分離的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離的抗體。PTA-954720081015PTA-1017020090706
【專利說明】分離的抗體
[0001] 本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2009/003994,中國國家申請(qǐng) 號(hào)為200980126470. X，申請(qǐng)日為2009年7月8日，發(fā)明名稱為"Notch結(jié)合劑和拮抗劑及其 應(yīng)用方法"。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及包含結(jié)合人類Notch受體的試劑的組合物和使用所述組合物來治療 癌和其它疾病的方法。更具體而言，本發(fā)明提供了例如與人類Notch受體的胞外域的非配 體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合，并抑制腫瘤生長的抗體。本發(fā)明還提供了癌的治療方法，所述方法包 括施用治療有效量的抗體，所述抗體與人類Notch受體蛋白的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異 性結(jié)合,并抑制腫瘤生長。

【背景技術(shù)】
[0003] Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚后組織維持和干細(xì)胞生物學(xué)的幾種關(guān)鍵 調(diào)節(jié)方式之一。更特別的是，Notch信號(hào)傳導(dǎo)參與相鄰細(xì)胞命運(yùn)之間的側(cè)抑制過程，并且在 不對(duì)稱細(xì)胞分裂其間在細(xì)胞命運(yùn)確定中起重要作用。失調(diào)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)與許多人類 癌有關(guān)，在這些癌中Notch信號(hào)傳導(dǎo)可以改變腫瘤細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)，將其維持在未分化的 增殖狀態(tài)（Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res. 5:69)。因此，由于算奪控制著正 常發(fā)育和由干細(xì)胞群進(jìn)行的組織修復(fù)的體內(nèi)平衡機(jī)制，可以導(dǎo)致癌形成（Beachy等，2004， Nature 432 ：324)〇
[0004] Notch受體首先在果蠅突變體中鑒定出，所述果蠅突變體患有單倍不足，導(dǎo)致翅緣 處的缺刻，而功能喪失型產(chǎn)生胚胎致死"神經(jīng)性"表型，該表型中表皮的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變成神 經(jīng)組織（]?〇〇111'，1919,661^^.4 :252 屮〇1118〇11，1937，？嫩3 23:133 丨〇1118〇11，1940，了』叉口· Zool. 83 :271)。Notch受體是單跨膜的跨膜受體，在大胞外域中含有許多串聯(lián)的表皮生長 因子（EGF)-樣重復(fù)和三個(gè)富含半胱氨酸的Notch/LIN-12重復(fù)（Wharton等，1985, Cell 43 :567 ;Kidd 等，1986, Mol. Cell. Biol. 6 :3094 ;Artavanis 等的綜述，1999, Science 284 : 770)。已經(jīng)鑒定出4種哺乳動(dòng)物Notch蛋白（Notchl、Notch2、Notch3和Notch4)，這些受體 中的突變總是導(dǎo)致發(fā)育異常和人類病變，所述發(fā)育異常和人類病變包括如以下詳細(xì)說明的 幾種癌癥（Gridley，1997，Mol. Cell Neurosci. 9 :103 ;Joutel&Tournier-Lasse;rve，1998， Semin. Cell Dev. Biol. 9 :619-25)。
[0005] Notch受體受Delta, Serrated, Lag-2 (DSL)家族的單次跨膜配體激活。哺乳動(dòng)物 中存在 5 種已知的 Notch 配體：Delta-樣 I (DLLl)、Delta_ 樣 3 (DLL3)、Delta_ 樣 4 (DLL4)、 Jagged I(JAGl)和Jagged 2(JAG2)，其特征在于DSL域和在胞外域內(nèi)的串聯(lián)的EGF-樣重 復(fù)。Notch受體的胞外域與通常位于相鄰細(xì)胞上的其配體的胞外域相互作用，導(dǎo)致Notch的 2個(gè)蛋白水解切割，一個(gè)由ADAM (A Disintegrin And Metallopeptidase,解整合素-金屬 肽酶）蛋白酶介導(dǎo)的胞外切割和一個(gè)由Y分泌酶介導(dǎo)的跨膜域內(nèi)的切割。后一切割產(chǎn)生 Notch胞內(nèi)域（ICD)，該Notch胞內(nèi)域然后進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核中其激活CBFl, Suppressor of Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL)家族的轉(zhuǎn)錄因子,上述家族的轉(zhuǎn)錄因子作為主要下游效 應(yīng)子增加 Hairy和Split增強(qiáng)子[E(spl)]家族的細(xì)胞核堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn) 錄（Artavanis等，1999, Science 284:770 ;Brennan和Brown, 2003,Breast Cancer Res. 5: 69 ; I so 等，2003，ArterioscIer. Thromb. Vase. Biol. 23 :543)。哺乳動(dòng)物中還可以存在涉 及果蠅中鑒定出的胞質(zhì)蛋白Deltex的替代性細(xì)胞內(nèi)途徑（Martinez等，2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :524-33)，并且該Deltex-依賴性途徑可以起到抑制Wnt靶基因表達(dá)的作用 (Brennan 等，1999, Curr. Biol. 9 :707-710 ;Lawrence 等，2001，Curr. Biol. 11 :375-85)。
[0006] 哺乳動(dòng)物Notch受體經(jīng)過切割以形成成熟受體，然后進(jìn)行配體結(jié)合從而激活下游 的信號(hào)傳導(dǎo)。成熟期間弗林（furin)-樣蛋白酶切割Notch受體，從而產(chǎn)生近膜異二聚體， 該近膜異二聚體包含結(jié)合在一起處于自身抑制狀態(tài)的非共價(jià)連接的胞外亞基和跨膜亞基。 配體結(jié)合解除了這種抑制并且誘導(dǎo)Notch受體被ADAM-型金屬蛋白酶和γ -分泌酶切割， 其中Y-分泌酶將胞內(nèi)域（ICD)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，使得其易位到細(xì)胞核從而激活基因轉(zhuǎn)錄。 ADAM進(jìn)行的切割發(fā)生在位于近膜負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的非配體結(jié)合切割域內(nèi)。
[0007] 造血干細(xì)胞（HSC)是體內(nèi)了解最清楚的干細(xì)胞，并且Notch信號(hào)傳導(dǎo)涉及其正常 維持以及白血病轉(zhuǎn)化（Kopper&Hajdu，2004, Pathol. Oncol. Res. 10 :69-73)。HSC 是稀少 的細(xì)胞群體，存在于成體骨髓內(nèi)的間質(zhì)小生境（stromal niche)中。這些細(xì)胞的特征在于 獨(dú)特的基因表達(dá)圖譜和連續(xù)產(chǎn)生更加分化的祖細(xì)胞以重建整個(gè)造血系統(tǒng)的能力。HSC和 祖細(xì)胞中的Notchl信號(hào)傳導(dǎo)的組成型激活在體外和在長期重建測試中建立了同時(shí)產(chǎn)生 淋巴樣細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的永生化細(xì)胞系（Varnum-Finney等，2000, Nat. Med. 6 :1278-81)， 并且Jaggedl的存在增加了 HSC富集的人類骨髓細(xì)胞群的移植（Karanu等，2000, J. Exp. Med. 192 :1365-72)。最近，已經(jīng)在體內(nèi)于HSC中證明了 Notch信號(hào)傳導(dǎo)，并且其顯示參與抑 制HSC分化。另外，Notch信號(hào)傳導(dǎo)似乎是Wnt-介導(dǎo)的HSC自我更新所需要的（Duncan等， 2005, Nat. Immunol. 6 :314)。
[0008] Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑還在神經(jīng)干細(xì)胞的維持中起關(guān)鍵作用，并且涉及其正常維 持和腦癌（Kopper&Hajdu，2004，Pathol. Oncol. Res. 10 :69-73 ;Purow 等，2005，Cancer Res. 65 :2353-63 ;Hallahan 等，2004, Cancer Res. 64 :7794-800)。神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育期 間產(chǎn)生哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的所有神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且最近已經(jīng)在成體腦中 得到鑒定（Gage，2000, Science 287:1433-8)。Notchl 缺陷型小鼠 、Notch 靶基因 HesU 3和5缺陷型小鼠；和Notch信號(hào)傳導(dǎo)早衰蛋白I(PSl)的調(diào)節(jié)子缺陷型小鼠顯示胚胎神 經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量減少。另外，在PSl雜合小鼠腦中成體神經(jīng)干細(xì)胞減少（Nakamura等，2000， J. Neurosci. 20 :283-93 ;Hitoshi 等，2002, Genes Dev. 16 :846-58)。神經(jīng)干細(xì)胞的減少似 乎是由于其過早分化成神經(jīng)元（Hatakeyama等，2004, Dev. 131 :5539_50)，表明Notch信號(hào) 傳導(dǎo)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化和自我更新。
[0009] 異常Notch信號(hào)傳導(dǎo)涉及許多人類癌。人類中的Notchl基因首次在T-細(xì)胞急 性淋巴母細(xì)胞白血病亞類中鑒定為可導(dǎo)致Notch途徑激活的易位的基因座（Ellisen等， 1991，Cell 66:649-61)。小鼠模型中T細(xì)胞內(nèi)的Notchl信號(hào)傳導(dǎo)的組成型激活類似地 產(chǎn)生T-細(xì)胞淋巴瘤，表明了發(fā)病原因（Robey等，1996, Cell 87 :483-92 ;Pear等，1996， J. Exp. Med. 183 :2283-91 ;Yan 等，2001，Blood 98 :3793-9 ;Bellavia 等，2000, EMBO J. 19 : 3337-48)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生異常Notchl信號(hào)傳導(dǎo)的Notchl點(diǎn)突變、插入和缺失經(jīng)常存 在于兒童和成體T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤中（?631&48七61'，2004，(]111'1\0卩；[11· Hematol. 11 :416-33)。
[0010] 小鼠乳腺瘤病毒在乳腺瘤的Notchl和Notch4基因座中的頻繁插入以及所導(dǎo)致 的活化Notch蛋白片段首先涉及乳癌中的Notch信號(hào)傳導(dǎo)（Gallahan&Callahan，1987， J. Virol. 61 :66-74 ;Brennan&Brown,2003, Breast Cancer Res. 5 :69, Politi 等，2004， Semin Cancer Biol. 14:341-7)。轉(zhuǎn)基因小鼠中的進(jìn)一步研究已經(jīng)確認(rèn)了 Notch在正常 乳腺發(fā)育期間的導(dǎo)管分支（ductal branching)中的作用，并且在乳房上皮細(xì)胞中Notch4 的組成型激活形式抑制上皮分化和導(dǎo)致腫瘤發(fā)生（Jhappan等，1992, Genes&Dev. 6345-5 ; Gallahan 等，1996，Cancer Res. 56 :1775_85，Smith 等，1995，Cell Growth Differ. 6: 563-77, Soriano 等，2000, Int. J. Cancer 86 :652_9, Uyttendaele 等，1998, Dev. Biol. 196 : 204-17 ;Politi 等，2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7)。表明 Notch 受體在乳癌中的 表達(dá)及其與臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)性的數(shù)據(jù)Notch在人類乳癌中的作用提供了證據(jù)（Weijzen 等，2002, Nat. Med. 8 :979-86, Parr 等，2004, Int. J. Mol. Med. 14 :779-86)。另外，在宮頸 癌（Zagouras 等，I"5, PNAS 92 :6414-8)、腎細(xì)胞癌（Rae 等，2〇00, Int. J. Cancer 88 : 726-32)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（Leethanakul 等，2000, Oncogene 19:3220-4)、子宮內(nèi)膜癌 (Suzuki 等，2000，Int. J. Oncol. 17 :1131-9)和神經(jīng)母細(xì)胞瘤（van Limpt 等，2000，Med. Pediatr. Oncol. 35 :554-8)中已經(jīng)觀察到Notch途徑的過表達(dá)，表明Notch在許多贅生物 的發(fā)生中具有潛在作用。令人感興趣的是，Notch信號(hào)傳導(dǎo)可能在結(jié)腸的Ape-突變贅生 性細(xì)胞的未分化狀態(tài)的維持中起作用（van Es&Clevers，2005，Trends in Mol.Med. 11: 496-502)〇
[0011] Notch途徑還涉及血管發(fā)育的多個(gè)方面，包括增殖、遷移、平滑肌分化、血管發(fā)生和 動(dòng)脈-靜脈分化（Iso 等，2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23 :543)。例如，在動(dòng)脈 發(fā)育和卵黃囊血管形成中，Notchl/4和Jaggedl的純合型無效突變以及DLL4的雜合喪失 導(dǎo)致嚴(yán)重但是可變的缺陷。另外，DLLl-缺陷和Notch2-減效小鼠胚胎顯示出血，這可能 是由于血管結(jié)構(gòu)的不良發(fā)育（Gale 等，2004, PNAS，101 :15949-54 ;Krebs 等，2000, Genes Dev. 14 :1343-52 ;Xue 等，1999, Hum. Mel. Genet. 8 :723-30 ;Hrabe de Angelis 等，1997， Nature 386 :717-21 ;McCright 等，2001，Dev. 128 :491-502)。人類中，Jagged I 的突變與 阿拉吉耶綜合征（Alagille syndrome, -種包括血管缺陷的發(fā)育障礙）相關(guān)，Notch 3的突 變是遺傳性血管性癡呆（Cadasil)(其中血管體內(nèi)平衡有缺陷）的原因（Joutel等，1996， Nature 383 :707-10)。
[0012] 之前已經(jīng)報(bào)道了抗Notch抗體及其作為抗癌治療劑的可能應(yīng)用。例如參見美國專 利申請(qǐng)公開第2008/0131434號(hào)，本文通過參考并入其全部內(nèi)容。還參見國際申請(qǐng)公開WO 2008/057144 和 WO 2008/076960,以及美國專利申請(qǐng)公開第 2008/022662U2008/0118520 和 2008/0131908 號(hào)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了新型Notch結(jié)合劑和一種或多種人類Notch受體的新型拮抗劑，以 及使用所述試劑和拮抗劑的方法。本發(fā)明還提供新型多肽，例如結(jié)合一種或多種人類Notch 受體的抗體，所述抗體的片段，和與所述抗體相關(guān)的其它多肽。在特定實(shí)施方式中，本發(fā) 明提供人類Notch2和/或人類Notch3的拮抗劑，包括但不限于，特異性結(jié)合人類Notch2 和/或人類Notch3的抗體。如本文所用，短語"Notch2和/或Notch3"表示"Notch2"、 "Notch3"或"Notch2和Notch3二者"。在特定實(shí)施方式中，所述抗體或其它拮抗劑與在配 體結(jié)合域（例如，Notch2的EGFlO或Notch3的EGF9)外的Notch受體的區(qū)域結(jié)合。在特 定實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié)合人類Notch2。在特定實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié) 合人類Notch2和人類Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié)合人類Notch3。還 提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的載體。還提供 包含本發(fā)明多肽和/或多核苷酸的細(xì)胞。還提供包含所述新型Notch拮抗劑的組合物（例 如，藥物組合物）。還提供使用所述試劑和拮抗劑的方法，例如使用所述Notch拮抗劑來抑 制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性、抑制血管發(fā)生、和/或治療癌或其它與血管發(fā)生相關(guān)的疾 病的方法。
[0014] 在一方面，本發(fā)明提供與一種或多種人類Notch受體的EGFlO域（或EGFlO域的 等效物）特異性結(jié)合的試劑（例如，抗體）。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是抗體。在特定 實(shí)施方式中，所述試劑是拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述試劑與人類Notch2的EGFlO和 /或人類Notch3的EGF9特異性結(jié)合。EGF9是人類Notch3內(nèi)的EGF，其對(duì)應(yīng)于其它人類 Notch受體Notchl、Notch2和Notch4中的EGFlO。在某些實(shí)施方式中，所述試劑與Notch 2的EGF10特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑可與Notch2的EGF10特異性結(jié)合，并 且可與Notch 3的EGF9特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑與Notch3的EGF9特異 性結(jié)合。在其它實(shí)施方式中，所述試劑與位于Notch2EGF10內(nèi)的序列HKGAL(SEQ ID N0:28) 的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑與位于Notch3EGF9內(nèi)的序列HEDAI (SEQ ID NO :29)的至少一部分結(jié)合。
[0015] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞降拿恳惶囟?實(shí)施方式中，所述試劑抑制配體與人類Notch2和/或Notch3的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中， 所述試劑抑制配體與人類Notch2的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑抑制配體與Notch2 和Notch3的結(jié)合。在其他實(shí)施方式中，所述試劑抑制配體與Notch3的結(jié)合。在特定實(shí)施 方式中，所述配體是DLL4、JAG1或JAG2。在其它實(shí)施方式中，所述試劑抑制人類Notch2和 /或Notch3的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，所述試劑抑制人類Notch2的信號(hào)傳導(dǎo)。在某 些實(shí)施方式中，所述試劑抑制Notch2和Notch3的信號(hào)傳導(dǎo)。在其它實(shí)施方式中，所述試劑 抑制Notch3的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中通過DLL4、JAGl或JAG2誘導(dǎo)Notch2和/或 Notch3信號(hào)傳導(dǎo)。還提供包含所述試劑的藥物組合物，和將上述試劑用于諸如抑制血管發(fā) 生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0016] 在另一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所 述抗體包含（a)含有 SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈 CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈CDR2和/或含有SIFYTT(SEQ ID NO :51)的重鏈CDR3 ;和/或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈 CDR2 和 / 或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO :10)的輕鏈CDR3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體包含（a)含有 SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈CDR1，或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變 體；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈CDR2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保 守性氨基酸取代的其變體；和/或含有SIFYTT (SEQ ID NO :51)的重鏈CDR3,或包含1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或（b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8) 的輕鏈⑶R1，或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；含有GASSRAT (SEQ ID NO :9)的輕鏈CDR2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含 有QQYSNFPI (SEQ ID NO :10)的輕鏈⑶R3,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代 的其變體。還提供包含所述抗體的藥物組合物，和將所述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制 腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0017] 在另一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所 述抗體包含（a)含有 SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈 CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈CDR2和/或含有GIFFAI (SEQ ID NO :7)的重鏈CDR3 ;和/或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈 CDR2 和 / 或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈⑶R3。在特定實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié)合 Notch2。在某些實(shí)施方式中，所述抗體包含（a)含有SSSGMS(SEQ ID NO :5)的重鏈CDR1，或 包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈⑶R2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有 GIFFAI (SEQ ID NO :7)的重鏈⑶R3,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其 變體；和/或（b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8)的輕鏈CDR1，或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或 4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；含有GASSRAT (SEQ ID NO :9)的輕鏈CDR2,或包含1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有QQYSNFPI (SEQ ID NO :10)的輕鏈 CDR3,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體。還提供包含所述抗體的藥 物組合物，和將所述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或 治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0018] 在其它方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所 述抗體包含（a)含有 SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈 CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈 CDR2 和 / 或含有（G/S) (I/S)F(F/Y) (A/P) (I/T/S/N) (SEQ ID NO :30)的 重鏈 CDR3 ;和 / 或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID NO :9)的輕鏈CDR2和/或含有QQYSNFPI (SEQ ID NO :10)的輕鏈CDR3。在某些實(shí)施方 式中，所述抗體包含含有SIFYPT(SEQ ID N0:22)的重鏈⑶R3。在某些實(shí)施方式中，所述抗 體包含含有SSSFFAS(SEQ ID N0:23)的重鏈⑶R3。在其它實(shí)施方式中，所述抗體包含含有 SSFYAS(SEQ ID N0:24)的重鏈CDR3。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含含有SSFFAT(SEQ ID N0:25)的重鏈CDR3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體包含含有SIFYPS(SEQ ID N0:26)的 重鏈⑶R3。在其它實(shí)施方式中，所述抗體包含含有SSFFAN(SEQ ID N0:27)的重鏈⑶R3。 還提供包含所述抗體的藥物組合物，和將上述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、 減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供一種多肽，所述多肽包含：（a)與SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57或SEQ ID NO :20(帶有或不帶有信號(hào)序列）具有至少約80%序 列同一性的多肽（例如，重鏈可變區(qū)）；和/或（b)與SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :39(帶有或不帶有信號(hào)序列）具有至少約80%序列同一性的多肽（例如，輕鏈可變 區(qū)）。在特定實(shí)施方式中，所述多肽是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述多肽特異性結(jié)合人類 Notch2和/或Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽與人類Notch2特異性結(jié)合。在某些 實(shí)施方式中，所述多肽與Notch2和Notch3結(jié)合。在其它實(shí)施方式中，所述多肽與Notch3 結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :50 具有至少約85 %，至少約90 %，至少約95 %，至少約98 %或約100 %序列同一性的多肽。還 提供包含所述多肽的藥物組合物，和將上述多肽用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、減 少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0020] 在還另一方面，本發(fā)明提供一種多肽（例如，抗體或抗體的重鏈或輕鏈），所述多 肽包含：（a)與SEQ ID NO :49、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO :2(帶有或不帶有信號(hào)序列）具 有至少約80 %序列同一性的多肽；和/或（b)與SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO :4(帶有或不 帶有信號(hào)序列）具有至少約80%序列同一性的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含與 SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO :40具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約98 % 或約100%序列同一性的多肽。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的方法，所述 方法包括施用治療有效量的所述抗體。
[0021] 在另一方面，本發(fā)明提供一種多肽（例如，抗體或抗體的重鏈或輕鏈），所述多肽 包含：（a)與SEQ ID NO :50具有至少約80%序列同一性的多肽；和/或（b)與SEQ ID NO : 13具有至少約80%序列同一性的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQ ID NO :50 或SEQ ID NO: 13具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約98 %或約100 %序列 同一性的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽是結(jié)合人類Notch2和/或人類Notch3的抗 體。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的方法，所述方法包括施用治療有效量 的所述抗體。
[0022] 在另一方面，本發(fā)明提供包含59RlIgG2抗體的抗體、由59RlIgG2抗體組成的抗 體或基本上由59RlIgG2抗體組成的抗體，所述59RlIgG2抗體包含分別為SEQ ID N0:16 和18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）的重鏈和輕鏈，或由DNA編碼，所述DNA于2008年10月 15日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，10801Univer Sity Boulevard, Manassas, VA，USA,并賦予保藏號(hào)PTA-9547。還提供包含所述抗體的藥物組合 物，和將上述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌 等應(yīng)用上的方法。
[0023] 在另外方面，本發(fā)明提供包含59R5IgG2抗體的抗體、由59R5IgG2抗體組成的抗體 或基本上由59R5IgG2抗體組成的抗體，所述59R5IgG2包含分別為SEQ ID N0:49和SEQ ID NO : 18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）的重鏈和輕鏈，或由DNA編碼，所述DNA于2009年7月6 日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào)[...]。還提供包含所述抗體的藥物組合物，和將上述抗體用 于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0024] 在另一方面，本發(fā)明提供與包含含有SEQ ID NO: 14的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :13的輕鏈可變區(qū)的抗體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合的抗體。在特 定實(shí)施方式中，所述抗體與59RlIgG2抗體競爭特異性結(jié)合，所述59RlIgG2抗體包含分別為 SEQ ID NO : 16和18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）的重鏈和輕鏈，或由DNA編碼，所述DNA于 2008年10月15日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào)PTA-9547。在某些實(shí)施方式中，所述抗體競 爭與人類Notch2的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體競爭與人類Notch2和Notch3的結(jié) 合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體競爭與人類Notch3的結(jié)合。還提供包含所述抗體的藥物 組合物，和將上述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治 療癌等應(yīng)用上的方法。
[0025] 在另一方面，所述抗體與包含含有SEQ ID NO :50的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO : 13的輕鏈可變區(qū)的抗體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方 式中，所述抗體與59R5抗體競爭特異性結(jié)合，所述59R5抗體包含分別為SEQ ID NO :49和 18的重鏈和輕鏈，或由DNA編碼，所述DNA于2009年7月6日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào) [...]。在某些實(shí)施方式中，所述抗體競爭與人類Notch2的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述 抗體競爭與人類Notch2和Notch3的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體競爭與人類Notch3 的結(jié)合。還提供包含所述抗體的藥物組合物，和將上述抗體用于諸如抑制血管發(fā)生、抑制腫 瘤生長、減少腫瘤的致瘤性和/或治療癌等應(yīng)用上的方法。
[0026] 在特定的其它方面，本發(fā)明提供一種多肽（帶有或不帶有信號(hào)序列）以及編碼所 述多肽的多核苷酸，所述多肽包含選自由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO : 19、 SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：49,SEQ ID N0：50,SEQ ID N0：52,SEQ ID N0：53,SEQ ID NO： 54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56和SEQ ID NO :57組成的組的序列。在特定實(shí)施方式中， 所述多肽是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2和/或人類Notch3特異性 結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與Notch2特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體 與人類Notch2和人類Notch3特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與Notch3特異性 結(jié)合。在另一方面，本發(fā)明提供一種多核苷酸，所述多核苷酸包含選自由SEQ ID NO :1、SEQ ID N0：3,SEQ ID NO ：15,SEQ ID NO ： 17,SEQ ID NO ：47,SEQ ID NO ：48,SEQ ID NO ：58,SEQ ID NO :59和SEQ ID NO :60組成的組的序列。
[0027] 在另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)受試對(duì)象中（例如，在受試對(duì)象中的腫瘤或其它異 常血管發(fā)生位置處）周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的方法。在特定實(shí)施方式中，所 述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用有效量的特異性結(jié)合人類Notch2和/或人類Notch3的試 齊U。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是在上述方面或?qū)?施方式、以及本文所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w。在特定實(shí)施方式中， 所述試劑是拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述試劑與人類Notch3特異性結(jié)合，并且是人類 Notch3的拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的調(diào)節(jié)對(duì)導(dǎo)致 血管發(fā)生和/或腫瘤生長的抑制。
