抗CD1d的抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供結(jié)合CD1d的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。這些抗體及其抗原結(jié)合部分具有在治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抗CD1d的抗體
[0001] 提交數(shù)據(jù)
[0002] 本申請(qǐng)與2011年10月14日提交的澳大利亞專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?011904190和2011年 10月14日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/547, 307相關(guān)并要求其優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)各自的全部 內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及結(jié)合⑶Id并抑制⑶Id介導(dǎo)的生物學(xué)功能(例如活化⑶Id限制性T細(xì) 胞、自然殺傷T (NKT)細(xì)胞）的抗體。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 按照字母順序在說(shuō)明書(shū)結(jié)尾處收集了作者在本說(shuō)明書(shū)中提及的出版物的書(shū)目細(xì) 節(jié)。
[0006] 在本說(shuō)明書(shū)中提及任何現(xiàn)有技術(shù)不被也不應(yīng)視為是承認(rèn)或以任何形式暗示現(xiàn)有 技術(shù)在任何國(guó)家構(gòu)成公知常識(shí)的一部分。
[0007] CDld是對(duì)觸發(fā)細(xì)胞群體(例如NKT細(xì)胞）以釋放高水平的細(xì)胞因子(與某些炎性疾 病相關(guān)的活性）必不可少的反受體。因此阻斷CDld介導(dǎo)的作用具有潛在的治療益處。
[0008] ⑶Id蛋白質(zhì)顯示于許多抗原呈遞細(xì)胞（APC)亞群上,包括朗氏細(xì)胞(皮膚中的主 要樹(shù)突狀抗原呈遞細(xì)胞)、活化B細(xì)胞、淋巴結(jié)中的樹(shù)突細(xì)胞、活化的血單核細(xì)胞。經(jīng)CDld刺 激的一個(gè)細(xì)胞群體是NKT細(xì)胞--與多種通常與NK細(xì)胞相關(guān)的分子標(biāo)記物例如CD161和 NKG2D-起表達(dá)alpha/beta (α β)Τ細(xì)胞受體（TCR)的T細(xì)胞亞群?？乖蔬f細(xì)胞（APC) 經(jīng)⑶Id呈遞脂質(zhì)或糖脂刺激ΝΚΤ細(xì)胞。大多數(shù)人⑶Id限制性ΝΚΤ細(xì)胞表達(dá)包含與νβ 11 配對(duì)的 Va 24Ja 18 的半不變 TCR (Brigl, Μ 等人，2004Annu. Rev. Immunol. , 22:817-890)。 ⑶ld-TCR相互作用快速誘導(dǎo)許多Thl-或Th2-樣細(xì)胞因子，例如干擾素（IFN) - γ和腫瘤 壞死因子（TNF)-a，以及白細(xì)胞介素（IL)-4、IL-5和IL-13。已知Thl/Th2細(xì)胞因子響應(yīng) 的平衡在編排免疫反應(yīng)性質(zhì)方面起重要的作用。
[0009] 迄今已經(jīng)在人體內(nèi)識(shí)別了五種⑶1基因：⑶la、⑶lb、⑶lc、⑶Id和⑶le。⑶1蛋 白被表達(dá)為與β2-微球蛋白（β2Μ)非共價(jià)相關(guān)的大的亞單位(重鏈）（Van Agthoven，A. 和 Terhorst，C·，1982J. Immunol. 128:426-432 ;Terhorst，C.等人，1981Cell23:771-780)。 ⑶Id的胞外域由三個(gè)域組成：α 1域(殘基20-108)、α 2域(殘基109-201)和α 3域(殘基 202-295) (Pellicci，D.G.等人，2009Immunity31:47-59)。
[0010] 多種具有不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)已經(jīng)顯示：以在⑶Id分子的兩個(gè)疏水性結(jié)合口袋（A' 和F)各個(gè)中提供脂肪酸鏈的獨(dú)特方式結(jié)合CDld分子。能夠結(jié)合CDld分子的脂質(zhì)物類(lèi)包 括分枝菌酸類(lèi)、二酰甘油類(lèi)、鞘脂類(lèi)、類(lèi)聚異戊二烯類(lèi)、脂肽類(lèi)、phosphomycoketides和小 的疏水性化合物（Venkataswamy, Μ· M.和 Porcelli, S. A.，201 OSeminTmmunol 22:68-78)。 用于研究體內(nèi)和體外的NKT細(xì)胞激活的原型化合物是KRN7000，一種衍生自海綿 Agelasmauritianus的α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(" a GalCer")。附加的激動(dòng)劑包括但不限 于異球三己糖基神經(jīng)酰胺（"iGb3")，據(jù)報(bào)道其是內(nèi)源性鞘糖脂，以及一類(lèi)衍生自微生物 的α-葡糖醒酸基神經(jīng)酰胺（glycuronosylceramides)的成員與多種人類(lèi)糖脂如溶血磷 脂醜膽喊（lysophophatidylcholine)和溶鞘憐脂（lysosphingomyelin) (Fox，L.M.等 人，2009Plos Bi〇17:el000228)。某些天然存在的β-連接的糖鞘脂例如β-D-吡喃葡 萄糖基神經(jīng)酰胺的C24:1形式也是ΝΚΤ細(xì)胞的弱激動(dòng)劑（Brennan，P. J.等人，201 INat Immunol12:1202-1211)。
[0011] ΝΚΤ細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生細(xì)胞因子可能會(huì)貢獻(xiàn)于某些自身免疫性或炎性疾病的病理，例 如重癥肌無(wú)力（Reinhardt, C.等人，1999Neurology52:1485-87)、牛皮癬（Bonish, Β. D.等 人，2000J. Immunol. 165:4076-85)、潰瘍性結(jié)腸炎（Saubermann, L. J.等人，2000Gastroen terologyll9:119-128)、原發(fā)性膽汁性肝硬變（Kita, Η·等人，2002Gastroenterologyl23 :1031-43)、結(jié)腸炎（Heller, F.等人，2002Immunityl7, 629-638)、脂肪性肝炎（Syn，W.等 人，（2010) Hepatology, 51 (6) : 1998-2007)、自身免疫性肝炎（Santodomingo-Garzon，T.和 Swain，M.G. (2011)Autoimmunity Reviewsl0:793_800)、動(dòng)脈粥樣硬化（Kyriakakis，E.等 人，EurJImmunol201040:3268-79)或與鐮狀細(xì)胞病相關(guān)的肺部炎癥或機(jī)能障礙（Wallace 等人，2009Bloodll4:667-676)。越來(lái)越多的證據(jù)表明ΝΚΤ細(xì)胞在哮喘中施加了有害影響 (Iwamura，C.和 Nakayama，Τ.，2010Curr0pinImmunol22:807-13)。
[0012] 哮喘是慢性炎性肺疾病，其特征是慢性局部炎癥引起的可逆的氣道阻塞、粘 液阻塞和響應(yīng)于非特異性刺激的支氣管痙攣（Murdoch, J. R.和Lloyd, C. M. 20lOMutat Res690:24-39)。高哮喘患病率，越來(lái)越高的發(fā)病率和龐大的相關(guān)醫(yī)療保健開(kāi)支使哮喘 成為主要公共衛(wèi)生問(wèn)題（Holgate，S.T.和 Polosa，R.2008Nat Rev Immunol8:218_30; Bahadori，K.，Doyle_WatersM.M·等人，2009BMC Pulm Med9:24)。在患有嚴(yán)重形式的哮喘， 例如皮質(zhì)類(lèi)固醇難治性哮喘的患者的治療方面存在顯著的未滿(mǎn)足的醫(yī)療需求?；加袊?yán)重哮 喘的患者不能對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療產(chǎn)生響應(yīng)，并占全部哮喘人群的約5-10%。這僅在美國(guó)就包括約 850, 000例患者。
[0013] 在過(guò)敏性哮喘的小鼠模型中，NKT細(xì)胞已經(jīng)顯示使疾病加重（Akbari，0.等 人，2003NatMed9:582-8)。NKT細(xì)胞可以被CDld限制性糖脂抗原激活并釋放細(xì)胞因子例如 IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13,這些細(xì)胞因子激活在哮喘中重要的嗜酸性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞 亞群（Chuang，Y.H.等人，2011J Immunoll86:4687-92)。通過(guò)針對(duì) NKT 細(xì)胞，施用抗-CDld 抗體或⑶Id-依賴(lài)性拮抗劑在實(shí)驗(yàn)中抑制了誘發(fā)的氣道炎癥（LiSb〇nne，M.等人，2003J Immunoll71:1637-41 ;Pichavant，M.等人，2008JExpMed, 205:385-93)。NKT 細(xì)胞在哮喘 的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中是也有害的（Matangkasombut,P.等，2008J Allergy Clin Immun〇1121:1287-9)。這樣的結(jié)果表明，肺中存在的低數(shù)量NKT細(xì)胞對(duì)人哮喘的發(fā)展和延 續(xù)非常重要。
[0014] 非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)是其中過(guò)量脂肪堆積在無(wú)酗酒史的患者體內(nèi)的一種 病況。NAFLD分為單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。在NASH中，存在脂肪變 性、小葉內(nèi)炎癥和肝細(xì)胞氣球樣，通常伴隨著進(jìn)行性纖維化。長(zhǎng)期NASH會(huì)發(fā)展為肝硬化，并 且肝細(xì)胞癌（HCC)可能是一種結(jié)果。NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。NAFLD在近數(shù) 十年來(lái)已經(jīng)與增加流行的肥胖、2型糖尿病與高脂血癥一起在世界范圍內(nèi)增力口。NAFLD/NASH 目前被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的慢性肝病。據(jù)估計(jì)，全部成年人的約20%患有NAFLD，而 2-3%的成年人患有NASH。非酒精性脂肪肝疾病是慢性肝病的主要原因。其涵蓋組織病理 學(xué)的范圍，包括肝脂肪變性(脂肪肝）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。
[0015] 肝臟包含可以調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答的NKT細(xì)胞定居群體。例如，含有不變的T細(xì) 胞受體的NKT細(xì)胞，其包含小鼠肝臟中最多20%的T細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞也富集在包含更多樣 化的NKT細(xì)胞的組成部分的人肝臟中（最多10%的T細(xì)胞)。在這兩種物種體內(nèi)，NKT細(xì)胞主 要存在于肝竇狀隙中，在這里它們提供血管內(nèi)的免疫監(jiān)視。NKT細(xì)胞特異性地識(shí)別糖脂抗原 并可以在激活時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞因子。該細(xì)胞亞群可能貢獻(xiàn)于NASH的發(fā)病機(jī)理(參見(jiàn)例如Syn，W. 等人，（2010)Η印atology，51 (6) : 1998-2007)。因此，輸送在體內(nèi)阻斷NKT細(xì)胞的功能的抗 ⑶Id抗體可以具有治療益處。
[0016] 自身免疫性肝病的三個(gè)主要大類(lèi)是自身免疫性肝炎（AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬變 (PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC)。這些疾病各自具有相對(duì)獨(dú)特的臨床、血清學(xué)和組織 學(xué)表現(xiàn)。這三種肝病在肝損傷的病理組織學(xué)形態(tài)方面也各不相同。AIH的特征在于肝實(shí)質(zhì) 的進(jìn)行性破壞，稱(chēng)為界面性肝炎。另一方面，PBC的特征在于小肝內(nèi)膽管的特異性破壞，而 PSC主要涉及大膽管的破壞。盡管這些病況的表現(xiàn)不同，所有這些自身免疫性肝疾病共享 涉及T淋巴細(xì)胞(其識(shí)別和摧毀干細(xì)胞）的肝復(fù)原的免疫介導(dǎo)肝損傷的共同徑路，并最終發(fā) 展為肝纖維化。NKT細(xì)胞可能有助于自身免疫性肝病的病理（Santodomingo_Garzon，T.和 Swain, M. G. (2011)AutoimmunityReviewsl0:793-800)。激活的 NKT 細(xì)胞可以直接通過(guò)上調(diào) 細(xì)胞表面FasL表達(dá)和/或釋放腫瘤壞死因子-a (TNF- α )與穿孔素/粒酶B誘導(dǎo)肝細(xì)胞 死亡。ΝΚΤ細(xì)胞可以通過(guò)釋放促炎細(xì)胞因子例如IFN-γ間接誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡。ΝΚΤ細(xì)胞還 可以產(chǎn)生IL-4,其誘導(dǎo)Th2響應(yīng)和隨后的由漿細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體。由于ΝΚΤ細(xì)胞的活化會(huì) 導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞并最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)展。通過(guò)輸送抗⑶Id抗體阻斷NKT細(xì)胞功能可因 此具有治療益處。除了細(xì)胞因子釋放外，導(dǎo)致細(xì)胞溶解的NKT效應(yīng)細(xì)胞功能,例如穿孔素釋 放和粒酶釋放以及Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，以及其它已知的NKT功能例如IL-2介導(dǎo)的旁觀者 效應(yīng)可能也與涉及NKT細(xì)胞的病況相關(guān)。阻斷NKT細(xì)胞活化劑⑶ld，例如通過(guò)施用抗⑶Id 抗體，也可以調(diào)節(jié)這些NKT效應(yīng)子功能。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 迫切需要抑制CDld介導(dǎo)的細(xì)胞活化并隨后表現(xiàn)出在治療炎性疾病(例如嚴(yán)重的 皮質(zhì)類(lèi)固醇難治性哮喘）中的益處的療法。完全人抗體具有實(shí)現(xiàn)開(kāi)發(fā)提高治療效果的人用 藥物的目的的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。它們可以靶向結(jié)合高度有效的中和表位并在施用于人類(lèi)時(shí)耐受良 好。雖然已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述了結(jié)合CDld并與其反應(yīng)的小鼠抗體，本發(fā)明描述了在抑制 CDld介導(dǎo)的NKT細(xì)胞活化和所得效應(yīng)子功能方面表現(xiàn)出強(qiáng)大效力的人抗體。令人驚訝地， 在某些情況下，這些抗體的效力比現(xiàn)有技術(shù)抗體的當(dāng)前狀態(tài)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。具有顯著提高 的效力的此類(lèi)抗體應(yīng)當(dāng)能夠治療CDld-介導(dǎo)的疾病，并應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)異的臨床療效。
[0019] 因此，在第一方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分， 其中該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)與CDld 的結(jié)合。
[0020] 在第二方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結(jié)合的表位 相同的表位。
[0021] 在第三方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%與之相同的序列的VH域。
[0022] 在第四方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID勵(lì)2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%與之相同的序列的VL域。
[0023] 在第五方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0024] 在第六方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0025] 在第七方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VL域，該VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0026] 在第八方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合具有如使用基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定測(cè)得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合具有0. 5ng/ml 至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0027] 在第九方面中，本發(fā)明提供分離的DNA分子，其編碼本發(fā)明的分離的抗體或其抗 原結(jié)合部分。
