者可任選地給予預(yù)防性方案，盡管在許多免疫腫瘤適應(yīng)癥中繼續(xù)治療不是需要的。本文所述的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可改變，以獲得有效地對特定患者、組合物和給藥方式實現(xiàn)需要的治療反應(yīng)，而對患者沒有毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于各種藥代動力學(xué)因素，包括本文所述使用的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥次數(shù)、使用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與使用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料，治療的患者的年齡、性別、體重、條件、一般健康和在先病史，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的其它因素。本文所述的抗-tigit抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴重性降低、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加或阻止由于疾病痛苦導(dǎo)致的損傷或失能。在癌癥的情況下，治療有效劑量優(yōu)選地阻止與癌癥有關(guān)的身體癥狀的進一步惡化。癌癥的癥狀是本領(lǐng)域眾所周知的和包括例如，不尋常的胎塊特征，胎塊外觀的變化包括不對稱、邊界、顏色和/或直徑，新染色的皮膚區(qū)域，異常的胎塊，指甲下區(qū)域變暗，乳房結(jié)塊，乳頭改變，乳房囊腫，乳房痛，死亡，失重，虛弱，過度疲勞，難以進食，失去食欲，慢性咳嗽，氣喘惡化，咳血，尿血，便血，惡心，嘔吐，肝轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移，腹脹，胃氣脹，腹膜腔積液，陰道出血，便秘，腹脹，結(jié)腸穿孔，急性腹膜炎(感染、發(fā)燒、疼痛)，疼痛，嘔血，重汗，發(fā)燒，高血壓，貧血，腹瀉，黃疸，暈眩，寒戰(zhàn)，肌肉抽搐，結(jié)腸轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移，膀胱轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移，腎轉(zhuǎn)移，和胰腺轉(zhuǎn)移，吞咽困難等。治療功效可在首次給予本發(fā)明的抗-hutigitmab后直接觀察到，或其可僅在一段時間和/或一系列劑量后觀察到。這樣的延遲功效可僅在數(shù)月治療，至多6、9或12個月后觀察到。鑒于一些免疫腫瘤試劑顯示的延遲功效，不過早判定本發(fā)明的抗-hutigitmab缺乏治療功效是重要的。治療有效劑量可阻止或延遲癌癥發(fā)生，例如當(dāng)疾病的早期或初步跡象存在時可能是需要的。用于診斷癌癥的實驗室檢驗包括化學(xué)(包括測量tigit水平)、血液學(xué)、血清學(xué)和放射學(xué)。因此，監(jiān)測任何前述癥狀的任何臨床或生物化學(xué)測定法可用于確定特定治療是否是治療癌癥的治療有效劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于例如受試者尺寸、受試者癥狀嚴重性和特定的組合物或選擇的給藥途徑等因素，確定這樣的量。本文所述的組合物可通過一種或多種給藥途徑使用本領(lǐng)域已知的各種方法的一種或多種給予。技術(shù)人員將理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)需要的結(jié)果而改變。本文所述的抗體的優(yōu)選的給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其它胃腸外給予途徑，例如通過注射或輸注。本文使用的詞語"胃腸外給予"意指并非腸內(nèi)和局部給予的給予方式，通常通過注射，和包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注?；蛘?，本文所述的抗體可通過非胃腸外途徑給予，例如局部、表皮或粘膜給予途徑，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。活性化合物可用保護化合物免于快速釋放的載體制備，例如控制釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微囊封遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這樣的制劑的許多方法是取得專利的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的。參見例如，sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson,ed.,marceldekker,inc.,newyork,1978。治療性組合物可用本領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置給予。例如，在優(yōu)選的實施方案中，本文所述的治療性組合物可用無針頭皮下注射裝置，例如公開于美國專利號5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556的裝置給予。用于本文所述的抗-tigit抗體的眾所周知的植入物和模塊的實例包括：美國專利號4,487,603，其公開了可植入微輸注泵，用于以受控速率分配藥物；美國專利號4,486,194，其公開了用于通過皮膚給予藥物的治療裝置；美國專利號4,447,233，其公開了藥物輸注泵，用于以準確的輸注速率遞送藥物；美國專利號4,447,224，其公開了可變流量可植入輸注裝置，用于持續(xù)藥物遞送；美國專利號4,439,196，其公開了滲透藥物遞送系統(tǒng)，具有多個室的區(qū)室；和美國專利號4,475,196，其公開了滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利通過引用結(jié)合到本文中。許多其它這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在某些實施方案中，可配制本文所述的抗-tigit抗體以確保合適的體內(nèi)分布。例如，血-腦屏障(bbb)排除了許多高親水性化合物。為了確保本文所述的治療性化合物穿過bbb(如果需要)，它們可配制例如，在脂質(zhì)體中。對于制備脂質(zhì)體的方法，參見例如，美國專利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂質(zhì)體可包含選擇性運輸至特定細胞或器官，從而增強靶向藥物遞送的一個或多個部分(參見例如，v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685)。實例性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如，lowetal.的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(umezawaetal.,(1988)biochem.biophys.res.commun.153:1038)；抗體(p.g.bloemanetal.(1995)febslett.357:140;m.owaisetal.(1995)antimicrob.agentschemother.39:180)；表面活性劑蛋白a受體(briscoeetal.(1995)am.j.physiol.1233:134);p120(schreieretal.(1994)j.biol.chem.269:9090);亦參見k.keinanen;m.l.laukkanen(1994)febslett.346:123;j.j.killion;i.j.fidler(1994)immunomethods4:273。x.用途和方法本文所述的抗體、抗體組合物和方法具有許多體外和體內(nèi)功用，包括例如通過阻斷tigit信號傳導(dǎo)增強免疫反應(yīng)或檢測tigit。在優(yōu)選的實施方案中，本文所述的抗體是人或人源化抗體。例如，本文所述的抗-tigit抗體可給予體外或離體培養(yǎng)的細胞，或人受試者，例如，體內(nèi)，以增強各種疾病的免疫性。因此，本文提供了改變受試者的免疫反應(yīng)的方法，包括給予受試者本文所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段，使得受試者中的免疫反應(yīng)被增強、刺激或上調(diào)。優(yōu)選的受試者包括其中需要免疫反應(yīng)增強的人患者。方法特別適合于治療具有可通過增強免疫反應(yīng)(例如，t-細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng))治療的病癥的人患者。在特定的實施方案中，方法特別適合于體內(nèi)治療癌癥。為了實現(xiàn)免疫性的抗原-特異性增強，本文所述的抗-tigit抗體可與目的抗原一起給予，或抗原可已經(jīng)存在于待治療的受試者中(例如，帶腫瘤或帶病毒的受試者)。當(dāng)tigit的抗體與另一試劑一起給予時，兩者可分開或同時給予。還包括用于檢測樣品中人tigit抗原的存在的方法，或測量人tigit抗原的量的方法，包括使樣品和對照樣品與特異性結(jié)合人tigit的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段在允許在抗體或其片段和人tigit之間形成復(fù)合物的條件下接觸。然后檢測復(fù)合物的形成，其中樣品與對照樣品相比，復(fù)合物形成的差異指示樣品中存在人tigit抗原。此外，本文所述的抗-tigit抗體可用于通過免疫親和純化純化人tigit。鑒于本文所述的抗-tigit抗體阻斷t細胞反應(yīng)，例如抗原-特異性t細胞反應(yīng)的抑制或共抑制的能力，本文提供了使用本文所述的抗體刺激、增強或上調(diào)抗原-特異性t細胞反應(yīng)，例如，抗-腫瘤t細胞反應(yīng)的體外和體內(nèi)方法。在某些實施方案中，還提供cd3刺激(例如，通過與表達膜cd3的細胞共孵育)，所述刺激可與用抗-tigit抗體治療同時、之前或之后提供。例如，本文提供了提高抗原-特異性t細胞反應(yīng)的方法，包括使所述t細胞與本文所述的抗-tigit抗體和任選地與cd3接觸，使得抗原-特異性t細胞反應(yīng)得到增強，例如，通過除去tigit-介導(dǎo)的抑制效果?？乖?特異性t細胞反應(yīng)的任何合適的指示劑可用于測量抗原-特異性t細胞反應(yīng)。這樣的合適的指示劑的非限制性實例包括在存在抗體的情況下增加t細胞增殖和/或在存在抗體的情況下增加細胞因子產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中，抗原-特異性t細胞產(chǎn)生的白介素-2和/或干擾素-γ得到增強。進一步包括在受試者中提高免疫反應(yīng)(例如，抗原-特異性t細胞反應(yīng))的方法，包括給予受試者本文所述的抗-tigit抗體，使得受試者的免疫反應(yīng)(例如，抗原-特異性t細胞反應(yīng))得到增強。在優(yōu)選的實施方案中，受試者是帶腫瘤的受試者，和針對腫瘤的免疫反應(yīng)得到增強。腫瘤可以是實體腫瘤或液體腫瘤，例如，血液惡性腫瘤。在某些實施方案中，腫瘤是免疫原性腫瘤。在某些實施方案中，腫瘤是非免疫原性的。在某些實施方案中，腫瘤是pd-l1陽性的。在某些實施方案中，腫瘤是pd-l1陰性的。受試者也可以是帶病毒的受試者，和針對病毒的免疫反應(yīng)得到增強。還提供了在受試者中抑制腫瘤細胞的生長的方法，包括給予受試者本文所述的抗-tigit抗體，使得受試者的腫瘤生長得到抑制。還提供了在受試者中治療慢性病毒感染的方法，包括給予受試者本文所述的抗-tigit抗體，使得受試者的慢性病毒感染得到治療。本文還包括用于自具有腫瘤例如，癌性腫瘤的受試者的腫瘤微環(huán)境耗盡treg細胞的方法，包括給予受試者治療有效量的本文所述的抗-tigit抗體，其包含刺激腫瘤微環(huán)境中treg細胞的耗盡的fc。fc可例如是具有效應(yīng)子功能或增強的效應(yīng)子功能的fc，例如結(jié)合一種或多種活化fc受體或與一種或多種活化fc受體的結(jié)合增強的fc。在優(yōu)選的實施方案中，treg耗盡發(fā)生而沒有顯著耗盡或抑制腫瘤微環(huán)境中的teff，和沒有顯著耗盡或抑制腫瘤微環(huán)境外的teff細胞和treg細胞。在某些實施方案中，例如，在腫瘤微環(huán)境中，受試者在treg細胞上比在teff細胞上具有更高水平的tigit。在某些實施方案中，抗-tigit抗體可耗盡腫瘤中的treg和/或腫瘤侵潤淋巴細胞(til)中的treg。例如在ct26腫瘤模型中，格式化為小鼠igg2a的抗-小鼠tigit抗體(其顯示效應(yīng)子功能)部分地耗盡treg和cd8+t細胞二者，但不耗盡cd4+t細胞。格式化為小鼠igg1d265a的無效對應(yīng)物抗-tigit抗體不耗盡t細胞。當(dāng)考慮是否使用具有效應(yīng)子功能或無效抗-tigit抗體時，必須考慮可增強抗-腫瘤免疫反應(yīng)的tregs的耗盡和消除實際殺死腫瘤細胞所需要的一些細胞的cd8+t細胞的耗盡之間的權(quán)衡。盡管耗盡tregs可預(yù)期增強抗-腫瘤活性，但最近的研究表明，連接tigit與tigit+tregs促進treg細胞-介導(dǎo)的teff細胞增殖抑制(jolleretal.(2014)immunity40:569)，表明tigit信號傳導(dǎo)的阻斷(例如，使用本發(fā)明的拮抗劑抗-tigit抗體)也可能增強抗-腫瘤活性。因此，可能最有效的是，使用缺少效應(yīng)子功能的拮抗劑抗-tigit抗體，其i)阻斷tregs中的tigit信號傳導(dǎo)，從而減少它們的免疫抑制活性，ii)通過阻斷tigit的抑制性效果，同時避免它們的效應(yīng)子功能介導(dǎo)的耗盡，活化抗-腫瘤cd8+t細胞，和iii)通過允許dnam結(jié)合否則會結(jié)合tigit的pvr(和通過減少直接tigit-dnam相互作用)，增強dnam-介導(dǎo)的活化(johnstonetal.