[0028] 在另一方面，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中血管發(fā)生（例如，腫瘤血管發(fā)生）的 方法。在特定實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用有效量的特異性結(jié)合人類 Notch2和/或人類Notch3的試劑。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是拮抗劑。在某些實(shí)施 方式中，所述試劑與人類Notch2特異性結(jié)合，并且是人類Notch2的拮抗劑。在特定實(shí)施方 式中，所述試劑與人類Notch3特異性結(jié)合，并且是人類Notch3的拮抗劑。在某些實(shí)施方式 中，所述試劑是Notch2和Notch3二者的拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是抗體。 在特定實(shí)施方式中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是在上述方面或?qū)嵤┓?式、以及本文所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w。在某些實(shí)施方式中，所述拮 抗劑不是抗體。在某些實(shí)施方式中，抑制血管發(fā)生的方法還包括對(duì)所述受試對(duì)象施用血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF)的拮抗劑或VEGF受體的拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述方法 是通過調(diào)節(jié)周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能從而抑制血管發(fā)生的方法。
[0029] 在另一方面，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中腫瘤生長的方法。在特定實(shí)施方式中，所 述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的人類Notch2和/或人類Notch3的拮抗劑。 在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑是特異性結(jié)合人類Notch2的抗體。在某些實(shí)實(shí)施方式中， 所述拮抗劑是特異性結(jié)合人類Notch2和人類Notch3的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述拮 抗劑是特異性結(jié)合人類Notch3的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是在上述方面或?qū)?施方式、以及本文所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w。在特定實(shí)施方式中，所 述腫瘤包含磷酸酶和張力蛋白（tensin)同源物（PTEN)基因的缺失或其它突變。在特定實(shí) 施方式中，所述腫瘤是乳腫瘤。
[0030] 在另一方面，本發(fā)明提供選擇受試對(duì)象以用于使用人類Notch2和/或人類Notch3 拮抗劑進(jìn)行治療的方法。在特定實(shí)施方式中，所述方法包括（a)確定所述腫瘤是否包含磷 酸酶和張力蛋白同源物（PTEN)基因中的缺失或突變；和（b)如果所述腫瘤包含所述缺失 或突變，則選擇所述受試對(duì)象以用于使用Notch2和/或Notch3拮抗劑進(jìn)行治療。在某些 實(shí)施方式中，使用Notch2拮抗劑治療所述受試對(duì)象。在某些實(shí)施方式中，使用Notch2和 Notch3的拮抗劑治療所述受試對(duì)象。在某些實(shí)施方式中，使用Notch3的拮抗劑治療所述受 試對(duì)象。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤是乳腫瘤。
[0031] 在另一方面，本發(fā)明提供與至少一種人類Notch受體（例如，Notch受體1、2、3或 4)的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述非配體結(jié)合區(qū)包 括人類Notch受體的EGF重復(fù)10 (或EGFlO的等效物，例如人類Notch3的EGF9)，或由人類 Notch受體的EGF重復(fù)10 (或EGFlO的等效物，例如人類Notch3的EGF9)組成。在某些實(shí) 施方式中，所述抗體抑制腫瘤生長。在某些實(shí)施方式中，所述抗體抑制配體與Notch受體的 結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體抑制通過所述Notch受體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí) 施方式中，所述Notch受體是人類Notchl、Notch2、Notch3或Notch4受體。在特定實(shí)施方 式中，所述抗體與Notch2(例如，Notch2的EGF10)特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗 體與Notch2和至少一種其它Notch受體特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述其它Notch 受體是Notch3。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的方法，所述方法包括施用 治療有效量的所述抗體。
[0032] 在另外方面，本發(fā)明提供與兩種以上（S卩，至少兩種或兩種、三種或四種）人類 Notch受體特異性結(jié)合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與兩種以上人類Notch受體的 胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，如果所述兩種以上人類Notch受 體包含 Notchl、Notch2 或 Notch4,則所述抗體與 Notchl、Notch2 或 Notch4 的 EGF10 結(jié)合， 如果所述兩種以上人類Notch受體包含Notch3,則所述抗體與Notch3的EGF9結(jié)合。在特 定實(shí)施方式中，所述非配體結(jié)合區(qū)不是EGF4。在特定實(shí)施方式中，所述兩種以上人類Notch 受體包含Notch2。在特定實(shí)施方式中，所述兩種以上人類Notch受體包含Notch3。在另外 的實(shí)施方式中，所述兩種以上人類Notch受體包含Notch2和Notch3。在特定實(shí)施方式中， 所述抗體是所述兩種以上人類Notch受體的拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述抗體抑制腫 瘤生長。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的方法，所述方法包括施用治療有 效量的所述抗體。
[0033] 在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗體，所述分離的抗體與人類Notch2受體的 胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長，其中所述非配體結(jié)合區(qū)包含人類 Notch2受體的EGF重復(fù)10(例如，SEQ ID NO :36)，或由人類Notch2受體的EGF重復(fù)10(例 如，SEQ ID NO :36)組成。在某些實(shí)施方式中，所述抗體不與EGF重復(fù)10外的人類Notch2 的任何區(qū)域結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體還與至少一種其它人類Notch受體的EGF 重復(fù)1〇(或等效物）（例如，Notch3的EGF9)特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與 人類Notch2EGF10和Notch3EGF9結(jié)合。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的 方法，所述方法包括施用治療有效量的所述抗體。
[0034] 在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗體，所述分離的抗體與人類Notch3受體的 胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長，其中所述非配體結(jié)合區(qū)包含人類 Notch3受體的EGF重復(fù)9 (其它Notch受體中的EGFlO的等效物），或由人類Notch3受體 的EGF重復(fù)9 (其它Notch受體中的EGFlO的等效物）組成。在某些實(shí)施方式中，所述抗 體不與EGF重復(fù)9外的人類Notch3的任何區(qū)域結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體還與至 少一種其它人類Notch受體的EGF重復(fù)10特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與 Notch3EGF9和人類Notch2EGF10結(jié)合。還提供了包含所述抗體的藥物組合物和治療癌的方 法，所述方法包括施用治療有效量的所述抗體。
[0035] 在其它方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體結(jié)合人類Notch受體的胞外 域的非配體結(jié)合區(qū)，并且包含（a)含有SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID N0:6)的重鏈 CDR2 和 / 或含有 GIFFAI(SEQ ID N0:7)的重鏈 CDR3 ;和/或（b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8)的輕鏈CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO : 9)的輕鏈CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈CDR3。在特定實(shí)施方式中，所 述人類Notch受體是Notch2。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2受體的EGF10和 /或人類Notch3受體的EGF9結(jié)合。在另外方面，本發(fā)明提供在競爭結(jié)合檢測中與所述抗體 競爭對(duì)Notch2的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的特異性結(jié)合的抗體。還提供了包含所述抗體的 藥物組合物和治療癌的方法，所述方法包括施用治療有效量的所述抗體。還提供抑制血管 發(fā)生的方法，所述方法包括施用所述組合物。
[0036] 在另一方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體結(jié)合人類Notch受體的胞外 域的非配體結(jié)合區(qū)，并且包含（a)含有SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈 CDR2 和 / 或含有 SIFYTT(SEQ ID NO :51)的重 鏈 CDR3;和 / 或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈CDR3。在特定實(shí)施方式 中，所述人類Notch受體是Notch2。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2和Notch3 受體結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2受體的EGF10和/或人類Notch3 受體的EGF9結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在競爭結(jié)合檢測中與所述抗體競爭對(duì) Notch2的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的特異性結(jié)合的抗體。還提供了包含所述抗體的藥物組合 物和治療癌的方法，所述方法包括施用治療有效量的所述抗體。還提供抑制血管發(fā)生的方 法，所述方法包括施用所述組合物。
[0037] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2和人類Notch3特異性結(jié)合。
[0038] 在上述方面或?qū)嵤┓绞健⒁约氨疚膭e處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，所述抗體是重組抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在特定實(shí) 施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在特定實(shí)施 方式中，所述抗體是人類抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是單價(jià)的、雙價(jià)的或多價(jià)的。在 特定實(shí)施方式中，所述抗體是單特異性抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體的各抗原-結(jié)合 位點(diǎn)結(jié)合（或能夠結(jié)合）超過一種人類Notch受體（例如，Notch2和Notch3)的胞外域的 非配體結(jié)合區(qū)。在某些替代性實(shí)施方式中，所述抗體是雙特異性抗體。在特定實(shí)施方式中， 所述抗體是IgGl抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是IgG2抗體。在特定實(shí)施方式中，所 述抗體與細(xì)胞毒性基團(tuán)（cytotoxic moiety)綴合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是分離的。 在其它實(shí)施方式中，所述抗體基本上是純化的。
[0039] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，用所述抗體治療的癌或腫瘤是乳腺、結(jié)直腸、肺、胰腺、前列腺或頭頸癌或腫 瘤。在特定實(shí)施方式中，所述癌或腫瘤是黑色素瘤。在特定實(shí)施方式中，所述癌或腫瘤是乳 癌或乳腫瘤。在特定實(shí)施方式中，所述癌或腫瘤是結(jié)直腸癌或結(jié)直腸腫瘤。在特定實(shí)施方 式中，所述癌或腫瘤是胰腺癌或胰腺腫瘤。在特定實(shí)施方式中，所述癌或腫瘤是前列腺癌或 前列腺腫瘤。
[0040] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，治療癌的方法包括抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，治療癌的方法包括（例 如，通過減少癌干細(xì)胞在腫瘤中的頻率）減少腫瘤的致瘤性。
[0041] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，將所述拮抗劑或抗體與用于癌的其它治療對(duì)受試對(duì)象組合施用。在特定實(shí)施 方式中，所述用于癌的其它治療包括放射治療、化學(xué)治療和/或其它抗體治療劑。在某些實(shí) 施方式中，所述其它用于癌的治療包括化學(xué)治療劑。在特定實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療包括 紫杉醇（例如，TAX0L)、伊立替康、吉西他濱和/或奧沙利鉬。在特定實(shí)施方式中，所述其 它抗體治療劑是特異性結(jié)合人類Notch受體（例如，Notchl、2、3或4)或人類Notch受體 配體（例如，DLL4或JAGl)的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述其它抗體治療劑是抗DLL4抗 體。在某些替代性實(shí)施方式中，所述其它抗體治療劑是特異性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (VEGF)的抗體。在特定實(shí)施方式中，其它治療劑結(jié)合VEGF受體。
[0042] 在上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文別處所述其它方面和/或?qū)嵤┓绞街忻恳惶囟?實(shí)施方式中，將所述抗體與第二治療劑組合施用于受試對(duì)象，所述第二治療劑是抗血管發(fā) 生劑。
[0043] 本發(fā)明還提供包含或產(chǎn)生本文所述抗體或其它多肽的細(xì)胞系（例如，雜交瘤細(xì)胞 系）。還提供包含本文所述多核苷酸的多核苷酸（例如，載體），包括編碼本文所述多肽、或 者抗體的輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的細(xì)胞系。
[0044] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療癌的方法，其中所述癌包含癌干細(xì)胞，所述方 法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的結(jié)合Notch受體的抗體。在更具體的方面，本發(fā) 明提供治療癌的方法，其中所述癌包含表達(dá)一種或多種Notch受體家族成員的干細(xì)胞，所 述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的結(jié)合這些Notch受體家族成員的抗體。本發(fā) 明提供與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合域結(jié)合并且對(duì)于癌是治療有效的抗體。因 此，在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié) 合并且抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供治療癌的方法，所述方法包 括施用治療有效量的抗體，所述抗體與人類Notch受體蛋白的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異 性結(jié)合并且抑制腫瘤生長。
[0045] 本文涉及使用可結(jié)合Notch受體家族成員或這些Notch受體的配體的抗體治療這 些癌癥的各種優(yōu)點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，某些Notch受體在某些實(shí)體瘤中（例如乳腫瘤或 結(jié)腸腫瘤中）高度表達(dá)，并且這提供活性藥物的匯點(diǎn)（sink)，其中所述藥物與Notch受體結(jié) 合。據(jù)預(yù)期，結(jié)合過表達(dá)Notch受體的抗體比目前可獲得的化學(xué)治療藥物具有更安全的特 性。
[0046] 本發(fā)明還提供一種治療人類癌癥的方法，其中包含癌干細(xì)胞的癌的特征不在于癌 干細(xì)胞的一種或多種Notch受體的過表達(dá)，所述方法包括對(duì)人施用治療有效量的抗體，所 述抗體與Notch受體結(jié)合并且阻斷Notch受體的配體激活。
[0047] 本發(fā)明還提供一種治療人類癌癥的方法，所述方法包括對(duì)人施用治療有效量的 (a)結(jié)合Notch受體并抑制過表達(dá)Notch受體的癌干細(xì)胞的生長或增殖的第一抗體，和（b) 結(jié)合Notch受體并阻斷Notch受體的配體激活的第二抗體。
[0048] 本發(fā)明還提供一種治療癌的方法，其中所述癌選自由乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌和結(jié)直 腸癌組成的組，所述方法包括施用治療有效量的結(jié)合Notch的抗體。本發(fā)明還提供了另一 治療癌的方法，其中所述癌選自由乳癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌和結(jié)直腸 癌組成的組，所述方法包括施用治療有效量的阻斷Notch受體的配體激活的抗體。本發(fā) 明還提供了另一治療癌的方法，其中所述癌選自由乳癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、 直腸癌和結(jié)直腸癌組成的組，所述方法包括施用治療有效量的結(jié)合Notch的抗體和阻斷 Notch受體的配體激活的抗體。
[0049] 在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于（尤其在）在上述方法中使用的制造品 (article)。例如，本發(fā)明提供一種制造品，所述制造品包括容器和容器中容納的組合物，其 中所述組合物包含結(jié)合Notch的抗體，還包含表明所述組合物可用于治療包含癌干細(xì)胞的 癌的藥品說明書。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種制造品，所述制造品包括容器和容器 中容納的組合物,其中所述組合物包含結(jié)合Notch的抗體，還包含表明所述組合物可用于 治療包含癌干細(xì)胞的癌的藥品說明書，所述癌干細(xì)胞表達(dá)一種或多種Notch受體。
[0050] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明另外涉及一種制造品，所述制造品包括容器和容器中 容納的組合物，其中所述組合物包含結(jié)合Notch受體并且阻斷Notch受體的配體激活的抗 體，還包含表明所述組合物可用于治療癌的藥品說明書，其中所述癌包含特征不在于所述 Notch受體的過表達(dá)的癌干細(xì)胞。
[0051] 在特定實(shí)施方式中，提供一種制造品，所述制造品包括（a)其中容納組合物的第 一容器，其中所述組合物包含結(jié)合Notch受體并且抑制包含過表達(dá)Notch的癌干細(xì)胞的 癌細(xì)胞的生長的第一抗體；和（b)其中容納組合物的第二容器，其中所述組合物包含結(jié)合 Notch并且阻斷Notch受體的配體激活的第二抗體。
[0052] 在某些實(shí)施方式中，提供另一種制造品，所述制造品包括容器和容器中容納的組 合物，其中所述組合物包含結(jié)合Notch并且阻斷Notch受體的配體激活的抗體，并且還包 含表明所述組合物可用于治療癌的藥品說明書，其中所述癌選自由結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺 癌、肺癌、直腸癌和結(jié)直腸癌組成的組。
[0053] 本發(fā)明另外提供：結(jié)合Notch并且阻斷Notch受體的配體激活的抗體（例如，人類 抗體或人源化抗體）；包含所述抗體和藥學(xué)上可接受的載體的組合物；和包含綴合有細(xì)胞 毒性劑的抗體的免疫綴合物。
[0054] 在一方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼上述方面 以及本文別處所述其它方面/實(shí)施方式的任何抗體和/或多肽。在某些實(shí)施方式中，本發(fā) 明提供包含所述多核苷酸的載體。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含所述多核苷酸或所述 載體。在其它實(shí)施方式中，生產(chǎn)所述抗體的方法包括培養(yǎng)包含所述多核苷酸的宿主細(xì)胞，從 而表達(dá)所述多核苷酸，并且可選的是，所述方法還包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物（例如，從宿主細(xì) 胞培養(yǎng)基）回收所述抗體。
[0055] 另外，本發(fā)明提供編碼上述實(shí)施方式或方面以及本文別處所述其它實(shí)施方式或方 面所述的人源化抗體或人類抗體的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的載體；包含所述 多核苷酸或所述載體的宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)所述抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含所述 多核苷酸的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述多核苷酸，并且可選的是，所述方法還包括從宿主細(xì)胞 培養(yǎng)物（例如，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基）回收所述抗體。
[0056] 本發(fā)明還涉及包含與一種或多種加利車霉素分子綴合的結(jié)合Notch的抗體的免 疫綴合物，和所述綴合物在治療表達(dá)Notch的癌，例如其中癌干細(xì)胞過表達(dá)Notch的癌中的 應(yīng)用。
[0057] 在根據(jù)馬庫什組或可選擇要素的其它分組（包括以"和/或"或"或"隔開的可選 擇要素的組）描述了本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞降那闆r下，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的 整個(gè)組，還個(gè)別包括所述組的各成員和主要組的所有可能亞組，以及缺少一個(gè)或多個(gè)組成 員的主要組。本發(fā)明還設(shè)想到明確排除要求保護(hù)的發(fā)明中任何組成員中的一個(gè)或多個(gè)。例 如，諸如"X和/或Y"等語言包括單獨(dú)"X"、單獨(dú)"Y"以及"在一起的X"和"Y"。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058] 圖I :59R1抗體和變體結(jié)合人類Notch2并且阻斷配體結(jié)合。（A) 59RlFab與人類 Notch2結(jié)合的FACS分析。"克隆1"是顯示與位于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上的人類Notch2 結(jié)合的59RlFab。"克隆5"是從噬菌體文庫中分離的不結(jié)合Notch2的不同克隆的Fab。（B) 通過59RlFab阻斷配體（JAGl)結(jié)合的FACS分析。"克隆1"是顯示阻斷hjaggedl ECD-Fc 融合物與位于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上的人類Notch2結(jié)合的59RlFab。"克隆5"是從噬 菌體文庫中分離的在檢測中不阻斷配體結(jié)合的不同克隆的Fab。（C) 59RlIgG2抗體與位于 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上的人類Notch2結(jié)合的FACS分析。59RlIgG2抗體顯示與位于穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上的人類Notch2結(jié)合。（D)通過59RlIgG2抗體阻斷配體（DLL4)結(jié) 合的FACS分析。59RlIgG2抗體顯示阻斷hDLL4ECD-Fc融合物與位于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì) 胞上的人類Notch2的結(jié)合。（E)用于59R1的重鏈⑶R3親和成熟策略。59R1的重鏈⑶R3 的親本序列示于框中?？尚械臍埢淖兪居谠搱D中的親本序列之下。（F)親和成熟的59R1 序列的JAGl阻斷能力的篩選。改善的變體用箭頭指出。
[0059] 圖2 :59RlIgG2抗體與四種人類Notch同源物的交叉反應(yīng)性的FACS分析。發(fā)現(xiàn) 59R1結(jié)合位于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞上的hNotch2和hNotch3,但是未發(fā)現(xiàn)其展示與相 同細(xì)胞上的hNotchl和hNotch4的明顯結(jié)合。
[0060] 圖3 :59R1抗體的表位作圖。（A)抗Notch2/3抗體59R1與人類Notch2的EGF重復(fù) 10結(jié)合。將來自表達(dá)重組Notch2-Fc融合蛋白的HEK 293細(xì)胞的上清液用于以抗Notch2/3 抗體59R1進(jìn)行的ELISA，所述融合蛋白具有在1至12 (X軸）的指出的Notch2的EGF重復(fù)。 OD(y軸）表示抗體僅與包含EGF重復(fù)10的Notch2融合蛋白結(jié)合（陰影線棒）。（該圖顯 示分別示于上圖和下圖的從兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)。）（B)EGF重復(fù)11和12不參與抗 Notch2/3抗體59R1與全長hNotch2的結(jié)合。用綠色熒光蛋白（GFP) (X軸）單獨(dú)（左上） 轉(zhuǎn)染或用GFP與全長完整Notch2共轉(zhuǎn)染或用GFP與缺失EGF重復(fù)11 ( Λ EGFl 1)或缺失EGF 重復(fù)12(AEGF12)的全長Notch 2共轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞的FACS分析。對(duì)于在GFP-表 達(dá)細(xì)胞中的所有三種Notch2蛋白，沿y軸（PE)表示59R1的結(jié)合。（C)EGF重復(fù)10參與抗 Notch2/3抗體59R1與全長hNotch2的結(jié)合，但不參與配體結(jié)合。通過與hNotch2的EGF 1-4結(jié)合的抗Notch2抗體59M70進(jìn)行的結(jié)合表示為"抗Notch2結(jié)合"。通過DLL4進(jìn)行的 結(jié)合表示為"配體結(jié)合"。
[0061] 圖4 :抗Notch2/3抗體59R1抑制突光素酶報(bào)告子檢測中的Notch2信號(hào)傳導(dǎo)。 (A) 59R1阻斷hDLL4-誘導(dǎo)的Notch2報(bào)告子活性。（B) 59R1阻斷hJAGl-誘導(dǎo)的Notch2報(bào) 告子活性。（C) 59R1阻斷hJAG2-誘導(dǎo)的Notch2報(bào)告子活性。
[0062] 圖5 :Notch2/3受體抗體59R1體內(nèi)抑制腫瘤形成和生長。（A)抗Notch2/3(59Rl) 抑制PE13乳腫瘤的形成。PE13乳瘤細(xì)胞注射兩天后，用對(duì)照抗體（正方形）或抗Notch2/3 抗體59R1 (空心三角）治療注射有PE13乳瘤細(xì)胞的N0D/SCID小鼠，并且測定腫瘤隨時(shí)間 (X軸，細(xì)胞注射后天數(shù)）的體積（y軸，mm 3)。與對(duì)照相比，用59R1抗體進(jìn)行的治療顯著抑 制腫瘤形成（P〈〇.〇〇l)。（B)抗Notch2/3(59Rl)抑制T3乳瘤的形成。T3乳瘤細(xì)胞注射兩 天后，用對(duì)照抗體（正方形）或抗Notch2/3抗體59R1 (空心三角）治療注射有T3乳瘤細(xì) 胞的N0D/SCID小鼠，并且測定腫瘤隨時(shí)間（X軸，細(xì)胞注射后天數(shù)）的體積（y軸，mm 3)。與 對(duì)照相比，用59R1抗體進(jìn)行的治療顯著抑制腫瘤形成（p〈0. 001)。（C)抗Notch2/3(59Rl) 抑制Colo-205結(jié)腸瘤的生長。腫瘤體積達(dá)到65mm3?200mm 3的尺寸后，用對(duì)照抗體（正 方形）或抗Notch2/3抗體59R1 (菱形）治療用Colo-205結(jié)腸瘤細(xì)胞注射的6?8周大的 免疫缺陷bg/nu XID雌性小鼠，所述小鼠具有Swiss CD-I背景。測定隨時(shí)間（X軸，細(xì)胞注 射后天數(shù)）的平均腫瘤體積（y軸，mm3)。與對(duì)照相比，用59R1抗體進(jìn)行的治療抑制腫瘤生 長（40天后*#p〈0. 001)。（D)抗Notch2/3 (59R1)抑制PM胰腺瘤的生長。腫瘤體積達(dá)到 65mm3?200mm3的尺寸后，用對(duì)照抗體（正方形）或抗Notch2/3抗體59R1 (菱形）治療注 射有PM胰腺瘤細(xì)胞的N0D/SCID小鼠。測定隨時(shí)間（X軸，細(xì)胞注射后天數(shù)）的平均腫瘤體 積（y軸，mm 3)。與對(duì)照相比，用59R1抗體進(jìn)行的治療抑制腫瘤生長（70天后***p〈0. 001)。 (E)抗Notch2/3(59Rl)抑制PE13乳瘤的生長。腫瘤體積達(dá)到65mm3?200mm 3的尺寸后， 用對(duì)照抗體（正方形）或抗Notch2/3抗體59R1 (菱形）治療注射有PE13乳瘤細(xì)胞的NOD/ SCID小鼠。測定隨時(shí)間（X軸，細(xì)胞注射后天數(shù)）的平均腫瘤體積（y軸，mm3)。與對(duì)照相 t匕，用59R1抗體進(jìn)行的治療抑制腫瘤生長（57天后*p〈0. 05)。（F)抗Notch2/3 (59R1)抑 制T3乳瘤的生長。腫瘤體積達(dá)到65mm3?200mm3的尺寸后，用對(duì)照抗體（實(shí)心柱）或抗 Notch2/3抗體59R1 (空心柱）治療注射有T3乳瘤細(xì)胞的N0D/SCID小鼠。在細(xì)胞注射后第 18、25、39和42天測定平均腫瘤體積。與對(duì)照相比，用59R1抗體進(jìn)行的治療抑制腫瘤生長 (在第 42 天 ***ρ〈0·001)。
[0063] 圖6 :抗Notch2/3抗體59R1延遲紫杉醇治療后的乳瘤復(fù)發(fā)。
[0064] 圖7 :抗Notch2/3抗體59R1減少B51乳瘤中癌干細(xì)胞的頻率。
[0065] 圖8 :與吉西他濱組合，抗Notch2/3抗體59R1抑制PM胰腺瘤的生長。
[0066] 圖9 :抗Notch2/3抗體59R1抑制M4黑色素瘤異種移植物模型中的腫瘤生長。
[0067] 圖10 :抗Notch2/3抗體59R1可單獨(dú)抑制C28結(jié)腸瘤的生長，也可與伊立替康組 合抑制C28結(jié)腸瘤的生長。
[0068] 圖11 :59RlIgG2抗體顯著抑制體內(nèi)已建立的人類腫瘤異種移植物的腫瘤生長。 每周一次以15mg/kg的標(biāo)出的抗體（1B711，LZ-I對(duì)照抗體，黑色正方形；59R1，黑色三角 形；阿瓦斯汀，黑色圓形；阿瓦斯汀+59R1，黑色菱形）治療已建立的Colo-205 (A)、C8 (B)、 PN8 (C)、B34 (D)、B39 (E)、B44 (F)、PE-13 (G)和 TUH)腫瘤（皮下，η = 10/ 組）。腫瘤體積 (X軸）相對(duì)于時(shí)間（y軸）繪圖。在Colo-205異種移植物模型中，59R1與AVASTIN的組合 治療比任一抗體單獨(dú)治療顯著地更有效。圖IlB至IlH中，星號(hào)表示在所示天時(shí)的顯著腫 瘤生長抑制：*，Ρ〈〇·〇5 ;#，Ρ〈0·01 ;*#，Ρ〈0·001，學(xué)生 t 檢驗(yàn)：符號(hào)（Symbols),平均值： 誤差棒，SHVL
[0069] 圖12 :在各種異種移植物腫瘤模型中59R1治療顯著調(diào)節(jié)了所選擇基因的相對(duì)表 達(dá)水平。從之前測試的異種移植物模型通過TaqMarv?分析單獨(dú)測試HEYL(A)、Notch3(B)、 RGS5(C)、ANGPT1(D)和ANGPT2(E)的表達(dá)水平。值得注意的是，缺乏雌激素（ne)終止了 59R1在減少攜帶有Tl的小鼠的宿主間質(zhì)中的ANGPTl和ANGPT2表達(dá)方面的作用?？招膱A 對(duì)應(yīng)于所分析的各腫瘤。水平線，平均值。
[0070] 圖13 :腫瘤抑制子PTEN基因在許多59R1顯示出抗腫瘤功效的乳瘤中缺失。顯示 了 PTEN外顯子、Affymetrix探針分布和染色體10中PTEN基因的缺失。深灰和淺灰陰影 條分別表示染色體片段的純合缺失和雜合缺失。
[0071] 圖14. 59R1抗體的表位作圖。（A)人類Notch同源物的蛋白比對(duì)。通過Clone Manager軟件進(jìn)行所述比對(duì)。所示的是人類Notchl、Notch2和Notch4的EGF 10重復(fù)以 及人類Notch3中的等效EGF?？騾^(qū)表示含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的區(qū)域，所述一個(gè)或多個(gè)氨 基酸組成通過59RlIgG2抗體與hNotch2H385N AL 388-89SN突變體（圖14B)和與其中aa 382-386已經(jīng)突變成對(duì)應(yīng)hNotch2序列的hNotchl構(gòu)建體（圖14C)的FACS結(jié)合定義的59R1 表位的至少一部分。（B)59RlIgG2抗體與hNotch2結(jié)合，但不與其中某些EGF 10殘基已突 變成 hNotchl 殘基的突變體 hNotch2(H385N AL 388-89SN)結(jié)合。（C)59RlIgG2 抗體不與 hNotchl結(jié)合，但與其中某些EGF 10殘基（aa382-387)已突變成匹配hNotch2殘基385-389 的突變體hNotchl結(jié)合。
[0072] 圖15. 59R5的體外表征。（A)圖15A顯示抗體59R5能夠阻斷Notch2和Notch3 的配體-誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)PC3腫瘤細(xì)胞用人類或小鼠 Notch受體（hN2,人類Notch2 ; mN2,鼠類Notch2 ;hN3,人類Notch3 ;mN3,鼠類Notch3)和GFP誘導(dǎo)型報(bào)告子構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染。使經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與不同濃度的抗體59R1和59R5在被動(dòng)固定的DLL4Fc的存在下一起溫 育。（B)圖15B顯示59R5結(jié)合與59R1類似的表位。對(duì)HEK 293細(xì)胞用編碼人類Notch2、 人類Notchl或殘基382-386突變成相應(yīng)的人類Notch2殘基的人類Notchl的表達(dá)載體瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染。還用編碼綠色熒光蛋白（GFP)的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，從而標(biāo)記接受所轉(zhuǎn)染質(zhì) 粒的那些細(xì)胞。使細(xì)胞與59R1或59R5以及熒光第二抗體一起溫育，然后通過FACS進(jìn)行檢 查。通過框突出顯示的區(qū)域表明用所示Notch表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠與59R1或59R5結(jié) 合。
[0073] 圖16. Notch受體抗體59R5抑制體內(nèi)腫瘤形成和生長。圖16A顯示使用抗體59R5 對(duì)PE13乳瘤細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)治療。圖16B顯示使用抗體59R5對(duì)C28結(jié)腸細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi) 治療。圖16C顯示使用抗體59R5對(duì)C〇1〇205結(jié)腸細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)治療。
[0074] 圖17.組合治療中使用Notch2/3抗體59R5對(duì)腫瘤的體內(nèi)治療。（A)用PN8胰腺 瘤細(xì)胞注射小鼠。使腫瘤生長33天直到它們達(dá)到120mm 3的平均體積。將對(duì)照Ab (正方 形）、59R1 (三角形）或59R5 (圓形）與每周一次20mg/kg的吉西他濱組合治療所述動(dòng)物4 周。（B)用PE13乳瘤細(xì)胞注射小鼠。開始治療前使腫瘤生長40天。每周兩次用15mg/kg 的紫杉醇加上對(duì)照抗體（正方形）或59R5(圓形）治療所述動(dòng)物5周。5周后，停止紫杉醇 治療，繼續(xù)抗體治療。
[0075] 圖18.用抗體59R5治療后腫瘤中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。圖18顯示用59RU59R5或?qū)?照抗體治療后，所選擇基因在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平和所選擇人類基因在PE13腫瘤細(xì)胞 中的表達(dá)水平。