[0028] 在第十方面中，本發(fā)明提供在人類(lèi)對(duì)象中治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的 方法，包括向該對(duì)象施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0029] 在第^^一方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中存在CDld的方法，該方法包括使懷疑含 有CDld的樣品與本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分在允許該抗體或其抗原結(jié)合部分 結(jié)合CDld的條件下接觸以形成復(fù)合物并檢測(cè)樣品中該復(fù)合物的存在。
[0030] 在第十二方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)細(xì)胞樣品中CDld陽(yáng)性細(xì)胞的存在的方法，該方 法包括將細(xì)胞群體與本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸以允許該抗體或其抗原 結(jié)合部分結(jié)合CDld陽(yáng)性以形成復(fù)合物并檢測(cè)該抗體或其抗原結(jié)合部分-細(xì)胞復(fù)合物的存 在。
[0031] 在第十三方面中，本發(fā)明提供從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性地結(jié)合人CDld 并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上的結(jié)合的⑶Id結(jié)合 蛋白的方法，該方法包括：
[0032] 在足以允許⑶Id結(jié)合蛋白結(jié)合該突變蛋白以形成⑶Id結(jié)合蛋白-人⑶Id突變 蛋白復(fù)合物和排除的多種沒(méi)有結(jié)合該人CDld突變蛋白的CDld結(jié)合蛋白的條件下，使多種 ⑶Id結(jié)合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID N0:116的氨基酸 位置87至93和141-143已經(jīng)被這些位置處的相應(yīng)的小鼠氨基酸取代，并且
[0033] 從排除的多種CD 1 d結(jié)合蛋白中收集沒(méi)有結(jié)合人CD Id突變蛋白的CD Id結(jié)合蛋白，
[0034] 其中收集的⑶Id結(jié)合蛋白特異性地結(jié)合人⑶Id并與選自401. 1U402.8和 401. 11. 158的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上的結(jié)合。
[0035] 在第十四方面中，本發(fā)明提供從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性地結(jié)合人CDld 的CDld結(jié)合蛋白的方法，該方法包括：
[0036] 在足以允許⑶Id結(jié)合蛋白結(jié)合h⑶ldmu以形成⑶Id結(jié)合蛋白-h⑶ldmu復(fù)合物 和排除的多種沒(méi)有結(jié)合hCDldmu的CDld結(jié)合蛋白的條件下，使多種CDld結(jié)合蛋白接觸其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經(jīng)被這些位置 處的相應(yīng)小鼠序列替代的h⑶ldmu(SEQIDN0 :119)，并且
[0037] 從排除的多種⑶Id結(jié)合蛋白中收集沒(méi)有結(jié)合h⑶ldmu的⑶Id結(jié)合蛋白，
[0038] 其中收集的⑶Id結(jié)合蛋白特異性地結(jié)合人⑶Id (SEQ ID N0:116)或mCDldhu (SEQ ID N0:118)〇
[0039] 在任意上述方面的的一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分還結(jié)合食 蟹猴和獼猴⑶Id。
[0040] 附圖簡(jiǎn)述
[0041] 圖1 :證明通過(guò)抗⑶Id抗體抑制四聚體結(jié)合的測(cè)定結(jié)果的圖示。在使用α-半乳 糖苷神經(jīng)酰胺（a -GalCer)脂質(zhì)裝載的CDld四聚體(其結(jié)合用ΝΚΤ細(xì)胞受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 J. RT3-T3. 5細(xì)胞）的測(cè)定中，由信號(hào)平均熒光強(qiáng)度降低，抗⑶Id抗體401. 11和402. 8與抗 體42和51. 1相比顯示出提高的對(duì)CDld四聚體結(jié)合的抑制。不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物 沒(méi)有顯示出抑制。表2列舉了所有受試抗體的EC50值。
[0042] 圖2:證明通過(guò)抗⑶Id抗體抑制IL-2釋放的測(cè)定結(jié)果的圖示。在使用 a -GalCer-裝載的CDld-陽(yáng)性U-937細(xì)胞和NKT細(xì)胞受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的J. RT3-T3. 5細(xì)胞的 測(cè)定中，如通過(guò)ELISA測(cè)定的那樣，抗CDld抗體402. 8和401. 11與抗CDld抗體42和51. 1 相比在24小時(shí)后顯示出提高的IL-2釋放的抑制。在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性陰性對(duì) 照物抗體沒(méi)有顯示出對(duì)IL-2釋放的抑制。表3中提出了來(lái)自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0043] 圖3 :通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)證明抗⑶Id抗體結(jié)合初生外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)的 測(cè)定結(jié)果的圖示。如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的那樣，作為本說(shuō)明書(shū)中所述抗體實(shí)例而非不相 關(guān)的特異性對(duì)照物抗體的抗⑶Id抗體402. 8結(jié)合初生人PBMC中的⑶Id-陽(yáng)性、⑶11c-陽(yáng) 性群體。
[0044] 圖4 :在使用THP-1細(xì)胞系作為抗原呈遞細(xì)胞的基于初生NKT細(xì)胞的測(cè)定中證明 通過(guò)抗CDld抗體抑制初生NKT細(xì)胞功能的測(cè)定結(jié)果的圖示。如通過(guò)ELISA測(cè)定的那樣，與 抗⑶Id抗體42相比，抗體401. 11和402. 8分別表現(xiàn)出高達(dá)114倍和高達(dá)180倍的24小 時(shí)后的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)釋放的提高的抑制。該結(jié)果來(lái)自于 使用a -GalCer-擴(kuò)增的NKT細(xì)胞和a -GalCer-裝載的THP-1細(xì)胞作為CDld陽(yáng)性細(xì)胞的 測(cè)定。在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體沒(méi)有抑制細(xì)胞因子釋放。表4中給 出了來(lái)自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0045] 圖5 :在使用初生⑶14+單核細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞的基于初生NKT細(xì)胞的測(cè)定 中證明通過(guò)抗⑶Id抗體抑制初生NKT細(xì)胞功能的測(cè)定結(jié)果的圖示。在使用a-GalCer-擴(kuò) 增的NKT細(xì)胞和a -GalCer-裝載的⑶14+單核細(xì)胞-衍生樹(shù)突細(xì)胞作為⑶Id陽(yáng)性細(xì)胞的 測(cè)定中，如通過(guò)ELISA測(cè)定的那樣，與抗⑶Id抗體42和51. 1相比，抗體401. 11和402. 8證 實(shí)了在24小時(shí)后顯著提高的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)釋放的抑制。 在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體沒(méi)有抑制細(xì)胞因子釋放。表5中給出了來(lái) 自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0046] 圖6 :證明高度有效的抗CDld抗體共享不同于通過(guò)較低效現(xiàn)有技術(shù)抗體所看到的 表位的類(lèi)似中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖示。根據(jù)實(shí)施例7,如通過(guò)對(duì)應(yīng)于結(jié)合的生物素 化402. 8 (A)水平的450nm下吸光度讀數(shù)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度（百分比）值（B)所顯示的那樣，使 用基于競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，抗⑶Id抗體402. 8與其本身和與401. 11競(jìng)爭(zhēng)但不與抗⑶Id抗體 42和51. 1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人CDld。
[0047] 圖7 :證明與重組食蟹猴⑶Id的交叉反應(yīng)性的測(cè)定結(jié)果的圖示。根據(jù)實(shí)施例8,抗 CDld抗體401. 11和402. 8結(jié)合人CDld (A)，并通過(guò)ELISA與食蟹猴CDld (B)是交叉反應(yīng) 性的。
[0048] 圖8 :證明與基于食蟹猴細(xì)胞的CDld的交叉反應(yīng)性的測(cè)定結(jié)果的圖示。根據(jù)實(shí)施 例9,如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所示，抗CDld抗體402. 8而非不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體結(jié) 合來(lái)自?xún)芍华?dú)立的食蟹猴供體的PBMC上的⑶Id。數(shù)據(jù)顯示為篩選的活細(xì)胞（gated live cells)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)柱狀圖，以柱狀圖形式劃分CDld陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。
[0049] 圖9 :證明食蟹猴CDld介導(dǎo)的初生NKT擴(kuò)增的細(xì)胞基抑制的測(cè)定結(jié)果的圖示。根 據(jù)實(shí)施例10,如通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)通過(guò)量化CD3+V α 24+細(xì)胞所顯示的那樣，抗CDld抗 體402. 8而不是不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體在a GalCer-裝載的⑶Id-陽(yáng)性PBMC的 存在下抑制食蟹猴NKT細(xì)胞的擴(kuò)增。
[0050] 圖10 :顯示401. 11的可變區(qū)的序列的序列比對(duì)。框出區(qū)含有Kabat編號(hào)系統(tǒng)與增 強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體顯示。 由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0051] 圖11 :顯示402. 8的可變區(qū)的序列的序列比對(duì)?？虺鰠^(qū)含有Kabat編號(hào)系統(tǒng)與增 強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體顯示。 由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0052] 圖12 :401. 11的變體的比對(duì)。根據(jù)實(shí)施例11，顯示了 401. 11對(duì)IGHV-9. 01和 401. 11的變體的重鏈與輕鏈的氨基酸序列比對(duì)。
[0053] 圖13 :401. 11的優(yōu)化變體的比對(duì)。根據(jù)實(shí)施例11，顯示了 401. 11及其變體的重 鏈與輕鏈的氨基酸序列比對(duì)。
[0054] 圖14 :證明通過(guò)抗⑶Id抗體401. 11的增強(qiáng)變體對(duì)初生NKT細(xì)胞功能的提高 抑制的測(cè)定結(jié)果的圖示。根據(jù)實(shí)施例11，401.11及其變體從lyg/mL滴定。在使用 a -GalCer-擴(kuò)增NKT細(xì)胞與a -GalCer-裝載的CD14+單核細(xì)胞-衍生的樹(shù)突細(xì)胞作為 ⑶Id陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定中，401. 11抗體變體證實(shí)與401. 11相比通過(guò)ELISA測(cè)定的在24小時(shí) 后類(lèi)似或提高的IFN- γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制，以及與從10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗 體42和51. 1相比通過(guò)ELISA測(cè)定的在24小時(shí)后顯著提高的IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋 放的抑制。在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體沒(méi)有抑制細(xì)胞因子釋放。表13 中給出了來(lái)自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0055] 圖15 :402. 8的優(yōu)化變體的比對(duì)。根據(jù)實(shí)施例11，顯示了 402. 8對(duì)402. 8的變體 的重鏈的氨基酸序列比對(duì)。
[0056] 圖16 :證明通過(guò)抗⑶Id抗體402. 8的增強(qiáng)變體抑制初生NKT細(xì)胞功能的測(cè)定結(jié) 果的圖示。根據(jù)實(shí)施例11，在使用α-GalCer-擴(kuò)增NKT細(xì)胞和α-GalCer-裝載的CD14+ 單核細(xì)胞-衍生樹(shù)突細(xì)胞作⑶Id陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定中，402. 8及其變體由10 μ g/mL滴定并 證實(shí)與由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗體42相比，通過(guò)ELISA測(cè)定的在24小時(shí)后的類(lèi)似的 IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制，和通過(guò)ELISA測(cè)定的在24小時(shí)后顯著提高的IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制。在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性陰性對(duì)照物抗體沒(méi)有抑制細(xì) 胞因子釋放。在表18中給出了來(lái)自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0057] 圖17 :證明在使用α-GalCer的替代抗原的基于初生NKT細(xì)胞的測(cè)定中通過(guò) 抗CDld抗體對(duì)初生NKT細(xì)胞功能的提高抑制的測(cè)定結(jié)果的圖示。根據(jù)實(shí)施例12,在使用 a -GalCer-擴(kuò)增NKT細(xì)胞和C24:1 β -D-吡喃葡萄糖基神經(jīng)酰胺-裝載的⑶14+單核細(xì) 胞-衍生樹(shù)突細(xì)胞作為⑶Id陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定中，由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗體42和51 相比，由lyg/mL滴定的抗體401. 11. 158、401. 11和402. 8證實(shí)了通過(guò)ELISA測(cè)定的在24 小時(shí)后IFN-γ (A)和IL-4 (B)釋放的顯著提高的抑制。在所有測(cè)定中，不相關(guān)的特異性 陰性對(duì)照物抗體沒(méi)有抑制細(xì)胞因子釋放。在表20中給出了來(lái)自代表性試驗(yàn)的EC50值。
[0058] 圖18 :證明在修正的條件下高度有效的抗⑶Id抗體共享不同于通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)抗 體所看到的表位的類(lèi)似中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖示。根據(jù)實(shí)施例13,如通過(guò)450nm 下吸光度讀數(shù)（A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度(百分比）值（B)所顯示的那樣，抗體402. 8與其本身和與 401. 11競(jìng)爭(zhēng)但不與抗體42和51. 1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人⑶Id。