(2014)cancercell26:923)。在某些實施方案中，給予受試者抗-tigit抗體作為輔助療法。相對于當(dāng)前的護理標準，用抗-tigit抗體治療具有癌癥的受試者可導(dǎo)致長期持久反應(yīng)；長期存活至少1,2,3,4,5,10或更多年，無復(fù)發(fā)存活至少1,2,3,4,5,或10或更多年。在某些實施方案中，用抗-tigit抗體治療具有癌癥的受試者阻止癌癥復(fù)發(fā)或延遲癌癥復(fù)發(fā)達例如，1,2,3,4,5,或10或更多年?？?tigit治療可用作一線或二線治療。本文所述的這些和其它方法在下文更詳細地描述。癌癥通過抗-tigit抗體阻斷通過tigit的pvr/nectin-2信號傳導(dǎo)可增強患者中對癌癥細胞的免疫反應(yīng)。本文提供了治療具有癌癥的受試者的方法，包括給予受試者本文所述的抗-tigit抗體，使得受試者被治療，例如，使得癌性腫瘤的生長被抑制或減少，和/或腫瘤消退?？?tigit抗體可單獨用于抑制癌癥腫瘤的生長?；蛘?，抗-tigit抗體可與另一試劑，例如，其它免疫原性劑、標準癌癥治療或其它抗體組合使用，如下文所述。還提供了與pd-1的抑制劑，例如抗-pd-1或抗-pd-l1抗體的組合。因此，本文提供了例如，通過抑制受試者的腫瘤細胞生長治療癌癥的方法，包括給予受試者治療有效量的本文所述的抗-tigit抗體，例如，15a6,22g2,11g11或10d7或其抗原-結(jié)合片段?？贵w可以是人抗-tigit抗體(例如本文所述的任何人抗-hutigit抗體)或其可以是嵌合或人源化非-人抗-hutigit抗體，例如，嵌合或人源化抗-tigit抗體與至少一種本文所述的抗-tigit抗體競爭結(jié)合，或結(jié)合與至少一種本文所述的抗-tigit抗體相同的表位。其生長可使用本發(fā)明的抗體抑制的癌癥包括通常對免疫療法有響應(yīng)的癌癥。治療的癌癥的非限制性實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(nsclc)、非nsclc、膠質(zhì)瘤、胃腸癌、腎癌(例如，透明細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌(例如，腎細胞癌(rcc))、前列腺癌(例如，激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、成神經(jīng)細胞瘤、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤(多形性成膠質(zhì)細胞瘤)、宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤、鼻腔鼻竇天然殺傷(sinonasalnaturalkiller)、黑素瘤(例如，轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤，例如皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區(qū)的癌癥、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀旁腺的癌癥、腎上腺的癌癥、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童的實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤(cns)、原發(fā)性cns淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱軸腫瘤、腦干膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、t-細胞淋巴瘤、環(huán)境誘導(dǎo)的癌癥包括石棉誘導(dǎo)的癌癥，病毒相關(guān)的癌癥(例如，人乳頭瘤病毒(hpv)-相關(guān)腫瘤)和源自兩種主要的血液細胞譜系，即骨髓細胞系(其產(chǎn)生粒細胞、紅細胞、血小板、巨噬細胞和肥大細胞)或淋巴細胞系(其產(chǎn)生b、t、nk和漿細胞)的任一種的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，例如所有類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如，急性的、慢性的淋巴細胞性和/或骨髓性白血病，例如急性白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴細胞性白血病(cll)和慢性骨髓性白血病(cml)，未分化的aml(m0)、成髓細胞白血病(m1)、成髓細胞白血病(m2；具有細胞成熟)、前髓細胞白血病(m3或m3變體[m3v])、骨髓單核細胞白血病(m4或m4變體，含嗜酸性細胞[m4e])、單核細胞白血病(m5)、紅細胞白血病(m6)、成巨核細胞白血病(m7)、分離的粒細胞肉瘤和綠色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、b-細胞淋巴瘤、t-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核細胞樣b-細胞淋巴瘤、粘膜相關(guān)的淋巴組織(malt)淋巴瘤、惡性(例如，ki1+)大細胞淋巴瘤、成年t-細胞淋巴瘤/白血病、套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞t-細胞淋巴瘤、中心血管淋巴瘤、腸內(nèi)t-細胞淋巴瘤、原發(fā)性縱隔b-細胞淋巴瘤、前體t-成淋巴細胞性淋巴瘤、t-成淋巴細胞性淋巴瘤/白血病(t-lbly/t-all)、外周t-細胞淋巴瘤、成淋巴細胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、真性組織細胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、成淋巴細胞性淋巴瘤(lbl)、淋巴譜系的造血腫瘤、急性成淋巴細胞性白血病、彌散性大b-細胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌散性組織細胞淋巴瘤(dhl)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體b-成淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚t-細胞淋巴瘤(ctlc)(亦稱為蕈樣肉芽腫病或sezary綜合征)和淋巴漿細胞樣淋巴瘤(lpl)伴有waldenstrom巨球蛋白血癥；骨髓瘤，例如igg骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、郁積性骨髓瘤(亦稱為無痛骨髓瘤)、單生漿細胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、毛細胞淋巴瘤；骨髓譜系的造血腫瘤、間充質(zhì)來源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；精原細胞瘤、畸胎癌、中樞和外周神經(jīng)腫瘤，包括星形細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤；間充質(zhì)來源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；和其它腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌癥和畸胎癌、淋巴譜系的造血腫瘤例如t-細胞和b-細胞腫瘤，包括但不限于t-細胞疾病，例如t-前淋巴細胞性白血病(t-pll)，包括小細胞和腦形細胞類型；大顆粒狀淋巴細胞白血病(lgl)，優(yōu)選地具有t-細胞類型；和t-nhl肝脾淋巴瘤；外周/后-胸腺t細胞淋巴瘤(多形和成免疫細胞亞型)；血管中心(鼻)t-細胞淋巴瘤；頭頸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及所述癌癥的任何組合。本文所述的方法還可用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥、難治性癌癥(例如，對之前的免疫療法，例如，用阻斷性ctla-4或pd-1抗體難治的癌癥)和復(fù)發(fā)性癌癥?？?tigit抗體可作為單一療法給予，或僅作為免疫刺激療法給予，或在癌癥疫苗策略中其可與免疫原性劑，例如癌癥細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子)或用編碼免疫刺激性細胞因子的基因轉(zhuǎn)染細胞組合(heetal.(2004)j.immunol.173:4919-28)?？墒褂玫哪[瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原的肽，例如肽gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶，或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達細胞因子gm-csf的腫瘤細胞。已設(shè)計了對腫瘤進行疫苗接種的許多實驗策略(參見rosenberg,s.,2000,developmentofcancervaccines,ascoeducationalbookspring:60-62;logothetis,c.,2000,ascoeducationalbookspring:300-302;khayat,d.2000,ascoeducationalbookspring:414-428;foon,k.2000,ascoeducationalbookspring:730-738;亦參見restifo,n.和sznol,m.,cancervaccines,ch.61,pp.3023-3043indevitaetal.(eds.),1997,cancer:principlesandpracticeofoncology,fifthedition)。在這些策略之一中，使用自體或同種異體的腫瘤細胞制備疫苗。當(dāng)腫瘤細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達gm-csf時，這些細胞疫苗已表明最有效。gm-csf已表明是對于腫瘤疫苗接種的抗原呈遞的有效激活物(dranoffetal.(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:3539-43)。在各種腫瘤中基因表達和大規(guī)?；虮磉_模式的研究已產(chǎn)生了所謂的腫瘤特異性抗原的定義(rosenberg,sa(1999)immunity10:281-7)。在許多情況下，這些腫瘤特異性抗原是腫瘤和腫瘤產(chǎn)生的細胞中表達的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、mage抗原和trp-2。更重要的是，許多這些抗原可表明是宿主中發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性t細胞的靶標。tigit抑制可與腫瘤中表達的一系列重組蛋白和/或肽結(jié)合使用，以產(chǎn)生對這些蛋白的免疫反應(yīng)。這些蛋白正常被免疫系統(tǒng)視為自身抗原和因此耐受它們。腫瘤抗原可包括蛋白端粒酶，其是合成染色體的端粒所需要的和其在超過85%的人癌癥中和在僅有限數(shù)量的體組織中表達(kimetal.(1994)science266:2011-2013)。因為體細胞突變改變蛋白序列或在兩個不相關(guān)序列之間產(chǎn)生融合蛋白(即，philadelphia染色體中的bcr-abl)或來自b細胞腫瘤的個體基因型，腫瘤抗原也可以是癌癥細胞中表達的“新-抗原”。其它腫瘤疫苗可包括來自涉及人癌癥的病毒，例如人乳頭瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv和hcv)和卡波西皰疹肉瘤病毒(khsv)的蛋白。可與tigit抑制結(jié)合使用的另一形式的腫瘤特異性抗原是自腫瘤組織本身分離的純化的熱休克蛋白(hsp)。這些熱休克蛋白包含來自腫瘤細胞的蛋白片段，和這些hsp在遞送抗原呈遞細胞以引發(fā)腫瘤免疫時高度有效(suot&srivastava(1995)science269:1585-1588;tamuraetal.(1997)science278:117-120)。樹突細胞(dc)是可用于引發(fā)抗原-特異性反應(yīng)的有效的抗原呈遞細胞。dc可離體產(chǎn)生和加載各種蛋白和肽抗原以及腫瘤細胞提取物(nestleetal.(1998)naturemedicine4:328-332)。dc還可通過遺傳方式被轉(zhuǎn)導(dǎo)以也表達這些腫瘤抗原。為免疫目的，dc已直接與腫瘤細胞融合(kugleretal.(2000)naturemedicine6:332-336)。作為接種方法，dc免疫可有效地與tigit阻斷組合，以活化(釋放)更有效的抗-腫瘤反應(yīng)。tigit抑制還可與標準癌癥治療(例如，手術(shù)、放射和化學(xué)療法)組合。tigit抑制可有效地與化學(xué)治療方案組合。在這些情況下，減少給予的化學(xué)治療劑的劑量是可能的(mokyretal.(1998)cancerresearch58:5301-5304)。這樣的組合的實例是抗-tigit抗體與達卡巴井組合來治療黑素瘤。這樣的組合的另一實例是抗-tigit抗體與白介素-2(il-2)組合來治療黑素瘤。組合使用tigit抑制和化學(xué)療法的科學(xué)原理是細胞死亡，其是大多數(shù)化學(xué)治療化合物的細胞毒性作用的結(jié)果，可導(dǎo)致抗原呈遞途徑中腫瘤抗原的水平增加。可通過細胞死亡導(dǎo)致與tigit抑制協(xié)同的其它組合療法是放射、手術(shù)和激素剝奪。這些方案各自在宿主中產(chǎn)生腫瘤抗原的來源。血管發(fā)生抑制劑也可與tigit抑制組合。血管發(fā)生的抑制導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，其可提供腫瘤抗原進入宿主抗原呈遞途徑。本文所述的抗-tigit抗體還可與使表達fcα或fcγ受體的效應(yīng)細胞靶向腫瘤細胞的雙特異性抗體組合使用(參見例如，美國專利號5,922,845和5,837,243)。