[0076] 圖19. 59R1對(duì)PE13乳癌干細(xì)胞頻率的降低。（A)用對(duì)照抗體、紫杉醇加上對(duì)照抗 體，59R1或紫杉醇加上59R1治療已建立的腫瘤。治療3周后收獲腫瘤，進(jìn)行處理，并將來自 四個(gè)治療組中每一組的連續(xù)滴定的人類細(xì)胞移植到新的小鼠組（每細(xì)胞劑量η = 10)中。 75天后確定腫瘤生長速率。利用L-calc程序（Stem Cell Technologies, Inc.)使用生長 75天后的腫瘤生長速率來計(jì)算CSC頻率。（B)用59R1和/或紫杉醇治療后癌干細(xì)胞在PE13 乳瘤中的頻率。（C)用59R1和/或吉西他濱治療后癌干細(xì)胞在PM胰腺瘤中的頻率。（D) 用59R5和/或紫杉醇治療后癌干細(xì)胞在PE13乳瘤中的頻率。單星號(hào)表示相對(duì)于對(duì)照抗體 治療組的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P〈〇. 05)，雙星號(hào)表示相對(duì)于紫杉醇和對(duì)照抗體治療組的顯著差 異。

【具體實(shí)施方式】
[0077] 本發(fā)明提供了與一種或多種人類Notch受體（例如Notch2和/或Notch3)結(jié)合 的新型試劑，包括但不限于諸如抗體等多肽。所述Notch結(jié)合劑包括人類Notch受體的拮 抗劑。還提供了相關(guān)的多肽和多核苷酸，包含Notch結(jié)合劑的組合物，以及制備Notch結(jié)合 劑的方法。還提供了使用所述新型Notch結(jié)合劑的方法，例如抑制腫瘤生長、抑制血管發(fā)生 和/或治療癌或其它血管發(fā)生相關(guān)疾病的方法。
[0078] 本發(fā)明還鑒定了與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并抑 制體內(nèi)腫瘤生長的分子（例如抗體）。已經(jīng)將是配體結(jié)合充要條件的Notch的配體結(jié)合 區(qū)，鑒定為EGF重復(fù)11和12,表明Notch受體的該區(qū)在Notch信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中是 重要的（Rebay 等，1991，Cell 67 :687 ;Lei 等，2003, Dev. 130-6411 ;Hambleton 等，2004， Structure 12:2173)。預(yù)料之外的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類Notch受體的胞外域的配體結(jié)合域 的外部結(jié)合的抗體抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長（參見美國專利公開第2008/0131434號(hào)，通過引 用將其整體并入本文）。因此，在一種或多種人類Notch受體Notchl、Notch2、Notch3和 Notch4-的胞外域的配體結(jié)合域外部結(jié)合的抗體具有作為潛在的癌治療劑的價(jià)值。
[0079] 已經(jīng)鑒定出與含有人類Notch2的EGF重復(fù)10內(nèi)的殘基的表位特異性結(jié)合的抗 體（實(shí)施例1和3以及圖3A-3C)。抗體59R1抑制配體與Notch2的結(jié)合（實(shí)施例1和圖 1A-1D)，并且抑制配體誘導(dǎo)的Notch2信號(hào)傳導(dǎo)（實(shí)施例4和圖4A-4C)，不過可與Notch2在 配體結(jié)合區(qū)外的區(qū)域中結(jié)合。59R1還特異性結(jié)合人類Notch3(實(shí)施例2和圖2)。已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)所述抗體可單獨(dú)地或與第二抗癌劑組合時(shí)防止或抑制各種不同的異種移植物模型中的 體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長（實(shí)施例5、6、7和9以及圖5A-F、6、8-10和11A-H)。所述抗體還通過 減少癌干細(xì)胞的頻率而顯示出減少多種異種移植物模型中體內(nèi)腫瘤的致瘤性（實(shí)施例8和 23以及圖7和19A-C)。另外，發(fā)現(xiàn)使用59R1的治療下調(diào)RGS5( -種周細(xì)胞和/或血管平 滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物）、Notch3和HeyL在各種腫瘤的間質(zhì)中的表達(dá)（實(shí)施例10和圖12A-E)， 和上調(diào)乳瘤和結(jié)腸瘤中的缺氧（實(shí)施例11)。不受理論限制，這些數(shù)據(jù)表明59R1抗體對(duì)腫 瘤血管發(fā)生具有抑制效果，這至少部分是由于對(duì)周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的調(diào) 節(jié)。還發(fā)現(xiàn)使用59R1的治療調(diào)節(jié)乳瘤中的其它基因。發(fā)現(xiàn)59R1下調(diào)了細(xì)胞周期基團(tuán)途徑、 myc-激活基因和幾種干細(xì)胞基因集（實(shí)施例22)。
[0080] 還開發(fā)出另外的人類抗體59R5。59R5具有與59R1相似的性質(zhì)，例如與Notch2和 Notch3相似的結(jié)合親和性和它們表位的相似性或重疊（實(shí)施例13和圖15B)。已經(jīng)顯示抗 體59R5在阻斷Notch2和Notch 3信號(hào)傳導(dǎo)方面具有與59R1相似的活性（實(shí)施例13和圖 15A)。還顯示該59R5抗體可單獨(dú)地或與第二抗癌劑組合時(shí)抑制幾種異種移植物模型中體 內(nèi)腫瘤生長（實(shí)施例14和15以及圖16A-C和17A-B)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用59R5進(jìn)行的治 療與使用59R1的治療類似，下調(diào)各種腫瘤的間質(zhì)中RGS5、Notch3和HeyL的表達(dá)，并且還發(fā) 現(xiàn)59R5治療將腫瘤細(xì)胞中人類基因 ID4、EDNRA和EGLN3的表達(dá)調(diào)節(jié)至與59R1相似的程度 (實(shí)施例16)。59R5還顯示通過減少癌干細(xì)胞的頻率而減少異種移植物模型中的體內(nèi)致瘤 性（實(shí)施例23和19D)。
[0081] 定義
[0082] Notch受體的"拮抗劑"是包括部分或全部阻斷、抑制或中和Notch途徑的生物學(xué) 活性的任何分子的術(shù)語。合適的拮抗劑分子特別包括拮抗性抗體或抗體片段。
[0083] 使用術(shù)語"抗體"來指通過至少一個(gè)位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的抗原識(shí)別 位點(diǎn)，識(shí)別和特異性結(jié)合諸如蛋白、多肽、肽、糖類、多核苷酸、脂質(zhì)或上述物質(zhì)的組合等靶 標(biāo)的免疫球蛋白分子。如本文所用，該術(shù)語包括完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗 體片段（例如Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段）、單鏈Fv(ScFv)突變體、由至少兩個(gè)完整抗 體產(chǎn)生的諸如雙特異性抗體等多特異性抗體、包含抗體部分的融合蛋白和任何其它包含抗 原識(shí)別位點(diǎn)的經(jīng)修飾免疫球蛋白分子，只要所述抗體顯示所需的生物活性?；诜謩e稱為 α、δ、ε、Y和μ的抗體重鏈恒定域的同一性，抗體可以是五個(gè)主要種類免疫球蛋白中的 任一種：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亞類（同型）（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和IgA2)。不同種類的免疫球蛋白具有不同的眾所周知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造?？贵w可以 是裸露的或與諸如毒素、放射性同位素等其它分子綴合。
[0084] 如本文所用，術(shù)語"抗體片段"表示完整抗體的一部分，和表示完整抗體的抗原性 決定可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括，但不限于Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段、線性抗體、單 鏈抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0085] "Fv抗體"是指含有完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段，可以是其中一 個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變域形成非共價(jià)二聚體的雙鏈，也可以是其中一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可 變域通過柔性肽連接子共價(jià)連接的單鏈（scFv)，從而使得2條鏈以類似的二聚結(jié)構(gòu)連接。 在該構(gòu)造中各可變域的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)相互作用從而限定出Fv二聚體的抗原結(jié)合特異 性。作為選擇，可以使用單可變域（或Fv的一半）來識(shí)別和結(jié)合抗原，雖然通常而言親和 性較低。
[0086] 本文所用的"單克隆抗體"是指涉及高度特異性識(shí)別和結(jié)合單抗原決定簇（或表 位）的同源性抗體群。這與通常包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的多克隆抗體相反。 術(shù)語"單克隆抗體"包括完整的全長單克隆抗體以及抗體片段（例如，F(xiàn)ab、Fab'、F (ab'）2、 Fv)、單鏈（scFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白和任何其它包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的經(jīng)修 飾免疫球蛋白分子。另外，"單克隆抗體"是指以包括但不限于通過雜交瘤、噬菌體選擇、重 組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在內(nèi)的任何數(shù)量的方式制得的此類抗體。
[0087] 如本文所用，術(shù)語"人源化抗體"是指非人類（例如鼠類）抗體的形式，其為含有 最小非人類序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常而言，人源化抗體 是其中互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的殘基被非人類物種（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）的具有所需 特異性、親和性和能力的CDR的殘基置換的人類免疫球蛋白。在某些情況下，人類免疫球蛋 白的Fv框架區(qū)（FR)殘基被來自非人類物種的具有所需特異性、親和性和能力的抗體中的 相應(yīng)殘基置換?？梢酝ㄟ^在Fv框架區(qū)中和/或在經(jīng)置換的非人類殘基內(nèi)取代另外的殘基 而進(jìn)一步修飾所述人源化抗體，從而改善和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。通常，人 源化抗體會(huì)包含基本上不少于（all of)至少一個(gè)，通常兩個(gè)或三個(gè)可變域，所述可變域含 有所有，或基本上所有的與非人類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的CDR區(qū)，而所有，或基本上所有的FR區(qū) 是人類免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。所述人源化抗體還可以包含免疫球蛋白（通常為人 類免疫球蛋白）恒定區(qū)或域（Fe)的至少一部分。用于產(chǎn)生人源化抗體的方法的實(shí)例描述 于美國專利第5, 225, 539號(hào)，通過參考將其并入本文。
[0088] 抗體的"可變區(qū)"是指單獨(dú)的或組合的抗體輕鏈的可變區(qū)和/或抗體重鏈的可變 區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各由通過三個(gè)還稱為高變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)連接的四個(gè)框架 區(qū)（FR)組成。各鏈中的⑶R通過FR鄰近（in close proximity)保持在一起，并且與來 自另一鏈的CDR幫助形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。至少有兩種用于確定CDR的技術(shù)：（1)基 于跨物種序列變異性的方法（即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第 5 版，1991，National Institutes of Health，Bethesda Md.));和（2)基 于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法（Al-lazikani等，1997, J. Molec. Biol. 273 : 927-948)。另外，本領(lǐng)域有時(shí)使用這兩種方法的組合來確定⑶R。
[0089] 本文使用的術(shù)語"人類抗體"是指由人類產(chǎn)生的抗體或通過使用本領(lǐng)域已知的任 何技術(shù)制備的具有與由人類產(chǎn)生的抗體相應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人類抗體的該定義包括 完整或全長抗體、其片段和/或包含至少一個(gè)人類重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如，包含 鼠類輕鏈和人類重鏈多肽的抗體。
[0090] "雜交抗體"是其中將來自具有不同抗原決定簇區(qū)域的重鏈和輕鏈對(duì)組裝在一起， 從而使得所得四聚體可以識(shí)別和結(jié)合兩個(gè)不同的表位或兩個(gè)不同的抗原的免疫球蛋白分 子。
[0091] 術(shù)語"嵌合抗體"是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩個(gè)以上物種的抗 體。通常而言，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于源自一個(gè)哺乳動(dòng)物物種（例如，小鼠、大鼠、兔 等）的具有所需特異性、親和性和/或能力的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與源自另一物種（通 常是人類）的抗體中的序列具有同源性，從而避免引發(fā)該物種中的免疫應(yīng)答。
[0092] 術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"在本文中可相互替換地使用，并且是指抗原的能夠 被特定抗體識(shí)別和特異性結(jié)合的那部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位可由連續(xù)的氨基酸形成和 由通過蛋白的三級(jí)折疊而并置的不連續(xù)氨基酸形成。當(dāng)?shù)鞍鬃冃詴r(shí)通常會(huì)保留由連續(xù)的氨 基酸形成的表位，而當(dāng)?shù)鞍鬃冃詴r(shí)通常會(huì)失去通過三級(jí)折疊形成的表位。在單獨(dú)空間構(gòu)象 中表位通常包括至少3個(gè)，或更經(jīng)常至少5個(gè)或8個(gè)至10個(gè)氨基酸。
[0093] 通過其中所研究的免疫球蛋白抑制參照抗體與通用抗原的特異性結(jié)合的檢測來 確定抗體之間的競爭。已知許多類型的競爭性結(jié)合檢測，例如：固相直接或間接放射免 疫檢測（RIA)、固相直接或間接酶免疫檢測（EIA)、夾心競爭檢測（參見Stahh等，1983， Methods in Enzymology 9:242-253);固相直接生物素-親和素 EIA (參見 Kirkland 等， J. Immunol. 1986,137 :3614-3619);固相直接標(biāo)記的檢測、固相直接標(biāo)記的夾心檢測（參見 Harlow 和 Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)； 使用 1-125 標(biāo)簽的固相直接標(biāo)記 RIA (參見 Morel 等，1988, Molec. Immunol. 25 (I) :7-15); 固相直接生物素-親和素 EIA(Cheung等，1990, Virology 176 :546-552);和直接標(biāo)記的 RIA (Moldenhauer 等，1990, Scand. J Immunol.，1990, 32 :77-82))。通常而言，所述檢測包 括使用與固體表面或攜帶未標(biāo)記的測試免疫球蛋白和經(jīng)標(biāo)記的參照免疫球蛋白中任一的 細(xì)胞結(jié)合的經(jīng)純化抗原。通過確定在測試免疫球蛋白的存在下與固體表面或細(xì)胞結(jié)合的標(biāo) 簽的量來測定競爭性抑制。通常測試免疫球蛋白是過量存在的。通過競爭檢測鑒定出的抗 體（競爭性抗體）包括與參照抗體結(jié)合相同表位的抗體，和與相鄰表位結(jié)合的抗體，該相鄰 表位與參照抗體所結(jié)合的表位足夠近，從而使得出現(xiàn)空間位阻。通常而言，當(dāng)競爭性抗體過 量存在時(shí)，其會(huì)將參照抗體與通用抗原的特異性結(jié)合抑制至少50%或75%。
[0094] 抗體與表位或受體"選擇性結(jié)合"或"特異性結(jié)合"是指抗體與該表位或受體的反 應(yīng)或結(jié)合比與其它物質(zhì)（包括不相關(guān)蛋白）的反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更迅速、持久性更高、親 和性更高或上述情況的某些組合。"選擇性結(jié)合"或"特異性結(jié)合"例如是指，抗體與蛋白結(jié) 合的Kd為約0. ImM以下，更通常為約1 μ M以下。"選擇性結(jié)合"或"特異性結(jié)合"有時(shí)是指， 抗體與蛋白結(jié)合的Kd為約0. ImM以下，有時(shí)為約IyM以下，有時(shí)為約0. IyM以下，有時(shí)為 約0. 01 μ M以下或有時(shí)為約InM以下。由于不同物種中同源性蛋白之間的序列同一性，特 異性結(jié)合可以包括識(shí)別超過一個(gè)物種中Notch受體的抗體。類似地，由于不同Notch受體 (例如，Notch2和Notch3)之間在受體的多肽序列的特定區(qū)中的同源性，特異性結(jié)合可以包 括識(shí)別超過一種Notch受體的抗體。應(yīng)該理解，在特定實(shí)施方式中，與第一靶標(biāo)特異性結(jié)合 的抗體或結(jié)合部分可以與第二靶標(biāo)特異性結(jié)合或不與第二靶標(biāo)特異性結(jié)合。這樣，"特異性 結(jié)合"不必然地需要（盡管其可以包括）專一性結(jié)合，即，與單個(gè)靶標(biāo)結(jié)合。因此，在特定實(shí) 施方式中，抗體可以與超過一個(gè)祀標(biāo)（例如，人類Notch2和Notch3)特異性結(jié)合。在特定 實(shí)施方式中，多種靶標(biāo)可以被所述抗體上的相同抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。例如，在特定情況下， 抗體可以包含兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其每一個(gè)位點(diǎn)特異性結(jié)合兩種以上人類Notch受 體（例如，人類Notch2和Notch3)。在某些替代性實(shí)施方式中，抗體可以具有雙特異性，并 且包含至少兩個(gè)具有不同特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。借助于非限制性實(shí)例，雙特異性抗體可 以包含識(shí)別位于一種Notch受體（例如人類Notch2)上的表位的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且 還包含識(shí)別位于另一種Notch受體（諸如人類Notch3)上的不同表位的另一不同抗原結(jié)合 位點(diǎn)。通常而言，但不是必然地，本文"結(jié)合"是指"特異性結(jié)合"。
[0095] 如本文所用，當(dāng)提到抗體與蛋白或肽的相互作用而使用時(shí)術(shù)語"非特異性結(jié)合"和 "背景結(jié)合"，是指不依賴于特定結(jié)構(gòu)的存在的相互作用（即，所述抗體一般性地與蛋白結(jié)合 而不是與諸如表位等特定結(jié)構(gòu)結(jié)合）。
[0096] 術(shù)語"分離的"或"純化的"是指實(shí)質(zhì)上或基本上不含在該材料的天然狀態(tài)下通常 附帶的組分的材料。通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜等分析化學(xué)技術(shù)確 定純度和均一性。作為制劑中存在的主要物種（species)的蛋白（例如抗體）或核酸是基 本上純的。特別地，將分離的核酸與開放閱讀框分離，所述開放閱讀框天然地位于所述基因 側(cè)翼并且編碼除了由所述基因編碼的蛋白之外的蛋白。將分離的抗體與其它非免疫球蛋白 和其它具有不同抗原結(jié)合特異性的免疫球蛋白分離。其還可以指核酸或蛋白具有至少85 % 的純度、具有至少95 %的純度和在某些實(shí)施方式中，具有至少99 %的純度。
[0097] 如本文所用，術(shù)語"癌（cancer) "或"癌性的（cancerous) "是指或描述其中一群 細(xì)胞的特征在于失調(diào)的細(xì)胞生長的哺乳動(dòng)物中的生理狀況。癌的實(shí)例包括，但不限于，癌、 淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。更特別地，所述癌的實(shí)例包括：鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、 非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、 子宮頸癌、卵巢癌、肝臟癌（liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子 宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝臟癌（liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝 癌（hepatic carcinoma)和各種類型的頭頸癌。
[0098] 術(shù)語"增殖性障礙"和"增殖性疾病"是指與異常細(xì)胞增殖有關(guān)的障礙，如癌。 [0099] 本文所用的"腫瘤"和"贅生物"是指任何由過度的細(xì)胞生長或增殖導(dǎo)致的組織的 團(tuán)塊，其可以是良性的（非癌的）或惡性的（癌的），包括癌前病變。
[0100] 本文所用的"轉(zhuǎn)移"是指癌從原始位置擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移到身體的其它區(qū)域的過程，并且 伴隨著位于新位置處的類似的癌病變的發(fā)生。"轉(zhuǎn)移"或"轉(zhuǎn)移性"細(xì)胞是失去與相鄰細(xì)胞 的粘附接觸并且經(jīng)由血流或淋巴從疾病的原發(fā)位置遷移從而侵襲鄰近的身體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。 [0101] 如本文所用，術(shù)語"受試對(duì)象"是指任何動(dòng)物（例如，哺乳動(dòng)物），包括但不限于人、 非人靈長類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物等，其是特定治療的接收者。通常而言，對(duì)于人類受試對(duì)象， 術(shù)語"受試對(duì)象"和"患者"在本文中可相互替換地使用。
[0102] 術(shù)語"癌干細(xì)胞"或"腫瘤干細(xì)胞"或"實(shí)體瘤干細(xì)胞"在本文中可相互替換地使 用，并且指具有以下性質(zhì)的實(shí)體瘤的細(xì)胞群：（1)具有廣泛的增殖能力；2)能夠進(jìn)行不對(duì)稱 細(xì)胞分裂從而產(chǎn)生增殖或發(fā)育潛能減少的一種以上分化子代；和（3)能夠進(jìn)行對(duì)稱分裂以 用于自我更新或自我維持。當(dāng)連續(xù)移植到免疫妥協(xié)小鼠時(shí)，與不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤 細(xì)胞相比，"癌干細(xì)胞"或"腫瘤干細(xì)胞"或"實(shí)體瘤干細(xì)胞"的這些性質(zhì)賦予這些癌干細(xì)胞 以形成可察覺的腫瘤的能力。癌干細(xì)胞以無序方式進(jìn)行自我更新而不是分化，從而形成具 有異常細(xì)胞類型的腫瘤，當(dāng)發(fā)生突變時(shí)所述異常細(xì)胞類型可以隨時(shí)間而改變。
[0103] 術(shù)語"癌細(xì)胞"或"腫瘤細(xì)胞"和語法等效物是指源自腫瘤的全部細(xì)胞群體，包括 占腫瘤細(xì)胞群大部分的非致瘤性細(xì)胞和致瘤性干細(xì)胞（癌干細(xì)胞）。
[0104] 如本文所用，"致瘤性的"是指實(shí)體瘤干細(xì)胞的功能特征，包括自我更新（產(chǎn)生另外 的致瘤性癌干細(xì)胞）的性質(zhì)和增殖以產(chǎn)生所有其它腫瘤細(xì)胞（產(chǎn)生分化的因而非致瘤性的 腫瘤細(xì)胞）的性質(zhì)，從而使實(shí)體瘤干細(xì)胞形成腫瘤。
[0105] 如本文所用，腫瘤的"致瘤性"是指當(dāng)連續(xù)移植到免疫妥協(xié)小鼠時(shí)，來自腫瘤的細(xì) 胞的隨機(jī)樣品形成可察覺的腫瘤的能力。
[0106] 如本文所用，術(shù)語"干細(xì)胞癌標(biāo)記"或"癌干細(xì)胞標(biāo)記"或"腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記"或"實(shí) 體瘤干細(xì)胞標(biāo)記"是指基因，或由基因表達(dá)的蛋白、多肽或肽，與非致瘤性細(xì)胞相比，所述基 因的表達(dá)水平（單獨(dú)或與其它基因組合）與致瘤性癌細(xì)胞的存在相關(guān)。該相關(guān)可以涉及基 因的表達(dá)增加或減少（例如，mRNA或由所述基因編碼的肽的水平增加或減少）。
[0107] 術(shù)語"癌干細(xì)胞基因標(biāo)簽"或"腫瘤干細(xì)胞基因標(biāo)簽"或"癌干細(xì)胞標(biāo)簽"在本文 中可相互替換地使用，來指包含與其它細(xì)胞或細(xì)胞群體（例如正常乳腺上皮組織）相比在 癌干細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因的基因標(biāo)簽。在某些實(shí)施方式中癌干細(xì)胞基因標(biāo)簽包含與正 常乳腺上皮相比在癌干細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因，所述表達(dá)差異成倍變化，例如表達(dá)減少/ 或增加2倍，并且還通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，例如根據(jù)多個(gè)樣品間的t檢驗(yàn)的P值來進(jìn)一步限制。 在另一實(shí)施方式中，將在癌干細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因基于其表達(dá)與所選擇基因的相關(guān)性 以及表達(dá)改變的倍數(shù)或百分比，分成各種癌干細(xì)胞基因標(biāo)簽。癌干細(xì)胞標(biāo)簽是臨床變化方 面（包括但不限于轉(zhuǎn)移和死亡）是可回顧和前瞻性預(yù)期的。
[0108] 如本文所用術(shù)語"遺傳測試"是指對(duì)患者或患者腫瘤樣品的遺傳組成進(jìn)行分析的 程序。該分析可以包括檢測DNA、RNA、染色體、蛋白或代謝物，從而檢測可遺傳的或與身體 疾病相關(guān)的基因型或核型以用于臨床目的。
[0109] 如本文所用，術(shù)語"活檢樣"或"活檢組織"是指出于確定所述樣品是否含有癌組 織的目的而從受試對(duì)象中取得的組織或流體的樣品。在某些實(shí)施方式中，由于受試對(duì)象疑 似患有癌而獲得活檢組織或流體。然后檢查活檢組織或流體是否存在癌。
[0110] 如本文所用，"可接受的藥物載體"是指當(dāng)與藥物組合物的活性成分（例如抗體） 組合時(shí)，允許所述抗體例如保留其生物活性的任何材料。另外，"可接受的藥物載體"在接受 者受試對(duì)象中不觸發(fā)免疫應(yīng)答。實(shí)例包括，但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如磷酸鹽緩沖 的鹽水溶液、水、各種油/水乳液。某些用于氣溶膠或胃腸外施用的稀釋劑是磷酸鹽緩沖的 鹽水或生理（〇· 9% )鹽水。
[0111] 術(shù)語"治療有效量"是指對(duì)于"治療"受試對(duì)象或哺乳動(dòng)物中的疾病或障礙有效的 抗體、多肽、多核苷酸、小有機(jī)分子或其它藥物的量。在癌的情況下，治療有效量的藥物可以 減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減少腫瘤尺寸；抑制或停止癌細(xì)胞向周圍器官中的浸潤；抑制和停止 腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制和停止腫瘤生長；某種程度上減輕與癌有關(guān)的一種或多種癥狀；或所述效 應(yīng)的組合。在藥物阻止生長和/或殺死現(xiàn)有的癌細(xì)胞的情況下，可將其稱為具有細(xì)胞抑制 性和/或細(xì)胞毒性。
[0112] 諸如"治療"或"處理"或"要治療"或"緩解"或"要緩解"等術(shù)語是指1)治愈、減 慢、減輕診斷的病理性狀況或障礙的癥狀，和/或使診斷的病理性狀況或障礙的進(jìn)展停止 的治療措施；和2)防止或減緩所靶向的病理性狀況或障礙的發(fā)展的預(yù)防性或防備性措施。 因此需要治療的受試對(duì)象包括已經(jīng)患有疾病的受試對(duì)象；有傾向患疾病的受試對(duì)象和要預(yù) 防疾病的受試對(duì)象。如果所述患者顯示出以下情況的一種或多種，則根據(jù)本發(fā)明的方法成 功地"治療"了受試對(duì)象：癌細(xì)胞的數(shù)量減少或完全不存在、腫瘤尺寸的減少；對(duì)癌細(xì)胞向 外圍器官的浸潤（包括癌向軟組織和骨的擴(kuò)散）的抑制或不存在；腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制或不存 在；腫瘤生長的抑制或不存在；減輕一種或多種與特定癌相關(guān)的癥狀；發(fā)病率和致死率減 少；和生活質(zhì)量改善。因此，在特定實(shí)施方式中，癌的治療包括受試對(duì)象中腫瘤生長的抑制。
[0113] 如本文所用，術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"是指由許多經(jīng)由磷酸二酯鍵連接的核苷 酸單元（核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體）組成的聚合物，包括但不限于， DNA或RNA。該術(shù)語包括含有DNA和RNA的任何已知堿基類似物的序列，所述堿基類似物包 括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基 羥基甲基）尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基2-硫尿嘧啶、5-羧基 甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1 -甲基假 尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2, 2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、 3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、 5_甲氧基氨基甲基2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、S' -甲氧基羰基甲基尿嘧陡、5-甲氧 基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙 酸、氧丁苷（oxybutoxosine)、假尿啼陡、Q苷、2-硫胞啼陡、5-甲基-2硫尿啼陡、2-硫尿啼 啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸和2, 6-二 氨基嘌呤。
[0114] 術(shù)語"基因"是指包含產(chǎn)生多肽、前體或RNA(例如，rRNA，tRNA)所需的編碼序列的 核酸（例如DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或由所述編碼序列的任何部分編碼，只要保 留全長多肽或片段的所需活性或功能性質(zhì)（例如酶促活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性 等）。該術(shù)語還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和在任一端以約Ikb以上的距離與5'和3'末端的 編碼區(qū)相鄰的序列，從而使得所述基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5'并且存 在于mRNA上的序列是指5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3'或下游并且存在于mRNA上的序 列是指3'非翻譯序列。術(shù)語"基因"包括cDNA和基因的基因組形式?；虻幕蚪M形式 或克隆含有由被稱為"內(nèi)含子"或"間隔區(qū)"和"間隔序列"的非編碼序列打斷的編碼區(qū)。內(nèi) 含子是轉(zhuǎn)錄成核RNA(hnRNA)的基因的區(qū)段；內(nèi)含子可以含有諸如增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)元件。從核 或初始轉(zhuǎn)錄物中除去或"剪接下"內(nèi)含子；因此內(nèi)含子在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中不存在。 翻譯中mRNA起到規(guī)定新生多肽中氨基酸的序列或順序的作用。除了含有內(nèi)含子之外，基因 的基因組形式還可以包括位于存在于RNA轉(zhuǎn)錄物上的序列的5'和3'末端的序列。這些序 列還稱為"側(cè)翼"序列或區(qū)域（這些側(cè)翼序列位于存在于mRNA轉(zhuǎn)錄物上的非翻譯序列的5' 或3'）。5'側(cè)翼序列可以含有控制或影響基因的轉(zhuǎn)錄的諸如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列。 3'側(cè)翼區(qū)可以含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和多腺苷酸化的序列。
[0115] 當(dāng)關(guān)于細(xì)胞、核酸、蛋白或載體使用時(shí)，術(shù)語"重組"是指已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸或 蛋白、改變天然核酸或蛋白而對(duì)所述細(xì)胞、核酸、蛋白或載體進(jìn)行修飾，或所述細(xì)胞源自如 此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)在天然（非重組）形式的細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因或 表達(dá)過表達(dá)或異常表達(dá)（例如表達(dá)為非天然存在的片段或剪接變體）的基因。本文的術(shù)語 "重組核酸"是指以自然中正常未發(fā)現(xiàn)的形式的、通常通過例如使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶操 作核酸，最初在體外形成的核酸。以此方式，實(shí)現(xiàn)了不同序列的可操作連接。因此，線性形 式的分離的核酸，或通過將通常不接合的DNA分子進(jìn)行連接而在體外形成的表達(dá)載體，都 認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的重組體。應(yīng)該理解，一旦制得重組核酸并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生 物體中，其會(huì)非重組（即使用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)構(gòu)而不是體外操作）地復(fù)制；但是，所 述核酸一旦重組地產(chǎn)生，雖然隨后進(jìn)行非重組地復(fù)制，仍然被認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的重 組體。類似地，"重組蛋白"是使用重組技術(shù)（即，通過上述重組核酸的表達(dá)）制備的蛋白。
[0116] 如本文所用，使用術(shù)語"載體"來指將DNA區(qū)段從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞的核酸 分子。術(shù)語"載劑"有時(shí)與"載體"相互替換地使用。載體通常源自質(zhì)粒、噬菌體或植物病 毒或動(dòng)物病毒。
[0117] 如本文所用，術(shù)語"基因表達(dá)"是指下述過程：通過基因的"轉(zhuǎn)錄"（例如經(jīng)由RNA聚 合酶的酶促作用）將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)化成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)， 并且對(duì)于編碼蛋白的基因，通過mRNA的"翻譯"轉(zhuǎn)化成蛋白?？梢栽谠撨^程中的許多階段 對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。"上調(diào)"或"激活"是指增加基因表達(dá)產(chǎn)物（例如，RNA或蛋白）的產(chǎn) 生的調(diào)節(jié)，而"下調(diào)"或"抑制"是指減少產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。參與上調(diào)或下調(diào)的分子（例如轉(zhuǎn)錄 因子）通常分別稱為"激活子"和"抑制子"。
[0118] 術(shù)語"多肽"或"肽"或"蛋白"或"蛋白片段"在本文中可相互替換地使用，來指氨 基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一種或多種氨基酸殘基為相應(yīng)天然存在的氨基酸的 人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚 合物。
[0119] 術(shù)語"氨基酸"是指天然存在和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸功能類似 的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸以及稍后 經(jīng)過修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。"氨基酸類似 物"是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)（例如與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié) 合的α碳）的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物 可具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)（例如正亮氨酸）或經(jīng)修飾的肽主鏈，但是保持與天然存在的氨基 酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的通常化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但 與天然存在的氨基酸功能類似的化合物。