[0059] 圖19 :證明是401. 11變體的高度有效的抗⑶Id抗體與402. 8共享類(lèi)似中和表位 的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖示。根據(jù)實(shí)施例13,如通過(guò)450nm下吸光度讀數(shù)(A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度 (百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身并與作為401. 11抗體變體實(shí) 例的 401. 11. 160、40L 11. 161 和 401. 11. 165 強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人 CDld。
[0060] 圖20 :證明衍生自402. 8的高度有效的抗⑶Id抗體與402. 8共享類(lèi)似中和表位 的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖示。根據(jù)實(shí)施例13,如通過(guò)450nm下吸光度讀數(shù)(A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度 (百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身并與作為402. 8抗體變體實(shí)例 的 402. 8. 84、402. 8. 86 和 402. 8. 87 強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人 CDld。
[0061] 圖21 :證明單克隆抗人⑶Id抗體不競(jìng)爭(zhēng)402. 8的中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果 圖示。如實(shí)施例13中所述，如通過(guò)吸光度讀數(shù)(A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度(百分比）值（B)所顯示的 那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)但不與其它單克隆抗人⑶Id抗體例如AD58E7、 C3D5和C-9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人CDld。
[0062] 圖22 :證明單克隆抗小鼠⑶Id抗體不競(jìng)爭(zhēng)402. 8的中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果 圖示。如實(shí)施例13中所述，如通過(guò)450nm下吸光度讀數(shù)（A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度（百分比）值（B) 所顯示的那樣，抗CDld抗體402. 8與其本身強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)但不與其它單克隆抗小鼠 CDld抗體 例如HB-321、HB-322和HB-323競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人CDld。
[0063] 圖23 :證明多克隆抗人⑶Id抗體不競(jìng)爭(zhēng)402. 8的中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果 圖示。如實(shí)施例13中所述，如通過(guò)450nm下吸光度讀數(shù)（A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度（百分比）值（B) 所顯示的那樣，抗CDld抗體402. 8與其本身強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)但不與作為多克隆抗人CDld抗體的 實(shí)例的C-19、H70和Ab96515競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人CDld。
[0064] 圖24 :證明高度有效的抗⑶Id抗體共享不同于其它抗⑶Id抗體所結(jié)合表位的類(lèi) 似中和表位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果圖示。如實(shí)施例13中所述，如通過(guò)450nm下吸光度讀數(shù) (A)與競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)化度（百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體401. 11. 158與其本身并與 402. 8強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)，但不與抗⑶Id抗體42和51. 1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人⑶Id。
[0065] 圖25 :證明402. 8以及Fab或全長(zhǎng)IgG形式的40L 1L 165結(jié)合至人CDld的ELISA 結(jié)果的圖示。
[0066] 圖26 :用于闡明抗⑶Id抗體結(jié)合的人⑶Id上的位置的⑶Id結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)。
[0067] 圖27 :證明結(jié)合人⑶Id和已經(jīng)向其中引入人序列的小鼠 ⑶Id (mCDldhu)的抗體 402. 8 (A)與401. 11. 158 (B)的滴定的ELISA結(jié)果的圖示。兩種抗體均沒(méi)有結(jié)合小鼠 ⑶Id 和已經(jīng)向其中引入小鼠序列的人⑶Id (h⑶ldmu)。
[0068] 圖28 :證明抗人CDld抗體的表位的氫氘交換圖譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示。（A)具有以黑 色顯示的氨基酸89-94和141-14的人⑶Id (灰色)。注意：X射線結(jié)構(gòu)是具有表面描述的 3HUJ。（B)與NKT細(xì)胞受體（α和β鏈)復(fù)合的人CDld(具有結(jié)合的α-GalCer)。人CDld 上的抗⑶Id抗體的表位(氨基酸89-94和141-142)的原子用深灰色著色。該抗⑶Id抗體 的表位位于該NKT細(xì)胞受體β -鏈的結(jié)合位點(diǎn)的附近。
[0069] 圖29Α :優(yōu)化的401. 11抗體的VH區(qū)的比對(duì)和共有序列?？虺鰠^(qū)含有Kabat編號(hào)系 統(tǒng)與增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體 顯示。由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0070] 圖29B :優(yōu)化的401. 11抗體的八區(qū)的比對(duì)和共有序列?？虺鰠^(qū)含有Kabat編號(hào)系 統(tǒng)與增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體 顯示。由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0071] 圖30A:優(yōu)化的402. 8抗體的VH區(qū)的比對(duì)和共有序列?？虺鰠^(qū)含有Kabat編號(hào)系 統(tǒng)與增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體 顯示。由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0072] 圖30B :優(yōu)化的402. 8抗體的八區(qū)的比對(duì)和共有序列。框出區(qū)含有Kabat編號(hào)系 統(tǒng)與增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R以粗體 顯示。由增強(qiáng)Chothia編號(hào)系統(tǒng)定義的⑶R具有下劃線。
[0073] 發(fā)明詳述
[0074] 本發(fā)明涉及結(jié)合CDld的特定表位的人和人源化的抗體及其抗原結(jié)合部分。本發(fā) 明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合CDld的這種表位的抗體在減輕CDld對(duì)NKT細(xì)胞的影響方面特別有效。 由于這種影響，據(jù)信這些抗體與其抗原結(jié)合部分將可用于治療其中NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能 (例如NKT細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生細(xì)胞因子）起作用的病況，例如哮喘。
[0075] 因此，在第一方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分， 其中該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)與CDld 的結(jié)合。
[0076] 在第二方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結(jié)合的表位 相同的⑶Id表位。
[0077] 在第三方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%與之相同的序列的VH域。
[0078] 在第四方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID勵(lì)2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%與之相同的序列的VL域。
[0079] 在第五方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0080] 在本發(fā)明的這一方面的實(shí)施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154), GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127), GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，CDR2 的序列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、EINPSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:133)或EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:134)。
[0081] 在第六方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0082] 在本發(fā)明的第六方面的實(shí)施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127)、GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，CDR2 的序列是 IWNSAI (SEQ ID N0:137)、NHSGS (SEQ ID N0:138)、NPSGS (SEQ ID NO:139)或 NHAGS (SEQ ID NO:140)。
[0083] 在第七方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分包含VL域，該VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0084] 在本發(fā)明的第七方面的實(shí)施方案中，⑶R3的序列是QQANRFPLT (SEQ ID N0:141) 或LLYFGDTQLGV (SEQ ID N0:142)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，CDR2的序列是AASSLQS (SEQ IDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
[0085] 在第八方面中，本發(fā)明提供結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合具有如使用基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定測(cè)得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在實(shí)施方案中，該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合具有0. 5ng/ml至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0086] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO: 2的VH和VL序列對(duì)。
[0087] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 46 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0088] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQID NO: 24 和 SEQ ID NO:47 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0089] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的VH和VL序列對(duì)。
[0090] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 48 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0091] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 49 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0092] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 50 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0093] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 28 和 SEQ ID NO: 51 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0094] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 52 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0095] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 53 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0096] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 54 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0097] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 55 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0098] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 56 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0099] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 34 和 SEQ ID NO: 57 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0100] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 58 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0101] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 59 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0102] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQID NO: 37 和 SEQ ID NO: 60 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0103] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 38 和 SEQ ID NO: 61 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0104] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO :40 和 SEQ ID NO :62 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0105] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 41 和 SEQ ID NO: 63 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0106] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID N0:42 和 SEQ ID N0:64 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0107] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對(duì)。
[0108] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對(duì)。
[0109] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對(duì)。
[0110] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對(duì)。