雙特異性抗體可用于靶向兩種單獨的抗原。例如抗-fc受體/抗腫瘤抗原(例如，her-2/neu)雙特異性抗體已用于使巨噬細胞靶向腫瘤位點。這種靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應(yīng)。這些反應(yīng)的t細胞分支可通過抑制tigit而增強?；蛘?，抗原可通過使用結(jié)合腫瘤抗原和樹突細胞特異性細胞表面標記的雙特異性抗體，直接遞送至dc。腫瘤通過各種機制逃避宿主免疫監(jiān)督。許多這些機制可通過失活由腫瘤表達的免疫抑制性蛋白克服。這些特別包括tgf-β(kehrletal.(1986)j.exp.med.163:1037-1050),il-10(howard&o'garra(1992)immunologytoday13:198-200)和fas配體(hahneetal.(1996)science274:1363-1365)。這些實體的各自的抗體可用于與抗-tigit抗體組合以抵消免疫抑制劑的作用和有助于宿主的腫瘤免疫反應(yīng)?；罨拗髅庖叻磻?yīng)的其它抗體可與抗-tigit抗體組合使用。這些包括樹突細胞表面上的分子，其活化dc功能和抗原呈遞?？?cd40抗體能夠有效地替代t細胞輔助活性(ridgeetal.(1998)nature393:474-478)和可與抗-tigit抗體組合使用。t細胞共刺激性分子例如ox-40(weinbergetal.(2000)immunol164:2160-2169)、cd137/4-1bb(meleroetal.(1997)naturemedicine3:682-685(1997)和icos(hutloffetal.(1999)nature397:262-266)的活化抗體也可提供增加的t細胞活化水平。pd-1或pd-l1或ctla-4(例如，美國專利號5,811,097)的抑制劑也可與抗-tigit抗體組合使用。骨髓移植目前用于治療造血來源的各種腫瘤。盡管移植物抗宿主病是這種治療的結(jié)果，但治療益處可獲自移植物抗腫瘤反應(yīng)。tigit抑制可用于增加供體移植的腫瘤特異性t細胞的功效。還存在若干實驗治療方案，包括離體活化和擴增抗原特異性t細胞和繼承性轉(zhuǎn)移這些細胞至受體，以刺激針對腫瘤的抗原-特異性t細胞(greenberg&riddell(1999)science285:546-51)。這些方法也可用于活化對感染性病原例如cmv的t細胞反應(yīng)。在抗-tigit抗體的存在下離體活化可增加繼承性轉(zhuǎn)移的t細胞的頻率和活性。慢性病毒感染在另一個方面，本文所述的發(fā)明提供了在受試者中治療感染性疾病的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段，使得受試者的感染性疾病被治療。類似于上文所述的其對于腫瘤的應(yīng)用，抗體-介導(dǎo)的tigit抑制可單獨使用，或作為輔助劑與疫苗組合使用，以增強對病原體、毒素和自身抗原的免疫反應(yīng)。這種治療性方法可特別用于的病原體的實例包括但不限于，hiv、肝炎(a,b,&c)、流感、皰疹、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌。tigit抑制可特別用于由病原例如hiv確立的感染，其在感染期間提供改變的抗原。這些新的表位在抗-人tigit抗體給予時作為外來物識別，因此引起強的t細胞反應(yīng)。導(dǎo)致通過本文所述的方法可治療的感染的病原性病毒的一些實例包括hiv、肝炎(a,b,或c)、皰疹病毒(例如，vzv,hsv-1,hav-6,hsv-ii,和cmv,eb病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、jc病毒和蟲媒病毒腦炎病毒。引起可通過本文所述方法治療的感染的病原性細菌的一些實例包括衣原體、立克次氏體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風(fēng)、肉毒桿菌中毒、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆病細菌。引起可通過本文所述方法治療的感染的病原性真菌的一些實例包括假絲酵母(白色假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等)、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、曲霉菌(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌屬(mucor,absidia,rhizopus)、申克孢子絲菌(sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)和histoplasmacapsulatum。引起可通過本文所述方法治療的感染的病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內(nèi)阿米巴(entamoebahistolytica)、結(jié)腸小袋蟲(balantidiumcoli)、naegleriafowleri、棘阿米巴(acanthamoebasp.)、giardialambia、隱孢子蟲(cryptosporidiumsp.)、卡氏肺囊蟲(pneumocystiscarinii)、plasmodiumvivax、果氏巴貝蟲(babesiamicroti)、布氏錐蟲(trypanosomabrucei)、克氏錐蟲(trypanosomacruzi)、杜氏利什曼原蟲(leishmaniadonovani)、剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)、nippostrongylusbrasiliensis。在所有上述方法中，tigit抑制可與其它形式的免疫療法例如細胞因子治療(例如，干擾素、gm-csf,g-csf,il-2)或雙特異性抗體療法組合，其提供增強的腫瘤抗原呈遞(參見例如，holliger(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448;poljak(1994)structure2:1121-1123)。疫苗輔助劑本文所述的抗-tigit抗體可通過共給與抗-tigit抗體與目的抗原(例如，疫苗)，用于增強抗原-特異性免疫反應(yīng)。因此，本文提供了提高對目的抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括給予受試者：(i)抗原；和(ii)抗-tigit抗體或其抗原-結(jié)合片段，使得在受試者中對抗原的免疫反應(yīng)得到增強?？乖梢允抢纾[瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。這樣的抗原的非限制性實例包括上文論述的那些，例如上文論述的腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)，或來自上述病毒、細菌或其它病原體的抗原。在某些實施方案中，代替抗-tigit抗體或除了抗-tigit抗體之外，包含抗-tigit抗體所結(jié)合的表位的肽或融合蛋白用作疫苗。體內(nèi)和體外給予本文所述的抗體組合物(例如，人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)的合適途徑是本領(lǐng)域眾所周知的和可由普通技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可通過注射給予(例如，靜脈內(nèi)或皮下)。使用的分子的合適劑量取決于受試者的年齡和體重和抗體組合物的濃度和/或制劑。如之前所述，本文所述的抗-tigit抗體可與一種或其它多種治療劑，例如，細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑共給予。抗體可與試劑連接(作為免疫復(fù)合物)或可與試劑分開給予。在后一情況下(分開給予)，抗體可在試劑之前、之后或同時給予，或可與其它已知的療法，例如，抗-癌癥療法，例如，放射共給予。這樣的治療劑特別包括，抗-腫瘤劑，例如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來霉素、亞硝脲氮芥、苯丁酸氮芥、達卡巴井和環(huán)磷酰胺羥基脲，其本身僅在對患者為毒性或亞毒性的水平上有效。順鉑以100mg/ml劑量靜脈內(nèi)給予，每四周一次，和阿霉素以60-75mg/ml劑量靜脈內(nèi)給予，每21天一次。與化學(xué)治療劑共給予本文所述的抗-tigit抗體或其抗原結(jié)合片段，提供兩種抗-癌癥劑，其通過不同的機制起作用，產(chǎn)生對人腫瘤細胞的細胞毒性作用。這樣的共給予可解決由于發(fā)生耐藥性或腫瘤細胞的抗原性改變引起的問題，抗原性改變可賦予它們與抗體無反應(yīng)。本文所述的范圍內(nèi)還包括包含本文所述的抗體組合物(例如，人抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫綴合物)和使用說明書的藥劑盒。藥劑盒可進一步包含至少一種另外的試劑，或本文所述的一種或多種另外的人抗體(例如，具有互補活性的人抗體，其結(jié)合不同于第一種人抗體的tigit抗原表位)。藥劑盒通常包括標記，指示藥劑盒內(nèi)容物的預(yù)期用途。術(shù)語標記包括提供在藥劑盒上或隨藥劑盒提供，或以其它方式連同藥劑盒一起的任何書面或記錄的材料。組合療法除了上文提供的組合療法，本文所述的抗-tigit抗體還可用于組合療法，例如，用于治療下文所述的癌癥。本發(fā)明提供組合療法的方法，其中抗-tigit抗體與一種或多種另外的試劑，例如有效刺激免疫反應(yīng)從而進一步增強、刺激或上調(diào)受試者的免疫反應(yīng)的抗體共給予。如實施例7中所示，和圖5a和5b中所示，給予小鼠拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑抗-pd-1抗體具有增強的抑制腫瘤生長的效果。通常，本文所述的抗-tigit抗體可與以下組合：(i)共刺激受體的激動劑，和/或(ii)t細胞上抑制性信號的拮抗劑，其任一導(dǎo)致放大抗原-特異性t細胞反應(yīng)(免疫檢查點調(diào)節(jié)劑)。大多數(shù)共刺激和共抑制性分子是免疫球蛋白超家族(igsf)的成員，和本文所述的抗-tigit抗體可與靶向igsf家族的成員以增加免疫反應(yīng)的試劑給予。結(jié)合共刺激或共-抑制性受體的膜結(jié)合配體的一個重要的家族是b7家族，其包括b7-1,b7-2,b7-h1(pd-l1),b7-dc(pd-l2),b7-h2(icos-l),b7-h3,b7-h4,b7-h5(vista),和b7-h6。結(jié)合共刺激或共-抑制性受體的膜結(jié)合配體的另一個家族是tnf家族的分子，其結(jié)合相關(guān)的tnf受體家族成員，包括cd40和cd40l,ox-40,ox-40l,cd70,cd27l,cd30,cd30l,4-1bbl,cd137/4-1bb,trail/apo2-l,trailr1/dr4,trailr2/dr5,trailr3,trailr4,opg,rank,rankl,tweakr/fn14,tweak,baffr,edar,xedar,taci,april,bcma,ltβr,light,dcr3,hvem,vegi/tl1a,tramp/dr3,edar,eda1,xedar,eda2,tnfr1,淋巴細胞毒素α/tnfβ,tnfr2,tnfα,ltβr,淋巴細胞毒素α1β2,fas,fasl,relt,dr6,troy,ngfr(參見例如，tansey(2009)drugdiscoverytoday00:1)。t細胞活化還受可溶性細胞因子調(diào)節(jié)。因此，抗-tigit抗體可與以下組合使用：(i)抑制t細胞活化的igsf家族或b7家族或tnf家族的蛋白的拮抗劑(或抑制劑或阻斷劑)，或抑制t細胞活化的細胞因子(例如，il-6,il-10,tgf-?,vegf或其它免疫抑制性細胞因子)的拮抗劑，和/或(ii)igsf家族、b7家族或tnf家族的刺激性受體或刺激t細胞活化的細胞因子的激動劑，用于刺激免疫反應(yīng)，例如，用于治療增殖性疾病，例如癌癥。在一個方面，t細胞反應(yīng)可通過本發(fā)明的抗-tigitmab和以下一種或多種的組合刺激：(i)抑制t細胞活化的蛋白的拮抗劑(例如，免疫檢查點抑制劑)，例如ctla-4,pd-1,pd-l1,pd-l2,lag-3,tim-3,galectin9,ceacam-1,btla,cd69,galectin-1,cd113,gpr56,vista,2b4,cd48,garp,pd1h,lair1,tim-1,cd96(wo2015/024060;bernhardtetal.(2014)nat.immunol.15:406)和tim-4，和(ii)刺激t細胞活化的蛋白的激動劑，例如b7-1,b7-2,cd28,4-1bb(cd137),4-1bbl,icos,cd40,icos-l,ox40,ox40l,gitr,gitrl,cd70,cd27,cd40,dr3和cd28h。調(diào)節(jié)上述蛋白之一和可與激動劑抗-tigit抗體(例如，本文描述的那些)組合用于治療癌癥的實例性的試劑包括：yervoy?/ipilimumab或tremelimumab(對ctla-4),galiximab(對b7.1),opdivo?/nivolumab/bms-936558(對pd-1),pidilizumab/ct-011(對pd-1),keytruda?/pembrolizumab/mk-3475(對pd-1),amp224(對b7-dc/pd-l2),bms-936559(對b7-h1),mpdl3280a(對b7-h1),medi-570(對icos),amg557(對b7h2),mga271(對b7h3–wo11/109400),imp321(對lag-3),urelumab/bms-663513和pf-05082566(對cd137/4-1bb),cdx-1127(對cd27),medi-6383和medi-6469(對ox40),rg-7888(對ox40l–wo06/029879),atacicept(對taci),cp-870893(對cd40),lucatumumab(對cd40),dacetuzumab(對cd40),和muromonab-cd3(對cd3)。可與拮抗劑抗-tigit抗體組合用于治療癌癥的其它分子包括nk細胞上的抑制性受體的拮抗劑或nk細胞上的活化受體的激動劑。