[0120] "保守性修飾變體"適用于氨基酸和核酸序列。"氨基酸變體"是指氨基酸序列。 對(duì)于特定的核酸序列，保守性修飾變體是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核 酸，或當(dāng)所述核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，是指基本上相同或相關(guān)（例如天然連續(xù)）的序列。 由于遺傳編碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、 GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個(gè)由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，該密碼子可 以改變成所述相應(yīng)密碼子中的另一個(gè)而不會(huì)改變所編碼的多肽。所述核酸變化是"沉默變 化"，其是保守性修飾變化的一種。編碼多肽的本文的每個(gè)核酸序列也描述了核酸的沉默變 化。認(rèn)識(shí)到的是，在某些背景下可以對(duì)核酸中的各密碼子（除了通常是蛋氨酸的唯一密碼 子的AUG，和通常是色氨酸的唯一密碼子的TGG)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編 碼多肽的核酸的沉默變化涉及關(guān)于表達(dá)產(chǎn)物的所述序列，而不是關(guān)于實(shí)際的探針序列的所 述序列。關(guān)于氨基酸序列，認(rèn)識(shí)到的是，在所編碼序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或小 百分比的氨基酸的、對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行的各取代、缺失或添加，是"保守性修 飾變體"，包括其中改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。所述保守性修飾變體是除 了本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物和等位基因之外但不排除其的變體。提供用于保守性氨 基酸取代的功能相似氨基酸的表是本領(lǐng)域眾所周知的。通常而言保守性取代包括：1)丙氨 酸㈧、甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸⑶、谷氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨 酸（R)、賴氨酸（K)，5)異亮氨酸⑴、亮氨酸（L)、蛋氨酸（M)、繳氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)、 酪氨酸（Y)、色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)、蘇氨酸（T);和8)半胱氨酸（C)、蛋氨酸（M)(參見， 例如，Creighton, Proteins (1984))。（還參見本文表 1)。
[0121] 如本說明書和權(quán)利要求所用，單數(shù)形式的"a"、〃an"和〃the"包括復(fù)數(shù)形式，除非 上下文明確指出。
[0122] 應(yīng)該理解每當(dāng)在本文用詞匯"包含"來描述實(shí)施方式時(shí)，還提供以"由……組成"和 /或"基本上由……組成"描述的其它類似實(shí)施方式。
[0123] 本發(fā)明的特定實(shí)施方式
[0124] 本發(fā)明提供了用于研究、診斷、表征和治療癌的組合物和方法。特別地，在特定實(shí) 施方式中，本發(fā)明提供了結(jié)合Notch受體的試劑（包括拮抗劑）和使用所述試劑或拮抗劑 來抑制腫瘤生長和治療人類患者的癌癥和其它疾病的方法。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗 劑是特異性識(shí)別一種或多種人類Notch受體的抗體。
[0125] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合 的抗體。在某些實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的抗 體抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性 結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體，與至少兩種Notch受體家族成員的胞外域的非配體結(jié)合區(qū) 特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與Notch2和/或Notch3受體的胞外域的非配體 結(jié)合區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類Notch2的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合。在某些實(shí) 施方式中，所述抗體與Notch2和Notch3的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式 中，所述抗體與人類Notch3的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與Notchl 和/或Notch4結(jié)合。
[0126] 在特定實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且 抑制腫瘤生長的抗體是單克隆抗體。在特定實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非 配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體是嵌合抗體。在特定實(shí)施方式中，與人類 Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體是人源化抗體。 在特定實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤 生長的抗體是人類抗體。在特定實(shí)施方式中，與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū) 特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體是單特異性抗體。在特定實(shí)施方式中，與人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體是雙特異性抗體。在特 定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并 且抑制腫瘤生長的抗體的雜交瘤。
[0127] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與人類Notch受體的胞外域的包含EGF重復(fù)1-10 的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與 人類Notch受體的胞外域的包含EGF重復(fù)10 (或等效物）的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且 抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與人類Notch受體的胞外域的包含 EGF重復(fù)13-36的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。某些實(shí)施方式提供 與人類Notch受體的胞外域的包含EGF重復(fù)4的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生 長的抗體。某些實(shí)施方式提供與人類Notch受體的胞外域的包含EGF重復(fù)13的非配體結(jié) 合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與包含LNR-HD域 的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長。
[0128] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了對(duì)需要治療癌癥的受試對(duì)象進(jìn)行癌癥治療的方 法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的與人類Notch受體蛋白的胞外域的非 配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制所述受試對(duì)象中腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，所 述治療癌癥的方法包括施用治療有效量的與至少兩種Notch受體家族成員特異性結(jié)合并 且抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述對(duì)需要治療癌癥的受試對(duì)象進(jìn)行癌癥治 療的方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的與Notch2和/或Notch3受體的胞外域的 非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。
[0129] 在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與人類Notch受體 的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的單克隆抗體。在特定實(shí)施方式 中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū) 特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的嵌合抗體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施 用治療有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生 長的人源化抗體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與人類 Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的人類抗體。在某些實(shí) 施方式中，所述抗體是單特異性抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是雙特異性抗體。
[0130] 在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與包含EGF重復(fù) 1-10的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在 特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與包含EGF重復(fù)10 (或如果是 Notch3的話則是其等效物）的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且 抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與包 含EGF重復(fù)13-36的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生 長的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與包含EGF重復(fù) 4的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在特 定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與包含EGF重復(fù)4的人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在某些其它實(shí)施方式 中，施用的抗體與人類Notch受體的LNR-HD域特異性結(jié)合。
[0131] 在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與人類Notch受 體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的與細(xì)胞毒性基團(tuán)（cytotoxic moiety)綴合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括與放射治療組合施用治療 有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗 體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括與化學(xué)治療組合施用治療有效量的與人類 Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體。在特定實(shí)施方 式中，所述治療癌的方法包括施用治療有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合 區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗體，所述腫瘤生長來自乳腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、肺腫瘤、 胰腺腫瘤、前列腺腫瘤或頭頸腫瘤。
[0132] 在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括使用遺傳測試鑒定可使用抗體進(jìn)行治 療的患者，所述抗體與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合；和施用治療 有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長的抗 體。在特定實(shí)施方式中，所述治療癌的方法包括使用檢測癌干細(xì)胞標(biāo)簽的遺傳測試鑒定可 使用抗體進(jìn)行治療的患者，所述抗體與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié) 合；和施用治療有效量的與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制 腫瘤生長的抗體。
[0133] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供鑒定與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū) 結(jié)合并且抑制腫瘤生長的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子與人類Notch受體的 胞外域的非配體結(jié)合域一起溫育；ii)確定所述分子是否與人類Notch受體的胞外域的非 配體結(jié)合區(qū)結(jié)合；和iii)確定所述分子是否抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提 供鑒定與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合并且抑制腫瘤生長的分子的方法， 所述方法包括：i)使所述分子與包含EGF重復(fù)1-10的人類Notch受體的胞外域的非配體 結(jié)合域一起溫育；ii)確定所述分子是否與包含EGF重復(fù)1-10的人類Notch受體的胞外域 的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合；和iii)確定所述分子是否抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，本發(fā) 明提供鑒定與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合并且抑制腫瘤生長的分子的 方法，所述方法包括：i)使所述分子與包含EGF重復(fù)10(或如果是Notch3則是等效物）的 人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合域一起溫育；ii)確定所述分子是否與包含EGF重 復(fù)10 (或如果是Notch3則是等效物）的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合；和 iii)確定所述分子是否抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供鑒定與人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合并且抑制腫瘤生長的分子的方法，所述方法包括：i)使 所述分子與包含EGF重復(fù)13-36的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合域一起溫育；ii) 確定所述分子是否與包含EGF重復(fù)13-36的人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié) 合；和iii)確定所述分子是否抑制腫瘤生長。
[0134] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含抗體的藥物組合物，所述抗體與人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長。
[0135] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備抗體的方法，所述抗體與人類Notch受體的 胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長。
[0136] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供編碼抗體的分離的核酸，所述抗體與人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合并且抑制腫瘤生長。
[0137] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與一種或多種人類Notch受體的EGF10域（或如 果是Notch3的話則是EGF10域的等效物）特異性結(jié)合的試劑（例如，抗體）。在特定實(shí)施 方式中，所述試劑是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述 試劑與人類Notch2的EGF10和/或人類Notch3的EGF9特異性結(jié)合。EGF9是人類Notch3 內(nèi)的EGF，其等效于其它人類Notch受體Notchl、Notch2和Notch4中的EGF10。在特定實(shí) 施方式中，所述試劑特異性結(jié)合人類Notch2。在特定實(shí)施方式中，所述試劑特異性結(jié)合人類 Notch2和Notch3。在特定實(shí)施方式中，所述試劑特異性結(jié)合人類Notch3。
[0138] 在一方面，本發(fā)明提供59R1抗體，所述59R1抗體包含分別在SEQ ID NO :16和 18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）中提供的的重鏈和輕鏈序列，或由DNA編碼，所述DNA于2008 年10月15日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào)PTA-9547。本發(fā)明還提供包含所述59R1抗體的 重鏈可變區(qū)（例如，SEQ ID NO :14)和/或輕鏈可變區(qū)（例如，SEQ ID NO :13)的多肽或抗 體。本發(fā)明還提供包含所述59R1抗體的1個(gè)或多個(gè)（例如1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)）重鏈⑶R和 /或1個(gè)或多個(gè)輕鏈CDR的多肽或抗體。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了所結(jié)合表位與 59R1抗體相同的抗體或與59R1抗體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合的抗 體。
[0139] 在另一方面，本發(fā)明提供59R5抗體，所述59R5抗體包含分別在SEQ ID N0:49和 18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）中提供的重鏈和輕鏈序列，或由DNA編碼，所述DNA于2009年 7月6日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào)[...]。本發(fā)明還提供包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變 區(qū)序列SEQ ID NO :50和/或SEQ ID NO : 13的多肽或抗體。本發(fā)明還提供包含59R5抗體 的1個(gè)或多個(gè)（例如1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)）重鏈⑶R和/或1個(gè)或多個(gè)輕鏈⑶R的多肽或抗 體。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了所結(jié)合表位與59R5抗體相同的抗體或與59R5抗 體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合的抗體。
[0140] 在某些其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與兩種以上（即，至少兩種或者兩種、三種 或四種）人類Notch受體特異性結(jié)合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體與兩種以上人 類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是與兩 種以上人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的單特異性抗體。在特定實(shí)施 方式中，所述抗體與Notchl、Notch2或Notch4的EGF10、和/或Notch3的EGF9結(jié)合。在 特定實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合的非配體結(jié)合區(qū)不是EGF4或不包含EGF4。在特定實(shí)施方式 中，所述兩種以上人類Notch受體包括Notch2和/或Notch3。在特定實(shí)施方式中，所述兩 種以上人類Notch受體包括Notch2和Notch3。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是所述兩種以 上人類Notch受體的拮抗劑。
[0141] 本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)受試對(duì)象中周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的方法，其中 所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用有效量的特異性結(jié)合人類Notch2和/或人類Notch3的試 齊U。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是拮抗劑。
[0142] 本發(fā)明還提供抑制受試對(duì)象中血管發(fā)生的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施 用有效量的特異性結(jié)合人類Notch2和/或人類Notch3的試劑的步驟。在特定實(shí)施方式中， 所述試劑是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑 是Notch2的拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑是Notch3的拮抗劑。在特定實(shí)施方 式中，所述拮抗劑是Notch2和Notch3的拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述抑制血管發(fā)生的 方法包括調(diào)節(jié)周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能。在某些實(shí)施方式中，所述血管發(fā)生是 腫瘤血管發(fā)生。
[0143] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑是與人類Notch受體特異性結(jié)合的拮抗劑。 在某些替代性實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑是與人類Notch受體特異性結(jié)合的激動(dòng)劑。
[0144] 在特定實(shí)施方式中，與一種或多種Notch受體特異性結(jié)合并且是所述一種或多種 Notch受體的拮抗劑的試劑抑制所結(jié)合Notch受體的一種或多種活性的至少約10%、至少 約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%。
[0145] 在特定實(shí)施方式中，所述一種或多種人類Notch受體（例如，Notch2和/或 Notch3)的拮抗劑具有一種或多種以下效果：抑制一種或多種人類Notch受體的配體結(jié)合， 抑制一種或多種人類Notch受體的配體誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)；抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；通過減少 癌干細(xì)胞在腫瘤中的頻率而減少腫瘤的致瘤性；抑制腫瘤生長；增加存活、觸發(fā)腫瘤細(xì)胞 的細(xì)胞死亡；抑制血管發(fā)生；或防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
[0146] 在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑具有一種或多種以下效果：干擾Notch受體的表 達(dá)；通過例如空間上抑制Notch受體和一種或多種其配體之間的相互作用、或與人類Notch 受體結(jié)合而干擾Notch受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活和觸發(fā)細(xì)胞死亡或抑制細(xì)胞增殖。
[0147] 在特定實(shí)施方式中，針對(duì)諸如Notch2或Notch3等Notch受體的拮抗劑在胞外 對(duì)Notch受體起作用，或抑制所述Notch受體的功能。在特定實(shí)施方式中，拮抗劑是與 Notch受體的胞外域結(jié)合的小分子。在特定實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑是蛋白質(zhì)性的 (proteinaceous)。在某些實(shí)施方式中，Notch受體的蛋白質(zhì)性拮抗劑是與Notch受體的細(xì) 胞外表位特異性結(jié)合的抗體。針對(duì)Notch受體的拮抗劑的細(xì)胞外結(jié)合通過抑制Notch受體 的固有激活（例如激酶活性）和/或通過空間上抑制例如Notch受體與其配體之一的相互 作用，從而能夠抑制Notch受體的信號(hào)傳導(dǎo)。另外，針對(duì)Notch受體的拮抗劑的細(xì)胞外結(jié)合 通過例如使Notch受體內(nèi)化和/或減少Notch受體的細(xì)胞表面運(yùn)輸，從而能夠下調(diào)Notch 受體的細(xì)胞表面表達(dá)。
[0148] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑（例如，抗體）與至少一種人類 Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合，其中所述非配體結(jié)合區(qū)包含EGF重復(fù) 10 (或如果是Notch3的話則是其等效物）。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與Notch2 特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與Notch3特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方 式中，所述試劑或拮抗劑與人類Notch2和人類Notch3特異性結(jié)合。
[0149] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑（例如，抗體）與人類Notch2的 EGF10域特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑不與EGF10域外的人 類Notch2的任何區(qū)域結(jié)合。在某些替代性實(shí)施方式中，與人類Notch2的EGF10域特異性 結(jié)合的Notch結(jié)合劑或拮抗劑還與人類Notch2的另一區(qū)域結(jié)合。換言之，在某些實(shí)施方式 中，所述試劑或拮抗劑的全部表位落入EGF10中。在某些其它實(shí)施方式中，與人類Notch2 結(jié)合的試劑或拮抗劑的表位與EGF10部分重疊。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與 位于人類Notch2EGF10內(nèi)的序列HKGAL(SEQ ID N0:28)的至少一部分結(jié)合。在特定實(shí)施方 式中，所述試劑或拮抗劑還與人類Notch2EGF10內(nèi)的其它氨基酸結(jié)合（例如，抗Notch2抗 體的完整表位不必全部包含于序列HKGAL內(nèi)）。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或 拮抗劑還與至少一種其它人類Notch受體（例如，Notchl、Notch3或Notch4)特異性結(jié)合。 在特定實(shí)施方式中，與人類Notch2的EGF10結(jié)合的Notch結(jié)合劑或拮抗劑還與人類Notchl 的EGF10域、人類Notch3的EGF9域和/或人類Notch4的EGF10域結(jié)合。在特定實(shí)施方式 中，所述其它人類Notch受體是人類Notch3。
[0150] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑（例如，抗體）與人類Notch3的 EGF9域結(jié)合。從人類Notch2和人類Notch3的胞外域的序列之間的同源性明顯看出，在人 類Notch3中EGF9是Notch2EGF10的功能/結(jié)構(gòu)等效物。在特定實(shí)施方式中，所述Notch 結(jié)合劑或拮抗劑不與EGF9外的人類Notch3的任何區(qū)域結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述試 劑或拮抗劑與位于人類Notch3EGF9域內(nèi)的序列HEDAI (SEQ ID NO :29)的至少一部分結(jié) 合。HEDAI(SEQ ID N0:29)是與人類 Notch2EGF10 內(nèi)的序列 HKGAL(SEQ ID N0:28)相對(duì)應(yīng) 的Notch3EGF9域內(nèi)的序列。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑還與人類Notch3EGF9 內(nèi)的其它氨基酸結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑還與至少一種其它 人類Notch受體（例如，Notchl、Notch2和/或Notch4)的EGF10域特異性結(jié)合。在特定 實(shí)施方式中，所述其它人類Notch受體是人類Notch2,例如與人類Notch2的EGFlO域結(jié) 合的試劑或拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑不與EGFlO外的人類 Notch2的任何區(qū)域結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與位于人類Notch2EGF10 內(nèi)的序列HKGAL(SEQ ID N0:28)的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗 劑是與Notch2中的序列HKGAL(SEQ ID N0:28)的至少一部分結(jié)合并且還與Notch3中的序 列HEDAI (SEQ ID NO :29)的至少一部分結(jié)合的單特異性抗體。
[0151] 在某些替代性實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑與除了 EGFlO之外的區(qū)域 的Notchl、Notch2或Notch4受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的至少一部分結(jié)合，或與除了 EGF9之外的區(qū)域的Notch3受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的至少一部分結(jié)合。例如，在特 定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與一種或多種Notch受體的LNR-HD域結(jié)合。在特定實(shí)施 方式中，所述試劑或拮抗劑與一種或多種Notch受體的胞外域的EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、 EGF5、EGF6、EGF7、EGF9、EGF10、EGF13、EGF14、EGF15、EGF16、EGF17、EGF18、EGF19、EGF20、 EGF21、EGF22、EGF23、EGF24、EGF25、EGF26、EGF27、EGF28、EGF29、EGF30、EGF31、EGF32、 EGF33、EGF34、EGF35 和 / 或 EGF36 結(jié)合。
[0152] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑與一種或多種人類Notch受體的 胞外域的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合。因此，在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑可以與 Notchl、2 或 4 的 EGFll 和 / 或 EGF12 結(jié)合（Rebay 等，1991，Cell 67 :687 ;Lei 等，2003， Dev. 130 :6411 ;Hambleton 等，2004, Structure 12 :2173)或與 Notch3 的 EGF10 和 / 或 EGFll 結(jié)合（Peters 等，2004, Experimental Cell Research，299 :454-464)。
[0153] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑（例如，抗體）與兩種以上人類Notch受 體（例如，Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4)特異性結(jié)合。換言之，在特定實(shí)施方 式中，所述試劑或抗體結(jié)合至少兩種人類Notch受體（即，兩種、三種或四種人類Notch受 體）。所涵蓋的有與兩種人類Notch家族受體（例如，Notch2和Notch3、Notchl和Notch2、 Notchl 和 Notch3、Notchl 和 Notch4、Notch2 和 Notch4,或 Notch3 和 Notch4)特異性結(jié)合 的試劑和抗體。還設(shè)想了與三種人類Notch受體家族成員特異性結(jié)合的試劑和抗體（例如， 與 Notchl、Notch2 和 Notch3 ;Notchl、Notch2 和 Notch4 ;或 Notch2、Notch3 和 Notch4 特 異性結(jié)合的試劑和抗體），以及與四種人類Notch受體家族成員特異性結(jié)合的試劑和抗體 (例如，與Notchl、Notch2、Notch3和Notch4特異性結(jié)合的試劑和抗體）。在特定實(shí)施方式 中，所述試劑或抗體與人類Notch2和Notch3特異性結(jié)合。在某些替代性實(shí)施方式中，所述 試劑或抗體與人類Notchl和Notch2特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體與 人類Notchl和Notch3特異性結(jié)合。在另外實(shí)施方式中，所述試劑或抗體與人類Notchl和 Notch4特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或抗體是所述兩種以上人類Notch受體 的拮抗劑。
[0154] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑與Notch受體（例如，Notch2和/ 或Notch3)結(jié)合的解離常數(shù)是約1 μ M以下、約IOOnM以下、約40nM以下、約20nM以下或約 IOnM以下。在特定實(shí)施方式中，所述試劑或拮抗劑與一種或多種人類Notch受體（例如人 類Notch2和/或人類Notch3)結(jié)合的K d為InM以下。在某些實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合 劑是與Notch2結(jié)合的Kd為約InM以下的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑是與 Notch3結(jié)合的Kd為約InM以下的抗體。在特定實(shí)施方式中，相對(duì)于特定Notch受體的試劑 或拮抗劑的解離常數(shù)是使用固定在Biacore芯片上的包含Notch胞外域和/或包含EGFlO 的胞外域的一部分的Notch-Fc融合蛋白確定的解離常數(shù)。
[0155] 在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑與人類Notch3特異性結(jié)合并且抑制配體（例如， DLL4、JAG1和/或JAG2)與人類Notch3的結(jié)合和/或抑制人類Notch3的信號(hào)傳導(dǎo)。在特 定實(shí)施方式中，所述拮抗劑與人類Notch2特異性結(jié)合并且抑制配體（例如，DLL4、JAGl和/ 或JAG2)與人類Notch2的結(jié)合和/或抑制人類Notch2的信號(hào)傳導(dǎo)。在特定實(shí)施方式中，所 述拮抗劑抑制DLL4誘導(dǎo)的Notch2信號(hào)傳導(dǎo)。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑抑制DLL4誘 導(dǎo)的Notch3信號(hào)傳導(dǎo)。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑抑制JAG2誘導(dǎo)的Notch2信號(hào)傳導(dǎo)。 在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑抑制JAG2誘導(dǎo)的Notch3信號(hào)傳導(dǎo)。在特定實(shí)施方式中，由 Notch2和/或Notch3進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)被減少至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少 約75 %、至少約90 %或至少約95 %。在特定實(shí)施方式中，一種或多種配體與Notch2和/或 Notch3的結(jié)合被減少至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或 至少約95%。