[0111] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO :43 和 SEQ ID NO :65 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0112] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO :44 和 SEQ ID NO :66 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0113] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQ ID NO :45 和 SEQ ID NO :67 的 VH 和 VL 序列對(duì)。
[0114] 在任一上述方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人⑶Id (SEQ ID NO: 116)，但是不結(jié)合h⑶ldmu (SEQ ID NO: 119)。在任意上述方面的一個(gè)實(shí)施方案 中，該抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合mCDldhu (SEQ ID N0:118)，但是不結(jié)合mCDld (SEQ ID N0:117)。
[0115] 在第九方面中，本發(fā)明提供分離的DNA分子，其編碼本發(fā)明的分離的抗體或其抗 原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的DNA分子選自以下SEQ ID N0的任意種：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115或至少95%與之相同的序列或在中等至高度嚴(yán)格條件 下與之雜交的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的DNA分子選自以下SEQ ID N0的任一種：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114 或 115。
[0116] 在第十方面中，本發(fā)明提供在人類(lèi)對(duì)象中治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的 方法，包括向?qū)ο笫┯帽景l(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0117] 在第十一方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中存在CDld的方法，其包括使懷疑含有 CDld的樣品與本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分在允許該抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié) 合CDld的條件下接觸以形成復(fù)合物并檢測(cè)樣品中該復(fù)合物的存在。
[0118] 在第十二方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)細(xì)胞樣品中CDld陽(yáng)性細(xì)胞的存在的方法，該 方法包括將細(xì)胞群體與本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸以允許該抗體或其抗 原結(jié)合部分結(jié)合CDld陽(yáng)性以形成復(fù)合物并檢測(cè)該抗體或其抗原結(jié)合部分細(xì)胞復(fù)合物的存 在。
[0119] 在第十三方面中，本發(fā)明提供從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性地結(jié)合人CDld 并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上的結(jié)合的⑶Id結(jié)合 蛋白的方法，該方法包括：
[0120] 在足以允許CDld結(jié)合蛋白結(jié)合該突變蛋白以形成CDld結(jié)合蛋白-人CDld突變蛋 白復(fù)合物和排除的多種沒(méi)有結(jié)合該人CDld突變蛋白的CDld結(jié)合蛋白的條件下使多種CDld 結(jié)合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID NO: 116位置87至93 和141-143的氨基酸已經(jīng)被這些位置處的相應(yīng)的小鼠氨基酸取代，并且從排除的多種⑶Id 結(jié)合蛋白中收集沒(méi)有結(jié)合人CDld突變蛋白的CDld結(jié)合蛋白，其中收集的CDld結(jié)合蛋白特 異性地結(jié)合人⑶Id并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上 的結(jié)合。
[0121] 在第十四方面中，本發(fā)明提供從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性地結(jié)合人CDld 的CDld結(jié)合蛋白的方法，該方法包括：
[0122] 在足以允許⑶Id結(jié)合蛋白結(jié)合h⑶ldmu以形成⑶Id結(jié)合蛋白-h⑶ldmu復(fù)合物 和排除的多種沒(méi)有結(jié)合hCDldmu的CDld結(jié)合蛋白的條件下，使多種CDld結(jié)合蛋白與其中 位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經(jīng)被相應(yīng)于小鼠 的這些位置處的序列替代的h⑶ldmu (SEQ ID N0:119)接觸，并從排除的多種⑶Id結(jié)合蛋 白中收集沒(méi)有結(jié)合hCDldmu的CDld結(jié)合蛋白，其中收集的CDld結(jié)合蛋白特異性地結(jié)合人 CDld(SEQIDN0:116)或mCDldhu(SEQIDN0:118)。本發(fā)明的抗CDld抗體還可以用于 從血液中識(shí)別或選擇CDld陽(yáng)性細(xì)胞群體?？笴Dld抗體可用于在人類(lèi)患者的外周血中檢測(cè) CDld陽(yáng)性細(xì)胞群，包括骨髓細(xì)胞如單核細(xì)胞，或淋巴樣細(xì)胞如B細(xì)胞。該抗體可用于在其中 此類(lèi)⑶Id陽(yáng)性細(xì)胞導(dǎo)致疾病的病況中檢測(cè)這些細(xì)胞，所述疾病例如是某些白血病，包括慢 性淋巴細(xì)胞白血病（CLL) (Metelitsa 等人，Leukemia(2003) 17, 1068 - 1077 ;Kotsianidis 等人，2011 ;AmJClinPathl36, 400-408)。
[0123] 該抗人CDld抗體還可以用于使用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)組織切片進(jìn)行染色用于免 疫組織化學(xué)。
[0124] 在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案中，該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分可以包含人 kappa鏈恒定區(qū)或人lambda鏈恒定區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該分離的抗體或其抗原結(jié)合部 分包含IgGl或IgG4恒定區(qū)。當(dāng)該抗體包含IgG4恒定區(qū)時(shí)，其可以包括S228P突變。
[0125] 本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分的DNA分子。在某些實(shí) 施方案中，該DNA分子的序列選自SEQ ID N0. 10至18、SEQ ID N0S68至115或至少95%與 之相同的序列或在中等至高度嚴(yán)格條件下與之雜交的序列的任意一種。
[0126] 本發(fā)明還提供在人類(lèi)對(duì)象中治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的方法，其包括 向該對(duì)象施用本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分?？梢灾委煹纳婕癗KT細(xì)胞效應(yīng)子功 能例如NKT細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生細(xì)胞因子的病況實(shí)例包括牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎、原發(fā)性膽汁性 肝硬化、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、哮喘和與鐮 狀細(xì)胞病相關(guān)的肺部炎癥或機(jī)能障礙。
[0127] 如在下列實(shí)施例中描述的那樣，本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了結(jié)合CDld的特定表位的有 效抗體。確定這個(gè)表位的性質(zhì)是抗體和抗原提供（arm)的領(lǐng)域中的技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。 本領(lǐng)域那些技術(shù)人員公知的可用于確定抗體401. 11和402. 8結(jié)合的⑶Id表位的方法包括 CDld丙氨酸掃描誘變、氫/氣交換圖譜(mapping)、X射線晶體學(xué)、核磁共振和光親和標(biāo)記 法。
[0128] 丙氨酸掃描誘變（參見(jiàn)例如 Ausubel: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN047 150338, 1987，第 8 和 15 章；或 Cunningham 等 人，1989Science244 1081-5)在CDld分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變。隨后對(duì) 所得突變分子測(cè)試它們結(jié)合該401. 11和/或402. 8抗體的能力。損失結(jié)合意味著已經(jīng)變 為丙氨酸的特定殘基可能包括在該表位中。
[0129] 在使用氫氘交換的表位圖譜中，CDld中的氫在溶液中用氘交換。該401. 11和/或 402. 8抗體隨后結(jié)合到CDld上，其隨后在H20中交換回氫。在該方法中，存在于該表位中的 氘被抗體的結(jié)合保護(hù)。比較受該抗體結(jié)合保護(hù)和未受保護(hù)的CDld的交換模式揭示了作為 保留氣的CDld的氣基酸殘基的該表位。
[0130] 在X射線晶體學(xué)中，將401. 11和/或402. 8抗體與之結(jié)合的⑶Id結(jié)晶，并通過(guò) X射線衍射檢查該晶體。這種方法提供了抗體與之結(jié)合的CDld的區(qū)的明確信息。核磁共 振或光親和標(biāo)記也可使用，如deVos等人，1992Science255 306-12 ;和Smith等人，1992J MolBiol224 899-904 中所述。
[0131] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的那樣，通過(guò)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分識(shí)別的表 位可以包含氨基酸的線性系列或可以是構(gòu)象表位。
[0132] 在一方面中，本發(fā)明涉及與至少一種選自401. 11和402. 8的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人⑶Id 的抗體。
[0133] 本文中所用的"競(jìng)爭(zhēng)"指的是該抗體或其抗原結(jié)合部分以濃度依賴(lài)性方式降低了 選自 40L 11、40L 1L 28、402· 8、402· 8. 45、402· 8. 53 和 402. 8. 60 的至少一種抗體與 CDld 的結(jié)合。在下面給出的實(shí)施例7中提供了評(píng)估其的方式的一個(gè)實(shí)例。特別地，當(dāng)選自401. 11 和402. 8的至少一種抗體與測(cè)試抗體的結(jié)合比與相同濃度使用的抗體42或51. 1結(jié)合極大 降低時(shí)，抗體或其抗原結(jié)合部分被稱(chēng)為與至少一種選自401. 11和402. 8的抗體"競(jìng)爭(zhēng)"與 CDld的結(jié)合(現(xiàn)有技術(shù)的抗體42和5L 1描述在Exley等人，1997JExp Medl86, 109-120和 W003/092615 中）。
[0134] 如本文中所述，"競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDld"的抗體或其抗原結(jié)合部分在競(jìng)爭(zhēng)ELISA的歸一 化結(jié)果中表現(xiàn)出至少50%的競(jìng)爭(zhēng)，其中40 μ g/mL的非生物素化測(cè)試抗體與結(jié)合到固定在固 體底物上的1. 〇 μ g/mL重組人⑶Id上結(jié)合的0. 2 μ g/mL生物素化抗⑶Id抗體402. 8或 40L 11 或 40L 1L 158 競(jìng)爭(zhēng)。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合具有如使 用基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定測(cè)得的小于20ng/ml的EC50的CDld。在某些實(shí)施方案中，該分離的 抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合至具有〇. 5ng/ml至20ng/ml的EC50的⑶Id。如本文中所用， 如下文給出的實(shí)施例4中那樣評(píng)估該抗體或其抗原結(jié)合部分的EC50。
[0136] 如上所述，該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合CDld。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"特 異性地"指的是與CDld的結(jié)合是經(jīng)由該抗體或其抗原結(jié)合部分的VH和VL域并且不是非特 異性結(jié)合(例如可以經(jīng)Fc區(qū)發(fā)生的）。
[0137] 如在下列實(shí)施例中所述，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與人CDld、和食蟹猴或 獼猴⑶Id結(jié)合。這與現(xiàn)有技術(shù)的抗體42和51. 1不同。
[0138] 人⑶Id的氨基酸序列可以是例如：
[0139] MGCLLFLLLWALLQAWGSAEVPQRLFPLRCLQISSFANSSffTRTDGLAffLGELQTHSffSNDSDTVRSLK PWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQG TSWEPTQEAPLffVNLAIQVLNQDKWTRETVQffLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAffLSRGPSPGPGRLLLV CHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQP⑶ILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYT SMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL (SEQ ID 勵(lì)：157)人0)1(1的此1?1'(^登錄號(hào)為 P15813。
[0140] 在另一方面，本發(fā)明涉及抗體，其結(jié)合與選自401. 11和402. 8(在某些實(shí)施方案中 為40. 11. 158)的至少一種抗體所結(jié)合的表位相同的⑶Id的表位。如上所述，通過(guò)特定抗 體結(jié)合的CDld的表位可以通過(guò)許多方法評(píng)估，并且隨后可以與指定抗體所結(jié)合的表位進(jìn) 行比較。
[0141] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該表位包含SEQ ID N0:116的殘基141至143或SEQIDN0:116 的殘基87至93和141至143。
[0142] 本文中所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"廣泛地指由四條多肽鏈--兩條重（H)鏈和兩條輕（L) 鏈--組成的任何免疫球蛋白（Ig)分子，或其保留了 Ig分子的必需表位結(jié)合特征的任何 功能性片段、突變體、變體或其衍生物。此類(lèi)突變體、變體或衍生物抗體形式是本領(lǐng)域已知 的。下面討論其非限制性實(shí)施方案。
[0143] 在全長(zhǎng)抗體中，各重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫(xiě)為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū) 組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮 寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以 進(jìn)一步細(xì)分為稱(chēng)作互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的超可變區(qū)，該超可變區(qū)點(diǎn)綴有稱(chēng)為框架區(qū)（FR)的更 保守的區(qū)。各VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，其以下列次序從氨基端向羧基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何類(lèi)型(例如，IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類(lèi)別（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類(lèi)。