例如，拮抗劑抗-tigt抗體可與kir的拮抗劑(例如，lirilumab)組合。用于組合療法的其它試劑包括抑制或耗盡巨噬細胞或單核細胞的試劑，包括但不限于csf-1r拮抗劑，例如csf-1r拮抗劑抗體，包括rg7155(wo11/70024,wo11/107553,wo11/131407,wo13/87699,wo13/119716,wo13/132044)或fpa-008(wo11/140249;wo13169264;wo14/036357)。通常，本文所述的拮抗劑抗-tigit抗體可與一種或多種以下試劑一起使用：連接陽性共刺激受體的激動劑、通過抑制性受體削弱信號傳導(dǎo)的阻斷劑，和系統(tǒng)增加抗-腫瘤t細胞的頻率的一種或多種試劑，在腫瘤微環(huán)境內(nèi)克服不同免疫抑制途徑的試劑(例如，阻斷抑制性受體接合(例如，pd-l1/pd-1相互作用)，耗盡或抑制tregs(例如，使用抗-cd25單克隆抗體(例如，daclizumab)或通過離體抗-cd25珠耗盡)，抑制代謝酶例如ido，或逆轉(zhuǎn)/阻止細胞無效能或耗竭)和觸發(fā)先天免疫活化和/或腫瘤位點的炎癥的試劑。本文提供了刺激受試者的免疫反應(yīng)的方法，包括給予受試者拮抗劑抗-tigit分子，例如，抗體，和一種或多種另外的免疫刺激抗體，例如pd-1拮抗劑，例如，拮抗劑抗體，pd-l1拮抗劑，例如，拮抗劑抗體，ctla-4拮抗劑，例如，拮抗劑抗體和/或lag3拮抗劑，例如，拮抗劑抗體，使得在受試者中的免疫反應(yīng)得到刺激，例如以抑制腫瘤生長或刺激抗-病毒反應(yīng)。在一個實施方案中，給予受試者拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑抗-pd-1抗體。在一個實施方案中，給予受試者拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑抗-pd-l1抗體。在一個實施方案中，給予受試者拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑抗-ctla-4抗體。在一個實施方案中，至少一種另外的免疫刺激抗體(例如，抗-pd-1,抗-pd-l1,抗-ctla-4和/或抗-lag3)是人抗體。或者，至少一種另外的免疫刺激抗體可以是例如，嵌合或人源化抗體，例如，自小鼠抗-pd-1、抗-pd-l1、抗-ctla-4和/或抗-lag3抗體制備。本文提供了治療過度增殖性疾病(例如，癌癥)的方法，包括給予受試者拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑pd-1抗體。tigit和pd-1在黑素瘤中共表達(chauvinetal.(2015)j.clin.invest.125:2046)，和還在來自非小細胞肺癌(nsclc)和腎細胞癌(rcc)患者的cd8+tils上以相對高水平共表達。參見表2(顯示對于來自數(shù)個患者的樣品，作為總cd3+cd8+tils的百分比的tigit+/pd-1+細胞的百分比)。表2癌癥中tigit+/pd-1+tils的百分比樣品%tigit+/pd-1+nsclc-113nsclc-35.8nsclc-437.4nsclc-514.6nsclc-649.1nsclc-757.8nsclc-850.5nsclc-921rcc-00225.5rcc-00365.6rcc-00620.5在某些實施方案中，抗-tigit抗體以亞治療劑量給予，抗-pd-1抗體以亞治療劑量給予，或二者均以亞治療劑量給予。本文還提供了改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體和亞治療劑量的抗-pd-1抗體。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，抗-pd-1抗體是人序列單克隆抗體和抗-tigit抗體是人序列單克隆抗體，例如包含本文公開的抗體的cdr或可變區(qū)的抗體。在一個實施方案中，僅具有顯示高表達的pvr和/或nectin-2和高表達pd-l1的腫瘤的受試者被選擇用本發(fā)明的抗-tigit抗體和pd-1拮抗劑組合治療。在另一個實施方案中，具有顯示高表達的pvr和/或nectin-2但低表達pd-l1的腫瘤的受試者被選擇用本發(fā)明的抗-tigit抗體單一療法，或用并非pd-1拮抗劑的另一治療劑的組合療法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供組合療法，其中在用pd-1/pd-l1拮抗劑治療后給予本發(fā)明的抗-tigit抗體。在一個實施方案中，僅在用pd-1/pd-l1拮抗劑治療失敗，導(dǎo)致不完全的治療反應(yīng)，或存在腫瘤復(fù)發(fā)或再發(fā)(本文稱為“pd-1失敗”)后，給予抗-tigit抗體。在進一步的實施方案中，篩選這樣的pd-1失敗中的腫瘤的pvr和/或nectin-2表達，和僅具有高水平表達的那些用抗-tigit抗體治療。用于本文所述方法的合適pd-1拮抗劑包括但不限于，配體、抗體(例如，單克隆抗體和雙特異性抗體)和多價試劑。在一個實施方案中，pd-1拮抗劑是融合蛋白，例如，fc融合蛋白，例如amp-244。在一個實施方案中，pd-1拮抗劑是抗-pd-1或抗-pd-l1抗體。實例性的抗-pd-1抗體是opdivo?/nivolumab(bms-936558)或包含wo2006/121168中描述的抗體17d8,2d3,4h1,5c4,7d3,5f4和4a11之一的cdr或可變區(qū)的抗體。在某些實施方案中，抗-pd-1抗體是wo2012/145493中描述的mk-3475(keytruda?/pembrolizumab/舊稱lambrolizumab)；wo2012/145493中描述的amp-514/medi-0680；和ct-011(pidilizumab;之前的ct-actibody或bat，參見例如，rosenblattetal.(2011)j.immunotherapy34:409)。另外已知的pd-1抗體和其它pd-1抑制劑包括wo2009/014708,wo03/099196,wo2009/114335,wo2011/066389,wo2011/161699,wo2012/145493,美國專利號7,635,757和8,217,149,和美國專利申請?zhí)?009/0317368中描述的那些。還可使用wo2013/173223中公開的任何抗-pd-1抗體。與這些抗體之一競爭結(jié)合，和/或結(jié)合與這些抗體之一相同的pd-1表位的抗-pd-1抗體也可用于組合治療。本文提供了治療過度增殖性疾病(例如，癌癥)的方法，包括給予受試者拮抗劑抗-tigit抗體和拮抗劑pd-l1抗體。在某些實施方案中，抗-tigit抗體以亞治療劑量給予，抗-pd-l1抗體以亞治療劑量給予，或二者均以亞治療劑量給予。本文提供了改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病相關(guān)的不良事件的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體和亞治療劑量的抗-pd-l1抗體。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，抗-pd-l1抗體是人序列單克隆抗體和抗-tigit抗體是人序列單克隆抗體，例如包含本文公開的抗體的cdr或可變區(qū)的抗體。在一個實施方案中，抗-pd-l1抗體是bms-936559(在wo2007/005874和美國專利號7,943,743中稱為12a4),msb0010718c(wo2013/79174),或包含公開于pct公開號wo07/005874和美國專利號7,943,743的3g10,12a4,10a5,5f8,10h10,1b12,7h1,11e6,12b7和13g4的cdr或可變區(qū)的抗體。在某些實施方案中，抗-pd-l1抗體是medi4736(亦稱為抗-b7-h1)或mpdl3280a(亦稱為rg7446)。還可使用公開于wo2013/173223,wo2011/066389,wo2012/145493,美國專利號7,635,757和8,217,149和美國公開號2009/145493的任何抗-pd-l1抗體。與任何這些抗體競爭和/或結(jié)合與任何這些抗體相同的表位的抗-pd-l1抗體也可用于組合治療。在又一實施方案中，本發(fā)明的激動劑抗-hucd40抗體與pd-1/pd-l1信號傳導(dǎo)的拮抗劑，例如pd-1拮抗劑或pd-l1拮抗劑組合，并與第三種免疫治療劑組合。在一個實施方案中第三種免疫治療劑是gitr拮抗劑或ox-40拮抗劑，例如本文公開的抗-gitr或抗-ox40抗體。在另一個方面，免疫腫瘤劑是gitr激動劑，例如激動性gitr抗體。合適的gitr抗體包括例如，bms-986153,bms-986156,trx-518(wo06/105021,wo09/009116)和mk-4166(wo11/028683)。在另一個方面，免疫腫瘤劑是ido拮抗劑。合適的ido拮抗劑包括例如,incb-024360(wo2006/122150,wo07/75598,wo08/36653,wo08/36642),indoximod或nlg-919(wo09/73620,wo09/1156652,wo11/56652,wo12/142237)。本文提供了治療過度增殖性疾病(例如，癌癥)的方法，包括給予受試者本文所述的抗-tigit抗體和ctla-4拮抗劑抗體。在某些實施方案中，抗-tigit抗體以亞治療劑量給予，抗-ctla-4抗體以亞治療劑量給予，或二者均以亞治療劑量給予。本文提供了改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體和亞治療劑量的抗-ctla-4抗體。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，抗-ctla-4抗體是選自以下的抗體:yervoy?(ipilimumab或抗體10d1，描述于pct公開號wo01/14424),tremelimumab(舊稱ticilimumab,cp-675,206)和描述于以下公開的抗-ctla-4抗體：wo98/42752;wo00/37504;美國專利號6,207,156;hurwitzetal.(1998)proc.natl.acad.sci.usa95(17):10067-10071;camachoetal.(2004)j.clin.oncology22(145):abstractno.2505(抗體cp-675206);和mokyretal.(1998)cancerres.58:5301-5304。還可使用wo2013/173223中公開的任何抗-ctla-4抗體。本文提供了治療過度增殖性疾病(例如，癌癥)的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體和抗-lag-3抗體。在進一步的實施方案中抗-tigit抗體以亞治療劑量給予，抗-lag-3抗體以亞治療劑量給予，或二者均以亞治療劑量給予。本文提供了改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體和亞治療劑量的抗-lag-3抗體。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，抗-lag-3抗體是人序列單克隆抗體和抗-tigit抗體是人序列單克隆抗體，例如包含本文公開的抗體的cdr或可變區(qū)的抗體?？?lag3抗體的實例包括包含描述于美國專利申請?zhí)杣s2011/0150892和wo2014/008218的抗體25f7,26h10,25e3,8b7,11f2或17e5的cdr或可變區(qū)的抗體。在一個實施方案中，抗-lag-3抗體是bms-986016?？墒褂玫谋绢I(lǐng)域公認的其它抗-lag-3抗體包括描述于us2011/007023的imp731。也可使用imp-321。與任何這些抗體競爭和/或結(jié)合與任何這些抗體相同的表位的抗-lag-3抗體也可用于組合治療。給予本文所述的抗-tigit抗體和針對一種或多種第二靶抗原例如lag-3和/或ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1的拮抗劑，例如，拮抗劑抗體，可增強對患者的癌細胞的免疫反應(yīng)。其生長可使用本公開內(nèi)容的抗體抑制的癌癥包括通常對免疫療法有響應(yīng)的癌癥。用本公開內(nèi)容的組合療法治療的癌癥的代表性實例包括上文特別列出的在用抗-tigit抗體的單一療法中論述的那些癌癥。在某些實施方案中，本文所述的治療性抗體的組合可作為在藥學(xué)上可接受的載體中的單一組合物同時給予，或作為以抗體分別在藥學(xué)上可接受的載體中的分開的組合物同時給予。在另一個實施方案中，治療性抗體的組合可序貫給予。例如，抗-ctla-4抗體和抗-tigit抗體可序貫給予，例如首先給予抗-ctla-4抗體，其次給予抗-tigit抗體，或首先給予抗-tigit抗體，其次給予抗-ctla-4抗體。另外或備選地，抗-pd-1抗體和抗-tigit抗體可序貫給予，例如首先給予抗-pd-1抗體，其次給予抗-tigit抗體，或首次給予抗-tigit抗體，其次給予抗-pd-1抗體。另外或備選地，抗-pd-l1抗體和抗-tigit抗體可序貫給予，例如首先給予抗-pd-l1抗體，其次給予抗-tigit抗體，或首先給予抗-tigit抗體，其次給予抗-pd-l1抗體。另外或備選地，抗-lag-3抗體和抗-tigit抗體可序貫給予，例如首先給予抗-lag-3抗體，其次給予抗-tigit抗體，或首先給予抗-tigit抗體，其次給予抗-lag-3抗體。此外，如果超過一個劑量的組合療法序貫給予，序貫給予的順序可在每個給予時間點逆轉(zhuǎn)或保持相同的順序，序貫給予可與同時給予組合，或其任何組合。例如首次給予組合抗-ctla-4抗體和抗-tigit抗體可以是同時的，第二次給予可以序貫的，其中首先給予抗-ctla-4抗體和其次給予抗-tigit抗體，和第三次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-tigit抗體和其次給予抗-ctla-4抗體等等。另外或備選地，首次給予組合抗-pd-1抗體和抗-tigit抗體可以是同時的，第二次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-pd-1抗體和其次給予抗-tigit抗體，和第三次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-tigit抗體和其次給予抗-pd-1抗體等等。