[0156] 在某些實(shí)施方式中，針對(duì)Notch受體的拮抗劑與Notch受體結(jié)合并且具有一種或 多種以下效果：抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、直接在腫瘤細(xì)胞中觸發(fā)細(xì)胞死亡或防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn) 移。在特定實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑經(jīng)由綴合毒素、化學(xué)治療劑、放射性同位素或 其它此類試劑觸發(fā)細(xì)胞死亡。例如，針對(duì)Notch受體的抗體與通過蛋白內(nèi)化而在表達(dá)Notch 受體的腫瘤細(xì)胞中激活的毒素綴合。在其它實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑經(jīng)由抗體依 賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性（ADCC)而介導(dǎo)表達(dá)Notch受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。ADCC涉及通過識(shí) 別抗體的Fc部分的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞裂解。例如，許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬 細(xì)胞、粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞具有Fc受體并且能夠介導(dǎo)細(xì)胞溶解（Dillman，1994, J. Clin. Oncol. 12 :1497)。在某些實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑是通過激活補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞 毒性（CDC)觸發(fā)表達(dá)Notch受體的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的抗體。CDC參與針對(duì)抗體的Fc部分的 血清補(bǔ)體的結(jié)合和補(bǔ)體蛋白級(jí)聯(lián)的隨后激活，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和最終的細(xì)胞死亡。在很大 程度上，已知抗體的生物活性由抗體分子的恒定域或Fc區(qū)確定（Uananue和Benacerraf，教 科書Immunology,第2版，Williams&Wilkins，第218頁（1984))。不同類別和亞類的抗體 在該方面有所不同，正如相同亞類但來自不同物種的抗體一樣。人類抗體中，IgM是結(jié)合補(bǔ) 體最有效類別的抗體，然后是IgGl、IgG3和IgG2,而IgG4在激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)方面似乎非常不 足（Dillman，1994，J.Clin.0ncol. 12 :1497 Jefferis 等，1998, Immunol. Rev. 163 :59-76)。 根據(jù)本發(fā)明，制備了具有所需生物活性的這些類別的抗體。
[0157] 可以測定針對(duì)Notch受體的任何特定抗體通過補(bǔ)體激活和/或ADCC介導(dǎo)靶細(xì)胞 的裂解的能力。使目的細(xì)胞在體外生長和進(jìn)行標(biāo)記；向細(xì)胞培養(yǎng)物添加所述抗體以及通過 抗原抗體復(fù)合物而激活的血清補(bǔ)體或免疫細(xì)胞。例如通過來自被裂解的細(xì)胞的標(biāo)記的釋放 檢測靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解。事實(shí)上，可以使用患者自身血清作為補(bǔ)體和/或免疫細(xì)胞的來源 對(duì)抗體進(jìn)行篩選。然后可以將在體外測試中能夠激活補(bǔ)體或介導(dǎo)ADCC的抗體治療性用于 該特定患者。
[0158] 在特定實(shí)施方式中，Notch結(jié)合劑或拮抗劑是不具有一種或多種效應(yīng)子功能的抗 體。例如，在某些實(shí)施方式中，所述抗體不具有抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性（ADCC)活性，和 /或不具有補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)活性。在特定實(shí)施方式中，所述抗體不與Fc受體和 /或補(bǔ)體因子結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，所述抗體不具有效應(yīng)子功能。
[0159] 在其它實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑通過抑制血管發(fā)生可間接觸發(fā)細(xì)胞死亡。 血管發(fā)生是通過新血管從已有脈管形成的過程，并且是在例如胚胎發(fā)育、傷口愈合和排卵 反應(yīng)期間的正常生長所需的基礎(chǔ)過程。大于Imm 2?2mm2的實(shí)體瘤生長也需要血管發(fā)生來 供應(yīng)營養(yǎng)物和氧，否則腫瘤細(xì)胞就會(huì)死亡。因此在特定實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑靶 向表達(dá)Notch受體的血管細(xì)胞,例如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或血管組裝所需的細(xì)胞外基質(zhì) 的組分。在特定實(shí)施方式中，Notch受體（例如，Notch2和/或Notch3)的拮抗劑祀向周 細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，Notch受體的拮抗劑抑制血管細(xì)胞募集 (recruitment)、組裝、維持或存活所需的生長因子信號(hào)傳導(dǎo)。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗 劑調(diào)節(jié)周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能。
[0160] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑（例如，抗體）單獨(dú)地或與第二治 療劑組合時(shí)能夠抑制腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑能夠抑制 體內(nèi)（例如，在異種移植物小鼠模型中和/或在患有癌癥的人類中）腫瘤生長。在特定實(shí) 施方式中，在異種移植物模型中在給定時(shí)間點(diǎn)所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑能夠?qū)⒛[瘤生長 抑制至少約10%、至少約25%、至少約50%、少約75%、少約90%。在特定實(shí)施方式中，所 述Notch結(jié)合劑或拮抗劑預(yù)防腫瘤生長。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑 抑制腫瘤復(fù)發(fā)。
[0161] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑能夠減少腫瘤的致瘤性。在特定實(shí)施方式 中，所述試劑或抗體能夠減少諸如小鼠異種移植物模型等動(dòng)物模型中包含癌干細(xì)胞的腫瘤 的致瘤性。在特定實(shí)施方式中，腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率減少至少約2倍、約3倍、約 5倍、約10倍、約50倍、約100倍或約1000倍（例如，在異種移植物模型中）。在特定實(shí)施 方式中，通過使用動(dòng)物模型進(jìn)行有限稀釋檢測確定了癌干細(xì)胞頻率的減少。以下在實(shí)施例 8中提供用于測試抗Notch抗體的功效的有限稀釋檢測的實(shí)例。關(guān)于使用有限稀釋檢測來 確定腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量和頻率的減少的其它實(shí)例和指南可以發(fā)現(xiàn)于例如國際公開WO 2008/042236、美國專利申請(qǐng)公開第2008/0064049和2008/0178305號(hào)，本文通過參考并入 每一篇的全文。
[0162] 本發(fā)明提供各種多肽，包括但不限于抗體或抗體的片段。在特定實(shí)施方式中，所述 多肽是分離的。在某些替代性實(shí)施方式中，所述多肽基本上是純的。
[0163] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可以是包含序列SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、 19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57(帶有或不帶有指出的信號(hào)序列）的重組多肽、 天然多肽或合成多肽，以及包含由多核苷酸SEQ ID N0:l、3、15、17、47、48、58、59或60(帶 有或不帶有指出的信號(hào)序列）編碼的多肽的多肽。
[0164] 本發(fā)明提供了包含分別在SEQ ID NO :16和/或SEQ ID NO :18中提供的59R1的 重鏈和/或輕鏈的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述多 肽特異性結(jié)合Notch2和/或Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性結(jié)合Notch2和 Notch3〇
[0165] 本發(fā)明提供了包含分別在SEQ ID NO :49和/或SEQ ID NO :18中提供的59R5的 重鏈和/或輕鏈的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽是抗體。在特定實(shí)施方式中，所述多 肽特異性結(jié)合Notch2和/或Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性結(jié)合Notch2和 Notch3〇
[0166] 本發(fā)明還提供包含SEQ ID NO :13和/或SEQ ID NO :14的多肽。在特定實(shí)施方式 中，所述多肽包含含有SEQ ID NO : 13的可變輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO : 14的可變重 鏈序列。在某些實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO: 13的可變輕鏈序列和含有SEQ ID NO :14的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO :13的可變 輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO :50的可變重鏈序列。在某些實(shí)施方式中，所述多肽包含含 有SEQ ID NO :13的可變輕鏈序列和含有SEQ IDNO :50的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式 中，所述多肽包含含有SEQ ID NO : 13的可變輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO :52的可變重 鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO: 13的可變輕鏈序列和/或含有 SEQ ID NO :53的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO :13的 可變輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO :54的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包 含含有SEQ ID NO : 13的可變輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO :55的可變重鏈序列。在特定 實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO :13的可變輕鏈序列和/或含有SEQ ID NO :56 的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO: 13的可變輕鏈序列和 /或含有SEQ ID NO :57的可變重鏈序列。在特定實(shí)施方式中，所述多肽是抗體。在特定實(shí) 施方式中，所述多肽特異性結(jié)合Notch2和/或Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異 性結(jié)合Notch2和Notch3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性結(jié)合人類Notch2。在某些 實(shí)施方式中，所述多肽特異性結(jié)合人類Notch3。
[0167] 本領(lǐng)域承認(rèn)可以對(duì)本發(fā)明的某些氨基酸序列進(jìn)行變化而不會(huì)顯著影響蛋白的結(jié) 構(gòu)或功能。如果關(guān)注序列上的所述差異，應(yīng)該記得在蛋白上存在確定活性的關(guān)鍵區(qū)域。因 此，本發(fā)明還包括顯示基本活性的多肽的改變。此類突變包括缺失、插入、倒置、重復(fù)和類型 取代?？梢栽?Bowie 等，Deciphering the Message in Protein Sequences ：Tolerance to Amino Acid Substituations，1990，Science 247 :1306-1310 中發(fā)現(xiàn)關(guān)于哪一種氨基酸變 化可能是表型上沉默的指南。
[0168] 因此，本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是：（i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘 基被保守性或非保守性氨基酸殘基（經(jīng)常是保守性氨基酸殘基）取代的多肽的片段、衍生 物或類似物，并且這種取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸； 或（ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基的多肽的片段、衍生物或類似物；或（iii) 其中成熟多肽與另一化合物融合的多肽的片段、衍生物或類似物，所述化合物例如是增加 所述多肽的半衰期的化合物（例如聚乙二醇）；或（iv)其中另外的氨基酸與成熟多肽融合 的多肽的片段、衍生物或類似物，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于對(duì)成熟多肽或前蛋白序 列進(jìn)行純化的序列。這種片段、衍生物或類似物被視為在本文教導(dǎo)的范圍之內(nèi)。
[0169] 特別感興趣的是帶電氨基酸被另一帶電氨基酸和被中性或帶負(fù)電氨基酸取代。 后者廣生正電荷減少的蛋白質(zhì)。蛋白的正電荷減少可導(dǎo)致蛋白聚集，而防止凝集是1?度 期望的。蛋白的凝集不僅導(dǎo)致活性喪失，由于其具有免疫原性，在制備藥物制劑時(shí)也有問 題。（Pinckard 等，1967，Clin. Exp. Immunol. 2 :331-340, Robbins 等，1987，Diabetes 36 : 838-845 ;Cleland等，1993,Crit. Rev Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377)。
[0170] 如所示，氨基酸變化通常對(duì)于微小的性質(zhì)，例如不顯著影響蛋白的折疊或活性的 保守性氨基酸取代（參見表1)。
[0171] 表1.保守性氨基酸取代
[0172] 起始?δ(基酸 示例性的保守性取代 丙Sit 纈氨酸、分亮氨酸、亮氨酸、?-氨酸、絲氨酸 精氨酸 賴^(酸、組M酸、谷M酰胺、天冬酰胺 天冬酰胺 答紱敵胺、組奴酸、賴M酸、精4^酸 天冬氨酸 答蓺酸、天冬酰胺 半朧氨酸 絲鉍+酸、丙氨酸、蛋氨酸 谷氨酰胺 大冬酰胺 谷氣酸 天冬M酸、谷HSf胺 氨酸 腦氨_、丙S酸 組奴?1 天冬酰胺、#^(酰胺、賴奴酸、精奴酸 異充貧:酸 兗奴酸、纈鉍酸、蛋奴酸、丙奴酸、苯丙^(酸、正兗氨1? 亮氨_ ιΗ亮ft酸、兄亮氨_、纈S酸、蛋^酸、丙S酸、苯丙SC酸 賴氨酸 Wm酸、谷MSit胺、天冬St按、組11酸 蚩氨酸 亮氨酸、苯丙M酸、異亮S酸、纈S酸、半胱氨酸 苯丙充鉍_、纈M-酸、異7￡奴酸、WM酸、K氨酸 脯S酸 丙氨酸、tT氨酸 絲SC酸 蘇氨酸 蘇鉍酸 絲奴酸 色氨酸 _氨酸、苯丙氨酸 IffMft 色^(酸、苯WM酸、蘇M酸、絲M酸 纈a酸 異亮M酸、蛋a酸、亮氨酸、苯丙a酸、丙a酸、￡亮氨酸
[0173] 當(dāng)然，進(jìn)行的氨基酸取代的數(shù)量取決于許多因素，包括上文所述的那些。在特定實(shí) 施方式中，對(duì)于任何給定的多肽，取代的數(shù)量不超過50個(gè)、40個(gè)、30個(gè)、25個(gè)、20個(gè)、15個(gè)、 10個(gè)或3個(gè)。
[0174] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽和多核苷酸以分離形式提供，并且有時(shí)經(jīng)純化 以使其具有均一性。
[0175] 本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、 55、56 或 57 的多肽，和與 SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、 56或57的多肽具有至少90%相似性（在某些時(shí)候具有至少90%序列同一性）的多肽，和 與 SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽具有至 少95%相似性（在某些時(shí)候具有至少95%序列同一性）的多肽，以及在其它實(shí)施方式中， 與 SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽具有至 少96%、97%、98%或99%相似性（在某些時(shí)候具有至少96%、97%、98%或99%序列同一 性）的多肽。本領(lǐng)域已知，通過將一個(gè)多肽的氨基酸序列和其保守性氨基酸取代與第二多 肽的序列進(jìn)行比較來確定兩個(gè)多肽之間的"相似性"。
[0176] 使用本發(fā)明多肽的片段或部分可以通過肽合成來生產(chǎn)相應(yīng)的全長多肽；因此可以 將所述片段用作生產(chǎn)全長多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可用于合成本發(fā)明 的全長多核苷酸。
[0177] 在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明蛋白的片段是能夠與Notchl受體蛋白結(jié)合的蛋白的 部分或全部。該片段對(duì)Notch受體或Notch受體的配體具有高親和性。融合蛋白的某些片 段是包含與免疫球蛋白的至少部分恒定區(qū)融合的所述多肽試劑或拮抗劑的至少部分Notch 結(jié)合域的蛋白片段。親和性通常為約l〇_nM?KT12M,不過親和性可以隨著片段尺寸的不同 而從KT 7M?KT13M顯著變化。在某些實(shí)施方式中，所述片段長度為約10?110個(gè)氨基酸， 并且包含與免疫球蛋白的至少部分恒定區(qū)連接的多肽試劑或拮抗劑的Notch結(jié)合域。
[0178] 可以對(duì)所述多肽和類似物進(jìn)一步進(jìn)行修飾以含有正常情況下不是所述蛋白部分 的其它化學(xué)基團(tuán)（chemical moieties)。這些衍生的基團(tuán)可以改善蛋白的溶解度、生物半 衰期和/或吸附。該基團(tuán)還可以減少或消除所述蛋白的任何不期望的副作用等?？梢栽?雷明頓藥典（Remington，s Pharmaceutical Sciences)，第 20 版，Mack Publishing Co.， Easton，PA(2000)中發(fā)現(xiàn)關(guān)于化學(xué)基團(tuán)的綜述。
[0179] 可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法生產(chǎn)本文所述的分離的多肽。所述方法從 直接蛋白合成方法，到構(gòu)建編碼分離的多肽序列的DNA序列并在合適的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主中表達(dá) 這些序列。
[0180] 在重組方法的某些實(shí)施方式中，通過分離或合成編碼野生型目的蛋白的DNA序列 來構(gòu)建DNA序列?？蛇x的是，可以通過位點(diǎn)特異性突變來對(duì)所述序列進(jìn)行誘變從而提供其 功能類似物。參見，例如 Zoeller 等，1984,Proc. Nat Acad. Sci. USA 81 :5662-5066 和美國 專利第4, 588, 585號(hào)。另一構(gòu)建編碼目的多肽的DNA序列的方法通過使用寡核苷酸合成儀 的化學(xué)合成進(jìn)行?？梢曰谒瓒嚯牡陌被嵝蛄泻瓦x擇在會(huì)產(chǎn)生重組目的多肽的宿主細(xì) 胞中受偏愛的那些密碼子來設(shè)計(jì)所述寡核苷酸。
[0181] 可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法來合成編碼分離的目的多肽的分離的多核苷酸序列。例如，可 以使用完整氨基酸序列來構(gòu)建反譯（back-translated)基因。另外，可以合成含有編碼特 定分離的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成幾種編碼所需多肽的各部分的 小型寡核苷酸并將其連接。各寡核苷酸通常含有5'或3'突出端以用于互補(bǔ)組裝。
[0182] -旦進(jìn)行組裝（通過合成、定點(diǎn)突變或另一方法），則將編碼特定的分離的目的多 肽的突變DNA序列插入表達(dá)載體中并可操作地連接至適合在所需宿主中表達(dá)蛋白的表達(dá) 控制序列?？梢酝ㄟ^核苷酸測序、限制酶作圖和在合適宿主中表達(dá)生物活性多肽來確認(rèn)合 適的組裝。如本領(lǐng)域眾所周知，為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染基因的高表達(dá)水平，將該基因可操作 地連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列，該表達(dá)控制序列在所選表達(dá)宿主中具有功能。
[0183] 可以使用重組表達(dá)載體來擴(kuò)增和表達(dá)編碼多肽的DNA。重組表達(dá)載體是可復(fù)制的 DNA構(gòu)建體，其具有編碼Notch受體融合物或生物等效類似物的合成或cDNA來源的DNA片 段，所述DNA片段與源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件 可操作地連接。如以下詳細(xì)描述，轉(zhuǎn)錄單元通常包括以下組件的組裝體：（1)在基因表達(dá)中 具有調(diào)節(jié)作用的遺傳元件，例如，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，（2)轉(zhuǎn)錄為mRNA并且翻譯成蛋白的 結(jié)構(gòu)或編碼序列，和（3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)和終止序列。所述調(diào)節(jié)元件可以包括用于 控制轉(zhuǎn)錄的操作子序列?？梢粤硗庖胪ǔＹx予在宿主中復(fù)制的能力的復(fù)制原點(diǎn)，和便于 識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。當(dāng)DNA區(qū)域相互功能上相關(guān)時(shí)，將它們可操作地連接。例如，如果 信號(hào)肽（分泌前導(dǎo)）的DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前體，則信號(hào)肽（分泌前導(dǎo)）的DNA可 操作地與多肽的DNA可操作地連接；如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼序 列可操作地連接；或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)定位而允許翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序 列可操作地連接。通常，"可操作地連接"意味著是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)區(qū)的情況下，意 味著連續(xù)并且在閱讀框中。旨在在酵母表達(dá)系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)元件包括能夠使宿主細(xì)胞將 翻譯蛋白分泌到胞外的前導(dǎo)序列。作為選擇，當(dāng)表達(dá)不具有前導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的重組蛋 白時(shí)，其可以包括N末端蛋氨酸殘基。可選地是可以隨后從表達(dá)重組蛋白中切割下該殘基 以提供最終產(chǎn)物。
[0184] 表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇取決于宿主的選擇?？梢允褂酶鞣N表達(dá)宿主/載 體組合。對(duì)于真核宿主有用的表達(dá)載體包括,例如,包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病 毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。對(duì)于細(xì)菌宿主有用的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì) 粒，例如包括pCRl、pBR322、pMB9和其衍生物等在內(nèi)的來自大腸桿菌的質(zhì)粒，以及諸如M13 和絲狀單鏈DNA噬菌體等廣宿主范圍質(zhì)粒。
[0185] 用于在合適啟動(dòng)子的控制下表達(dá)多肽的合適的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母、昆 蟲或高級(jí)真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌 或桿菌。高級(jí)真核細(xì)胞包括本文所述哺乳動(dòng)物來源的已建立細(xì)胞系。還可以使用無細(xì)胞翻 譯系統(tǒng)。Pouwels等描述了與細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主一起使用的合適的克隆 和表達(dá)載體（Cloning Vectors :A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985)，在此通過參 考并入其相關(guān)內(nèi)容。
[0186] 有利的是還使用各種哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白?？梢栽诓溉?動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，因?yàn)樗龅鞍淄ǔＵ_地折疊、合適地修飾和具有完全 功能。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括Gluzman 1981，Cell 23:175所述的猴腎細(xì) 胞的C0S-7系，和能夠表達(dá)合適載體的其它細(xì)胞系，包括例如L細(xì)胞、C127、3T3、中國倉鼠卵 巢（CHO)、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含與待表達(dá)基因連接的諸如復(fù)制 原點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等非轉(zhuǎn)錄元件和其它5'或3'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，以及諸如必需 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止序列等5'或3'非 翻譯序列。用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源性蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)由Luckow和Summers, 1988， Bio/Technology，6 :47 綜述。
[0187] 可以根據(jù)任何合適的方法對(duì)由經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行純化。所述標(biāo)準(zhǔn)方法包 括色譜（例如離子交換色譜、親和色譜和分級(jí)柱（sizing column)色譜）、離心、差別溶解 度或通過用于蛋白純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)方法。諸如六聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合域、流感病毒外 殼序列和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等親和標(biāo)簽可以與蛋白連接，從而允許通過合適的親和柱容 易地進(jìn)行純化。使用諸如蛋白水解、核磁共振和X-射線晶體學(xué)也可以物理地表征分離的蛋 白。
[0188] 例如，可以首先使用商購的蛋白濃縮過濾器，例如Amicon或Milhpore Pellicon 超濾裝置對(duì)來自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的系統(tǒng)的上清液進(jìn)行濃縮。濃縮步驟后，將濃 縮物施加到合適的純化基質(zhì)。作為選擇，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有下垂的二乙基 氨基乙基（DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)或基底。所述基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或 蛋白純化中常用的其它種類。作為選擇，可以使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換器 包括各種含有磺丙基或羧甲基的不溶性基質(zhì)。最后，可以使用一種或多種反相高效液相色 譜（RP-HPLC)步驟來進(jìn)一步純化癌干細(xì)胞蛋白-Fc組合物，所述反相高效液相色譜步驟采 用諸如具有下垂甲基或其它脂肪族基團(tuán)的硅膠等疏水性RP-HPLC介質(zhì)。還可以以各種組合 使用上述純化步驟中的一些或全部，從而提供均一性的重組蛋白。
[0189] 細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組蛋白通常通過起始提取從細(xì)胞團(tuán)塊中分離，然后是一步 或多步濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟。對(duì)于最后的純化步驟可以使用高效 液相色譜（HPLC)?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方法破壞重組蛋白表達(dá)中所用的微生物細(xì)胞，包括冷 凍-解凍循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞或是使用細(xì)胞裂解劑。
[0190] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑包含抗體。在特定實(shí)施方式中，所 述抗體是分離的。在特定實(shí)施方式中，所述抗體基本上是純的。
[0191] 本發(fā)明提供了這樣的抗體：該抗體與包含含有SEQ ID NO :14的重鏈可變區(qū)和含 有SEQ ID N0:13的輕鏈可變區(qū)的抗體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合。本 發(fā)明還提供了這樣的抗體：該抗體與包含59RlIgG2的抗體、由59RlIgG2組成的抗體或基本 上由59RlIgG2組成的抗體競爭對(duì)人類Notch2和/或Notch3的特異性結(jié)合，59RlIgG2抗體 包含分別為SEQ ID NO :16和18 (帶有或不帶有信號(hào)序列）的重鏈和輕鏈，或由DNA編碼， 所述DNA于2008年10月15日保藏在ATCC，并賦予保藏號(hào)PTA-9547。
[0192] 本發(fā)明還提供與一種或多種Notch受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含SEQ ID NO :5至10、22至27、30或51的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和/或6個(gè)CDR，每個(gè)CDR具有 最多4(即，0、1、2、3或4)個(gè)保守性氨基酸取代（例如見表1)。本發(fā)明還提供與一種或多 種Notch受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含59R1的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和/或6 個(gè)⑶R(即，SEQ ID N0:5至10)，每個(gè)⑶R具有最多4個(gè)保守性氨基酸取代。因此，本發(fā)明 提供與一種或多種Notch受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含59R1的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4 個(gè)、5個(gè)和/或6個(gè)CDR。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含具有最多4個(gè)保守性氨基酸取 代的59R1的重鏈⑶R3和/或具有最多4個(gè)保守性氨基酸取代的59R1的輕鏈⑶R3。在某 些實(shí)施方式中，所述抗體包含（a)含有SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈CDR1，或包含1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重 鏈⑶R2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有GIFFAI (SEQ ID NO :7)的重鏈⑶R3,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或 (b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8)的輕鏈CDR1，或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨 基酸取代的其變體；含有GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈CDR2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4 個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈CDR3,或包含 1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體。
[0193] 本發(fā)明還提供與一種或多種Notch受體特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含59R5的 1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和/或6個(gè)CDR(即，SEQ ID N0:5、6、8至10、51)，每個(gè)CDR具有最 多4個(gè)保守性氨基酸取代。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含具有最多4個(gè)保守性氨基酸 取代的59R5的重鏈⑶R3和/或具有最多4個(gè)保守性氨基酸取代的59R5的輕鏈⑶R3。在 某些實(shí)施方式中，所述抗體包含（a)含有SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈⑶Rl，或包含1個(gè)、 2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID N0:6)的重 鏈⑶R2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有SIFYTT (SEQ ID NO :51)的重鏈⑶R3,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或 (b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO :8)的輕鏈CDR1，或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨 基酸取代的其變體；含有GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈CDR2,或包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4 個(gè)保守性氨基酸取代的其變體；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈CDR3,或包含 1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代的其變體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含含有 SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈 CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID N0:6)的重鏈 CDR2 和 / 或含有 SIFYTT(SEQ ID NO :51)的重鏈 CDR3。
[0194] 還提供的是特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所述抗體包含含 有SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID N0:6)的重鏈CDR2 和 / 或含有（G/I) (I/S)F(F/Y) (A/P) (I/T/S/N) (SEQ ID NO :30)的重鏈 CDR3。在特定實(shí)施 方式中，所述重鏈⑶ R3 選自由 SIFYPT(SEQ ID N0:22)、SSFFAS(SEQ ID N0:23)、SSFYAS(SEQ ID NO :24)、SSFFAT(SEQ ID NO :25)、SIFYPS(SEQ ID NO :26)和 SSFFAN(SEQ ID NO :27)組 成的組。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含含有SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈⑶RU含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID N0:6)的重鏈 CDR2、和 / 或含有 GIFFAI(SEQ ID N0:7)的重鏈 CDR3。在特定實(shí)施方式中，所述重鏈CDR位于抗體重鏈的可變區(qū)內(nèi)。在特定實(shí)施方式中，所 述抗體還包含含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID N0:9) 的輕鏈⑶R2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈⑶R3。在特定實(shí)施方式中，所述 輕鏈CDR位于抗體輕鏈的可變區(qū)內(nèi)。在特定實(shí)施方式中，對(duì)所述重鏈CDR和/或輕鏈CDR 通過1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)保守性氨基酸取代進(jìn)行修飾。在特定實(shí)施方式中，通過不超過1 至2個(gè)保守性氨基酸取代對(duì)各CDR進(jìn)行修飾。