[0144] 本文中所用術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"指的是保留了特異性地結(jié)合抗原(例如 CDld)的能力的抗體或蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)表明，抗體的抗原結(jié)合功能可以通 過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)施。此類(lèi)抗體實(shí)施方案還可以是雙特異性、雙重特異性的或多重特 異性的形式；特異性地結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)不同的抗原。涵蓋在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分" 中的結(jié)合片段的實(shí)例包括（i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段；（ii) F (ab'）2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；（iii )由VH和 CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（v)結(jié)構(gòu) 域抗體（dAb) (Ward 等人，1989Nature341544_6，Winter 等人，PCT 公開(kāi) W090/05144,均 經(jīng)此引用并入本文)，其包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域；和（vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)。此外，盡 管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但可以使用重組方法，通過(guò)能夠使其 制成單個(gè)蛋白質(zhì)鏈的合成連接子，將它們接合，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成一價(jià)分子(稱(chēng)為 單鏈 Fv(scFv));(參見(jiàn)例如 Bird 等人，1988Science242 423-6 ;Huston 等人，1988Proc Natl Acad Sci USA85 5879-83)。此類(lèi)單鏈抗體也意在涵蓋在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部 分"中。還涵蓋了其它形式的單鏈抗體，例如也涵蓋雙抗體。雙抗體是二價(jià)的、雙特異性的 抗體，其中在單個(gè)多肽鏈上表達(dá)VH和VL結(jié)構(gòu)域，但使用太短以至于不允許同一鏈上兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接子，由此迫使該結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)（參見(jiàn)例如 Holliger, Ρ·等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 ; Poljak，R.J.等人，1994, Structure2:1121-1123)。此類(lèi)抗體結(jié)合部分在本領(lǐng)域中是已知 的（Kontermann和Dubel 編輯，Antibody Engineering2001Springer-Verlag.New York.第 790 頁(yè)，ISBN3-540-41354-5)。
[0145] 本文中描述的抗體可以是人源化抗體。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"應(yīng)理解為是指包含類(lèi)人 可變區(qū)的蛋白質(zhì)，其包括移植到或插入到來(lái)自人抗體的FR中的來(lái)自源于非人物種(例如小 鼠或大鼠或非人靈長(zhǎng)目動(dòng)物）的抗體的CDR (這種類(lèi)型的抗體也稱(chēng)為"CDR移植抗體")。人 源化抗體還包括其中人蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)殘基被一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換改性和/或人 蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)FR殘基用相應(yīng)的非人殘基替換的蛋白質(zhì)。人源化抗體還可以包含既 非在人抗體中或也非在非人抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。該蛋白質(zhì)的任何附加區(qū)(例如Fc區(qū))通常是 人的。人源化可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如US 5225539、US 6054297、US 7566771 或US5585089。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"還涵蓋超人源化蛋白質(zhì)，例如如在US 7732578中所述。
[0146] 本文中所述的抗體可以是人的。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"人抗體"指的是具有在人類(lèi) 中，例如在人類(lèi)種系或體細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)的可變抗體區(qū)和任選恒定抗體區(qū)的蛋白質(zhì)或來(lái)自使 用此類(lèi)區(qū)制得的文庫(kù)的蛋白質(zhì)。"人"抗體可以包括并非由人序列編碼的氨基酸殘基，例如 通過(guò)在體外的隨機(jī)或定點(diǎn)突變引入的突變(特別是包括在少量蛋白質(zhì)殘基中，例如在蛋白 質(zhì)的殘基的1、2、3、4、或5中的保守性置換或突變的突變)。這些"人抗體"不一定需要作為 人的免疫響應(yīng)而產(chǎn)生，相反，它們可以使用重組手段(例如篩選噬菌體展示文庫(kù))和/或通過(guò) 包含編碼人抗體恒定和/或可變區(qū)的核酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠）和/或使用定向選擇 (例如如US5565332中所述)產(chǎn)生。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋此類(lèi)抗體的親和力成熟形式。就本公開(kāi)目 的而言，人蛋白質(zhì)還被認(rèn)為包括含有來(lái)自人抗體的FR或包含來(lái)自人FR的共有序列的序列 的FR，其中CDR的一種或多種是隨機(jī)或半隨機(jī)的，例如如US6300064和/或US6248516中所 述。
[0147] 可以根據(jù)Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health，Bethesda，Md·，1987 和 1991 (在本文中也稱(chēng)為 "Kabat 編號(hào)系 統(tǒng)"）來(lái)限定指定給⑶R和FR的氨基酸位置。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)Enhanced Chothia Numbering Scheme ( http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)限定指定給 CDR 和 FR 的 氨基酸位置。根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)，VHFR和⑶R可如下定位：殘基1-30 (FRl)、31-35 (CDRl)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66-94 (FR3)、95-102 (CDR3)和 103-113 (FR4)。 根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)，VLFR和CDR如下定位：殘基1-23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)和 98-107 (FR4)。本公開(kāi)不限于通 過(guò)Kabat編號(hào)系統(tǒng)限定的FR和CDR,而是包括所有編號(hào)系統(tǒng)，包括規(guī)范的編號(hào)系統(tǒng)或 Chothia和Lesk，J.MolBiol. 196:901-917, 1987 ;Chothia等人，Nature342, 877-883, 1989 ; 和 / 或 Al-Lazikani 等人，JMolBiol273, 927-948, 1997 ;Honnegher 和 Pliikthun 的 編號(hào)系統(tǒng) J. Mol. Biol. , 309:657-670, 2001 ;或在 Giudicelli 等人，Nucleic Acids Res.，25:206-2111997中所討論的頂GT系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)限定該 ⑶R。任選地，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的重鏈⑶R2不包含本文中列舉的五個(gè)C-端氨基酸，或者 這些氨基酸的任意一個(gè)或多個(gè)被另一天然存在的氨基酸置換。在附加的或替換的選項(xiàng)中， 輕鏈CDR1不包含本文中列舉的四個(gè)N-端氨基酸，或者那些氨基酸的任意一個(gè)或多個(gè)被另 一天然存在的氨基酸置換。在這方面，Padlan等人，F(xiàn)ASEBJ.，9:133-139, 1995證實(shí)了重鏈 CDR2的五個(gè)C端氨基酸和/或輕鏈CDR1的四個(gè)N端氨基酸通常不涉及抗原結(jié)合。
[0148] 本文中所用的術(shù)語(yǔ)"抗體構(gòu)建體"指的是包含連接到連接多肽或免疫球蛋白恒定 結(jié)構(gòu)域上的本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部分的多肽。連接多肽包含兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)肽鍵 接合的氨基酸殘基并用于連接一個(gè)或更多抗原結(jié)合部分。此類(lèi)連接多肽在本領(lǐng)域中是公知 的（參見(jiàn)例如 Holliger 等人，1993Proc Natl Acad Sci USA90 6444-8)。
[0149] 免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域指的是重鏈或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié) 構(gòu)域氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的，并且實(shí)例如下所示。
[0150] 人重鏈IgGl恒定域(或其衍生物，如NCBI登錄號(hào)：P01857)
[0151] ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIΕΚΤISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:158)
[0152] 人重鏈IgG4恒定結(jié)構(gòu)域(如NCBI登錄號(hào)：P01861)
[0153] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:159)
[0154] 參入S228P突變的人重鏈IgG4恒定結(jié)構(gòu)域
[0155] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:160)
[0156] 如US7, 083, 784中所述的參入S228P突變和YTE突變的人重鏈IgG4恒定結(jié)構(gòu)域 也可以使用。
[0157] 人輕鏈kappa恒定結(jié)構(gòu)域(如NCBI登錄號(hào)：P01834)
[0158] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:161)
[0159] 人輕鏈lambda恒定結(jié)構(gòu)域(如NCBI登錄號(hào)：P01842)
[0160] QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASS YLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:162)
[0161] 如將被理解的，本發(fā)明中開(kāi)發(fā)和描述的序列可以使用本領(lǐng)域公知的方法改性以提 高結(jié)合，例如通過(guò)親和力成熟，或通過(guò)除去預(yù)測(cè)的MHCII類(lèi)結(jié)合基序來(lái)降低免疫原性。可 以通過(guò)調(diào)節(jié)其功能特性，如抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)、補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性 (⑶C)、血清半衰期、生物分布和與Fc受體結(jié)合或任意這些方法的組合來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)本文 中開(kāi)發(fā)和描述的序列的治療實(shí)用性。這種調(diào)節(jié)可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程、糖工程或化學(xué)方法來(lái) 實(shí)現(xiàn)。取決于所需的治療應(yīng)用，可以有利地提高或降低這些活性的任意種。
[0162] 用于抗體的親和力成熟的多種方法在本領(lǐng)域是已知的。這些方法許多基于通過(guò)誘 變并接著為提高的親和力而選擇和/或篩選生成變體蛋白的組或文庫(kù)的一般策略。誘變通 常在0嫩水平進(jìn)行，例如通過(guò)易錯(cuò)？0?法（111丨6!1200916丨11〇(18]\1〇18丨〇1.525:309-22)，通 過(guò)基因改組（Kolkman 和 Stemmer2001Nat Biotechnol. May; 19 (5) :423_8)，通過(guò)使用誘變 化學(xué)物質(zhì)或輻射，通過(guò)使用具有易錯(cuò)復(fù)制機(jī)制的"突變子"株（Green er1996)或通過(guò)利用天 然親和力成熟機(jī)制的體細(xì)胞超突變方法（Peled，Kuang等人，2008)。還可以在RNA水平下進(jìn) 行誘變，例如通過(guò)使用Q3復(fù)制酶（Kopsidas，Roberts等人，2006)酶。允許篩選提高的變 體蛋白的基于文庫(kù)的方法可以基于各種展示技術(shù)，如噬菌體、酵母、核糖體、細(xì)菌或哺乳動(dòng) 物細(xì)胞，并且在本領(lǐng)域是公知的（Benhar2007)。親和力成熟可以通過(guò)更有針對(duì)性/更有預(yù) 測(cè)性的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或通過(guò)來(lái)自3D蛋白質(zhì)建模的發(fā)現(xiàn)所指導(dǎo)的基因合 成(參見(jiàn)例如Queen, Schneider等人，1989或美國(guó)專(zhuān)利6, 180, 370或美國(guó)專(zhuān)利5, 225, 539)。
[0163] 用于調(diào)節(jié)抗體血清半衰期和生物分布的多種方法基于改變抗體與新生Fc受體 (FcRn)之間的相互作用，所述新生Fc受體是在保護(hù)IgG免受分解代謝并保持高血清抗 體濃度中起關(guān)鍵作用的受體。Dali' Acqua等人描述了在IgGl的Fc區(qū)中增強(qiáng)與FcRn的 結(jié)合親和力的置換，由此提高血清半衰期（Dali' Acqua，Woods等人，2002)，并用M252Y/ S254T/T256E (YTE突變）的三重置換進(jìn)一步證實(shí)了增強(qiáng)的生物利用率與ADCC活性的 調(diào)節(jié)（Dali，Acqua, Kiener 等人，2006)。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6, 277, 375 ;6, 821，505 ;和 7, 083, 784。Hinton等人已經(jīng)描述了賦予提高的體內(nèi)半衰期的在位置250和428處的恒 定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換（Hinton, Johlfs等人，2004) (Hinton, Xiong等人，2006)。還參見(jiàn) 美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 217, 797。Petkova等人已經(jīng)描述了賦予提高的體內(nèi)半衰期的在位置307、 380和434處的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換（Petkova, Akilesh等人，2006)。還參見(jiàn)Shields 等人（511丨61(18，似111611業(yè)等人，2001)和冊(cè)2000/42072?？贵w恒定區(qū)還可以改性以去除 效應(yīng)子功能。位置297處的天冬酰胺（N)突變?yōu)楣劝滨０罚≦)去除了介導(dǎo)Fc向Fc受體 的結(jié)合的N-聯(lián)碳水化合物。此類(lèi)糖基化抗體不結(jié)合到人Fc γ RI并且不會(huì)激活補(bǔ)體途徑 (complementpathway) (Tao和Morrisonl989)。調(diào)節(jié)與Fc受體的結(jié)合以及隨后通過(guò)這些 受體介導(dǎo)的功能(包括FcRn結(jié)合和血清半衰期）的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換的其它實(shí)例描述 在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?20090142340 ;20090068175 ;和 20090092599 中。
[0164] 在包含F(xiàn)c區(qū)的本發(fā)明的分子中，在某些實(shí)施方案中工程設(shè)計(jì)置換L235E中以 減少或消除Fc結(jié)合和Fc相關(guān)效應(yīng)子功能是有利的，如在Lund, Winter等人，（1991) J Immunologyl47:2657-2662 和 Alegre 等人，（1992) J Immunologyl48:3461-3468 中所述。 該抗體可以是IgGl，和IgG3或IgG4。
[0165] 在包含F(xiàn)c區(qū)的本發(fā)明的分子中，在某些實(shí)施方案中工程設(shè)計(jì)或以其它方式選擇 其中C端賴(lài)氨酸（K447)被刪除的Fc是有利的。優(yōu)選這種修改通過(guò)降低表達(dá)的分子的異質(zhì) 性而提高可制造性。