另外或備選地，首次給予組合抗-pd-l1抗體和抗-tigit抗體可以是同時的，第二次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-pd-l1抗體和其次給予抗-tigit抗體，和第三次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-tigit抗體和其次給予抗-pd-l1抗體等等。另外或備選地，首次給予組合抗-lag-3抗體和抗-tigit抗體可以是同時的，第二次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-lag-3抗體和其次給予抗-tigit抗體，和第三次給予可以是序貫的，其中首先給予抗-tigit抗體和其次給予抗-lag-3抗體等等。另一代表性的給藥方案可包括首次給予是序貫的，其中首先給予抗-tigit和其次給予抗-ctla-4抗體(和/或抗-pd-1抗體和/或抗-pd-l1抗體和/或抗-lag-3抗體)，和后續(xù)的給予可以是同時的。任選地，抗-tigit作為單獨的免疫治療劑，或抗-tigit抗體和一種或多種另外的免疫治療性抗體(例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3阻斷)的組合可進一步與免疫原性劑，例如癌細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子)、細胞和用編碼免疫刺激細胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細胞(heetal.(2004)j.immunol.173:4919-28)組合?？墒褂玫哪[瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原的肽，例如肽gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶，或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達細胞因子gm-csf的腫瘤細胞(下文進一步論述)。tigit抑制劑和一種或多種另外的抗體(例如，ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷)還可進一步與標準癌癥治療組合。例如，tigit抑制劑和一種或多種另外的抗體(例如，ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷)可有效地與化學(xué)治療方案組合。在這些情況下，有可能減少與本公開內(nèi)容的組合給予的其它化學(xué)治療劑劑量(mokyretal.(1998)cancerresearch58:5301-5304)。這樣的組合的實例是抗-tigit激動劑抗體與或不與另外的抗體(例如抗-ctla-4抗體和/或抗-pd-1抗體和/或抗-pd-l1抗體和/或抗-lag-3抗體)的組合進一步與達卡巴井組合以治療黑素瘤。另一實例是抗-tigit抗體與或不與抗-ctla-4抗體和/或抗-pd-1抗體和/或抗-pd-l1抗體和/或lag-3抗體的組合進一步與白介素-2(il-2)組合以治療黑素瘤。組合使用tigit抑制和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷以及化學(xué)療法的科學(xué)原理是細胞死亡，其是大多數(shù)化學(xué)治療化合物的細胞毒性作用的結(jié)果，可導(dǎo)致抗原呈遞途徑中腫瘤抗原的水平增加?？蓪?dǎo)致通過細胞死亡的含或不含ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷的組合tigit抑制的協(xié)同性的其它組合療法包括放射、手術(shù)或激素剝奪。這些方案各自在宿主中產(chǎn)生腫瘤抗原的來源。血管發(fā)生抑制劑還可與組合的tigit抑制和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷組合。血管發(fā)生的抑制導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，其可以是提供給宿主抗原呈遞途徑的腫瘤抗原的來源?？?tigit拮抗劑抗體作為單獨的免疫治療劑，或tigit拮抗劑和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷抗體的組合還可用于與使表達fcα或fcγ受體的效應(yīng)細胞靶向腫瘤細胞的雙特異性抗體組合(參見例如，美國專利號5,922,845和5,837,243)。雙特異性抗體可用于靶向兩種獨立的抗原。這些反應(yīng)的t細胞分支將通過使用組合的tigit抑制和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷而增強。在另一個實例中，抗-tigit拮抗劑抗體作為單獨的免疫治療劑或抗-tigit抗體和另外的免疫刺激劑例如，抗-ctla-4抗體和/或抗-pd-1抗體和/或抗-pd-l1抗體和/或lag-3劑例如抗體的組合，可用于與抗-腫瘤抗體，例如rituxan?(利妥昔單抗),herceptin?(曲妥單抗),bexxar?(tositumomab),zevalin?(ibritumomab),campath?(阿侖單抗),lymphocide?(eprtuzumab),avastin?(bevacizumab),和tarceva?(erlotinib)等組合。例如，并不希望受理論的束縛，用抗-癌癥抗體或與毒素綴合的抗-癌癥抗體治療可導(dǎo)致癌細胞死亡(例如，腫瘤細胞)，其可加強免疫刺激劑例如，tigit,ctla-4,pd-1,pd-l1或lag-3劑例如抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在實例性的實施方案中，過度增殖性疾病(例如，癌癥腫瘤)的治療可包括抗癌劑，例如抗體，與抗-tigit和任選地另外的免疫刺激劑，例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3劑例如抗體組合，同時或序貫或其任何組合，其可加強宿主的抗-腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤通過各種機制逃脫宿主免疫監(jiān)督。許多這些機制可通過失活腫瘤表達的和是免疫抑制性的蛋白而克服。這些特別包括tgf-β(kehrletal.(1986)j.exp.med.163:1037-1050),il-10(howard&o'garra(1992)immunologytoday13:198-200)和fas配體(hahneetal.(1996)science274:1363-1365)。這些實體各自的抗體可進一步與抗-tigit抗體，含或不含另外的免疫刺劑，例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3劑例如抗體組合，以抵消免疫抑制劑的作用和有助于宿主的抗-腫瘤免疫反應(yīng)?？捎糜诨罨拗髅庖叻磻?yīng)的其它試劑，例如抗體，可進一步與抗-tigit抗體，含或不含另外的免疫刺激劑，例如抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3抗體組合使用。這些包括樹突細胞表面上的分子，其活化dc功能和抗原呈遞?？?cd40抗體(ridgeetal.,同上)可與抗-tigit抗體和任選地另外的免疫刺激劑，例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3劑例如抗體組合使用。t細胞共刺激分子ox-40(weinbergetal.(2000)immunol164:2160-2169),cd137/4-1bb(meleroetal.(1997)naturemedicine3:682-685(1997)和icos(hutloffetal.(1999)nature397:262-266)的其它活化抗體也可提供增加的t細胞活化的水平。如上所述，骨髓移植目前用于治療造血來源的各種腫瘤?？?tigit免疫療法單獨或與ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷組合可用于增加供體移植的腫瘤特異性t細胞的效力。幾種實驗治療方案包括離體活化和擴增抗原特異性t細胞和繼承性轉(zhuǎn)移這些細胞至受體，以針對腫瘤的抗原-特異性t細胞(greenberg&riddell,同上)。這些方法還可用于活化對感染性病原例如cmv的t細胞反應(yīng)。在存在抗-tigit，含或不含另外的免疫刺激療法，例如，抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3抗體時離體活化可預(yù)期增加繼承性轉(zhuǎn)移的t細胞的頻率和活性。本文提供了改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病(例如，癌癥)有關(guān)的不良事件的方法，包括給予受試者抗-tigit抗體，含或不含亞治療劑量的抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3劑，例如抗體。例如，本文所述的方法提供通過給予患者不可吸收的類固醇，減少免疫刺激治療性抗體-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎或腹瀉的發(fā)生率的方法。如本文所用的，“不可吸收的類固醇”是糖皮質(zhì)激素，其顯示廣泛的首過代謝，使得在肝中代謝后，類固醇的生物利用率低，即，小于約20%。在本文所述的一個實施方案中，不可吸收的類固醇是布地奈德。布地奈德是一種局部起作用的糖皮質(zhì)激素，在口服給予后其廣泛代謝，主要在肝中。entocortec?(astra-zeneca)是一種ph-和時間-依賴性的布地奈德口服制劑，其經(jīng)開發(fā)以優(yōu)化藥物遞送至回腸和通過整個結(jié)腸。entocortec?在美國獲得批準用于治療輕度至中度的克羅恩病，涉及回腸和/或上行結(jié)腸。entocortec?治療克羅恩病的常用口服劑量是6-9mg/天。entocortec?在腸中釋放，然后被吸收和保留在腸粘膜中。一旦其通過腸粘膜靶組織，entocortec?被肝中的細胞色素p450系統(tǒng)廣泛代謝成代謝物，具有可忽略的糖皮質(zhì)激素活性。因此，生物利用率低(約10%)。與具有較不廣泛的首過代謝的其它糖皮質(zhì)激素相比，布地奈德的低生物利用率導(dǎo)致改進的治療率。布地奈德導(dǎo)致比系統(tǒng)作用的糖皮質(zhì)激素更少的副作用，包括更少的下丘腦-腦垂體抑制。然而，長期給予entocortec?可導(dǎo)致系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素作用，例如腎上腺功能亢進和腎上腺抑制。參見pdr58thed.2004;608-610。在還進一步的實施方案中，tigit抑制含或不含ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1和/或lag-3阻斷(即，免疫刺激治療性抗體抗-tigit和任選地抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3抗體)與不可吸收的類固醇組合，可進一步與水楊酸酯組合。水楊酸酯包括5-asa試劑，例如：sulfasalazine(azulfidine?,pharmacia&upjohn);olsalazine(dipentum?,pharmacia&upjohn);balsalazide(colazal?,salixpharmaceuticals,inc.);和mesalamine(asacol?,procter&gamblepharmaceuticals;pentasa?,shireus;canasa?,axcanscandipharm,inc.;rowasa?,solvay)。根據(jù)本文所述的方法，水楊酸酯與抗-tigit含或不含抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或lag-3抗體和不可吸收的類固醇組合給予可包括水楊酸酯和不可吸收的類固醇的任何重疊或序貫給予，以減少由免疫刺激抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生率。因此，例如，減少由本文所述的免疫刺激抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生率的方法包括同時或序貫給予水楊酸酯和不可吸收的類固醇(例如，在不可吸收的類固醇后6小時給予水楊酸酯)，或其任何組合。此外，水楊酸酯和不可吸收的類固醇可通過相同的途徑給予(例如，都經(jīng)口給予)或通過不同的途徑給予(例如，水楊酸酯經(jīng)口給予和不可吸收的類固醇直腸給予)，其可不同于用于給予抗-tigit和抗-ctla-4和/或抗-pd-1和/或抗-pd-l1和/或抗-lag-3抗體的途徑。本文所述的抗-tigit抗體和組合抗體療法還可與為它們針對治療的適應(yīng)癥(例如，癌癥)的特定用處而選擇的其它眾所周知的療法組合使用。本文所述的抗-tigit抗體的組合可與已知的藥學(xué)上可接受的試劑序貫使用。例如，本文所述的抗-tigit抗體和組合抗體療法可與另外的治療組合使用(例如，同時或分開)，例如放射、化學(xué)療法(例如，使用喜樹堿(cpt-11)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、順鉑、多柔比星、依立替康、紫杉醇、吉西他濱、順鉑、紫杉醇、卡鉑-紫杉醇(taxol),多柔比星、5-fu或喜樹堿+apo2l/trail(a6xcombo))，一種或多種蛋白酶體抑制劑(例如，硼替佐米或mg132)，一種或多種bcl-2抑制劑(例如，bh3i-2’(bcl-xl抑制劑)，吲哚胺雙加氧酶-1(ido1)抑制劑(例如，incb24360),at-101(r-(-)-棉酚衍生物),abt-263(小分子),gx-15-070(obatoclax)或mcl-1(骨髓白血病細胞分化蛋白-1)拮抗劑),iap(細胞凋亡蛋白的抑制劑)拮抗劑(例如，smac7,smac4,小分子smac模擬物,合成的smac肽(參見fuldaetal.,natmed2002;8:808-15),isis23722(ly2181308)或aeg-35156(gem-640)),hdac(組蛋白脫乙?