[0195] 例如，在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3 的抗體，其中所述抗體包含：（a)含有SSSGMS (SEQ ID NO :5)的重鏈CDR1、含有 VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈CDR2和含有GIFFAI(SEQ ID NO :7)的重鏈CDR3 ; 和 / 或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9) 的輕鏈⑶R2和含有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈⑶R3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體 同時(shí)包含所指出的輕鏈⑶R和重鏈⑶R。
[0196] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其 中所述抗體包含（a)含有SSSGMS(SEQ ID N0:5)的重鏈CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈CDR2和含有SIFYTT (SEQ ID NO :51)的重鏈CDR3 ;和/或（b)含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈 CDR2 和含 有QQYSNFPI(SEQ ID N0:10)的輕鏈⑶R3。在特定實(shí)施方式中，所述抗體同時(shí)包含所指出 的輕鏈⑶R和重鏈⑶R。
[0197] 本發(fā)明還提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所述抗體包含 含有 RASQSVRSNYLA(SEQ ID N0:8)的輕鏈 CDR1、含有 GASSRAT(SEQ ID N0:9)的輕鏈 CDR2 和 / 或含有 QQYSNFPI (SEQ ID NO :10)的輕鏈 CDR3。
[0198] 本發(fā)明還提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所述抗體包含： (a)與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 20具有至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約 95%或至少約98%序列同一性的多肽；和/或（b)與SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :19具有 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約98%序列同一性的多肽。因 此，在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含（a)與SEQ ID NO :14具有至少約95%序列同一性的 重鏈可變區(qū)；和/或（b)與SEQ ID NO :13具有至少約95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在 特定實(shí)施方式中，所述抗體包含：（a)包含SEQ ID NO :14或SEQ ID NO :20的多肽（例如， 重鏈可變區(qū)）；和/或（b)包含SEQ ID NO : 13或SEQ ID NO : 19的多肽（例如，輕鏈可變 區(qū)）。
[0199] 本發(fā)明還提供特異性結(jié)合人類Notch2和/或Notch3的抗體，其中所述抗體包含： (a)與SEQ ID NO :50具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約 98%序列同一性的多肽；和/或（b)與SEQ ID NO :13具有至少約80%、至少約85%、至少 約90%、至少約95%或至少約98%序列同一性的多肽。因此，在特定實(shí)施方式中，所述抗體 包含（a)與SEQ ID NO :50具有至少約95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或（b)與SEQ ID NO :13具有至少約95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在特定實(shí)施方式中，所述抗體包含： (a)包含SEQ ID NO :50的多肽（例如，重鏈可變區(qū)）；和/或（b)包含SEQ ID NO :13的多 肽（例如，輕鏈可變區(qū)）。
[0200] 在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑是可以接到補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性或抗體依賴性細(xì) 胞的細(xì)胞毒性從而殺死表達(dá)靶抗原的腫瘤的抗體。在某些替代性實(shí)施方式中，所述抗體與 毒素或放射性同位素直接綴合從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺死。另外，腫瘤存活取決于新血管化形 成，并且在特定實(shí)施方式中，所述抗體具有抗血管發(fā)生效果。
[0201] 本發(fā)明提供針對(duì)諸如人類Notch2和/或Notch3等Notch受體的分離的抗體。所 述抗體或抗體片段可以是特異性識(shí)別所述Notch受體的任何單克隆抗體或多克隆抗體。在 某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與本文所述Notch受體特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。 在某些實(shí)施方式中，所述單克隆抗體或其片段是與本文所述的Notch受體的胞外域特異性 結(jié)合的嵌合抗體或人源化抗體。在其它實(shí)施方式中，所述單克隆抗體或其片段是與本文所 述的Notch受體的胞外域特異性結(jié)合的人類抗體。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是IgGl或 IgG2抗體。
[0202] 發(fā)現(xiàn)針對(duì)Notch受體的抗體可用于本文所述的實(shí)驗(yàn)、診斷和治療方法。在特定實(shí) 施方式中，使用本發(fā)明的抗體來檢測生物樣品中Notch受體的表達(dá)，所述生物樣品例如患 者組織活檢物、胸腔積液或血液樣品?？梢詫?duì)組織活檢物進(jìn)行切片并且使用例如免疫熒光 或免疫組織化學(xué)法檢測蛋白。作為選擇，分離來自樣品的個(gè)體細(xì)胞，并通過FACS分析在固 定細(xì)胞或活細(xì)胞上檢測蛋白表達(dá)。另外，可以在蛋白陣列上使用所述抗體來檢測例如腫瘤 細(xì)胞上、細(xì)胞裂解物中或其它蛋白樣品中的Notch受體的表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，在體 外基于細(xì)胞的檢測中或在體內(nèi)動(dòng)物模型中，通過使腫瘤細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，從而使 用本發(fā)明的抗體來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。在其它實(shí)施方式中，通過施用治療有效量的針對(duì) Notch受體的抗體，從而使用所述抗體來治療人類患者中的癌。
[0203] 可以通過任何已知方法制備多克隆抗體。通過用相關(guān)抗原（經(jīng)純化的肽片段、全 長重組蛋白、融合蛋白等）的多次皮下或腹膜內(nèi)注射對(duì)動(dòng)物（例如兔、大鼠、小鼠、羊、驢等） 進(jìn)行免疫來產(chǎn)生多克隆抗體，所述相關(guān)抗原可選地與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)、血清白蛋白等綴 合、稀釋于無菌鹽水并與佐劑（例如完全或不完全弗氏佐劑）組合以形成穩(wěn)定的乳液。然 后從如此免疫的動(dòng)物的血液和腹水等中回收多克隆抗體。使收集的血液凝固，潷析血清，通 過離心使其澄清，并且測定抗體滴度。可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從血清或腹水中純化多 克隆抗體，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳、透析等。
[0204] 使用雜交瘤方法制備單克隆抗體，所述雜交瘤方法例如Kohler和Milstein, 1975，Nature 256:495中所述的方法。使用所述雜交瘤方法，如上所述對(duì)小鼠、倉鼠或其它 合適的宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫，從而引起淋巴細(xì)胞產(chǎn)生會(huì)與免疫抗原特異性結(jié)合的抗體。作為 選擇，可以在體外對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫。免疫后，分離淋巴細(xì)胞，并使用例如聚乙二醇將其 與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞，然后將該雜交瘤細(xì)胞從未融合的淋巴 細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中選擇出。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，Academic Press，1986)進(jìn)行體外培養(yǎng)或在動(dòng)物中體內(nèi)地作為 腹水腫瘤使產(chǎn)生特異性針對(duì)所選擇抗原的單克隆抗體的雜交瘤增殖，所述所選擇抗原通過 免疫沉淀、免疫印跡，或通過諸如放射免疫檢測（RIA)或酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA)等體外 結(jié)合檢測確定。然后可以按照關(guān)于以上多克隆抗體所述從培養(yǎng)基或腹水流體中對(duì)單克隆抗 體進(jìn)行純化。
[0205] 作為選擇還可以使用美國專利第4, 816, 567號(hào)中所述的重組DNA方法制備單克隆 抗體。例如通過RT-PCR使用特異性擴(kuò)增編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引 物，從成熟B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞中分離編碼單克隆抗體的多核苷酸，并且使用常規(guī)方法確 定其序列。然后將編碼重鏈和輕鏈的分離的多核苷酸克隆到合適的表達(dá)載體中，當(dāng)其被轉(zhuǎn) 染到宿主細(xì)胞中時(shí)就在宿主細(xì)胞中表達(dá)單克隆抗體，所述宿主細(xì)胞未被轉(zhuǎn)染時(shí)就不產(chǎn)生免 疫球蛋白，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。另外， 例如如本文所述，可以從噬菌體展示文庫中分離所需物種的重組單克隆抗體或其片段。
[0206] 可以使用重組DNA技術(shù)以多種不同的方式對(duì)編碼單克隆抗體的多核苷酸進(jìn)行進(jìn) 一步修飾，從而產(chǎn)生替代性的抗體。在某些實(shí)施方式中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈 的恒定域可以被：1)被例如人類抗體的那些區(qū)域取代從而產(chǎn)生嵌合抗體或2)被非免疫球 蛋白多肽取代從而產(chǎn)生融合抗體。在其它實(shí)施方式中，將所述恒定區(qū)截短或除去從而產(chǎn)生 單克隆抗體的所需抗體片段。另外，可使用可變區(qū)的定點(diǎn)突變或高密度突變發(fā)生來優(yōu)化單 克隆抗體的特異性、親和性等。
[0207] 通常而言，可以從任何抗體獲得或衍生出可用于本發(fā)明的修飾抗體。另外，用于產(chǎn) 生所述經(jīng)修飾抗體的親本抗體或前體抗體，或其片段，可以是鼠類的、人類的、嵌合的、人源 化的、非人靈長類的或靈長源化的。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體可以包括具有 本文所述的經(jīng)改變的恒定域的單鏈抗體構(gòu)建體（例如美國專利第5, 892, 019號(hào)中公開的， 通過參考將其并入本文）。因此，根據(jù)本文教導(dǎo)修飾的這些類型抗體中的任何抗體都與本發(fā) 明相容。
[0208] 根據(jù)本發(fā)明，使技術(shù)適于生產(chǎn)對(duì)本發(fā)明的多肽具有特異性的單鏈抗體（參見美國 專利第4, 946,778號(hào)）。另外，可使方法適于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫（Huse等，1989，Science, 246 :1275-1281)，從而允許快速有效地鑒定對(duì)Notch或其衍生物、片段、類似物或同源物具 有所需特異性的單克隆Fab片段。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)生產(chǎn)含有對(duì)本發(fā)明多肽是獨(dú)特型的 抗體片段，所述片段包括，但不限于：（a)通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab'） 2片段； (b)通過還原F(ab'）2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段；（c)通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理 抗體分子產(chǎn)生的Fab片段，和（d)Fv片段。
[0209] 雙特異性抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同抗原 (或，在特定實(shí)施方式中，對(duì)同一抗原上的至少兩個(gè)不同表位）具有結(jié)合特異性的單克隆 抗體，優(yōu)選是人類或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一針對(duì)本發(fā)明的抗原性多肽 (Notch，或其片段），而第二結(jié)合靶標(biāo)是任何其它抗原，并且有利地是細(xì)胞表面蛋白，或受體 或受體亞基。還提供包含特異性結(jié)合一種人類Notch受體（例如，Notch2)的一個(gè)抗原結(jié) 合位點(diǎn)并且還包含特異性結(jié)合第二人類Notch受體（例如，Notch3)的第二個(gè)不同的抗原 結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體。
[0210] 本領(lǐng)域已知制備雙特異性抗體的方法。常規(guī)上雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于 兩個(gè)免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩個(gè)重鏈具有不同的特異性（Milstein和 Cuello, Nature 1983,305:537-539)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交 瘤（四源雜交瘤）產(chǎn)生十種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性 結(jié)構(gòu)。通常通過親和色譜實(shí)現(xiàn)對(duì)正確分子的純化。
[0211] 作為選擇，在特定實(shí)施方式中，本文所述抗體可以是單特異性的。例如，在特定實(shí) 施方式中，抗體含有的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)中的每個(gè)都結(jié)合或能夠結(jié)合相同的一種或 多種人類Notch受體（例如，Notch2、Notch3、或在Notch2和Notch3上的同源性表位）。 在特定實(shí)施方式中，本文所述的單特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合或能夠結(jié)合人類Notch3 的EGF重復(fù)9和Notch2的EGF重復(fù)10。
[0212] 可以將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合物 具有免疫球蛋白重鏈恒定域，包括至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的 第一重鏈恒定區(qū)（CHl)可以存在于至少一個(gè)融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和如 果需要的話，免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入到單獨(dú)的表達(dá)載體中，并將其共轉(zhuǎn)染到合適的宿 主生物體中。在Suresh等，1986，Methods in Enzymology，121:210中可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生雙特 異性抗體的更詳細(xì)描述。
[0213] 可以將雙特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段。在該文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了用 于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以使用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體。另 夕卜，Brennan等，1985, Science，229 :81描述了其中將完整抗體進(jìn)行蛋白水解切割以產(chǎn)生 F(ab'）2片段的步驟。
[0214] 另外，可以直接從大腸桿菌回收Fab'片段，并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性 抗體（Shalaby等，J. Exp. Med. 1992,175 :217-225)。這些方法可用于生產(chǎn)全長人源化雙特 異性抗體F (ab'）2分子。
[0215] 還涉及具有超過兩價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體（Tutt等，1991， J. Immunol. 147 :60) 〇
[0216] 示例性的雙特異性抗體可以與兩個(gè)不同的表位結(jié)合，其中至少一個(gè)表位源自本發(fā) 明的多肽。作為選擇，免疫球蛋白分子的抗-抗原性臂可以與可結(jié)合位于白細(xì)胞上的觸發(fā) 分子的臂組合，從而將細(xì)胞防御機(jī)制集中到表達(dá)特定抗原的細(xì)胞，所述觸發(fā)分子例如T細(xì) 胞受體分子（例如⑶2、⑶3、⑶28或B7)，或IgG的Fc受體。還可使用雙特異性抗體來將 細(xì)胞毒性劑導(dǎo)向表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。這些抗體擁有抗原結(jié)合臂和結(jié)合諸如E0TUBE、DPTA、 DOTA或TETA等細(xì)胞毒性劑或放射性核素螯合劑的臂。
[0217] 異源偶聯(lián)抗體（Heteroconjugate antibody)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異源偶聯(lián) 抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體組成。例如，已經(jīng)提出所述抗體可使免疫細(xì)胞靶向不想要的細(xì) 胞（美國專利4, 676, 980)。設(shè)想的是可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法在體外制備所 述抗體，所述合成蛋白質(zhì)化學(xué)包括涉及交聯(lián)劑的合成蛋白質(zhì)化學(xué)。例如，可以利用二硫鍵交 換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑的實(shí)例包括亞氨基硫醇 鹽（或酯）（iminothiolate)和甲基-4-巰基丁亞氨酸鹽（或酯）。
[0218] 為了本發(fā)明的目的，應(yīng)該意識(shí)到經(jīng)修飾抗體可以包括任何類型的可變區(qū)，所述可 變區(qū)提供所述抗體與Notch多肽的結(jié)合。在這點(diǎn)上，所述可變區(qū)可以包括或源自任何類型 的哺乳動(dòng)物，可以誘導(dǎo)所述哺乳動(dòng)物發(fā)動(dòng)體液應(yīng)答和產(chǎn)生針對(duì)所需腫瘤相關(guān)抗原的免疫球 蛋白。因此，經(jīng)修飾抗體的可變區(qū)可以是例如人類、鼠類、非人靈長類（如食蟹猴、彌猴等） 或狼來源。在某些實(shí)施方式中經(jīng)修飾免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)是人類的。在其它實(shí)施 方式中，可以對(duì)相容性抗體的可變區(qū)（通常源自非人類來源）進(jìn)行工程化或特異性剪裁，從 而改善結(jié)合性質(zhì)或減少所述分子的免疫原性。在這點(diǎn)上，可以對(duì)本發(fā)明所用的可變區(qū)進(jìn)行 人源化，或通過包含所引入的氨基酸序列而進(jìn)行改變。
[0219] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，針對(duì)Notch受體的單克隆抗體是人源化抗體。人源 化抗體是在可變區(qū)內(nèi)含有來自非人類（例如鼠類）抗體的最小序列的抗體。當(dāng)對(duì)人類受試 對(duì)象施用所述抗體時(shí)，治療學(xué)上使用所述抗體來減少免疫原性和HAM (人抗鼠抗體）應(yīng)答。 實(shí)際上，人源化抗體通常是具有最小非人類序列至不含非人類序列的人類抗體。人類抗體 是由人類產(chǎn)生的抗體或具有與由人類產(chǎn)生的抗體相應(yīng)的氨基酸序列的抗體。
[0220] 可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)生產(chǎn)人源化抗體?？梢酝ㄟ^用具有所需特異性、 親和性和/或能力的非人類抗體（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）的CDR取代人類抗體的CDR 而使抗體人源化（Jones 等，1986, Nature，321 :522-525 ;Riechmann 等，1988, Nature，332 : 323-327 ;Verhoeyen 等，1988, Science，239 :1534-1536)?？梢酝ㄟ^在 Fv 框架區(qū)中和 / 或 在已置換的非人類殘基內(nèi)取代另外的殘基而進(jìn)一步對(duì)所述人源化抗體進(jìn)行修飾，從而改善 和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。
[0221] 作為人源化的替代性方案，可以產(chǎn)生人類抗體?？梢允褂冒ㄞD(zhuǎn)基因動(dòng)物、噬菌體 文庫和體外活化的人類B細(xì)胞在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備人類抗體。
[0222] 例如，可以生產(chǎn)含有人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（例如小鼠），當(dāng)免疫 時(shí)，在不存在內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生下所述人類免疫球蛋白基因座能夠產(chǎn)生全部指令集 (repertoire)的人類抗體。例如，已經(jīng)描述了在嵌合的種系突變小鼠中使抗體重鏈連接區(qū) (J h)基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn) 移到所述種系突變小鼠中會(huì)導(dǎo)致當(dāng)抗原挑戰(zhàn)時(shí)人類抗體的產(chǎn)生。參見，例如，Jakobovits 等，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90 :2551 Jakobovits 等，1993, Nature，362 :255-258 ; Bruggemann 等，1993, Year in Iminuno. 7 :33 ;美國專利第 5, 545, 806 ;第 5, 569, 825 號(hào)；第 5, 591，669 號(hào)；第 5, 545, 807 號(hào)；第 5, 545, 807 號(hào)；第 5, 625, 126 號(hào)；第 5, 633, 425 號(hào)和 WO 97/17852。
[0223] 作為選擇，可以使用噬菌體展示技術(shù)來體外從來自未經(jīng)免疫供體的免疫球蛋白可 變（V)域基因指令集（repertoire)中生產(chǎn)人類抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V域 基因在框架內(nèi)克隆到諸如M13或fd等絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中，并且作為 功能抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷 貝，基于抗體的功能性質(zhì)的選擇還導(dǎo)致編碼展示這些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。因此，該噬 菌體模擬B細(xì)胞的某些性質(zhì)?？梢砸愿鞣N形式進(jìn)行噬菌體展示。對(duì)于噬菌體展示可使用幾 種來源的V-基因區(qū)段。已經(jīng)從源自經(jīng)免疫小鼠的脾的V基因的小隨機(jī)組合文庫中分離出抗 噁唑酮抗體的各種陣列?？梢詷?gòu)建來自未經(jīng)免疫人類供體的V基因的指令集，并且可以分 離針對(duì)抗原（包括自體抗原）的各種陣列的抗體。從表達(dá)人類抗體的噬菌體文庫選擇人類 抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的（Vaughan等，1996, Nature Biotechnology 14:309-314; Sheets 等，1998, PNAS 95 :6157-6162 ;Hoogenboom 和 Winter，1991，J. Mol. Biol. 227 :381 ; McCafferty 等，1990, Nature348 :552-554 ;Clackson 等，1991，Nature 352 :624-628 ;和 Marks等，1991，J. Mol. Biol.，222 :581-597)。用于產(chǎn)生和使用抗體噬菌體文庫的技術(shù)還 描述于美國專利第5, 969, 108號(hào)；第6, 172, 197號(hào)；第5, 885, 793號(hào)；第6, 521，404號(hào)；第 6, 544, 731 號(hào)；第 6, 555, 313 號(hào)；第 6, 582, 915 號(hào)；第 6, 593, 081 號(hào)；第 6, 300, 064 號(hào)；第 6, 653, 068 號(hào)；第 6, 706, 484 ;和第 7, 264, 963 號(hào)；以及 Rothe 等，2008, J. Mol. Bio. 376 : 1182-1200(通過參考并入每一篇的全文）。諸如鏈改組等親和熟化策略（Marks等，1992， 81〇八〇(*11〇1(^ 7 10:779-783，通過參考并入其全文）是本領(lǐng)域已知的，并且可用于產(chǎn)生高 親和性人類抗體。
[0224] 可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)直接制備人類抗體?？梢援a(chǎn)生體外免疫的或分離 自經(jīng)免疫個(gè)體的永生化人B淋巴細(xì)胞,所述經(jīng)免疫個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)祀抗原的抗體（參見,例 如，Cole 等，1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第 77 頁； Boemer 等，1991，J. Immunol. ,147(1)86-95 ;和美國專利第 5, 750, 373 號(hào)；第 5, 567, 610 號(hào)； 和第 5, 229, 275 號(hào)）。
[0225] 應(yīng)該意識(shí)到將整個(gè)非人類可變域移植到人類恒定區(qū)會(huì)產(chǎn)生"經(jīng)典"嵌合抗體。在本 申請(qǐng)的情況中，術(shù)語"嵌合抗體"用來指其中免疫反應(yīng)區(qū)或位點(diǎn)獲自或源自第一物種，并且 恒定區(qū)（根據(jù)本發(fā)明其可以是完整、部分或經(jīng)修飾的）獲自第二物種的任何抗體。在某些 實(shí)施方式中，抗原結(jié)合區(qū)或位點(diǎn)會(huì)來自非人類來源（例如小鼠），并且恒定區(qū)是人類的。雖 然可變區(qū)的免疫原性特異性通常不受其來源影響，與來自非人類來源的恒定區(qū)相比，人類 恒定區(qū)更不可能引發(fā)人類受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
[0226] 通過至少部分置換一個(gè)或多個(gè)⑶R，以及必要時(shí)通過部分框架區(qū)置換和序列改變， 可改變重鏈和輕鏈中的可變區(qū)。雖然所述CDR可以源自與框架區(qū)所源自的抗體相同類別或 甚至相同亞類的抗體，可以設(shè)想所述CDR源自不同類別的抗體，并且優(yōu)選源自不同物種的 抗體。必須強(qiáng)調(diào)為了將一個(gè)可變域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移到另一個(gè)可變域，不需要將全部CDR 用來自供體可變區(qū)的完整CDR置換。相反，可以僅需要轉(zhuǎn)移對(duì)于維持抗原結(jié)合位點(diǎn)活性所 必需的那些殘基。根據(jù)美國專利第5, 585, 089號(hào)、第5, 693, 761號(hào)和第5, 693, 762號(hào)中提 出的解釋，在本領(lǐng)域內(nèi)可以很好地通過進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)或通過試錯(cuò)試驗(yàn)以獲得免疫原性降低 的功能抗體。
[0227] 雖然對(duì)可變區(qū)進(jìn)行了改變，但應(yīng)該意識(shí)到本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體會(huì)包含下述抗體或 其免疫反應(yīng)性片段：其中一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分已經(jīng)缺失或改變從而提供 所需生化和/或生物學(xué)特性，例如當(dāng)與包含天然或未經(jīng)改變恒定區(qū)的免疫原性近似相同的 抗體相比，腫瘤定位增加或血清半衰期減少。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體的恒定區(qū)會(huì)包 含人類恒定區(qū)。與本發(fā)明相容的對(duì)恒定區(qū)的修飾包括在一個(gè)或多個(gè)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸的添加、缺失或取代。即，本文所述的經(jīng)修飾抗體可以包含對(duì)三個(gè)重鏈恒定區(qū)（CH1、CH2 或CH3)和/或輕鏈恒定區(qū)（CL)中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行改變或修飾。在本發(fā)明的某些實(shí)施方 式中涉及其中一個(gè)或多個(gè)域部分或完全缺失的經(jīng)修飾恒定區(qū)。在其它實(shí)施方式中經(jīng)修飾抗 體會(huì)包含其中除去整個(gè)CH2域的域缺失構(gòu)建體或變體（△ CH2構(gòu)建體）。在其它實(shí)施方式中 省略的恒定區(qū)域會(huì)被短的氨基酸間隔子（例如10個(gè)殘基）置換，所述間隔子提供通常由缺 少的恒定區(qū)賦予的某些分子柔性。
[0228] 除了其構(gòu)造之外，本領(lǐng)域已知恒定區(qū)介導(dǎo)幾種效應(yīng)子功能。例如，補(bǔ)體的Cl組分 與抗體的結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的激活在細(xì)胞病原體的調(diào)理作用和裂解中是重要的。補(bǔ) 體的激活還刺激炎性反應(yīng)，并且還可以涉及自體免疫超敏性。另外，抗體經(jīng)由Fc區(qū)與細(xì)胞 結(jié)合，伴隨著位于抗體Fc區(qū)上的Fc受體位點(diǎn)與位于細(xì)胞上的Fc受體（FcR)結(jié)合。存在許 多對(duì)不同種類的抗體具有特異性的Fc受體，包括IgGO受體）、IgE(ε受體）、IgA(a受 體）和IgM( μ受體）。抗體與位于細(xì)胞表面上Fc受體的結(jié)合觸發(fā)許多重要的各種生物應(yīng) 答，包括抗體包被顆粒的內(nèi)吞和破壞、免疫復(fù)合物的清除、抗體包被靶細(xì)胞被殺傷細(xì)胞裂解 (稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或ADCC)、炎癥介體的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移和免疫球蛋 白產(chǎn)生的控制。雖然已經(jīng)對(duì)各種Fc受體和受體位點(diǎn)研究到一定程度，關(guān)于其定位、結(jié)構(gòu)和 功能仍然存在許多未知。
[0229] 雖然不限制本發(fā)明的范圍，據(jù)信包含本文所述進(jìn)行修飾的恒定區(qū)的抗體提供經(jīng)改 變的效應(yīng)子功能，這進(jìn)而影響所施用抗體的生物特征。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活 (通過點(diǎn)突變或其它方式）可以減少Fc受體與循環(huán)的經(jīng)修飾抗體的結(jié)合，由此增加腫瘤定 位。在其它情況下，可以的是，與本發(fā)明相容的恒定區(qū)修飾緩和補(bǔ)體結(jié)合并且由此減少血清 半衰期和綴合細(xì)胞毒素的非特異性結(jié)合。還可使用恒定區(qū)的其它修飾來消除雙硫鍵或寡糖 基團(tuán)，從而由于抗原特異性或抗體柔性增加而增強(qiáng)定位。類似地，使用眾所周知的生化或分 子生物工程化技術(shù)可以容易地進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明對(duì)恒定區(qū)的修飾。
[0230] 應(yīng)該注意可以對(duì)經(jīng)修飾抗體進(jìn)行工程化以將CH3域直接融合到各經(jīng)修飾抗體的 鉸鏈區(qū)。在其它構(gòu)建體中理想的是在鉸鏈區(qū)和經(jīng)修飾CH2和/或CH3域之間提供肽間隔 子。例如,可以表達(dá)相容性構(gòu)建體,所述構(gòu)建體中CH2域已經(jīng)缺失，并且剩余的CH3域（經(jīng) 修飾或未經(jīng)修飾）與具有5?20個(gè)氨基酸的間隔子的鉸鏈區(qū)結(jié)合。例如，可以添加所述間 隔子，從而確保恒定域的調(diào)節(jié)元件保持自由并且是可接觸的，或確保鉸鏈區(qū)保持柔性。但 是，應(yīng)該注意在某些情況下，可以證明氨基酸間隔子具有免疫原性，并且引發(fā)不想要的針對(duì) 所述構(gòu)建體的免疫應(yīng)答。因此，如果可以維持經(jīng)修飾抗體的所需生化和/或生物學(xué)質(zhì)量，則 向構(gòu)建體添加的任何間隔子應(yīng)是相對(duì)非免疫原性的，甚至可以一起省略。
[0231] 除了缺失整個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域之外，應(yīng)意識(shí)到可以通過幾個(gè)甚至單個(gè)氨基酸的部分 缺失或取代來提供本發(fā)明的抗體。例如，在CH2域的所選區(qū)域中單個(gè)氨基酸的突變可能足 以實(shí)質(zhì)地減少Fc結(jié)合并由此增加腫瘤定位。類似地，理想的是可簡單地缺失一個(gè)或多個(gè)控 制待調(diào)節(jié)的效應(yīng)子功能（例如補(bǔ)體Clq結(jié)合）的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的部分。恒定區(qū)的所述部分 缺失可以改善抗體的所選特性（血清半衰期），同時(shí)使與受試對(duì)象恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域有關(guān)的其 它所需功能保持完整。另外，如上所述，可以通過增強(qiáng)所得構(gòu)建體性質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸 的突變或取代而對(duì)所公開抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾。在這點(diǎn)上，可以破壞由保守結(jié)合位點(diǎn)提 供的活性（例如Fc結(jié)合），同時(shí)基本上保持經(jīng)修飾抗體的構(gòu)造和免疫原性特征。其它實(shí)施 方式還包括將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到恒定區(qū)，從而增強(qiáng)諸如效應(yīng)子功能等所需特性或提 供更多的細(xì)胞毒素或糖類粘附。在所述實(shí)施方式中可以期望插入或復(fù)制源自所選恒定區(qū)結(jié) 構(gòu)域的特異性序列。
[0232] 本發(fā)明還包含特異性識(shí)別Notch受體的雙特異性抗體。雙特異性抗體是能夠特 異性識(shí)別和結(jié)合至少兩個(gè)不同表位的抗體。不同的表位可以位于同一分子（例如同一 Notch受體多肽）內(nèi)或位于不同的分子上。例如所述抗體可以特異性識(shí)別和結(jié)合Notch受 體，以及，例如1)白細(xì)胞上的效應(yīng)分子，例如T細(xì)胞受體（如CD3)或Fc受體（如CD64、 CD32或CD 16)或2)本文詳細(xì)描述的細(xì)胞毒性劑。雙特異性抗體可以是完整抗體或抗體 片段。用于制備雙特異性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域常見的（Millstein等，1983, Nature, 305: 537-539 ;Brennan 等，1985,Science，229 :81 ;Suresh等，1986，Methods in Enzymol.，121 : 120 Jraunecker 等，1991，EMBO J.，10 :3655-3659 ;Shalaby 等，1992, J. Exp. Med.，175 : 217-225 ;Kostelny 等，1992，J. Tmmunol. , 148 :1547-1553 ;Gruber 等，1994，J. Tmmunol., 152 :5368 ;和美國專利第5, 731，168號(hào)）。