[0166] 連接抗體分子的多糖已知會(huì)影響抗體與Fc受體和多糖受體的相互作用并由此影 響抗體活性，包括血清半衰期（Kaneko, Nimmer jahn等人，2006Jones, Papac等人，2007 ; 和Kanda，Yamada等人，2007)。因此，調(diào)節(jié)期望的抗體活性的某些糖形可以賦予治療優(yōu) 勢(shì)。產(chǎn)生工程的糖形的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 602, 684 ; 7, 326, 681 ;7, 388, 081 ;和 W02008/006554 中描述的那些。
[0167] 通過(guò)添加聚乙二醇（PEG)延長(zhǎng)半衰期已經(jīng)廣泛用于延長(zhǎng)蛋白質(zhì)的血清半衰期，如 例如由Fishburn2008所綜述的。
[0168] 本發(fā)明還提供包含至少一種本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分的組合物。這 種組合物通常將包含至少一種配制劑，所述配制劑選自無(wú)菌水、無(wú)菌緩沖水和/或至少一 種防腐劑，所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、芐醇、對(duì)羥基苯甲酸烷基 酯、苯扎氯銨、芐索氯銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或其在水性稀釋劑中的混合物，任選地，其 中蛋白質(zhì)的濃度為約〇. lmg/ml至約200mg/ml，進(jìn)一步包含至少一種等滲劑或至少一種生 理可接受的緩沖劑。
[0169] 本發(fā)明的抗體組合物可以任選進(jìn)一步包含有效量的至少一種化合物或蛋白質(zhì)， 其選自抗感染藥、心血管（CV)系統(tǒng)藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)藥、自主神經(jīng)系統(tǒng)（ANS)藥、呼 吸道藥、胃腸（GI)道藥、激素藥、用于體液或電解質(zhì)平衡的藥、血液學(xué)藥、抗腫瘤藥、免疫 調(diào)節(jié)藥、眼、耳或鼻藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥等等的至少一種。這些藥在本領(lǐng)域是公知的，包 括各種本文中提出的制劑、指征、劑量和給藥(參見(jiàn)例如Nursing2001Handbook of Drugs, 第 21 版，Springhouse Corp. , Springhouse, Pa.,2001 ；Health ProfessionalJ s Drug Guide2001,編輯Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N. J.； Pharmcotherapy Handbook, Wells 等人編輯，Appleton&Lange, Stamford, Conn.,其各自經(jīng) 此引用全文并入本文)。
[0170] 本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含任何合適的助劑的至少一種，例如但不限于稀 釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等等。優(yōu)選藥學(xué)上可接受 的助劑。此類(lèi)無(wú)菌溶液的非限制性實(shí)例及其制備方法在本領(lǐng)域是公知的，例如但不限 于 Gennaro 編輯，Remington, sPharmaceutical Sciences,第 18 版，Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990?？梢匀绫绢I(lǐng)域中公知或如本文中所述那樣常規(guī)選擇適于給藥方式、 抗體組合物的溶解性和/或穩(wěn)定性的藥學(xué)可接受載體。
[0171] 可用于本組合物的藥物賦形劑和添加劑包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì) 和碳水化合物(例如，糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇類(lèi)、醛糖酸 類(lèi)、酯化糖類(lèi)等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以單獨(dú)或組合地存在，單獨(dú)或組合地構(gòu)成 1-99. 99重量％或體積％。示例性蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白，如人血清白蛋白（HSA)、重 組人白蛋白（rHA)、明膠、酪蛋白等等。也可以在緩沖能力方面起作用的代表性的氨基酸包 括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一種優(yōu)選的氨基酸是組氨酸。第二 優(yōu)選的氨基酸是精氨酸。
[0172] 適用于本發(fā)明的碳水化合物賦形劑包括例如單糖類(lèi)，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、 葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖類(lèi)，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維素二糖等等；多糖 類(lèi)，例如蜜三糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇類(lèi)，例如甘露糖醇、木糖 醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（山梨醇)、肌醇等等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的碳水化合 物賦形劑是甘露糖醇、海藻糖和蜜三糖。
[0173] 抗體組合物還可以包括緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑；通常，緩沖劑是由有機(jī)酸或堿制備的 鹽。代表性的緩沖劑包括有機(jī)酸鹽，如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或鄰苯二甲酸的鹽；Tris、鹽酸氨丁三醇（tromethamine)或磷酸鹽緩沖劑。用于本組合 物的優(yōu)選緩沖劑是有機(jī)酸鹽，如檸檬酸鹽。
[0174] 此外，本發(fā)明的組合物可以包含聚合賦形劑/添加劑，如聚乙烯吡咯烷酮、菲可 (一種聚合糖)、葡萄糖結(jié)合劑(例如，環(huán)糊精，如2-羥丙基-β -環(huán)糊精)、聚乙二醇、調(diào)味劑、 抗微生物齊?、甜味齊?、抗氧化齊?、抗靜電齊?、表面活性劑(例如聚山梨酯，例如" TWhHN? 20"和" TWEEN? 80")、脂質(zhì)(例如磷脂、脂肪酸)、類(lèi)固醇(例如膽固醇）和螯合劑(例如 EDTA)。
[0175] 適用于本發(fā)明的抗體組合物的這些和其它已知藥物賦形劑和/或添加劑在 本領(lǐng)域中是己知的，例如如在"Remington:The Science&Practice of Pharmacy"， 第 19 版，Williams&Williams, (1995)和在 "Physician，sDesk Reference"，第 52 版，MedicalEconomics, Montvale, N. J. (1998)中所列舉的，其公開(kāi)內(nèi)容經(jīng)此引用全部并入 本文。優(yōu)選的載體或賦形劑材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)或 聚合劑。
[0176] 本發(fā)明還提供了治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的方法，其包括施用該抗體 或其抗原結(jié)合部分。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能"意在包括由致使NKT細(xì)胞的 CDld限制性糖脂活化所產(chǎn)生的NKT細(xì)胞功能。此類(lèi)功能包括但不必要限于以下的任意一種 或多種：由NKT細(xì)胞的腫瘤壞死因子a (TNF- α )、IFN- γ、IL-4、IL-5或IL-13釋放，NKT 細(xì)胞表面FasL表達(dá)的上調(diào)、釋放穿孔素以及由ΝΚΤ細(xì)胞釋放粒酶Β。
[0177] 給藥途徑可以選自寬范圍的給藥途徑，包括腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、推注（bolus)、 腹膜內(nèi)、皮下、呼吸、吸入、局部、鼻、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)、真皮下和經(jīng)皮。但是目 前據(jù)信最合適的途徑是腸胃外或吸入。關(guān)于吸入蛋白質(zhì)的附加信息可以在Borish LC等 人，1999Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160(6)，1816-1823 中找到。
[0178] 對(duì)于腸胃外給藥，該抗體或其抗原結(jié)合部分可以配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干 粉末，與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體結(jié)合或單獨(dú)地提供。此類(lèi)載體的實(shí)例是水、鹽水、林格 氏溶液、右旋葡萄糖溶液和1-10%的人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水性載體，如不 揮發(fā)油。載體或凍干粉末可含有保持等滲性的添加劑(例如氯化鈉、甘露糖醇）和保持化學(xué) 穩(wěn)定性的添加劑(例如，緩沖劑和防腐劑)。通過(guò)已知的或合適的技術(shù)將該制劑滅菌。
[0179] 本發(fā)明的分離的核酸分子可以包括包含開(kāi)放閱讀框（0RF)的核酸分子，任選具有 一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，例如但不限于分別具有至少一個(gè)重鏈或輕鏈的至少一個(gè)⑶R (如⑶R1、 CDR2和/或CDR3)的至少一個(gè)特定部分；包含抗體或其抗體結(jié)合部分的編碼序列的核酸分 子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列但其因遺傳密碼簡(jiǎn)并仍編碼本文中所述的 和/或本領(lǐng)域已知的至少一種抗體或抗體結(jié)合部分的核酸分子。當(dāng)然，遺傳密碼在本領(lǐng)域 中是公知的。因此，產(chǎn)生編碼本發(fā)明的特異性抗體或其抗體結(jié)合部分的此類(lèi)簡(jiǎn)并核酸變體 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的。參見(jiàn)例如Ausubel等人(上文)，并且此類(lèi)核酸變體包括 在本發(fā)明中。
[0180] 如本文中所示，包含編碼抗體或其抗體結(jié)合部分的核酸的本發(fā)明的核酸分子可以 包括但不限于自身編碼抗體或其抗體結(jié)合部分的氨基酸序列的那些；整個(gè)抗體或其抗體結(jié) 合部分的編碼序列；抗體或其抗體結(jié)合部分的編碼序列以及附加序列，例如至少一個(gè)信號(hào) 前導(dǎo)或融合肽的編碼序列，含有或不含有前述附加編碼序列，例如至少一個(gè)內(nèi)含子，以及附 加的非編碼序列，包括但不限于非編碼5'和3'序列，如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(包括剪接和多 腺苷酸化信號(hào)--例如核糖體結(jié)合和mRNA的穩(wěn)定性）中起作用的轉(zhuǎn)錄、未翻譯的序列；編 碼附加氨基酸的附加編碼序列，例如提供附加功能的那些。由此，編碼抗體或其抗體結(jié)合部 分的序列可以融合成標(biāo)記序列(例如編碼有助于純化該融合抗體或其抗體結(jié)合部分的肽的 序列)。
[0181] 本發(fā)明提供了在選擇性雜交條件下與編碼本發(fā)明的抗體或其抗體結(jié)合部分的多 核苷酸雜交的分離的核酸。因此，該具體實(shí)施方案的多核苷酸可以用于分離、檢測(cè)和/或量 化包含此類(lèi)多核苷酸的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以用于識(shí)別、分離或擴(kuò)增保藏文 庫(kù)中的部分或全長(zhǎng)克隆。在某些具體實(shí)施方案中，該多核苷酸是從人或哺乳動(dòng)物核酸文庫(kù) 分離的基因組或cDNA序列，或者是與來(lái)自人或哺乳動(dòng)物核酸文庫(kù)的cDNA互補(bǔ)的基因組或 cDNA序列。
[0182] 該cDNA文庫(kù)優(yōu)選包含至少80%的全長(zhǎng)序列，優(yōu)選至少85%或90%的全長(zhǎng)序列，更 優(yōu)選至少95%的全長(zhǎng)序列?？梢詫DNA文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化以提高罕見(jiàn)序列的呈現(xiàn)。通常，但不限 于，與相對(duì)于互補(bǔ)序列具有降低的序列同一性的序列，使用低或中等嚴(yán)格雜交條件。對(duì)于同 一性較高的序列，任選使用中等和高度嚴(yán)格條件。低嚴(yán)格條件允許具有約70%的序列同一 性的序列的選擇性雜交，并可以用于識(shí)別直系同源序列或旁系同源序列。
[0183] 任選地，本發(fā)明的多核苷酸將編碼由本文中所述多核苷酸編碼的抗體或其抗原結(jié) 合部分的至少一部分。本發(fā)明的多核苷酸包括可用于與編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部 分的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列（參見(jiàn)例如Ausubel,上文)。
[0184] 可以使用本領(lǐng)域公知的（a)重組方法，（b)合成技術(shù)，和（c)純化技術(shù)，或其組合來(lái) 制備本發(fā)明的分離的核酸。
[0185] 該核酸可以方便地包含除本發(fā)明的多核苷酸外的序列。例如，可以將包含一個(gè)或 多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)插入到該核酸中以幫助多核苷酸的分離。此外， 可以插入可翻譯序列以幫助分離本發(fā)明的翻譯的多核苷酸。例如，六-組氨酸標(biāo)記序列提 供方便的手段以純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。除該編碼序列外，本發(fā)明的核酸任選是用于克隆和 /或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體、接頭或連接區(qū)。
[0186] 可以將附加序列添加到此類(lèi)克隆和/或表達(dá)序列中以?xún)?yōu)化它們?cè)诳寺『?或表達(dá) 中的功能，以便幫助多核苷酸的分離，或改善將多核苷酸引入到細(xì)胞中。克隆載體、表達(dá)載 體、接頭和連接區(qū)的使用在本領(lǐng)域中是公知的(參見(jiàn)例如Ausubel,上文)。
[0187] 可以使用任何數(shù)量的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆方法，從生物來(lái)源獲得本發(fā)明的 分離的核酸組合物，例如RNA、cDNA、基因組DNA或其任意組合。在一些具體實(shí)施方案中，在 嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針用于在cDNA或基因組DNA文 庫(kù)中識(shí)別所需序列。RNA的分離以及cDNA和基因組文庫(kù)的構(gòu)建是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知 的(參見(jiàn)例如Ausubel,上文)。
[0188] 可以使用基于本發(fā)明的多核苷酸序列（如本文公開(kāi)的那些）的探針來(lái)篩選cDNA或 基因組文庫(kù)。探針可以用于與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同生物體中的 同源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在測(cè)定中可以使用各種嚴(yán)格程度的雜交；并且雜交或 洗滌介質(zhì)可以是嚴(yán)格的。當(dāng)雜交條件變得更嚴(yán)格時(shí)，用于發(fā)生雙鏈體形成的探針與靶標(biāo)之 間的互補(bǔ)程度必須更高?？梢酝ㄟ^(guò)溫度、離子強(qiáng)度、pH和存在部分變性溶劑(例如甲酰胺） 的存在中的一種或多種來(lái)控制嚴(yán)格程度。例如，通過(guò)經(jīng)由在0%至50%范圍內(nèi)控制甲酰胺 濃度來(lái)改變反應(yīng)物溶液的極性，由此方便地改變雜交的嚴(yán)格性。可檢測(cè)結(jié)合所需的互補(bǔ)性 (序列同一性)程度將根據(jù)雜交介質(zhì)和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而變化?；パa(bǔ)性程度最適宜為 100%，或90-100%，或其中任何的范圍或值。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，探針和引物中較小的序列 變化可以通過(guò)降低雜交和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性來(lái)補(bǔ)償。