；?抑制劑,抗-cd20抗體(例如，利妥昔單抗),血管發(fā)生抑制劑(例如，貝伐單抗),靶向vegf和vegfr的抗-血管發(fā)生劑(例如，avastin?),合成的三萜類(參見hyeretal.,cancerresearch2005;65:4799-808),c-flip(細胞flice-抑制蛋白)調(diào)節(jié)劑(例如，pparγ(過氧化物酶體增殖子-活化受體γ)的天然和合成配體,5809354或5569100),激酶抑制劑(例如，sorafenib),曲妥單抗,西妥昔單抗,temsirolimus,mtor抑制劑例如雷帕霉素和temsirolimus,bortezomib,jak2抑制劑,hsp90抑制劑,pi3k-akt抑制劑,lenalildomide,gsk3β抑制劑,iap抑制劑和/或遺傳毒性藥物。本文所述的抗-tigit抗體和組合抗體療法可進一步與一種或多種抗-增殖細胞毒性劑組合使用?？捎米骺?增殖細胞毒性劑的化合物的類型包括但不限于以下：烷基化劑(包括但不限于，氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸酯、硝基脲和三嗪)：uracilmustard、氮芥、環(huán)磷酰胺(cytoxantm)fosfamide、美法侖、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、三亞乙基硫代磷酸胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、達卡巴井和替莫唑胺。抗代謝物(包括但不限于葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制劑)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱、pentostatine和吉西他濱。與拮抗劑抗-tigit抗體組合的合適的抗-增殖劑包括但不限于，紫杉烷類,紫杉醇(紫杉醇作為taxoltm市售可得),多西他賽,discodermolide(ddm),dictyostatin(dct),pelorusidea,epothilones,epothilonea,epothiloneb,epothilonec,epothiloned,epothilonee,epothilonef,furanoepothiloned,desoxyepothilonebl,[17]-脫氫脫氧epothiloneb,[18]脫氫脫氧epothilonesb,c12,13-環(huán)丙基-epothilonea,c6-c8橋接epothilonea,反式-9,10-脫氫epothiloned,順式-9,10-脫氫epothiloned,16-脫甲基epothiloneb,epothiloneb10,discoderomolide,patupilone(epo-906),kos-862,kos-1584,zk-epo,abj-789,xaa296a(discodermolide),tzt-1027(soblidotin),ilx-651(tasidotinhydrochloride),halichondrinb,甲磺酸艾日布林(e-7389),hemiasterlin(hti-286),e-7974,cyrptophycins,ly-355703,maytansinoid免疫綴合物(dm-1),mkc-1,abt-751,t1-38067,t-900607,sb-715992(ispinesib),sb-743921,mk-0731,sta-5312,eleutherobin,17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-b-同型-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇,cyclostreptin,isolaulimalide,laulimalide,4-表-7-脫羥基-14,16-二去甲基-(+)-discodermolides和cryptothilone1，以及本領(lǐng)域已知的其它微管穩(wěn)定劑。在結(jié)合用本文所述的抗-tigit抗體治療或其之前需要使異常增殖細胞休眠的情況下，激素和類固醇(包括合成的類似物)，例如17a-炔雌醇、己烯雌酚、睪酮、潑尼松、氟甲睪酮、dromostanolonepropionate、睪內(nèi)酯、megestrolacetate,甲潑尼龍,甲基-睪酮,潑尼松龍,曲安西龍,氯烯雌醚,羥孕酮,氨魯米特,雌莫司汀,medroxyprogesteroneacetate,亮丙瑞林,氟他胺,托瑞米芬,zoladextm也可給予患者。當(dāng)使用本文所述的方法或組合物時，在臨床條件下用于調(diào)節(jié)腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的其它試劑，例如抗模擬物，也可按需要給予。用于安全和有效給予化學(xué)治療劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，它們的給予描述于標準文獻中。例如，許多化學(xué)治療劑的給予描述于physicians'deskreference(pdr),例如，1996年版本(medicaleconomicscompany,montvale,n.j.07645-1742,usa);其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中?；瘜W(xué)治療劑和/或放射療法可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的治療方案給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，化學(xué)治療劑和/或放射療法的給予可根據(jù)治療的疾病和化學(xué)治療劑和/或放射療法對疾病的已知效果而改變。此外，根據(jù)熟練臨床醫(yī)師的知識，治療方案(例如，給予的劑量和次數(shù))可根據(jù)給予的治療劑對患者的觀察到的效果和根據(jù)疾病對給予的治療劑的觀察到的反應(yīng)而改變?；颊哌x擇在本發(fā)明的各種實施方案中，在用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療之前，測試患者以確定他們是否可能對抗-tigit療法有響應(yīng)，和僅顯示與治療反應(yīng)有關(guān)的特征的那些患者被治療?？蓽y量與tigit途徑有關(guān)的蛋白的表達，包括tigit,dnam,pvr,nectin-2,可溶性pvr(spvr)和可溶性nectin-2(snectin-2)或其組合。pvr和nectin-2mrna均在大多數(shù)人腫瘤中高表達。參見實施例9和圖6a。在一個實施方案中，spvr和/或snectin-2在人血清中檢測，例如通過elisa，其中升高的spvr和/或snectin-2水平指示具有癌癥的受試者可能對用本發(fā)明的抗-tigit抗體的治療有響應(yīng)。在一些實施方案中，篩選來自患者的樣品中t細胞上dnam-1的表達，以選擇最可能對抗-tigit療法有響應(yīng)的患者，其中t細胞或nk細胞上dnam-1的存在表明在抗-tigit療法時，例如，用本發(fā)明的抗-hutigit抗體或片段治療，患者將具有有益的抗-腫瘤反應(yīng)；和在t細胞或nk細胞上缺少dnam-1鑒定較不可能獲益于抗-tigit療法的患者。在其它實施方案中，篩選來自患者的樣品中腫瘤細胞或腫瘤-侵潤骨髓細胞上pvr和/或nectin-2/cd112的表達，以選擇最可能對抗-tigit療法有響應(yīng)的患者，其中腫瘤細胞或腫瘤-侵潤骨髓細胞上pvr和/或nectin-2/cd112的存在表明在抗-tigit療法時，例如，用本發(fā)明的抗-hutigit抗體或片段治療，患者將具有有益的抗-腫瘤反應(yīng)；和在腫瘤細胞或腫瘤-侵潤骨髓細胞上缺少pvr和/或nectin-2/cd112鑒定較不可能獲益于抗-tigit療法的患者。在一個實施方案中，在考慮用于本發(fā)明的抗-tigit抗體治療的受試者中，測量可溶性pvr和/或nectin-2的水平，和僅顯示升高的可溶性pvr和/或nectin-2的受試者用抗體治療。例如，高可溶性pvr和/或nectin-2可用作患者選擇生物標記物。如果腫瘤細胞表達升高水平的pvr和/或nectin-2，以及如果這樣的腫瘤具有高水平的侵潤tigit+cd8+t細胞，則腫瘤類型，和個體受試者中的腫瘤最可能對用本發(fā)明的抗-tigit抗體有響應(yīng)。本公開內(nèi)容在以下實施例中進一步說明，其不應(yīng)解釋為進一步限制。本申請中引用的所有附圖和所有參考文獻、genbank序列、專利和公開的專利申請的內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。特別是，pct公開號wo09/045957,wo09/073533,wo09/073546,wo09/054863和pct/us2013/072918和美國專利申請?zhí)?011/0150892的公開內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。實施例實施例1抗-hutigit抗體的產(chǎn)生人抗-hutigit單克隆抗體使用表達人抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，如下產(chǎn)生?？乖環(huán)utigit可溶性重組蛋白用作免疫的抗原?？扇苄匀诤系鞍拙哂?0.7kd的mw和包含hutigit的細胞外部分，在其c-末端與小鼠igg2afc連接。這種融合蛋白在本文被稱為“hutigit-mufc融合蛋白”。融合蛋白通過標準重組dna方法發(fā)生，和在轉(zhuǎn)染的cho細胞中表達，所述細胞分泌可溶性融合蛋白至培養(yǎng)上清液。用于轉(zhuǎn)染的cho宿主細胞獲自invitrogen(cat#11619-012)。分泌的可溶性融合蛋白經(jīng)純化用作免疫原。包括信號序列的全長人tigit的序列提供在seqidno:1。轉(zhuǎn)基因小鼠人tigit的全人單克隆抗體使用來自chd**;ckd2**;cmd++;jkd++;kco5(9272)+^;sc20+基因型的小鼠(下文稱為km?小鼠)制備。各個轉(zhuǎn)基因名稱在括號中，接著隨機整合轉(zhuǎn)基因的品系號。符號++和+表示純合子或半合子；然而因為小鼠使用基于pcr的測定法常規(guī)篩選，所述測定法不允許我們對隨機整合的人ig轉(zhuǎn)基因區(qū)分雜合性和純合性，因此+標記可給予對于這些元件實際上是純合的小鼠。在此品系中，內(nèi)源小鼠κ輕鏈基因已被純合子地破壞，如chenetal.(1993)emboj.12:811-820中所述，和內(nèi)源小鼠重鏈基因已被純合子地破壞，如wo2001/09187的實施例1中所述。此外，該小鼠品系帶有人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因，kco5，如fishwildetal.(1996)naturebiotechnology14:845-851中所述；帶有大部分人κ輕鏈基因座的酵母人工染色體(yac)，如wo2000/026373中所述。小鼠的免疫為了產(chǎn)生人tigit的全人單克隆抗體，km小鼠用純化的hutigit-mufc融合蛋白免疫。通用免疫方案描述于lonberg,n.etal(1994)nature368(6474):856-859;fishwild,d.etal.(1996)naturebiotechnology14:845-851和wo98/24884。在首次輸注抗原時小鼠大約4月齡。純化的重組hutigit-mufc抗原制備物(自表達融合蛋白的轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞純化的10μg)或用人tigit轉(zhuǎn)染的300-19細胞用于腹膜內(nèi)和皮下免疫小鼠。免疫原與ribi佐劑(sigmacat#m6536)1:1混合。小鼠以5-7天間隔免疫5次。首次和第二次免疫用重組蛋白進行。第三次免疫用細胞，第四次免疫用蛋白和第五次免疫用細胞進行。最后一次免疫后一周，將小鼠放血以評價抗原特異性效價。免疫反應(yīng)通過后眼眶采血監(jiān)測。通過facs分析使用轉(zhuǎn)染的300-19細胞篩選血漿，和對抗-人tigit人igg具有最高效價的小鼠用于融合。通過在處死和取出脾臟前靜脈內(nèi)(iv)和腹膜內(nèi)(ip)注射可溶性抗原(2天)和轉(zhuǎn)染的細胞(3天)，小鼠接受最后一次加強免疫。產(chǎn)生人tigit的人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生自高效價km小鼠分離的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤融合配對細胞用基于電場的電融合，使用cytopulse大室細胞融合電穿孔儀(cytopulsesciences,inc.,glenburnie,md)融合。來自免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與等量的p3x63ag8.6.53(atcccrl1580)非分泌小鼠骨髓瘤細胞融合(融合號：2541)。產(chǎn)生的細胞以2.0x104個細胞/孔在包含高葡萄糖(cellgro#10-013-cm)和10%胎牛血清(hyclone#sh30071.03)并補充有β-巰基乙醇(1000x,gibco#21985-023)、7mmhepes(cellgro25-060-cl)、另外的2mml-谷氨酰胺(cellgro25-005-cl)、hat(50x,sigma#h-0262)、5%雜交瘤克隆因子(bioveris#210001)、10%p388di(atcc#crltib-63)條件培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素(100x,cellgro#30-002-ci)的選擇性dmem培養(yǎng)基中置于平底微量滴定板中。約7天后，包含hat的一些培養(yǎng)基被包含ht(cellgro#25-047-ci)的培養(yǎng)基替換。10-12天后，使用均質(zhì)htrf測定法，篩選各個孔中人igg/人κ輕鏈抗體的存在。