[0233] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，可以期望使用抗體片段而不是完整抗體，來例如增 加腫瘤滲透。已知用于生產(chǎn)抗體片段的各種技術(shù)。常規(guī)上，這些片段經(jīng)由蛋白水解消化完整 抗體衍生（例如 Morimoto 等，1993，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 :107-117和fcennan等，1985, Science，229:81)。但是，現(xiàn)在這些片段通常通過本文所 述的重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。因此Fab、Fv和scFv抗體片段可以都在大腸桿菌或其它宿主 細(xì)胞中表達(dá)和分泌，從而允許生產(chǎn)大量的這些片段。作為選擇，可以從本文討論的抗體噬菌 體文庫中分離所述抗體片段。所述抗體片段還可以例如是美國專利第5, 641，870號(hào)中所述 的線性抗體，并且可以是單特異性或雙特異性的。用于生產(chǎn)抗體片段的其它技術(shù)是顯而易 見的。
[0234] 特別在抗體片段的情況下，還可以期望對(duì)抗體進(jìn)行修飾從而增加其血清半衰 期。這可以通過下述方式實(shí)現(xiàn)：例如通過在抗體片段中合適區(qū)域的突變從而將補(bǔ)救受體 (salvage receptor)結(jié)合表位引入到抗體片段中，或通過將所述表位引入到肽標(biāo)簽中，然 后所述肽標(biāo)簽與在任一端或在中間的抗體片段融合（例如通過DNA或肽合成）。
[0235] 本發(fā)明還包括與本文提出的嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體，或其抗體片段基 本上同源的變體或等效物。這些可以含有例如，保守性取代突變，即一個(gè)或多個(gè)氨基酸被類 似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指氨基酸被同一總種類的另一氨基酸取代，例如，一 個(gè)酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一個(gè)堿性氨基酸被另一堿性氨基酸取代或一個(gè)中性 氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守性氨基酸取代所指含義是本領(lǐng)域眾所周知的。
[0236] 本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒性劑綴合的免疫綴合物。細(xì)胞毒性劑包括化學(xué)治療 齊U、生長抑制劑、毒素（例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶促活性毒素，或其片段）、放射 性同位素（即放射綴合物）等。用于產(chǎn)生此類免疫綴合物的化學(xué)治療劑包括，例如，氨甲 蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法侖、絲裂霉素 C、苯丁酸氮芥、道諾紅菌素或其它嵌入劑。可以 使用的酶促活性毒素和其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈、蓖 麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-八疊球菌素、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美國商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜（Momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒素、巴豆毒素、肥阜草（Sapaonaria officinalis)抑制劑、白 樹毒素、有絲分裂毒素（mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和新月毒素?？梢允?用各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑制備抗體和細(xì)胞毒性劑的綴合物，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑例如 N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代）丙酸酯（STOP)、亞氨基硫烷（IT)、亞氨酸酯的雙官能 衍生物（例如二甲基己二亞氨酯HCL)、活性酯（例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯）、醛（例如戊 二醛）、雙疊氮化合物（例如雙（對(duì)疊氮苯甲酰）己二胺）、雙重氮基衍生物（例如雙（對(duì) 重氮苯甲酰）_乙二胺）、二異氰酸酯（例如亞甲苯2, 6-二異氰酸酯）和雙活性氟化合物 (例如1，5-二氟-2, 4-二硝基苯）。還可以使用抗體與一種或多種小分子毒素的綴合物， 所述小分子毒素例如加利車霉素、美登醇、單端孢霉烯（trichothene)和CC1065,以及具有 毒素活性的這些毒素的衍生物。
[0237] 綴合抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體組成。例如，已經(jīng)提出所述抗體可使免疫細(xì)胞靶 向不想要的細(xì)胞（美國專利4, 676, 980)。設(shè)想的是可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法 在體外制備所述抗體，所述合成蛋白質(zhì)化學(xué)包括涉及交聯(lián)劑的合成蛋白質(zhì)化學(xué)。例如，可以 利用二硫鍵交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑的實(shí)例包 括亞氨基硫醇鹽（或酯）（iminothiolate)和甲基-4-巰基丁亞氨酸鹽（或酯）。
[0238] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體含有人類Fc區(qū)，所述人類Fc區(qū)經(jīng)修飾以增強(qiáng) 效應(yīng)子功能，例如抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (⑶C)。這可以通過在所述抗體的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代來實(shí)現(xiàn)。例如，將半胱 氨酸殘基引入Fc區(qū)從而可在該區(qū)鏈內(nèi)形成二硫鍵，從而改善補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺死和抗體 依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性（ADCC) (Caron 等，1992, J. Exp Med. 176 :1191-1195 ;Shopes，1992， Immunol. 148 :2918-2922)。還可以使用如 Wolff 等，1993，Cancer Research 53 :2560-2565 中所述的異雙功能交聯(lián)劑制備具有增強(qiáng)抗腫瘤活性的同型二聚抗體。作為選擇，可以工程 化具有雙 Fc 區(qū)的抗體（Stevenson 等，1989, Anti-Cancer Drug Design 3 :219-230)。
[0239] 無論如何獲得可用量，本發(fā)明的抗體可以以許多綴合（即免疫綴合物）或未綴合 形式中的任一種使用。本發(fā)明抗體可以以未綴合或"裸"形式使用，從而利用受試對(duì)象的天 然防御機(jī)制以消除惡性細(xì)胞，所述天然防御機(jī)制包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和抗體依 賴性細(xì)胞毒性（ADCC)。在某些實(shí)施方式中，可以使用許多眾所周知的螯合劑或直接標(biāo)記法 使所述抗體與放射性同位素綴合，所述放射性同位素包括但不限于 9°Y、125I、131I、123I、mIn、 21如、1(15肋、1535111、67〇1、^1、 166!1〇、1771^，1861^和1881^等。在其它實(shí)施方式中，所公開的組合物 可以包含與藥物、前藥、或生物應(yīng)答修飾劑如氨甲蝶呤、阿霉素，和諸如干擾素等淋巴因子 偶聯(lián)的抗體。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括使用與諸如蓖麻毒蛋白或白喉毒素等特定生物毒 素綴合的抗體。在其它實(shí)施方式中經(jīng)修飾抗體可以與其它免疫活性配體（例如抗體或其片 段）絡(luò)合，其中所得分子與瘤細(xì)胞和諸如T細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞都結(jié)合。選擇何種綴合或未綴 合的經(jīng)修飾抗體來使用取決于癌的種類和階段、附加治療（例如化學(xué)治療或外部輻射）的 使用和患者情況。應(yīng)該意識(shí)到，根據(jù)本文的教導(dǎo)能夠容易地進(jìn)行所述選擇。
[0240] 抗Notch抗體的制備和表征還教導(dǎo)于例如美國專利申請(qǐng)公開第2008/0131434號(hào)， 本文通過參考并入其全文。
[0241] 在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑為不是抗體的多肽。本領(lǐng)域已 知用于鑒定和生產(chǎn)與蛋白靶標(biāo)高親和性地結(jié)合的非抗體多肽的各種方法。參見，例如， Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol, 18 :295-304 ;Hosse 等，2006, Protein Science, 15 : 14-27 ;Gill 等，2006, Curr. Opin. Biotechnol，17 :653-658 ;Nygren，2008, FEBSJ.，275 : 2668-76 ;和Skerra，2008, FEBS J.，275 :2677-83,本文通過參考并入每一篇的全文。在特 定實(shí)施方式中，已經(jīng)使用噬菌體展示技術(shù)來鑒定/生產(chǎn)所述Notch結(jié)合多肽。在特定實(shí)施 方式中，所述多肽包含種類是選自由蛋白A、脂鈣蛋白（Iipocalin)、纖連蛋白域、錨蛋白通 用重復(fù)域和硫氧還蛋白組成的組中的蛋白支架。
[0242] 在某些實(shí)施方式中，所述試劑是非蛋白分子。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是小 分子。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言用于鑒定非蛋白Notch結(jié)合劑的組合化學(xué)文庫和技術(shù)是已 知的。參見，例如，Kennedy 等，2008, J. Comb. Chem.，10 :345-354 ;Dolle 等，2007, J. Comb. Chem.，9 :855-902 ;和 Bhattacharyya，2001，Curr.Med. Chem.，8 :1383-404,本文通過參考 并入每一篇的全文。在其它特定實(shí)施方式中，所述試劑是糖類、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚 糖。
[0243] 在特定實(shí)施方式中，所述試劑是核酸適體。適體是基于其與另一分子結(jié)合的能力 而選擇（例如，從隨機(jī)庫或誘變庫中選擇）的多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述適體 包含DNA多核苷酸。在某些替代性實(shí)施方式中，所述適體包含RNA多核苷酸。在特定實(shí)施 方式中，所述適體包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核酸殘基。產(chǎn)生和篩選與蛋白結(jié)合的核酸適體 的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，美國專利第5, 270, 163 ;5, 683, 867 ;5, 763, 595 ; 6, 344, 321 ;7, 368, 236 ;5, 582, 981 ;5, 756, 291 ;5, 840, 867 ;7, 312, 325 ;和 7, 329, 742 號(hào)；國際專利公開W002/077262 ;W003/070984 ;美國專利申請(qǐng)公開第2005/0239134 ; 2005/0124565 ;和2008/0227735號(hào)，本文通過參考并入每一篇的全文。
[0244] 可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測本發(fā)明抗體的免疫特異性結(jié)合?？梢允褂?的免疫檢測包括，但不限于使用下述技術(shù)的競爭性和非競爭性檢測系統(tǒng)：如Biacore分析、 FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡分析、放射免疫檢測、ELISA、"夾心"免疫 檢測、免疫沉淀檢測、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散檢測、凝集檢測、補(bǔ)體固 定檢測、免疫放射度檢測、熒光免疫檢測和蛋白A免疫檢測。所述檢測在本領(lǐng)域中是常規(guī)的 并且是眾所周知的（參見，例如 Ausubel 等，eds，1994, Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York,本文通過參考并入其全文）。
[0245] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，使用ELISA確定針對(duì)Notch受體的抗體的免疫特異 性。ELISA檢測包括：制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔中添加與諸如 酶的底物（例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）等可檢測化合物綴合的針對(duì)Notch受體 的抗體，溫育一段時(shí)間，并且檢測所述抗原的存在。作為選擇，針對(duì)Notch受體的抗體不與 可檢測化合物綴合，而是向所述孔中添加識(shí)別針對(duì)Notch受體的抗體的第二綴合抗體。另 夕卜，代替用抗原包被所述孔的是，可以用針對(duì)Notch受體的抗體包被所述孔，并且在向經(jīng)包 被的孔中添加抗原后添加與可檢測化合物綴合的第二抗體。本領(lǐng)域中已知經(jīng)改編而可以增 加檢出信號(hào)的參數(shù)，并且本領(lǐng)域還已知ELISA的其它變化形式（參見例如Ausubel等，eds， 1994, Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，John ffiley&Sons, Inc., New York at IL 2. I) 〇
[0246] 可以通過競爭結(jié)合檢測確定抗體與Notch受體的結(jié)合親和力和抗體抗原相互作 用的解離率（off-rate)。競爭結(jié)合檢測的一個(gè)實(shí)例是放射免疫檢測，所述放射免疫檢測包 括在增加量的未標(biāo)記抗原的存在下使經(jīng)標(biāo)記抗原（例如 3H或125I)或其片段或變體與目的 抗體一起溫育，然后檢測與經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體?？梢詮母鶕?jù)斯卡恰特作圖分析獲得的 數(shù)據(jù)確定針對(duì)Notch受體的抗體的親和力和結(jié)合解離率。在某些實(shí)施方式中，使用Biacore 動(dòng)力學(xué)分析來確定針對(duì)Notch受體的抗體的結(jié)合速率和解離率。Biacore動(dòng)力學(xué)分析包括 分析抗體與表面上固定有Notch抗原的芯片的結(jié)合和解離。
[0247] 本發(fā)明提供編碼多肽 SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、 54、55、56或57的分離的多核苷酸，以及多核苷酸SEQIDN0:1、3、15、17、47或48。本發(fā) 明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA的形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。 所述DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且如果是單鏈的話，所述DNA可以是編碼鏈或非編碼（反 義）鏈。因此，術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"包括僅含有所述多肽的編碼序列的多核苷酸以 及含有另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與編碼 多肽 SEQ ID NO :2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多核苷酸 雜交的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸與多核苷酸SEQ ID N0:l、3、15、17、47、 48、58、59或60雜交。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。
[0248] 如本文所用，術(shù)語"雜交"或"選擇性雜交"或"特異性雜交"是指當(dāng)特定的核苷 酸序列存在于復(fù)雜混合物（例如，DNA或RNA的文庫）中時(shí)，分子僅與該特定的核苷酸序 列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下結(jié)合或形成雙鏈（duplexing)。參見，例如Andersen (1998)Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag ;Ross (1997年編輯）Nucleic Acid Hybridization ffiley〇
[0249] 如本文所用，短語"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"是指探針或其它多核苷酸與其靶亞序列 (subsequence)或其它互補(bǔ)序列通常以核酸的復(fù)雜混合物形式雜交，但通常不與其它序 列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境下是不同的。較長的序列在 較高的溫度下特異性雜交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中可發(fā)現(xiàn)核酸雜交 的詳盡指南。通常而言，在規(guī)定的離子強(qiáng)度下將嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇成比特定序列的熱熔解溫度 (Tm)低約5°C?KTC。Tm是（在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下）在該溫度下平衡時(shí) 50%的與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針與靶序列雜交時(shí)的溫度（因?yàn)榘行蛄羞^量存在，在Tm下，平衡時(shí) 50%的探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件是pH為7. 0?8. 3時(shí)鹽濃度低于約I. OM鈉離子，通常是 約0· OlM?I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），對(duì)于短探針（例如10?50個(gè)核苷酸）溫度是 至少約30°C，對(duì)于長探針（例如，大于50個(gè)核苷酸）溫度是至少約60°C。還可以添加諸如 甲酰胺等去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)條件。對(duì)于高嚴(yán)謹(jǐn)雜交，陽性信號(hào)是背景的至少兩倍，或背 景雜交的10倍。示例性的高嚴(yán)謹(jǐn)性或嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS， 在42°0溫育或5父33(：和1%303在651：下溫育，在0.2\33(：和0.1%303中于651：下洗 滌。對(duì)于PCR，對(duì)于低嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增溫度通常是約36°C，不過根據(jù)引物長度退火溫度可以是約 32°C?約48°C。對(duì)于高嚴(yán)謹(jǐn)PCR擴(kuò)增，溫度通常是約62°C，不過根據(jù)引物長度和特異性高 嚴(yán)謹(jǐn)退火溫度可以是約50°C?約65°C。用于高嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增和低嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包 括90°C?95°C的變性階段30秒?120秒，退火階段持續(xù)30秒?120秒，以及約72°C延伸 階段1分鐘?2分鐘。
[0250] 本發(fā)明還涉及編碼片段、類似物和衍生物的上文所述多核苷酸的變體。所述多核 苷酸的變體可以是所述多核苷酸的天然存在的等位變體或所述多核苷酸的非天然存在的 變體。
[0251] 如上文指出，所述多核苷酸可以具有編碼序列，所述編碼序列是所公開多肽的編 碼序列的天然存在的等位變體。本領(lǐng)域已知，等位變體是具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺 失或添加的多核苷酸序列的替代形式，其基本上不改變所編碼多肽的功能。
[0252] 本發(fā)明還包括多核苷酸，所述多核苷酸中成熟多肽的編碼序列融合在有助于多肽 表達(dá)和從宿主細(xì)胞分泌的多核苷酸的同一閱讀框中，所述有助于多肽表達(dá)和從宿主細(xì)胞分 泌的多核苷酸例如有前導(dǎo)序列，其充當(dāng)用于控制所述細(xì)胞的多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列。具有 前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白（preprotein)，并且可以使前導(dǎo)序列被宿主細(xì)胞切割，從而形成 所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸還可以編碼蛋白原（proprotein)，所述蛋白原是成熟 蛋白加上另外的5'氨基酸殘基。具有序列原（prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，并使是 蛋白的失活形式。序列原被切割時(shí)，保留活性成熟蛋白。
[0253] 因此，例如，本發(fā)明的多肽可以編碼成熟蛋白，或編碼具有序列原的蛋白，或編碼 同時(shí)具有序列原和前序列（presequence，前導(dǎo)序列）的蛋白。
[0254] 本發(fā)明的多核苷酸還可以具有與標(biāo)記物序列框內(nèi)融合的編碼序列，所述標(biāo)記物序 列允許對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化。例如，所述標(biāo)記物序列可以是PQE-9載體提供的六聚組 氨酸標(biāo)簽，從而在細(xì)菌宿主的情況下提供對(duì)與所述標(biāo)記物融合的成熟多肽的純化?；蚶?， 當(dāng)使用諸如C0S-7細(xì)胞等哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，所述標(biāo)記物序列可以是血凝素（HA)標(biāo)簽。所述 HA標(biāo)簽對(duì)應(yīng)于源自流感病毒血凝素蛋白的表位（Wilson等，1984, Cell 37 :767)。
[0255] 本發(fā)明的另外實(shí)施方式包括分尚的核酸分子，所述核酸分子包含具有與SEQ ID NO :1、3、15、17、47、48、58、59或60具有至少90%同一性、95%同一性和在某些實(shí)施方式中 具有至少96 %、97 %、98 %或99 %同一性的核苷酸序列的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中， 包含具有至少90%同一性、95%同一性和在某些實(shí)施方式中具有至少96%、97%、98%或 99%同一性的核苷酸序列的所述多核苷酸與多核苷酸SEQ ID NO :1、3、15、17、47、48、58、59 或60雜交。在某些實(shí)施方式中，包含具有至少90%同一性、95%同一性和在某些實(shí)施方式 中具有至少96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的所述多核苷酸與多核苷酸SEQ ID NO :58、59或60雜交。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。在某 些實(shí)施方式中，所述多核苷酸與多核苷酸SEQ ID NO :58、59或60在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。 提到具有與參照核苷酸序列具有至少例如95%"同一性"的核苷酸序列的多核苷酸，是指該 多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相似，不同之處在于該多核苷酸序列可以在參照核苷酸 序列的每100個(gè)核苷酸中包括最多5個(gè)點(diǎn)突變。換言之，為了獲得具有與參照核苷酸序列 具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中最多5 %的核苷酸可以缺失或 被其他核苷酸取代，或數(shù)量最多是參照序列中總核苷酸5 %的核苷酸可以插入?yún)⒄招蛄兄小?參照序列的這些突變可以出現(xiàn)在參照核苷酸序列的氨基或羧基末端位置，或這些末端位置 之間的任何地方，單獨(dú)散布在參照序列內(nèi)的核苷酸中，或位于參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連 續(xù)基團(tuán)中。
[0256] 實(shí)際上，常規(guī)上使用諸如Bestfit程序等已知的計(jì)算機(jī)程序可以確定任何特定的 核酸分子是否與參照序列具有特定的百分比序列同一性（例如，與參照序列具有至少約 80%、至少約90 %、至少約95 %或至少約97%序列同一性，或與參照序列具有95%、96%、 97%、98%或 99% 同一性）（Wisconsin Sequence Analysis Package，用于 Unix 的第 8 版 本，Genetics Computer Group, University Research Park,575Science Drive, Madison, WI 53711)。Bestfit 使用 Smith 和 Waterman，1981，Advances in Applied Mathematics 2: 482-489的局部同源性算法，來發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列之間的同源性最佳區(qū)段。當(dāng)然，當(dāng)使用Bestfit 或任何其它序列比對(duì)程序來確定特定序列是否與本發(fā)明的參照序列具有例如95 %同一性 時(shí)，對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，使得在參照核苷酸序列的全長上計(jì)算同一性百分比，并且允許同源性 的空位最多是參照序列中核苷酸總數(shù)的5%。
[0257] 多核苷酸變體可以含有編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)的改變。在某些實(shí)施方式中多核苷 酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽的性質(zhì)或活性。在某些實(shí)施方 式中，由于遺傳編碼的簡并性通過沉默取代而產(chǎn)生核苷酸變體?？梢猿鲇诟鞣N原因生產(chǎn)多 核苷酸變體，從而例如對(duì)特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá)，例如將人類mRNA中的密碼子改變?yōu)橹T 如大腸桿菌等細(xì)菌宿主偏好的密碼子）。
[0258] 本發(fā)明還提供包含靶向Notch受體的拮抗劑（例如，抗體）的藥物組合物。發(fā)現(xiàn) 這些藥物組合物可用于抑制腫瘤細(xì)胞生長和治療人類患者中的癌。
[0259] 通過將本發(fā)明的經(jīng)純化Notch結(jié)合劑或拮抗劑（例如，抗體）與藥學(xué)上可接受的 載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑組合，制備無菌凍干粉磨、水溶液等形式的用于貯存和使用的制 劑（Remington, The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，Mack Publishing, 2000)。合適的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑包括：諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸等無毒緩沖 齊U ;諸如氯化鈉等鹽；諸如抗壞血酸和蛋氨酸等抗氧化劑；防腐劑，如十八烷基二甲基芐基 氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、諸如尼泊金甲酯或尼泊金丙 酯等尼泊金烷基酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚；低分子量多肽（小于約10 個(gè)氨基酸）；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性聚 合物；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸和賴氨酸等氨基酸；諸如單糖、二 糖、葡萄糖、甘露糖、糊精等糖類；諸如EDTA等螯合劑；諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇 等糖；諸如鈉等成鹽對(duì)離子；諸如Zn-蛋白復(fù)合物等金屬復(fù)合物；和/或諸如吐溫或聚乙二 醇（PEG)等非離子表面活性劑。
[0260] 可以以用于局部治療或系統(tǒng)性治療的任何方式施用本發(fā)明的藥物組合物。施用可 以是局部的（例如施用至黏膜，包括陰道遞送和直腸遞送），諸如透皮貼劑、膏劑、洗劑、霜 齊[J、凝膠、滴劑、栓劑、噴劑、液體劑和粉末劑；（例如包括通過噴霧器在內(nèi)的通過吸入或吹 入粉末或氣溶膠；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮）等肺遞送；口服；包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、 腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注等胃腸外遞送；或顱內(nèi)（例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)）施用。
[0261] 治療制劑可以是單位劑量形式。所述制劑包括用于口服、胃腸外或直腸施用或用 于通過吸入施用的片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、水中或非水性介質(zhì)中的溶液或懸浮 液、或栓劑。在諸如片劑等固體組合物中主要活性成分與藥物載體混合。常規(guī)的制片成分 包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠和其它稀釋劑 (例如水），從而形成含有本發(fā)明化合物或其無毒藥學(xué)上可接受的鹽的均勻混合物的固體 預(yù)制劑組合物。然后所述固體預(yù)制劑組合物再分成本文所述種類的單位劑型?？梢詫?duì)該新 型組合物的片劑、丸劑等進(jìn)行包衣或配制，從而提供具有延長作用優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，所述 片劑或丸劑可以包括被外部組分覆蓋的內(nèi)部組分。另外，兩種組分可以通過腸溶層分隔， 所述腸溶層用于抵抗崩解，并且允許內(nèi)部組分完整地通過胃或延遲釋放。對(duì)于所述腸溶層 或包衣可以使用各種材料，所述材料包括許多聚合酸和聚合酸的混合物，所述材料是蟲漆、 十六烷醇和乙酸纖維素。
[0262] 藥物制劑包括與脂質(zhì)體復(fù)合的本發(fā)明的拮抗劑（例如抗體）（Epstein等，1985， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82 :3688 ;Hwang 等，1980, Proc. Natl. · Acad Sci. USA，77 :4030， 和美國專利第4, 485, 045和4, 544, 545號(hào)）。具有延長循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開于美國專利 第5, 013, 556號(hào)?？梢岳弥|(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)生產(chǎn)某些脂質(zhì)體，脂質(zhì)組合物包含磷 脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE)。將脂質(zhì)體通過規(guī)定孔徑的過濾器 擠出，從而產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。
[0263] 還可以將所述拮抗劑（例如，抗體）包埋在微膠囊中。例如根據(jù)Remington's，The Science and Practice of Pharmacy，第 20 版，Mack Publishing(2000)所述，在膠體藥物 遞送系統(tǒng)（例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊）中或在大乳液中分別 通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合，從而制備所述微膠囊，例如羥甲基纖維素或明膠-微膠囊 或聚_(甲基丙烯酸甲酯）微膠囊。
[0264] 另外可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有抗體的由固體疏水性聚合 物制成的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成型物的形式（例如膜或微膠囊）。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括 聚酯、諸如聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇）等水凝膠、聚交酯（美國專利第 3, 773, 919號(hào)），L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、 諸如Lupron D印ot (由乳酸乙醇酸共聚物以及乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球）等可降解 乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸異丁酸酯和聚-D (-)-3-羥基丁酸。
[0265] 在特定實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑以及第二治 療劑。在特定實(shí)施方式中，第二治療劑是抗癌劑和/或抗血管發(fā)生劑。
[0266] 本發(fā)明提供用于使用本文所述Notch受體拮抗劑抑制表達(dá)Notch受體的致瘤性細(xì) 胞的生長或增殖的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括使用任何一種本文所述抗體或 多肽抑制表達(dá)Notch2和/或Notch3受體的致瘤性細(xì)胞的生長。在某些實(shí)施方式中，所述 抑制表達(dá)Notch受體的致瘤性細(xì)胞的生長的方法包括使所述細(xì)胞與針對(duì)Notch受體的拮抗 劑體外接觸。例如，在添加有與Notch2和/或Notch3特異性結(jié)合并且抑制細(xì)胞生長的抗 體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)Notch受體的永生化細(xì)胞系或癌細(xì)胞系?；驈闹T如組織活檢樣、胸 腔積液或血液樣品等患者樣品分離腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤干細(xì)胞，并將其在添加有與Notch2 和/或Notch3特異性結(jié)合并且抑制細(xì)胞生長的抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中， 所述拮抗劑是特異性識(shí)別Notch2和/或Notch3受體的表位的抗體。
[0267] 在某些實(shí)施方式中，所述抑制表達(dá)Notch受體的致瘤性細(xì)胞的生長或增殖的方法 包括使所述細(xì)胞與針對(duì)Notch受體的拮抗劑（例如，Notch2和/或Notch3的拮抗劑）體 內(nèi)接觸。在特定實(shí)施方式中，在動(dòng)物模型中使致瘤性細(xì)胞與針對(duì)Notch受體的拮抗劑接觸。 例如，使表達(dá)Notch受體的異種移植物在免疫妥協(xié)小鼠（例如，N0D/SCID小鼠）中生長。對(duì) 所述小鼠施用針對(duì)Notch受體的拮抗劑以抑制腫瘤生長。作為選擇，從諸如組織活檢樣、胸 腔積液或血液樣品等患者樣品分離表達(dá)Notch受體的癌干細(xì)胞，并將其注入免疫妥協(xié)小鼠 中。然后對(duì)所述小鼠施用針對(duì)Notch受體的拮抗劑以抑制腫瘤細(xì)胞生長。在某些實(shí)施方式 中，在將致瘤性細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物的同時(shí)，或稍后不久施用Notch受體的拮抗劑從而預(yù)防腫瘤 生長。在其它實(shí)施方式中，在致瘤性細(xì)胞已經(jīng)生長至規(guī)定尺寸之后施用作為治療劑的Notch 受體的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是與Notch受體特異性結(jié)合的Notch受體蛋 白融合物。在特定實(shí)施方式中，所述拮抗劑是特異性識(shí)別Notch受體的表位的抗體。在某 些實(shí)施方式中，所述抗體是任何一種本文所述抗體或多肽。
[0268] 在特定實(shí)施方式中，致瘤性細(xì)胞與針對(duì)Notch受體的拮抗劑的接觸在診斷患有癌 的人類患者中發(fā)生。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是與Notch受體特異性結(jié)合的抗體。 在其它實(shí)施方式中，所述拮抗劑是特異性識(shí)別Notch受體的表位的抗體。例如，本發(fā)明提 供抑制受試對(duì)象中腫瘤生長的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的人類 Notch2和/或Notch3的拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是與Notch2結(jié)合的抗體。 在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是與Notch3結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑 是與Notch2和Notch3結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是在上述方面或?qū)嵤?方式、以及本文所述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w或多肽。在特定實(shí)施方式 中，所述腫瘤包含磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN)基因中的失活缺失或突變。