[0189] RNA或DNA的擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以基于本文中提供的教導(dǎo) 和指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明使用，而無(wú)需過(guò)度試驗(yàn)。已知的DNA或RNA的擴(kuò)增方法包括但不限 于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和相關(guān)的擴(kuò)增方法(參見(jiàn)例如授予Mullis等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4, 683, 195、4, 683, 202、4, 800, 159、4, 965, 188 ;授予 Tabor 等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4, 795, 699 和4, 921，794 ;授予Innis的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 142,033 ;授予Wilson等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 122,464 ;授予Innis的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,091，310 ;授予Gyllensten等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 066, 584 ;授予Gelfand等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 889, 818 ;授予Silver等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4, 994, 370 ;授予Biswas的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 766, 067 ;授予Ringold的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 656, 134) 和使用作為用于雙鏈DNA合成的模板的目標(biāo)序列的反義RNA的RNA介導(dǎo)擴(kuò)增(授予Malek等 人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 130, 238,商標(biāo)名為NASBA)，參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容經(jīng)此引用并入本文(參 見(jiàn)例如Ausubel,上文）。
[0190] 例如，PCR技術(shù)可以用于擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸序列和直接來(lái)自基因組DNA或 cDNA文庫(kù)的相關(guān)基因。PCR和其它體外擴(kuò)增方法也可用于例如克隆編碼待表達(dá)蛋白質(zhì)的 核酸序列、制造用作檢測(cè)樣品中所需mRNA的存在、用于核酸測(cè)序或用于其它目的的探針 的核酸。通過(guò)體外擴(kuò)增方法足以指導(dǎo)技術(shù)人員的技術(shù)實(shí)例可以在下列參考文獻(xiàn)中找到： Ausubel,上文，以及Mullis等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,202 (1987);和Ihnis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds, Academic Press Inc. , San Diego, Calif. (1990)。用于基因組PCR擴(kuò)增的市售試劑盒在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)例如 Advantage?-GC Genomic PCR Kit (Clontech)QT4 基因 32 蛋白（Boehringer Mannheim) 可以用于提高長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率。
[0191] 還可以通過(guò)已知方法通過(guò)直接化學(xué)合成來(lái)制備本發(fā)明的分離的核酸(參見(jiàn)例如 Ausubel等人，上文)?；瘜W(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡核苷酸，其可以通過(guò)與互補(bǔ)序列的雜交，或 通過(guò)使用單鏈作為模板用DNA聚合酶進(jìn)行聚合，轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí) 至IJ，雖然DNA的化學(xué)合成限于約100個(gè)或更多個(gè)堿基的序列，但是通過(guò)較短序列的連接可以 獲得更長(zhǎng)的序列。通過(guò)重疊寡核苷酸的組裝來(lái)合成更長(zhǎng)的序列在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
[0192] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的核酸的重組表達(dá)盒。本發(fā)明的核酸序列，例如， 編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的cDNA或基因組序列，可以用于構(gòu)建重組表達(dá)盒，該 重組表達(dá)盒可以被引入至少一個(gè)所需宿主細(xì)胞中。重組表達(dá)盒通常包含可操作地連接至轉(zhuǎn) 錄起始調(diào)控序列的本發(fā)明的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列將指導(dǎo)多核苷酸在預(yù)期的宿 主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄?？梢允褂卯愒春头钱愒矗磧?nèi)源）啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明核酸的表達(dá)。
[0193] 在一些實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的非異源形式的多核苷酸的合適位置中（上游、 下游或內(nèi)含子中）引入用作啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他元件的分離的核酸，以上調(diào)或下調(diào)本發(fā)明 的多核苷酸的表達(dá)。例如，可以通過(guò)突變、刪除和/或置換在體內(nèi)或體外改變內(nèi)源性啟動(dòng) 子。
[0194] 本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的分離的核酸分子的載體、用該重組載體遺傳工程化的 宿主細(xì)胞和如本領(lǐng)域中公知的那樣通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)至少一種抗體或其抗原結(jié)合部分。參 見(jiàn)例如Ausubel等人，上文?？梢匀芜x將該多核苷酸接合到含有可選標(biāo)記的載體上用于在 宿主中繁殖。通常，在沉淀物如磷酸鈣沉淀物中或在與帶電荷的脂質(zhì)的復(fù)合物中引入質(zhì)粒 載體。如果載體是病毒，可以使用合適的包裝細(xì)胞系在體外將其包裝并隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì) 胞中。
[0195] DNA插入物應(yīng)當(dāng)可操作地與合適的啟動(dòng)子連接。表達(dá)構(gòu)建體將進(jìn)一步含有用于 轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)，并且在轉(zhuǎn)錄區(qū)中，含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建體表 達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分優(yōu)選將包含適當(dāng)位于待翻譯的mRNA末端的開(kāi)始和終止密碼子 (例如UAA、UGA或UAG)上的翻譯起始，UAA和UAG優(yōu)選用于哺乳動(dòng)物或真核細(xì)胞的表達(dá)。
[0196] 表達(dá)載體優(yōu)選但任選包括至少一個(gè)可選擇的標(biāo)記。此類(lèi)標(biāo)記包括但不限于對(duì)真 核細(xì)胞培養(yǎng)具有抗性的氨甲蝶呤（MTX)、二氫葉酸還原酶（DHFR，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 399, 216 ; 4, 634, 665 ;4, 656, 134 ;4, 956, 288 ;5, 149, 636 和 5, 179, 017)、氨芐青霉素、新霉素 (G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶（GS，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 122,464 ;5, 770, 359和5, 827, 739)， 以及對(duì)于在大腸桿菌和其它細(xì)菌或原核生物中的培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因（上 述專(zhuān)利經(jīng)此引用全文并入本文)。用于上述宿主細(xì)胞的合適的培養(yǎng)基和條件在本領(lǐng)域中是 已知的。合適的載體對(duì)于技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的?？梢酝ㄟ^(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它已知方法實(shí)現(xiàn)將載體構(gòu)建體 引入宿主細(xì)胞中。此類(lèi)方法描述在本領(lǐng)域中，例如Ausubel,上文，第1、9、13、15、16章。
[0197] 可以以改進(jìn)的形式，例如融合蛋白，來(lái)表達(dá)本發(fā)明的至少一種抗體或其抗原結(jié)合 部分，并且不僅可以包括分泌信號(hào)，而且還包括附加的異源功能區(qū)。例如，可以將附加氨基 酸(特別是帶電荷的氨基酸)區(qū)，添加至抗體或其抗原結(jié)合部分的N-端以提高純化過(guò)程或隨 后的操作和存儲(chǔ)過(guò)程中在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。此外，可以將肽部分添加到本發(fā) 明的抗體或其抗原結(jié)合部分中以促進(jìn)純化。在抗體或其至少一個(gè)片段的最終制備之前，可 以將此類(lèi)區(qū)除去。此類(lèi)方法描述在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中，例如Ausubel，上文，第16、17和 18章。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以得知可用于編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)的許多表達(dá) 系統(tǒng)。
[0198] 可選地，通過(guò)在含有編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的內(nèi)源DNA的宿主細(xì)胞 中啟始(通過(guò)操縱)，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。此類(lèi)方法在本領(lǐng)域中是公知的， 例如如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 580, 734、5, 641，670、5, 733, 746和5, 733, 761中描述，其通過(guò)參考全 文并入本文。
[0199] 用于生產(chǎn)抗體、其特定部分或變體的說(shuō)明性細(xì)胞培養(yǎng)物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系統(tǒng)通常是單層細(xì)胞的形式，盡管也可以使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液或生物反應(yīng)器。 本領(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)了許多能夠表達(dá)完整糖基化蛋白質(zhì)的合適宿主細(xì)胞系，并且包括cos-ι (例 如 ATCCCRL1650)、C0S-7 (例如 ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如 ATCCCRL-10)、CH0 (例 如 ATCCCRL1610 )和 BSC-1 (例如 ATCCCRL-26 )細(xì)胞系、C0S-7 細(xì)胞、CH0K1SV 細(xì)胞、h印G2 細(xì) 胞、P3X63Ag8. 653、SP2/0-Agl4、293細(xì)胞、海拉細(xì)胞等等，其可以容易地獲自例如American Type Culture Collection, Manassas, Va。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括淋巴來(lái)源的細(xì)胞，例如骨髓 瘤和淋巴瘤細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是CH0K1 (ATCC:CRL-9618)或CH0K1SV (例如Lonza Biologies)。
[0200] 用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)以下的表達(dá)控制序列，例如但不限于， 復(fù)制起點(diǎn)；啟動(dòng)子(例如，晚期或早期SV40啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 168, 062 ; 5,385,839)，HSVtk啟動(dòng)子，pgk啟動(dòng)子(磷酸甘油酸激酶）啟動(dòng)子，EF-la啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān) 利號(hào)5, 266, 491)，至少一種人免疫球蛋白啟動(dòng)子；增強(qiáng)子，和/或加工信息位點(diǎn)，如核糖體 結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)（例如，SV40大TAgpolyA添加位點(diǎn)）和轉(zhuǎn)錄終止 子序列。參見(jiàn)例如Ausubel等人，上文。用于生產(chǎn)本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的其它細(xì)胞是已 知的和/或可獲自例如美國(guó)典型培養(yǎng)物中心的細(xì)胞系和雜交瘤目錄(WWW. atcc. org)或其 它已知或商業(yè)來(lái)源。
[0201] 使用真核宿主細(xì)胞時(shí)，通常將聚腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止子序列參入到該載體 中。終止子序列的一個(gè)實(shí)例是來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因的聚腺苷酸化序列。還可以包含 用于精確剪接轉(zhuǎn)錄本的序列。剪接序列的實(shí)例是來(lái)自SV40的VP1內(nèi)含子（Sprague等 人，1983JVir 〇145773-81)。此外，如本領(lǐng)域已知的那樣，可以將控制宿主細(xì)胞中復(fù)制的基因 序列參入到載體中。
[0202] 如將要看到的那樣，本說(shuō)明書(shū)使用術(shù)語(yǔ)" ％相同"來(lái)描述大量序列。要理解的是，術(shù) 語(yǔ)"％相同"指的是在特定區(qū)的兩個(gè)序列的比較中，兩個(gè)序列在相同位置具有特定數(shù)目的相 同殘基。同一性水平可以使用具有缺省參數(shù)的CLUSTALW來(lái)確定。
[0203] 還應(yīng)當(dāng)指出的是，該序列與比較序列"至少95%相同"。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選該 序列與比較序列至少96%或至少97%或至少98%或至少99%相同。
[0204] 本文中所用的與雜交條件相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"中等嚴(yán)格"指的是在2XSSC緩沖液， 0. l%(w/v)SDS中在45°C至65°C溫度下或等價(jià)條件下進(jìn)行的雜交和/或洗滌。本文中所用 的與雜交條件相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"高度嚴(yán)格"指的是在0. 1XSSC緩沖液，0. l%(w/v)SDS或更低鹽 濃度中并在至少65 °C的溫度下或等價(jià)條件下進(jìn)行的雜交和/或洗滌。本文中提到特定水平 的嚴(yán)格性包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的除SSC之外的洗滌/雜交溶液的等價(jià)條件。例如， 計(jì)算雙鏈核酸的鏈分解時(shí)的溫度(也稱(chēng)為熔融溫度，或Tm)的方法在本領(lǐng)域是已知的。類(lèi)似 于(例如在5°C內(nèi)或在10°C內(nèi)）或等于核酸的Tm的溫度被認(rèn)為是高度嚴(yán)格的。中等嚴(yán)格性 被認(rèn)為在核酸的計(jì)算Tm的10°C至20°C內(nèi)或10°C至15°C內(nèi)。
[0205] 在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，詞語(yǔ)"包含"（或變形如"comprises"或"comprising"）將理解 為意味著包括所述要素、整體（integer)或步驟，或要素、整體或步驟的組，但不排除任何其 它要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組。
[0206] 本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物經(jīng)此引入并入本文。本說(shuō)明書(shū)中已經(jīng)包括的文獻(xiàn)、 法案、材料、裝置、論文等等的任何討論僅是用于提供本
【發(fā)明內(nèi)容】
的目的。并未視為允許這 些內(nèi)容的任一或全部構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或者是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識(shí)，如 在本申請(qǐng)的每個(gè)權(quán)利要求的 優(yōu)先權(quán)日:之前，其存在于澳大利亞或別處。
[0207] 必須注意，如本說(shuō)明書(shū)中所用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代物， 除非上下文另行明確指出。因此，例如，"一個(gè)"的提法包括單個(gè)以及兩個(gè)或多個(gè)；"一種"的 提法包括單種以及兩種或多種；"該"的提法包括單個(gè)以及兩個(gè)或多個(gè)，等等。