在該測定法中，來自96孔融合板的上清液與銪-穴狀化合物標記的山羊抗-人igg(fc片段特異性的)、生物素化的山羊抗-人κ輕鏈(bethyl#a80-115b)、鏈霉親和素-xlent混合，和孵育1小時。然后將板在rubystar讀出儀中讀數(shù)。來自對人igg/人κ輕鏈或人igg/人λ輕鏈抗體陽性的孔的雜交瘤細胞然后通過facs使用用人tigit轉(zhuǎn)染的300-19細胞和300-19未轉(zhuǎn)染細胞作為對照進行篩選。將facs陽性親本系轉(zhuǎn)移至24-孔板。幾天后，來自各孔的細胞上清液通過facs再次篩選以證實igg對人tigit的特異性。雜交瘤通過連續(xù)稀釋克隆和通過facs再篩選。選擇36種抗體用于擴增和純化。隨后選擇4種抗體(15a6,22g2,11g11,10d7)用于測序和進一步分析。實施例2抗-hutigit抗體與可溶性人tigit的結(jié)合抗-hutigit抗體與可溶性人tigit的結(jié)合通過biacore?表面等離子體共振(spr)分析測定?？?hutigit抗體在人κ包被的芯片上捕獲(~5krus;southernbiotechcat#2060-01)和重組人tigit(rhtigit/fc)以濃度500nm,250nm,125nm,62nm和31nm流過芯片。mab/體積的捕獲濃度為2-40μg/ml(5μl，10μl/min)?？乖喓蠒r間為5分鐘，15μl/min，抗原離解時間為6分鐘，和用50mmhcl/50mmnaoh(各自12μl，100μl/min)進行再生。結(jié)果顯示在表3中。表3抗-hutigitmabs與人tigit的結(jié)合抗體ka(m-1s-1)(x105)kd(s-1)(x10-3)kd(nm)22g223.70.4030.1724e82.190.7043.2210b84.194.2710.226f71.111.3011.813d11.121.4412.819h21.662.4214.615a62.024.0419.916f61.383.7527.211g110.5031.4428.725e71.334.0030.124g11.254.3735.010d71.716.5138.117g42.198.4238.44e47.3537.350.75f40.5613.1456.020g63.1818.357.66f94.6831.968.26f92.9920.669.011c90.42.9473.59b111.2311.794.927f10.7778.5611013e62.0322.511127f10.5448.3815411g21.7433.419210c91.5229.41948c80.58233.1568抗體14b2,19h2和26d8的結(jié)合太弱而不能可靠地測量。表3顯示的初步結(jié)合常數(shù)測定用于幫助選擇抗-hutigit抗體以進一步研究。亞克隆和純化的抗體15a6和22g2的結(jié)合常數(shù)然后使用全效價曲線測定，分別為1.5nm和90pm。進行另外的spr實驗，比較具有修飾的框架殘基和改變的人igg1恒定區(qū)的15a6和22g2抗體。人igg1f序列提供在seqidno:45，同種異型變體提供在seqidno:46(其在r97k,e239d和m241l不同于seqidno:45)。人igg1.3提供在seqidno:47(其在l117a,l118e和g120a，對應(yīng)于eu編號的l234a,l235e和g237a，不同于seqidno:45)。另一無效的人igg1恒定區(qū)，人igg1.1f提供在seqidno:48(其在l117a,l118e,g120a,a213s和p214s，對應(yīng)于eu編號的l234a,l235e,g237a,a330s和p331s，不同于seqidno:45)。圖7顯示在igg1.1f構(gòu)建體中fcγ受體結(jié)合的顯著降低。使用這樣的“惰性”fc區(qū)是可取的，因為tigit在cd8+tils上高表達，和具有效應(yīng)子功能的抗-tigit抗體可能耗盡根除腫瘤恰好需要的抗-腫瘤cd8+tils和/或nk細胞。比較具有框架變體a72s和/或n112t的15a6和具有框架變體h3q的22g2抗體與它們的未修飾形式的spr實驗，證實了框架變化和同種型均沒有顯著影響與人tigit的結(jié)合。結(jié)果在表4中提供。表4選擇的抗-hutigitmab與人tigit的結(jié)合抗體序列變體同種型ka(m-1s-1)(x106)kd(s-1)(x10-3)kd(nm)15a6-igg1f1.01.51.515a6-igg1.1f1.11.61.515a6a72sigg1.1f1.11.71.515a6n112tigg1.1f1.11.91.715a6a72s&n112tigg1.1f1.02.02.022g2-igg1f1.90.170.0922g2-igg1.1f2.00.130.0722g2h3qigg11.90.300.1622g2h3qigg1.1f2.00.160.08另外的spr實驗發(fā)現(xiàn)，mab22g2以0.06nm的kd結(jié)合人tigit和以0.09nm的kd結(jié)合食蟹猴tigit。序列表中的氨基酸殘基編號比文獻中的編號低117，這是由于使用了eu編號和序列表中缺少igg序列的可變結(jié)構(gòu)域。人抗體的遺傳構(gòu)建體中存在的c-末端賴氨酸(k)殘基通常自市售產(chǎn)生的抗體中缺失，例如本發(fā)明的治療性抗體。dicketal.(2008)biotechnol.bioeng.100:1132。因此，該賴氨酸未包括在任何seqidno:45-48中，但在一個實施方案中，本發(fā)明的抗-hutigit抗體在重鏈的c-末端包括該另外的賴氨酸殘基。在一些實施方案中本發(fā)明的抗體為包含具有c-末端賴氨酸的重鏈和缺少c-末端賴氨酸的重鏈的混合物的制備物，例如，由于非預(yù)期的c-末端剪切。在一些實施方案中本發(fā)明的抗-hutigit抗體包含一個或多個重鏈和一個或多個輕鏈，例如兩個重鏈和兩個輕鏈。實施例3抗-tigit抗體框并至多個組進行抗體框并實驗以確定哪些抗-人tigit抗體與哪些其它抗體競爭結(jié)合hutigit，因此結(jié)合類似的表位。研究了抗體14b2,13e6,6f9,11g11,10c9,16f6,11c9,27a9,10d7,20g6,24e8,24g1,27f1,15a6,4e4,13d1,9b11,10b8,22g2,19h2,8c8,17g4,25e7,26d8和16a8?？?hutigit抗體之間的配對競爭如下測定，其中第一抗體結(jié)合至傳感器芯片的表面，第二抗體與tigit多肽構(gòu)建體在混合物中預(yù)孵育，和預(yù)孵育的混合物流過傳感器芯片以確定第二抗體干擾tigit多肽構(gòu)建體與在芯片表面上的第一抗體結(jié)合的程度。簡言之，第一抗-hutigit抗體固定在傳感器芯片cm5芯片(seriess,gehealthcarecat#br-1005-30)表面上，流動池2,流動池3&流動池4(5000rus)和流動池1用作陰性對照。第二抗體稀釋至起始濃度120μg/ml(2x)。第二抗體的一系列稀釋通過用緩沖液1:3稀釋抗體濃度進行，得到7個不同濃度和對照樣品0.0μg/ml以獲得滴定曲線。各抗體濃度系列分成兩半。第一半濃度系列中，在各孔中40nm(2x)將tigit抗原(rhtigit/fc)加入以制備終濃度系列(60μg/ml-0.0μg/ml)和20nm的終抗原濃度。在第二半濃度系列中，替換抗原，加入緩沖液使抗體稀釋至相同的濃度，和該一半作為空白處理。將第二抗-tigit抗體和rhtigit/fc的復(fù)合物孵育2小時。將40μl復(fù)合物以30μl/min流速注射到抗體(第一)包被的表面。使用biacore?t200表面等離子體共振儀器和運行緩沖液是hbe-ep,gehealthcarecat#br-1001-88，過濾脫氣，0.01mhepes,ph7.4,0.15nacl,3mmedta,0.005%surfactantp20。表面用25mmnaoh(ordercode:br-1003-58,gehealthcare)以100μl/min再生5秒。使用microsoftexcel分析數(shù)據(jù)，其中第二抗體的濃度系列針對相應(yīng)的反應(yīng)單元作圖，以獲得滴定曲線。結(jié)果表明試驗抗體框并至四個組。見圖1?？?的抗體(14b2,13e6,6f9,11g11,10c9,16f6,11c9,27a9,10d7,20g6,24e8,24g1,27f1,15a6,4e4,13d1,9b11,10b8)阻斷框1內(nèi)的其它抗體以及22g2,19h2,8c8和17g4的結(jié)合?？?的抗體(25e7,26d8,16a8)阻斷框2內(nèi)的其它抗體以及22g2,19h2和8c8的結(jié)合?？贵w22g2,19h2和8c8(框3)阻斷框3內(nèi)的其它抗體，以及框1和2二者中的抗體的結(jié)合，但不阻斷17g4(框4)的結(jié)合?？贵w17g4阻斷框1內(nèi)的抗體的結(jié)合，但不阻斷任何其它抗體的結(jié)合。實施例4通過酵母展示表位作圖選擇的本發(fā)明的抗-hutigit抗體(克隆22g2,11g11和15a6)的表位通過在酵母上展示隨機誘變的hutigit細胞外區(qū)域變體和基于它們不能結(jié)合特定的抗體來分選這些酵母確定。選擇的不能結(jié)合的酵母細胞被擴增和基于它們不能結(jié)合本發(fā)明的特定抗體進行另外輪的選擇。參見例如，chaoetal.(2004)j.mol.biol.342:539。對得到的酵母，確定hutigit變體的序列和分析各殘基對抗體結(jié)合的影響。本發(fā)明的抗體的結(jié)合表位作為hutigit序列內(nèi)的基因座確定，其中單個氨基酸突變破壞與本發(fā)明的抗-hutigit抗體的結(jié)合。簡言之，易錯pcr用于克隆人tigit-編碼dna至構(gòu)建體，允許表達hutigit變體，作為融合蛋白的氨基-末端部分，其還包含c-myc標簽序列和酵母細胞壁蛋白agα1p。這樣的構(gòu)建體，當(dāng)在酵母(釀酒酵母)中表達時，在酵母細胞表面上展示變體hutigit多肽，其通過aga1p多肽錨定至細胞表面。c-myc標簽可任選地用作在給定的酵母細胞上展示hutigit-融合蛋白的陽性對照。酵母細胞通過facs分選，和作為正確折疊的hutigit-融合蛋白表達(通過對照小鼠抗-hutigit抗體的結(jié)合測定，其通過別藻藍蛋白(apc)-標記的山羊抗-小鼠igg第二抗體檢出)而不結(jié)合本發(fā)明的抗體(通過用藻紅蛋白(pe)標記的山羊抗-人igg作為第二抗體檢測來測定)的那些被合并，擴增和用于后續(xù)輪的選擇。確定來自在若干輪選擇后仍保留的酵母構(gòu)建體的hutigit序列。沒有抗-hutigit抗體選擇的對照實驗證實了在沿hutigit序列的各位點上良好的突變體覆蓋度，和提供了基線以將用選擇的文庫獲得的結(jié)果標準化。對hutigit突變體分子的各抗體選擇群進行數(shù)百萬的高質(zhì)量序列讀出。發(fā)現(xiàn)殘基60結(jié)構(gòu)上耐受突變，但該位置的突變體不結(jié)合抗體22g2，表明e60參與表位。類似地，殘基i109,l65,n70,f107,t117,i68,h76和n58也發(fā)現(xiàn)是抗體22g2的表位的重要的殘基。22g2的表位殘基簇集至包含殘基58–76(nweqqdqllaicnadlgwh;seqidno:38)和殘基107–117(fciyhtypdgt;seqidno:39)的一級序列區(qū)。參見圖2a。該表位與tigit/pvr結(jié)合界面重疊，如通過x-射線晶體結(jié)構(gòu)所測量的。stengeletal.(2012)proc.nat’lacad.sci.(usa)109:5399。用抗體11g11的類似的實驗顯示殘基g74,n70,h76,l65,l73,q56,i68,h111和p114的重要的接觸點。11g11的表位殘基簇集至包含殘基56–76(qvnweqqdqllaicnadlgwh;seqidno:40)和殘基111–114(htyp;seqidno:41)的一級序列區(qū)，其它可能的接觸在殘基120–139(griflevlessvaehgarfq;seqidno:42)。參見圖2b。用抗體15a6的類似的實驗顯示殘基h76,g74,l65,n58,i68,q139,g135,l73,f107,n70,e60,h134,a132和i109的重要的接觸點。15a6的表位殘基簇集至包含殘基58–76(nweqqdqllaicnadlgwh;seqidno:38)和殘基107–109(fci)的一級序列區(qū)，其它可能的接觸在殘基132–139(aehgarfq;seqidno:43)。參見圖2c。所有三個表位包括殘基l65,i68,n70和h76，表明這些殘基和該區(qū)域，即殘基65–76(llaicnadlgwh;seqidno:44)或僅考慮15a6和22g2的58–76，代表了本發(fā)明的抗-hutigit抗體的結(jié)合的重要的區(qū)域(“核心表位”)。對hutigit與人pvr/cd155的結(jié)合的類似的實驗顯示殘基q56,n58,i68,n70,l73,g74,w75,h76,h111,t112,y113,p114,d115和g116的重要的接觸點，該接觸主要落入抗體22g2,11g11和15a6所結(jié)合的表位區(qū)。實施例5通過用抗-tigit抗體處理的nk細胞增強pvr+細胞的溶胞評價了抗-人tigit抗體22g2對體外nk-細胞介導(dǎo)的pvr+細胞溶胞的作用。在存在抗-hutigitmab22g2-igg1,22g2-igg1.1或同種型對照的情況下，野生型和工程改造以表達人pvr的p815細胞(小鼠肥大細胞瘤細胞系)暴露于人nk細胞。簡言之，人nk細胞，效應(yīng)子，自全血分離和用il-2孵育過夜。nk細胞用靶細胞，p815/pvr或p815[wt]，以e:t細胞比10:1或20:1鋪板?？贵w以終濃度5μg/ml加入至各孔。將板孵育2-4小時，和評價細胞上清液中乳酸脫氫梅(ldh)，死細胞或瀕死細胞的一種產(chǎn)物，的釋放。結(jié)果在圖3中提供。百分比(%)特異性溶胞計算為[(試驗信號-平均自發(fā)溶胞)/(平均最大溶胞-平均自發(fā)溶胞)]x100。使用抗-tigit抗體22g2的tigit阻斷減少nk細胞上的抑制性信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致表達pvr的靶細胞的溶胞以dnam-1特異性方式增加。