[0269] 本發(fā)明還提供抑制細(xì)胞中Notch信號(hào)傳導(dǎo)（例如，Notch2和/或Notch3)的方法， 所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的Notch拮抗劑接觸。這些方法可以是體內(nèi)方法或體外 方法。在某些實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑是抗體。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括抑 制細(xì)胞中Notch2信號(hào)傳導(dǎo)，包括使所述細(xì)胞與有效量的上述方面或?qū)嵤┓绞健⒁约氨疚乃?述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街械娜魏我环N抗體或多肽接觸。在某些實(shí)施方式中，所述Notch 拮抗劑是抗體。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括抑制細(xì)胞中Notch3信號(hào)傳導(dǎo)，包括使所 述細(xì)胞與有效量的上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文所述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街械娜魏?抗體或多肽接觸。
[0270] 本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的方法，所述方法包括對(duì) 受試對(duì)象施用有效量的人類Notch3的拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述方法通過調(diào)節(jié)周細(xì) 胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能抑制血管發(fā)生。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是在上述 方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文所述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w或多肽。在特 定實(shí)施方式中，受抑制的血管發(fā)育是異常血管發(fā)育。在特定實(shí)施方式中，受抑制的血管發(fā)育 在腫瘤中。在特定實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)所述受試對(duì)象施用VEGF的拮抗劑或VEGF 受體的拮抗劑。
[0271] 另外，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中血管發(fā)生或血管發(fā)育的方法，所述方法包括對(duì) 所述受試對(duì)象施用有效量的Notch拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑是Notch3 拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑是Notch2拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述 拮抗劑是Notch2和/或Notch3的拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述拮抗劑是抗Notch2/3 抗體。在某些實(shí)施方式中，抑制血管發(fā)生的方法包括施用上述方面或?qū)嵤┓绞?、以及本文?述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街腥我坏目贵w或多肽。在特定實(shí)施方式中，所述血管發(fā)生是腫 瘤血管發(fā)生。在特定實(shí)施方式中，所述血管發(fā)育位于腫瘤位置。在某些替代性實(shí)施方式中， 所述血管發(fā)生不是腫瘤血管發(fā)生。在特定實(shí)施方式中，血管發(fā)生或血管發(fā)育的抑制至少部 分是由于周細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的功能的調(diào)節(jié)。在特定實(shí)施方式中，所述方法還包 括對(duì)所述受試對(duì)象施用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF)的拮抗劑或VEGF受體的拮抗劑。
[0272] 還提供減少腫瘤（例如包含癌干細(xì)胞的腫瘤）的致瘤性的方法。在特定實(shí)施方式 中，所述方法包括對(duì)有需要的受試對(duì)象（例如，具有腫瘤的受試對(duì)象）施用治療有效量的 Notch拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑是結(jié)合Notch2的抗體。在特定實(shí)施 方式中，所述Notch拮抗劑是結(jié)合Notch3的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑 是結(jié)合Notch2和Notch3的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述Notch拮抗劑是上述方面或?qū)?施方式、以及本文他處所述任何其它方面或?qū)嵤┓绞街腥我凰龅目贵w或多肽。在特定實(shí) 施方式中，通過施用所述抗體減少所述腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率。在某些實(shí)施方式中，所述腫 瘤是結(jié)直腸腫瘤、乳腫瘤、胰腺腫瘤或黑色素瘤。
[0273] 還設(shè)想可以使用本發(fā)明的試劑和拮抗劑來治療特征在于Notch受體的表達(dá)和/或 細(xì)胞對(duì)Notch受體的應(yīng)答性增加的各種疾病。本發(fā)明提供治療增殖性疾病如癌、與血管發(fā) 生相關(guān)的疾?。ɡ?，血管發(fā)生依賴性疾病）和其中Notch信號(hào)傳導(dǎo)的上調(diào)或下調(diào)起作用 的疾病的方法。
[0274] 在特定實(shí)施方式中使用Notch結(jié)合劑或拮抗劑要治療的疾病是Notch相關(guān)疾病。 在特定實(shí)施方式中，所述疾病的特征在于Notch信號(hào)傳導(dǎo)（例如，Notch2和/或Notch3信 號(hào)傳導(dǎo)）的上調(diào)或下調(diào)。在特定實(shí)施方式中，所述疾病或腫瘤是Notch2和/或Notch3_依 賴性的。
[0275] 具體而言，設(shè)想使用針對(duì)Notch受體的拮抗劑（例如，抗體）來治療增殖性疾病， 所述疾病包括但不限于，腎、肝、膀胱、乳腺、胃、卵巢、結(jié)腸、直腸、前列腺、肺、外陰、甲狀腺、 頭頸、腦（成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成髓細(xì)胞瘤等）、血液和淋巴（白血病和淋巴瘤）的 良性腫瘤和惡性腫瘤。在特定實(shí)施方式中，使用Notch結(jié)合劑或拮抗劑治療的增殖性疾病 是結(jié)直腸癌、乳癌、胰腺癌或黑色素瘤。在特定實(shí)施方式中，所述癌包含癌干細(xì)胞。
[0276] 在特定實(shí)施方式中，所治療的腫瘤是實(shí)體瘤?？梢允褂帽景l(fā)明的治療組合物（例 如，結(jié)合Notch的抗體）治療的實(shí)體瘤的實(shí)例包括，但不限于肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、粘液 肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管 內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢 癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊 腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆 斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng) 管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜 瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。本發(fā)明適用于肉瘤和上皮癌，例如卵巢癌 和乳癌。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤、乳瘤、胰腺瘤或黑色素瘤。在特定實(shí)施 方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤是成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。在特定實(shí)施 方式中，所述腫瘤包含癌干細(xì)胞。
[0277] 在特定實(shí)施方式中，用所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑要治療的疾病是與血管發(fā)生相 關(guān)的疾病。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是癌。在某些其它實(shí)施方式中，所述疾病不是癌性 疾病。例如，所述疾病可以是視網(wǎng)膜黃斑變性（wet macular degeneration)、年齡相關(guān)性黃 斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、血管瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、新生血管性青光眼、多囊 卵巢病、子宮內(nèi)膜異位和炎癥性腸病。
[0278] 在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)Notch結(jié)合劑或拮抗劑祀向的一種或多種 Notch受體。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)Notch2和/或Notch3。在特定實(shí)施方式 中，所述腫瘤過表達(dá)Notch2和/或Notch3。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤取決于與施用的 抗體特異性結(jié)合的一種或多種Notch受體。例如，在特定實(shí)施方式中，可以使用特異性結(jié)合 Notch2 (或Notch2和Notch3)的抗體來抑制所述生長或祀向Notch2依賴性腫瘤。在特定 實(shí)施方式中，可以使用特異性結(jié)合Notch3 (或Notch2和Notch3)的抗體來抑制所述生長或 靶向Notch3依賴性腫瘤。在特定實(shí)施方式中，所述腫瘤包含癌干細(xì)胞。
[0279] 在特定實(shí)施方式中，對(duì)于編碼腫瘤抑制子磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN)的基 因中的失活缺失或突變，所述腫瘤是純合性或雜合性的。在特定實(shí)施方式中，包含缺失或突 變的腫瘤是乳瘤。
[0280] 根據(jù)已知的方法將所述拮抗劑作為合適的藥物組合物對(duì)人類患者施用。合適的 施用方法包括作為推注的靜脈內(nèi)施用或通過連續(xù)輸注一段時(shí)間，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腫瘤內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑施用。
[0281] 在特定實(shí)施方式中，除了施用Notch拮抗劑之外，所述方法或治療還包括（在施用 所述Notch拮抗劑之前、同時(shí)和/或之后）施用第二治療劑。在特定實(shí)施方式中，所述第二 治療劑是抗癌劑和/或抗血管發(fā)生劑。還提供包含所述Notch拮抗劑和第二治療劑的藥物 組合物。
[0282] 應(yīng)意識(shí)到可以以任何順序或同時(shí)施用Notch拮抗劑（例如，抗體）和第二治療劑 的組合。在所選實(shí)施方式中，對(duì)之前已經(jīng)接受第二抗癌劑治療的患者施用Notch拮抗劑。 在某些其它實(shí)施方式中，可以基本上同時(shí)或并行施用所述Notch拮抗劑和第二治療劑。例 如，受試對(duì)象可以被給予Notch拮抗劑，同時(shí)經(jīng)受使用第二治療劑進(jìn)行治療的過程（例如化 學(xué)治療）。在特定實(shí)施方式中，在使用第二治療劑進(jìn)行治療1年內(nèi)施用所述Notch拮抗劑。 在某些替代性實(shí)施方式中，在使用第二治療劑進(jìn)行任何治療的10個(gè)月、8個(gè)月、6個(gè)月、4個(gè) 月或2個(gè)月之內(nèi)施用所述Notch拮抗劑。在某些其它實(shí)施方式中，在使用第二治療劑進(jìn)行 任何治療的4周、3周、2周或1周之內(nèi)施用所述Notch拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，在使用 第二治療劑進(jìn)行任何治療的5天、4天、3天、2天或1天之內(nèi)施用所述Notch拮抗劑。還應(yīng) 意識(shí)到可以在大約幾小時(shí)或幾分鐘之內(nèi)（即，基本上同時(shí)）對(duì)所述受試對(duì)象施用兩種試劑 或治療。
[0283] 可用類別的抗癌劑包括，例如抗微管蛋白齊LU敖瑞斯汀（auristatins)、DNA小溝 結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷基化劑（鉬復(fù)合物如，諸如順鉬、單（鉬）、雙（鉬）和三核鉬復(fù) 合物以及卡鉬）、蒽環(huán)霉素（anthracycline)、抗生素、抗葉酸鹽、抗代謝藥、化學(xué)治療敏感 齊U、倍癌霉素（duocarmycins)、足葉乙式、氟化啼陡、離子載體、萊希特平（Iexitropsins)、 亞硝基脲、順鉬（platinols)、執(zhí)行化合物（performing compounds)、噪呤抗代謝物、噪呤霉 素、放射敏感劑、類固醇、紫杉烷、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或長春花生物堿等。在特定實(shí)施方式 中，所述第二抗癌劑是抗代謝藥、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或血管發(fā)生抑制劑。
[0284] 可以與Notch拮抗劑組合施用的抗癌劑包括化學(xué)治療劑。因此，在某些實(shí)施方式 中，所述治療包括組合施用本發(fā)明的拮抗劑和化學(xué)治療劑或多種不同的化學(xué)治療劑的混合 物?？梢栽谑┯没瘜W(xué)治療劑之前、與其同時(shí)或在其之后進(jìn)行使用拮抗劑的治療。本發(fā)明涉 及的化學(xué)治療劑包括本領(lǐng)域已知并且為商購可得的化學(xué)物質(zhì)或藥物，例如多柔比星、5-氟 尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷（^1^-(：〃）、環(huán)磷酰胺、噻替派、白消安、胞毒素（(3# 〇^11)、紫杉 醇、氨甲蝶呤、順鉬、美法侖、長春堿和卡鉬。組合施用可以包括以單一藥物制劑或使用分 開制劑的共施用，或以任何順序但通常在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)施用，從而使得所有活性劑可 以同時(shí)發(fā)揮其生物活性?？梢愿鶕?jù)制造商說明書或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，來使用用于所述化學(xué) 治療劑的制劑和給藥方案。用于所述化學(xué)治療的制劑和給藥方案還描述于Chemotherapy Service Ed. , Μ· C. Perry, Williams&Wilkins, Baltimore, Md. (1992)。
[0285] 用于本發(fā)明的化學(xué)治療劑還包括，但不限于，諸如噻替派和環(huán)磷酰胺 (CYTOXAN)等烷基化劑；諸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡等烷基磺酸酯；諸如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替哌（meturedopa)和烏瑞替派（uredopa)等氮丙陡；包括六 甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺（trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰 胺（triethylenethiophosphaoramide)和三輕甲蜜胺（trimethylolomelamime)氮芥在內(nèi) 的乙烯亞胺和甲基蜜胺（methylamelamines)，所述三輕甲蜜胺（trimethylolomelamime) 氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代環(huán)磷酰胺、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸甲氧氮芥、 美法侖、新氮芥、膽留醇對(duì)苯乙酸氮芥、潑尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；諸如卡莫司汀、氯 脲霉素（chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等亞硝基脲；諸如阿 克拉霉素、放線菌素、安曲霉素（authramycin)、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素 C、加利 車霉素、卡柔比星（carabicin)、洋紅霉素（caminomycin)、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道 諾紅菌素、地托比星（detorubicin)、6_重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、 依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、紫菜 霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他 丁、佐柔比星等抗生素；諸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU)等抗代謝藥；諸如二甲葉酸、 氨甲蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙等葉酸類似物；諸如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌 呤等嘌呤類似物；諸如安西他濱、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、 去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；諸如卡魯睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄 醇、美雄烷、睪內(nèi)酯等雄激素；諸如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺藥；諸如亞葉酸 (frolinic acid)等葉酸補(bǔ)充劑；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百托 布（bestrabucil);比山群；依達(dá)曲沙、得福安（defofamine);脫羧秋水仙堿；地Π 丫醌；艾福 敏（elformithine);依利醋銨（elliptinium acetate);依托格魯；硝酸鎵；輕基脲；香燕 多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔 比星；鬼日酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.;雷佐生；西索菲蘭（sizofuran);鍺螺胺；細(xì) 交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2, 2'，2〃-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露氮芥； 二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴燒；加胞啼陡（gacytosine);阿拉伯糖苷（〃Ara_C〃）、環(huán) 磷酰胺、噻替派；諸如紫杉醇（TAXOL)和多西他賽（Taxotere)等紫杉烷；苯丁酸氮芥；吉西 他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；諸如順鉬和卡鉬等鉬類似物；長春堿；鉬；足葉乙 甙（VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素 C ;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；異長春花堿；諾消靈 (novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT 11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑 制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥氨酸（DMFO);視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；和上述任何一種 的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物?；瘜W(xué)治療劑還包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素，如抗雌激素 齊U，對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，包括例如，三苯氧胺、雷洛昔芬（raloxifene)、芳香化酶抑制 性4(5)-咪唑、4-輕基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬鹽酸鹽（keoxifene)、LY 117018、奧那 司酮和托瑞米芬（Fareston);以及抗雄激素劑，如氟他米特、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞 林和戈舍瑞林；和上述任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0286] 在特定實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑是 干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶（例如拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II)作用的化學(xué)治療劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括， 但不限于，鹽酸多柔比星，道諾紅菌素檸檬酸鹽、鹽酸米托蒽醌、放線菌素 D、足葉乙甙、鹽酸 托泊替康、替尼泊苷（VM-26)和伊立替康。在特定實(shí)施方式中，所述第二抗癌劑是伊立替 康。在特定實(shí)施方式中，要治療的腫瘤是結(jié)直腸瘤，并且所述第二抗癌劑是諸如伊立替康等 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。
[0287] 在特定實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療劑是抗代謝藥?？勾x藥是具有以下結(jié)構(gòu)的 化學(xué)藥品，所述結(jié)構(gòu)與正常生化反應(yīng)所需的代謝物類似，但是不同之處足夠干擾細(xì)胞的一 種或多種正常功能，例如細(xì)胞分裂?？勾x藥包括，但不限于，吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他 濱、氨甲蝶呤鈉、雷替曲塞（ralitrexed)、培美曲塞、喃氟陡、胞啼陡阿拉伯糖苷、硫鳥噪呤、 5_氮胞苷、6-巰基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、氟達(dá)拉濱磷酸鹽和克拉屈濱， 以及這些中任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在特定實(shí)施方式中，所述第二抗癌 劑是是吉西他濱。在特定實(shí)施方式中，要治療的腫瘤是胰腺瘤，并且所述第二抗癌劑是抗代 謝藥（例如，吉西他濱）。
[0288] 在其它實(shí)施方式中，所述治療包括將本發(fā)明的拮抗劑與放射治療組合施用?？梢?在施用放射治療之前、與其同時(shí)或在其之后使用抗體進(jìn)行治療?？梢允褂糜糜谒龇派渲?療的任何給藥方案。
[0289] 在其它實(shí)施方式中，所述治療包括組合施用本發(fā)明的抗體以及針對(duì)與另外腫瘤 相關(guān)的抗原的其它抗體，所述抗體包括，但不限于，與EGF受體（EGFR) (ErWlux?:)、erbB2 受體（HER2) (Herceptin?)和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF) (Avas〖in?)結(jié)合的抗體。在某些 替代性實(shí)施方式中，所述第二抗癌劑包含與人類DLL4或Notch受體的其它配體特異性結(jié) 合的抗體或與另外的人類Notch受體特異性結(jié)合的抗體。舉例而言，抗DLL4抗體例如 描述于美國專利申請(qǐng)公開第US 2008/0187532號(hào)，本文通過參考并入其全文。另外的抗 DLL4抗體描述于例如國際專利公開W02008/091222和W02008/0793326,和美國專利申請(qǐng) 公開 US 2008/0014196、US 2008/0175847 ;US 2008/0181899;和 US 2008/0107648,本文 通過參考并入每一篇的全文。示例性的抗Notch抗體例如描述于美國專利申請(qǐng)公開US 2008/0131434,本文通過參考并入其全文。在特定實(shí)施方式中，所述第二抗癌劑是Notch信 號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。在特定實(shí)施方式中，所述第二抗癌劑是作為血管發(fā)生抑制劑的抗體（例 如，抗VEGF抗體）。在特定實(shí)施方式中，所述第二治療劑是特異性結(jié)合VEGF受體的抗體。 在特定實(shí)施方式中，所述第二治療劑是AVASTIN (貝伐單抗）、HERCEPTIN(曲妥珠單抗）、 VECTIBIX (帕尼單抗）或ERBITUX (西妥昔單抗）。組合施用可以包括在單一藥物制劑中或 使用分開制劑的共施用，或以任何順序但通常在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)施用，從而使得所有活 性劑可以同時(shí)發(fā)揮其生物活性。
[0290] 另外，治療可以包括施用一種或多種細(xì)胞因子（例如，淋巴因子、白介素、腫瘤壞 死因子和/或生長因子），或可以伴隨有外科手術(shù)除去癌細(xì)胞或治療醫(yī)師確信必須的任何 其它治療。
[0291] 對(duì)于所述疾病的治療，本發(fā)明的拮抗劑的合適劑量取決于待治療疾病的類型，疾 病的嚴(yán)重性和進(jìn)展，疾病的應(yīng)答性，是否為了治療或預(yù)防目的施用所述抗體、之前的治療、 患者臨床史等，所有這些都由治療醫(yī)師判斷。所述拮抗劑可以施用一次，或在持續(xù)幾天到幾 個(gè)月的一系列治療中施用，或直到治愈，或直到達(dá)到疾病狀態(tài)消退（例如腫瘤尺寸減少）。 最佳給藥方案可以由對(duì)患者體內(nèi)的累積藥物的測定來計(jì)算，并且可以根據(jù)各拮抗劑的相 對(duì)效力而變化。施用醫(yī)師可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)速率。通常，劑量為 0. Ol μ g?IOOmg/千克體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予1次或多次。治療醫(yī)師 可以基于體液或組織中藥物的測定的停留時(shí)間和濃度估算給藥的重復(fù)速率。
[0292] 在特定實(shí)施方式中，在用所述Notch拮抗劑進(jìn)行治療之前，對(duì)考慮進(jìn)行Notch拮抗 劑治療的患者進(jìn)行篩選。在特定實(shí)施方式中，對(duì)患者中的腫瘤或已經(jīng)從患者取出的腫瘤測 試癌干細(xì)胞的存在。在特定實(shí)施方式中，對(duì)所述腫瘤測試與所述拮抗劑結(jié)合的一種或多種 Notch受體（例如，Notch2和/或Notch3)的表達(dá)。在特定實(shí)施方式中，對(duì)所述腫瘤測試編 碼腫瘤抑制子磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN)的基因中的失活缺失或突變的存在。在特 定實(shí)施方式中，所測試的腫瘤是乳瘤。
[0293] 例如，本發(fā)明提供了選擇受試對(duì)象用于使用Notch2和/或Notch 3拮抗劑進(jìn)行治 療的方法，其中所述受試對(duì)象具有腫瘤或已移除腫瘤。在特定實(shí)施方式中，所述方法包括 (a)確定所述腫瘤是否包含PTEN基因中的缺失或突變；和（b)如果所述腫瘤包含所述缺失 或突變，則選擇所述受試對(duì)象以用于使用Notch3拮抗劑進(jìn)行治療。
[0294] 在本發(fā)明的某些替代性實(shí)施方式中，經(jīng)由遺傳測試對(duì)經(jīng)篩查存在結(jié)腸腺瘤或息肉 的患者測試等位基因損失和體細(xì)胞突變。在某些實(shí)施方式中，所述遺傳測試篩選fct途徑 中的損失或突變，包括，例如在APC、Axin2或β-連環(huán)蛋白中的損失或突變。
[0295] 在另一方面，本發(fā)明提供可用于執(zhí)行本文所述方法的試劑盒。在某些實(shí)施方式中， 試劑盒在一個(gè)或多個(gè)容器中包括對(duì)Notch受體具有特異性的抗體、經(jīng)純化抗體。在某些實(shí) 施方式中，試劑盒還包括基本上分離的Notch受體,不與所述Notch受體反應(yīng)的對(duì)照抗體和 /或用于檢測抗體與Notch受體結(jié)合的工具（means)(例如，與針對(duì)Notch受體的抗體或與 識(shí)別針對(duì)Notch受體的抗體的第二抗體綴合的熒光生色團(tuán)、酶底物、放射活性化合物或發(fā) 光化合物），所述基本上分離的Notch受體包含與試劑盒里包括的所述抗體具有特異性免 疫反應(yīng)性的表位。在其它實(shí)施方式中，試劑盒包含對(duì)于一種或多種Notch受體的mRNA或 cDNA(例如，寡核苷酸探針或引物）檢測具有特異性的試劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑 盒含有所有對(duì)執(zhí)行檢測測試而言必須和/或充分的組分，包括所有對(duì)照、執(zhí)行測試的指導(dǎo) 和用于分析和呈現(xiàn)結(jié)果的任何必需的軟件。
[0296] 區(qū)室試劑盒（compartment kit)包括其中試劑容納在分開的容器中的任何試劑 盒。所述容器包括小型玻璃容器、塑料容器或塑料條或紙條。所述容器允許有效地將試劑從 一個(gè)區(qū)室轉(zhuǎn)移到另一區(qū)室，從而使得所述樣品和試劑不交叉污染，并且可以以定量方式將 各容器的試劑或溶液從一個(gè)區(qū)室添加到另一區(qū)室。所述容器可包括接收測試樣品的容器、 含有本方法中所用抗體或探針的容器、含有洗滌試劑（例如磷酸鹽緩沖的鹽水、Tris-緩 沖液等）的容器和含有用于檢測結(jié)合的抗體或探針的試劑的容器?？扇菀椎匾庾R(shí)到的是， 可以容易地將本發(fā)明公開的多核苷酸、多肽和抗體并入本領(lǐng)域公知的已建立的試劑盒形式 中。
[0297] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供包括Notch結(jié)合劑或拮抗劑和第二治療劑的試 劑盒。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑是與Notch2和/或Notch3特異性 結(jié)合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述Notch結(jié)合劑或拮抗劑是與Notch2和Notch3特異 性結(jié)合的抗體。在特定實(shí)施方式中，所述第二治療劑是抗癌劑和/或抗血管發(fā)生劑。
[0298] 在一方面，本發(fā)明提供鑒定與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)結(jié)合并且 抑制腫瘤生長的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子與人類Notch受體的胞外域的 非配體結(jié)合域一起溫育；ii)確定所述分子是否與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合 區(qū)結(jié)合；和iii)確定所述分子是否抑制腫瘤生長。特異性結(jié)合人類Notch受體的胞外域的 非配體結(jié)合區(qū)的分子包括，但不限于，小有機(jī)分子、多肽和抗體。
[0299] 可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行篩選。在特定實(shí)施方式中，篩選在體 外進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，使表達(dá)人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的細(xì)胞與經(jīng) 標(biāo)記的分子一起溫育，并且通過FACS分析確定經(jīng)標(biāo)記的分子與人類Notch受體的胞外域的 非配體結(jié)合區(qū)的特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，通過噬菌體展示表達(dá)人類Notch受體的 胞外域的非配體結(jié)合區(qū)，并且鑒定與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合 的分子。用于鑒定與人類Notch受體的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的分子的其它適合的方法 包括，但不限于，ELISA、蛋白質(zhì)（或免疫）印跡和酵母雙雜交。
[0300] 然后測試與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的分子對(duì)腫瘤 細(xì)胞生長的抑制?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行測試。在特定實(shí)施方式中， 對(duì)與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的分子測試體外抑制腫瘤生長 的能力。在某些實(shí)施方式中，使與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的 分子與培養(yǎng)物中的腫瘤細(xì)胞一起溫育，在與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異 性結(jié)合的分子的存在下確定腫瘤細(xì)胞的增殖，并且將其與非結(jié)合對(duì)照分子一起溫育的腫瘤 細(xì)胞進(jìn)行比較。在特定實(shí)施方式中，對(duì)與人類Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性 結(jié)合的分子測試體內(nèi)抑制腫瘤生長的能力。在特定實(shí)施方式中，將與人類Notch受體的胞 外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的分子注入動(dòng)物異種移植物模型，確定在用與人類Notch 受體的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合的分子治療的動(dòng)物中腫瘤的生長，并且將其與用 非結(jié)合對(duì)照分子治療的動(dòng)物進(jìn)行比較。
[0301] 實(shí)施例
[0302] 應(yīng)該理解本文所述實(shí)施例和實(shí)施方式僅是用于舉例目的，根據(jù)這些實(shí)施例和實(shí)施 方式本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)提出各種改變或變化，并且這些改變或變化包括在本申請(qǐng)的精神和 范圍內(nèi)。
[0303] 實(shí)施例1
[0304] 針對(duì)Notch2的人類抗體的制備
[0305] 使用噬菌體展示技術(shù)分離特異性識(shí)別Notch2受體的胞外域的非配體結(jié)合部分的 人類抗體。對(duì)含有人類抗體可變域的合成抗體文庫進(jìn)行Notch2受體的特異性和高親和性 識(shí)別的篩選。
[0306] 簡言之，在第1輪使2xl013個(gè)Fab展示噬菌體顆粒與被動(dòng)固定的重組Notch2Fc融 合蛋白（SEQ ID N0:21)溫育，所述Notch2Fc融合蛋白包含Notch2的胞外配體結(jié)合位點(diǎn)和 周圍的EGF重復(fù)（EGF 1-12)。洗掉非特異性噬菌體，然后用DTT洗脫特異性噬菌體。使用 洗脫產(chǎn)物來感染TGlF+細(xì)菌，用輔助噬菌體進(jìn)行援助（rescue)，然后用IPTG(0.25mM)誘導(dǎo) Fab展示。將該過程重復(fù)另外兩輪，然后在針對(duì)被動(dòng)固定的重組Notch2 (EGFl-12)Fc融合物 (5 μ g/ml)的ELISA中篩選第3輪。
[0307] 鑒定出特定的Fab (59R1)，所述Fab結(jié)合人類Notch2受體并阻斷Jagged 1與人 類Notch2的結(jié)合。使用過表達(dá)人類Notch2 (hN2)的穩(wěn)定的人細(xì)胞系HEK-293通過FACS測 試驗(yàn)證59RlFab與人類Notch2的結(jié)合（圖1A)。通過藻紅蛋白（PE)-綴合的山羊抗-人 Fab (Jackson Immunochemicals)檢測 Fab 結(jié)合。59RlFab (圖 IA 中稱為克隆 1)顯不與 hN2 的良好結(jié)合。在使用相同的穩(wěn)定細(xì)胞系的結(jié)合檢測中，59RlFab還顯示針對(duì)Notch配體人 Jaggedl的良好阻斷活性（圖1B)。通過使與人類Fc恒定區(qū)融合的hjaggedl胞外域（ECD) 與細(xì)胞和選自噬菌體文庫的Fab -起溫育并使用用于檢測的PE-綴合的山羊抗人Fe Y特 異性抗體（Jackson Immunochemicals),從而確定配體結(jié)合和阻斷。
[0308] 59RlFab的VH和VL的序列分別提供于SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12 (包括當(dāng) 分泌時(shí)切割去的N-末端細(xì)菌信號(hào)序列）中。59RlFab的⑶R如以下表2所示。
[0309] 表 2. 59R1 人類 Fab 和 IfiG 抗體的 CDR

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的抗體，所述分離的抗體與人類Notch2的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)特異性 結(jié)合，其中所述抗體與人類Notch2的EGF重復(fù)10特異性結(jié)合。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK104402998SQ201410524761
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2008年7月8日
【發(fā)明者】奧斯丁·L·格尼, 蒂莫西·查爾斯·霍伊, 愛德華·特恩·圖恩范德霍斯特, 阿龍·肯·薩拓, 劉遠(yuǎn)程, 莫林·菲奇·布魯恩斯, 約翰·A·萊維茨基 申請(qǐng)人:昂考梅德藥品有限公司