實施例6通過抗-tigit抗體的cd8+t細胞的活化進行實驗以確定抗-人tigit抗體，單獨和與抗-人pd-1抗體組合對用抗原肽刺激的人t細胞的作用。初步觀察到，pd-1+/tigit+cd8+t細胞在來自暴露于抗原肽混合物(來自cmv、ebv、流感和破傷風(fēng))的健康人供體的血液中比來自未暴露的血液更普遍。參見圖4a。ifnγ產(chǎn)生在用ceft處理的血液中測量。參見圖4b。盡管與單一療法一樣無效，抗-tigitmab22g2增強抗-pd-1刺激ifnγ自暴露于抗原肽混合物的人t細胞產(chǎn)生的能力。亦參見chauvinetal.(2015)j.clin.invest.125:2046，其中抗-人tigit抗體10d7對人腫瘤特異性cd8+t細胞的作用在來自暴露于ny-eso-1肽的黑素瘤患者(同時給予或不給于抗-hupd-1抗體)的外周血單核細胞(pbmc)中測定。實施例7鼠ct26腫瘤模型中抗-tigit抗體的抗-腫瘤活性在同基因ct26結(jié)腸腺癌模型中測試抗-小鼠tigit抗體單獨和與抗-小鼠pd-1抗體組合的抗-腫瘤活性。這些實驗中使用的抗-mutigit抗體是本發(fā)明的抗-hutigit抗體的小鼠代替物。簡言之，抗-mutigitmab(克隆4b1)用鼠igg2a或鼠igg1d265a(具有減少的效應(yīng)子功能)fc區(qū)制備，以及抗-mupd-1(克隆4h2)用鼠igg1d265afc區(qū)制備。將這些抗體和其組合以及小鼠iggl同種型對照給予小鼠以確定在同基因ct26結(jié)腸腺癌模型中的抗-腫瘤活性。用于研究的igg1對照抗體是具有小鼠iggl同種型的重組人抗-白喉毒素抗體。在第0天，向15只balb/c小鼠/組(總共90只小鼠)皮下注射1x106個ct26腫瘤細胞。在移植后第7天開始治療。測量腫瘤，隨機分到治療組，以具有相當(dāng)?shù)钠骄[瘤體積(45-50mm3)，然后用設(shè)計的抗體(200μg/劑量)腹膜內(nèi)(ip)處理，和在第10和14天再次進行。各實驗還包括200μg/劑量的對照igg1抗體，因此對照igg1實驗本身包括400μg/劑量。腫瘤體積每周兩次測量。結(jié)果表示在圖5a中，其提供了各實驗的平均腫瘤體積作為時間的函數(shù)。減少的效應(yīng)子功能形式的抗-tigit抗體(g1d265a)未影響腫瘤生長和未除去任何腫瘤小鼠，而igg2a減少腫瘤生長和導(dǎo)致15只小鼠中的3只在第35天無腫瘤。igg2a抗-tigit抗體與抗-pd-1抗體的組合高度有效地減少腫瘤生長和導(dǎo)致15只小鼠中的10只無腫瘤，而抗-tigitg1d265a與抗-pd-1的組合略微無效地減少腫瘤生長和導(dǎo)致15只小鼠中的7只無腫瘤。無論如何，igg2a和igg1d265a抗-tigit抗體二者增強抗-pd-1抗體的活性，它們單獨導(dǎo)致15只小鼠中的僅2只無腫瘤。進行類似實驗以比較作為單一療法的抗-tigit與抗-tigit/抗-pd-1和抗-tigit/抗-ctla-4組合療法。使抗-tigit和抗-pd-1抗體的形式為fc-惰性小鼠igg1-d265a同種型，和抗-ctla-4作為小鼠igg2b。在第0天向雌性balb/c小鼠移植1x106個腫瘤細胞，和抗體以10mg/kg在第10、14和17天經(jīng)ip給予。結(jié)果提供在圖5b。加入抗-tigit至用抗-pd-1和抗-ctla-4的治療顯著增強腫瘤生長抑制(tgi)，從組合療法曲線上來看是明顯的，對于抗-tigit/抗-pd-1為56%tgi，和對于抗-tigit/抗-ctla-4為49%tgi，相比之下，對于用抗-tigit、抗-pd-1和抗-ctla-4的單一療法分別為7%、18%和13%tgi。組合療法還增加在實驗結(jié)束時的無腫瘤小鼠數(shù)，對于與抗-pd-1的組合從1/10增加至5/10，和對于與抗-ctla-4的組合從3/10增加至6/10。實施例8抗-hutigit抗體15a6,22g2,11g11和10d7的其它性質(zhì)進行各種其它體外測定法以確定選擇的本發(fā)明的抗體的性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)抗-hutigitmabs15a6,22g2,11g11和10d7結(jié)合表達hutigit的jurkat細胞。jurkat/htigit細胞的生物測定法證實抗體15a6,11g11和10d7全都以大致等同的效力阻斷pvr信號傳導(dǎo)，和抗體22g2的效力更佳，為約2倍(ic50=0.21nm)。顯示抗體15a6和22g2，當(dāng)在cho細胞上表達時，以基本上與人tigit相同的親和力結(jié)合來自食蟹猴的tigit，而11g11和10d7并非如此。例如，抗體22g2igg1.1f分別以0.09nm和0.07nm的kd結(jié)合人和猴tigit，和還分別具有0.55nm和0.28-0.58nm的結(jié)合cd8+t細胞的ec50，但不結(jié)合大鼠或小鼠tigit。然而，用原代細胞的后續(xù)實驗證實了在該背景下15a6不充分結(jié)合食蟹猴tigit。抗體22g2和15a6染色人淋巴細胞，但直至10μg/ml的濃度不染色22種其它人組織(大腦、小腦、心、肝、肺、腎、脾、扁桃體、胸腺、結(jié)腸、小腸、胃、胰腺、皮膚、骨骼肌、腎上腺、甲狀腺、外周神經(jīng)、前列腺、胎盤、睪丸和子宮)。當(dāng)以10μg/ml孵育20小時，抗體22g2不增加來自8個供體的人全血的75種不同的細胞因子和趨化因子的表達(包括gm-csf,il-10,il-12,il-13,il-2,ifnγ,ip-10)，表明低風(fēng)險的細胞因子釋放綜合征。在單獨的實驗中，抗-tigitmab22g2igg1.1f，對于阻斷tigit-mfc與分別過表達人pvr和人nectin-2的p815細胞結(jié)合，當(dāng)各自以其ec90濃度(分別14.1nm和12.8nm)存在時，顯示15.4nm和5.72nm的ic50。發(fā)現(xiàn)抗體22g2igg1.1f具有在重鏈的n310上的單n-糖基化位點，具有對cho中產(chǎn)生的單克隆抗體典型的聚糖特征。這些結(jié)果表明，在本發(fā)明的方法中，抗體22g2具有理想的性質(zhì)用于治療用途，因為其當(dāng)存在于細胞表面上時結(jié)合tigit，其抑制pvr和nectin-2信號傳導(dǎo)，其不結(jié)合外來的人組織或誘導(dǎo)不需要的細胞因子或趨化因子釋放，和其結(jié)合食蟹猴tigit，這有助于進行毒理學(xué)研究用于支持監(jiān)管批準的研究。實施例9基于tigit,dnam,pvr和nectin-2的表達選擇患者與tigit途徑相關(guān)的蛋白的表達水平(tigit,pvr/cd155,nectin-2/cd112,dnam/cd226)可用于指導(dǎo)用本發(fā)明的抗-tigit抗體的治療。可溶性形式的pvr和nectin-2(spvr和snectin-2)可在血清中檢出，例如，通過elisa或其它常規(guī)方式。tigit,pvr,nectin-2和dnam可在細胞表面上檢出，例如腫瘤細胞、cd8+t細胞、調(diào)節(jié)t細胞、nk細胞或腫瘤侵潤骨髓細胞，例如，通過免疫組織化學(xué)(ihc)、流式細胞術(shù)(facs)或質(zhì)譜方法，包括液相色譜質(zhì)譜(lc-ms)。不意欲受理論的限制，用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療基于在相互作用細胞上阻斷tigit與其配體，例如pvr或nectin-2的結(jié)合，和/或在所述細胞上阻止tigit與dnam相互作用。因此，最可能響應(yīng)這樣的治療的腫瘤或腫瘤類型是其中tigit活性對腫瘤進展是重要的那些，使得阻斷這樣的tigit活性將增強腫瘤根除。特別是，高水平的tigit+tils，例如tigit+cd8+t細胞、tigit+tregs或tigit+nk細胞，將表明腫瘤可能響應(yīng)拮抗劑抗-tigit治療。這些tigit+tils上的dnam表達進一步表明，腫瘤可響應(yīng)抗-tigit治療。類似地，在腫瘤細胞本身上或在腫瘤侵潤骨髓細胞上表達高水平的tigit配體pvr和/或nectin-2的腫瘤也將是用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療的良好的候選者。篩選tigit途徑的蛋白的表達水平可以治療適應(yīng)癥選擇水平或以個體患者水平(“患者分層”)進行。例如，表達水平可在來自具有許多不同癌癥的每一種的許多患者的組織樣品中測定，以確定哪種類型的癌癥顯示表明特定類型的癌癥可適合于用拮抗劑本發(fā)明的-tigitmab治療的蛋白表達模式。一旦對于統(tǒng)計學(xué)足夠數(shù)量的樣品做出這樣的確定，抗-tigit療法可被推薦用于患有預(yù)期對抗-tigit療法響應(yīng)的癌癥類型的任何個體患者。或者，可取而代之地測試來自個體患者的樣品，以幫助指導(dǎo)對該患者特定的治療決定。因為對于tigit途徑蛋白表達測試的相關(guān)細胞是在腫瘤和周圍微環(huán)境中的那些細胞，這樣的篩選可能需要獲得腫瘤樣品，例如，通過活檢或切除。因此，本發(fā)明還提供通過測量在侵潤cd8+t細胞、tregs或nk細胞中的tigit水平，和/或通過測量在腫瘤細胞或腫瘤侵潤骨髓細胞中pvr和/或nectin-2的表達，鑒定作為用本發(fā)明的拮抗劑抗-tigit抗體治療的良好候選者的腫瘤類型或具體腫瘤的方法。在一個實例中，抗-tigit療法用于代替、結(jié)合或補充用pd-1或pd-l1抑制劑的治療。顯示高pvr/nectin-2表達和低pd-l1表達的腫瘤可用作為單一療法的抗-tigit抗體，或抗-tigit抗體與另一種并非pd-1/pd-l1拮抗劑的免疫腫瘤學(xué)試劑的組合治療(如果對于這樣的試劑存在生物學(xué)原理的話)。本發(fā)明的抗-tigit抗體可在顯示高pvr/nectin-2表達和還顯示高pd-l1表達的腫瘤中基本上與抗-pd-1/pd-l1抗體同時給予?；蛘撸景l(fā)明的抗-tigit抗體可在抗-pd-1/pd-l1療法后給予難治性患者、復(fù)發(fā)性患者或具有任何其它不完全或不令人滿意的反應(yīng)的患者，如果他們的腫瘤顯示升高的pvr和/或nectin-2表達的話。在鑒定可能適合于用本發(fā)明的拮抗劑抗-tigit抗體治療的腫瘤類型的實驗中，使用tcga數(shù)據(jù)集對各種人癌癥測定人pvrmrna的表達。結(jié)果顯示在圖6a。結(jié)果以遞減順序提供，具有最高水平的pvrmrna，因此最可能適合于用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療的腫瘤在最上面。與結(jié)腸上皮對照樣品相比，在結(jié)腸腺癌樣品中pvr還以高得多的水平通過ihc檢出。參見圖6b。進一步的ihc實驗顯示，在100%的肝細胞癌癥樣品(10/10)、90%的結(jié)腸直腸癌樣品(9/10)和44%的卵巢癌樣品(4/9)中pvr表達升高。這些結(jié)果表明，具有這些癌癥，特別是肝細胞和結(jié)腸直腸癌的患者，是用本發(fā)明的拮抗劑抗-tigit抗體治療的良好候選者。本發(fā)明還提供治療方法，例如，治療結(jié)腸直腸癌的方法，包括測定腫瘤內(nèi)細菌具核梭桿菌的存在或不存在，其存在表明腫瘤可能是用本發(fā)明的抗-tigit抗體治療的良好候選者。這樣的治療方法還任選地包括給予具有腫瘤內(nèi)細菌具核梭桿菌的受試者抗生素，例如，甲硝噠唑、哌拉西林/tazobactum、ticarcillin/clavulanate、amoxicillin/sulbactum、氨芐西林/sulbactum、ertupenem、imipenem、meropenem、氯林肯霉素或cefoxitin。表5序列表概述seqidno.描述1人tigit多肽(np_776160.2)215a6vh結(jié)構(gòu)域315a6vh結(jié)構(gòu)域a72s415a6vh結(jié)構(gòu)域n112t515a6vh結(jié)構(gòu)域a72sn112t615a6vl結(jié)構(gòu)域722g2vh結(jié)構(gòu)域822g2vh結(jié)構(gòu)域h3q922g2vl結(jié)構(gòu)域1011g11vh結(jié)構(gòu)域1111g11vl結(jié)構(gòu)域1210d7vh結(jié)構(gòu)域1310d7vl結(jié)構(gòu)域1415a6cdrh11515a6cdrh21615a6cdrh31715a6cdrl11815a6cdrl21915a6cdrl32022g2cdrh12122g2cdrh22222g2cdrh32322g2cdrl12422g2cdrl22522g2cdrl32611g11cdrh12711g11cdrh22811g11cdrh32911g11cdrl13011g11cdrl23111g11cdrl33210d7cdrh13310d7cdrh23410d7cdrh33510d7cdrl13610d7cdrl23710d7cdrl33822g2/15a6表位–hutigit殘基58–763922g2表位–hutigit殘基107–1174011g11表位–hutigit殘基56–764111g11表位–hutigit殘基111–1144211g11表位–hutigit殘基120–1394315a6表位–hutigit殘基132–1394422g2/11g11/15a6核心表位–hutigit殘基65–7645igg1f恒定結(jié)構(gòu)域(人)46igg1恒定結(jié)構(gòu)域,同種異型變體(人)47igg1.3恒定結(jié)構(gòu)域(人)48igg1.1f恒定結(jié)構(gòu)域(人)49κ恒定結(jié)構(gòu)域(人)50pvr/cd155前體α(人)np_006496.451pvr/cd155前體β(人)np_001129240.152pvr/cd155前體γ(人)np_001129241.153pvr/cd155前體δ(人)np_001129242.2關(guān)于抗體序列，序列表提供了重鏈和輕鏈的成熟可變區(qū)的序列，即序列不包括信號肽。等同方案：本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，或使用不超過常規(guī)實驗?zāi)軌虼_定本文公開的特定實施方案的許多等同方案。這樣的等同方案意欲包括在隨附權(quán)利要求書中。當(dāng)前第1頁12