[0208] 已經(jīng)概括地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下列實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，下列實(shí)施 例以說(shuō)明的方式提供，且不是限制性的。
[0209] 本發(fā)明的實(shí)施例
[0210] 一般方法
[0211] HEK293/pTT5 表達(dá)系統(tǒng)
[0212] 對(duì)于涉及HEK293E/pTT5表達(dá)系統(tǒng)的所有轉(zhuǎn)染，HEK293E細(xì)胞在完全細(xì)胞生長(zhǎng)介 質(zhì)（1 升的 F17 培養(yǎng)基（Invitrogen)，9 毫升的 PluronicF68 (Invitrogen)，含有 20%(w/v) TryptoneNI (Organotechnie)和 50 μ L/100mL 培養(yǎng)液的 Geneticin (50mg/mL, Invitrogen) 的2mMGlutamine)中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染之前的那天，通過(guò)離心采集細(xì)胞并重新懸浮在不含 Geneticin的新鮮培養(yǎng)基中。第二天，將DNA與市售轉(zhuǎn)染試劑混合，并將該DNA轉(zhuǎn)染混合物 逐滴添加到培養(yǎng)物中。在沒(méi)有Geneticin的情況下將培養(yǎng)物在37°C、5%C02和120rpm下培 養(yǎng)整夜。第二天，每500毫升培養(yǎng)物添加12. 5毫升的Tryptone和250微升的Geneticin。 該培養(yǎng)物在37°C、5%C02和120rpm下培養(yǎng)七天，隨后收集上清液并純化。
[0213] CDld/P2M 蛋白質(zhì)
[0214] 使用與編碼β2Μ的DNA表達(dá)構(gòu)建體（SEQ ID N0:20)共轉(zhuǎn)染的、編碼具有位于HIS 標(biāo)簽的C端（SEQ ID N0:19)的CDld胞外域的DNA表達(dá)構(gòu)建體，在哺乳動(dòng)物的HEK293E/pTT5 表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)人⑶Id/ β 2M。通過(guò)2000g下離心10分鐘采集含有分泌的⑶Id/ β 2M蛋白 質(zhì)的培養(yǎng)物上清液以除去細(xì)胞。使用His Trap TM HP柱（GE Healthcare)經(jīng)His8親和標(biāo) 簽由該上清液提純?cè)揅Dld/β 2M蛋白質(zhì)復(fù)合物。洗脫的蛋白質(zhì)用HiL〇adl6/60Superdex200 制備級(jí)柱（GEHealthcare)緩沖交換到PBS中，并在HiLoad26/60Superdex200制備級(jí)柱 (GE Healthcare)上通過(guò)凝膠過(guò)濾分離?50kDa的級(jí)份。以類(lèi)似方式單獨(dú)制造人β 2M并 純化。采取類(lèi)似的純化方法純化其它物種的CDld (例如小鼠 CDld)和CDld的合成構(gòu)建體 (如 hCDldmu 和 mCDldmu)。
[0215] 為了確定食蟹猴⑶Id的序列，從Biochain獲得來(lái)自猴脾臟的cDNA。下列底物用 于擴(kuò)增基于獼猴 CDld mRNA 的 CDld DNA (PubMed 登錄號(hào)：NM_001033114):
[0216] FI-GTGCCTGCTGTTTCTGCTG (SEQ ID NO:120)
[0217] R1-TGCCCTGATAGGAAGTTTGC (SEQ ID NO:121)
[0218] 建立擴(kuò)增了 lkbDNA產(chǎn)物的PCR。使用M13正向與反向引物將該DNA連接到 pGEM-TEasy (Promega)中并測(cè)序。該序列與稱(chēng)猴⑶Id (UniProt登錄號(hào)：Q4AD67)的序列 比對(duì)并發(fā)現(xiàn)是相同的。隨后合成該基因序列，添加 C端HIS標(biāo)簽，亞克隆到pTT5載體中并 使用該ΗΕΚ-293Ε/ρΤΤ5系統(tǒng)表達(dá)。使用Ni層析經(jīng)引入的HIS標(biāo)簽純化該蛋白質(zhì)。
[0219] 對(duì)于噬菌體展示試驗(yàn)，使用EZ-linkSulfo-NHS-LC-生物素試劑盒（Pierce)以3:1 的biotin:⑶Id/β 2M比率將重組人⑶Id/β 2M生物素化。使用具有3. 5kDa分子量篩截 的Slide-A-Lyzer透析盒通過(guò)在PBS中的透析從蛋白質(zhì)制劑中除去游離生物素。對(duì)于活動(dòng) (campaign) 2,也如上所述制備生物素化重組食蟹猴⑶Id/ β 2M。
[0220] 表達(dá)抗體的載體的構(gòu)建
[0221] 表達(dá)具有人恒定區(qū)(人IgG4重鏈CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）（例如在S228P處 具有置換的NCBI登錄號(hào)P01861)的VH氨基酸鏈。這可以通過(guò)將氨基酸序列反向翻譯為 DNA序列并隨后重新合成和組裝合成的寡核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。在基因合成后，將整個(gè)序列亞克隆 到PTT5重鏈載體的多個(gè)克隆位點(diǎn)中（Durocher, Y.等人，2002, NucleicAcidsRes, 30, E9)。 通過(guò)將該序列亞克隆到pTT5輕鏈載體的多個(gè)克隆位點(diǎn)中，表達(dá)具有人kappa或lambda輕 鏈恒定區(qū)(如NCBI登錄號(hào)AAI10395和C6KXN3)的VL氨基酸鏈。
[0222] 抗體的表達(dá)和純化
[0223] 將重鏈和輕鏈DNA載體共轉(zhuǎn)染到HEK293/pTT5表達(dá)系統(tǒng)中并培養(yǎng)七天。在裝載到 HiTrapProteinA柱（5毫升，GEHealthcare)上之前將獲自這些轉(zhuǎn)染的上清液調(diào)節(jié)至ρΗ7· 4。 該柱用50毫升的1XPBS (ρΗ7. 4)洗滌。使用0. 1Μ檸檬酸ρΗ2. 5進(jìn)行洗脫。洗脫的抗體用 Zeba脫鹽柱（Pierce)脫鹽到1XPBS (ρΗ7·4)中。該抗體用SDS-PAGE分析?？贵w濃度使用 BCA測(cè)定試劑盒（Pierce)測(cè)定。
[0224] 實(shí)施例1--生成抗⑶Id抗體
[0225] 噬菌體展示
[0226] 從首次用于試驗(yàn)的噬菌粒文庫(kù)中分離與人和食蟹猴CDld/ β 2M結(jié)合的FAbs。
[0227] 在兩次淘選"活動(dòng)"（即具有不同試劑或淘選條件的分離的噬菌體展示試驗(yàn)）過(guò)程 中從噬菌體展示文庫(kù)中分離抗⑶Id/ β 2MFAbs。一般試驗(yàn)規(guī)程遵循Marks等人概述的方法 (Marks, J. D. &Bradbury, A. , 2004, MethodsMolBiol, 248, 161-76)〇
[0228] 各噬菌體展示活動(dòng)包含三輪淘選。對(duì)每一輪，通過(guò)與封閉緩沖液(在磷酸鹽緩沖鹽 水中的5%脫脂奶，pH7. 4) 1:1混合并在室溫下培育1小時(shí)，將?IX 1013噬菌體粒子封閉。 封閉的噬菌體文庫(kù)隨后通過(guò)用100微升鏈霉親和素偶聯(lián)的Dynabead (Invitrogen)培育45 分鐘來(lái)預(yù)排除鏈霉親和素結(jié)合劑，將該鏈霉親和素偶聯(lián)的Dynabead如對(duì)文庫(kù)所述進(jìn)行封 閉。在培育步驟后將該珠粒（以及連接于其上的鏈霉親和素結(jié)合劑）丟棄。
[0229] 通過(guò)捕獲至鏈霉親和素偶聯(lián)的Dynabead (Invitrogen)表面來(lái)制備重組⑶Id/ β2Μ抗原用于淘選。為此，10-100皮摩爾的生物素化⑶Id/β2Μ用100微升珠粒在室溫下 培育45分鐘。將所得CDld/ β 2Μ-珠粒復(fù)合物用PBS洗滌以除去游離的CDld/ β 2Μ并隨即 用于隨后的淘選反應(yīng)。
[0230] 通過(guò)將封閉的和預(yù)排除的文庫(kù)與該⑶Id/ β 2Μ-珠粒復(fù)合物在1. 5毫升微量離心 管中混合并在室溫下旋轉(zhuǎn)2小時(shí)來(lái)進(jìn)行文庫(kù)淘選。用一系列洗滌除去非特異性結(jié)合的噬菌 體。每次洗滌包括用磁架將珠粒復(fù)合物由溶液中牽引到管壁上，吸取上清液，并隨后將珠粒 再次懸浮在新鮮的洗滌緩沖液中。該洗滌用PBS洗滌緩沖液(含有0. 5%脫脂奶的PBS)或 PBS-T洗滌緩沖液(含有0. 05%吐溫20 (Sigma)和0. 5%脫脂奶的PBS)重復(fù)多次。通過(guò)用 〇. 5毫升的100mM三乙胺（TEA)(Merck)在室溫下培育20分鐘，將洗滌過(guò)程后保持結(jié)合的噬 菌體從⑶Id/ β 2M-珠粒復(fù)合物中洗脫。通過(guò)添加0. 25毫升的lMTris-HClpH7. 4 (Sigma) 來(lái)中和洗脫的"輸出"噬菌體。
[0231] 在第一和第二輪淘選結(jié)束時(shí)，將該輸出噬菌體添加到10毫升指數(shù)增長(zhǎng)的TG1 大腸桿菌(酵母-胰胨（YT)生長(zhǎng)培養(yǎng)基）的培養(yǎng)物中，并通過(guò)在37°C下在無(wú)搖振的情況 下培育30分鐘并隨后在250rpm的搖振下30分鐘以感染該細(xì)胞。將編碼該噬菌體展 示輸出的噬菌粒隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)計(jì)劃再活化（rescued)作為噬菌體粒子（Marks, J. D.&Bradbury，A.，2004, Methods Mol Biol, 248, 161-76)。在第三輪淘選結(jié)束時(shí)，用輸出噬 菌體感染該TG1細(xì)胞，但是細(xì)胞以足夠的稀釋度在固體YT生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2%的葡萄糖 和100微克/毫升的羧芐青霉素）上鋪板以制備離散的大腸桿菌菌落。這些菌落用于接種 1毫升液體培養(yǎng)物以允許表達(dá)用于篩選試驗(yàn)的FAb片段。
[0232] 用于⑶Id結(jié)合的基于ELISA的篩選
[0233] 各單獨(dú)的大腸桿菌菌落用于表達(dá)FAb，篩選該FAb的⑶Id/ β 2M結(jié)合活性。將菌 落接種到96孔深孔板（Costar)中的1毫升ΥΤ起子培養(yǎng)物(補(bǔ)充有100微克/毫升的羧芐 青霉素和2%的葡萄糖)并在以650rpm搖振的情況下在30°C下培育整夜。這些起子培養(yǎng)物 以1:50稀釋為1毫升表達(dá)培養(yǎng)物(僅用100微克/毫升的羧芐青霉素補(bǔ)充的YT)并生長(zhǎng)至 600nm下0. 8-1. 0的光學(xué)密度。通過(guò)添加異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷至ImM的最終濃 度來(lái)誘導(dǎo)FAb表達(dá)。培養(yǎng)物在20°C下培育16小時(shí)。
[0234] 通過(guò)離心（2500g，10分鐘）采集細(xì)胞并進(jìn)行周質(zhì)提取來(lái)制備FAb樣品。將細(xì)胞 聚合體再懸浮于75微升提取緩沖液（30mM Tris-HCl，pH8.0，lmM EDTA，20%蔗糖）中并 以lOOOrpm在4°C下?lián)u振10分鐘。通過(guò)添加225微升的H20,在lOOOrpm下?lián)u振1小時(shí) 并通過(guò)在2500g下離心10分鐘以澄清提取物，由此完成提取物制備。將上清液回收，經(jīng) AcropreplOOkDa分子量篩截板（Pall Corporation)過(guò)濾并在4°C下儲(chǔ)存直到下一次試驗(yàn) 需要的時(shí)候。
[0235] 為了通過(guò)ELISA篩選由噬菌體展示產(chǎn)生的潛在人⑶Id-結(jié)合劑，將人⑶Id/β 2M (如上所述在ΗΕΚ293Ε細(xì)胞中制得并生物素化）以1微克/毫升捕獲在涂布鏈霉親和素的 ELISA板（Pierce)上。隨后洗滌該板并將單獨(dú)的FAb樣品(如上所述制備)添加到ELISA板 上的單個(gè)孔中。讓FAb在室溫下結(jié)合捕獲的⑶Id/β 2M兩小時(shí)，隨后用PBS-T洗滌三次和 用PBS洗滌三次。使用針對(duì)融合到FAb重鏈C端的V5親和標(biāo)簽（Sigma)的HRP-綴合抗體 檢測(cè)結(jié)合的FAb。檢測(cè)抗體在室溫下培育1.5小時(shí)。洗滌該板以除去未結(jié)合的抗體，并通 過(guò)用50微升3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（KPL)培育并用50 μ L1MHC1猝滅以顯現(xiàn)測(cè)定信號(hào)。 測(cè)定信號(hào)使用酶標(biāo)儀（Bio-Tek)在A450nm下讀數(shù)。結(jié)果表示為原始A450nm值，其中任何 大于平均測(cè)定背景2倍的信號(hào)定義為"陽(yáng)性"。
[0236] 在后面的測(cè)定中，制備單獨(dú)涂布未生物素化的人⑶Id/β 2M、食蟹猴⑶Id/β 2M或 的β2Μ的MaxisorpELISA板（Nunc)以檢測(cè)FAb樣品的結(jié)合。洗漆和檢測(cè)步驟如上所述。
[0237] 對(duì)CD 1 d/ β 2M結(jié)合的FAb的SPR基篩選
[0238] 使用BIAcore4000Biosensor (GEHealthcare)以單一濃度分析物通過(guò)測(cè)定進(jìn) 行SPR篩選。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)在pH5. 5下在四個(gè)流動(dòng)池各個(gè)的點(diǎn)1、2、4和5上將約 10, 000RU 的抗 V5 抗體（Invitrogencat#R960CUS)固定在 CM5Series S Sensor 芯片上，留 下點(diǎn)3未修飾。所用運(yùn)行緩沖液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，所有相互作用在25°C下測(cè) 得，并將數(shù)據(jù)收集速率設(shè)定為10Hz。在各流動(dòng)池的點(diǎn)1或5上以10微升/分鐘的流速捕獲 100秒(通常捕獲約200RU的FAb)之前，將V5-標(biāo)記的FAbs的粗周質(zhì)制劑在運(yùn)行緩沖液中 稀釋兩倍。在短暫的穩(wěn)定期后，人或食蟹猴CDld/ β 2M同時(shí)以30微升/分鐘的流速在所有 四個(gè)流動(dòng)池的所有點(diǎn)上通過(guò)100秒。在使用lOOmM磷酸的30秒脈沖再生回抗V5抗體之前 測(cè)量相互作用的解離100秒。產(chǎn)生的傳感圖參考每個(gè)流動(dòng)池的相鄰抗V5抗體點(diǎn)，并用1:1 朗繆爾方程擬合以確定ka、kd和KD。
[0239] 噬菌體展示活動(dòng)的結(jié)果
[0240] 通過(guò)SPR測(cè)定對(duì)于與人和食蟹猴⑶Id/ β 2M的結(jié)合篩選了超過(guò)4400個(gè)克隆。發(fā) 現(xiàn)總計(jì)51種FAbs具有對(duì)人和食蟹猴CDld的高選擇性。
[0241] 實(shí)施例2--證實(shí)IgG結(jié)合CDld
[0242] 將人-食蟹猴⑶Id反應(yīng)性FAb轉(zhuǎn)化為IgG4格式，將其如一般方法中所述表達(dá)并 純化。使用實(shí)施例1中描述的改進(jìn)版本的測(cè)定通過(guò)ELISA和SPR測(cè)試純化抗體與人和食蟹 猴⑶Id的結(jié)合。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于ELISA測(cè)定，用合適的抗原以1微克/毫升涂布Maxisorp ELISA板（Nunc)。隨后洗滌該板，并將純化的IgG樣品添加到ELISA板的單個(gè)孔中。讓IgG 與捕獲的⑶Id/β 2M在室溫下結(jié)合一小時(shí)，并隨后用PBS-T洗滌三次和用PBS洗滌三次。使 用針對(duì)人Fc (Sigma)的HRP-綴合抗體檢測(cè)結(jié)合的IgG。檢測(cè)抗體在室溫下培育30分鐘。 洗滌該板以除去未結(jié)合的抗體，并通過(guò)用50微升3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（KPL)培育并 用50μ?1Μ HC1猝滅以顯現(xiàn)測(cè)定信號(hào)。測(cè)定信號(hào)使用酶標(biāo)儀（Bio-Tek)在A450nm下讀數(shù)。 結(jié)果表示為原始A450nm值，其中任何大于平均測(cè)定背景2倍的信號(hào)定義為"陽(yáng)性"。
[0243] 還使用Biacore T100生物傳感器（GE Healthcare)對(duì)純化抗體進(jìn)行全動(dòng)力學(xué)表 征（full kinetic)。在Biacore T100生物傳感器的流動(dòng)池（FC)1和FC2 (或者FC3和 FC4)中使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)將約10, 000RU的抗人IgG (Invitrogen cat#H10500)固定在 CM5Series S Sensor芯片上。所用運(yùn)行緩沖液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，相互作用在 25°C下測(cè)得。將峰值純化IgG在運(yùn)行緩沖液中稀釋至10nM，并以10微升/分鐘的流速在 FC2 (或者FC4)上捕獲以捕獲50-80RU的IgG。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定期后，該目標(biāo)一人或食蟹猴 CDld/ β 2M在33. 3nM至0. 4nM (使用三倍稀釋的CDld/ β 2M)濃度下以60微升/分鐘的流 速通過(guò)FC1和FC2 (或FC3和FC4)。用于締合的接觸時(shí)間為120秒，對(duì)于最高濃度在20分 鐘測(cè)得解離，對(duì)該系列中所有其它濃度在240秒測(cè)得解離。從FC1中減去來(lái)自FC2的傳感 圖數(shù)據(jù)，緩沖液僅為對(duì)照物。用1:1朗繆爾方程擬合曲線以生成ka、kd和KD值(表1)。
[0244] 表1 :噬菌體展示抗體的ELISA和SPR結(jié)果
[0245]
【權(quán)利要求】
1. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)與⑶Id的結(jié)合。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原 結(jié)合部分與抗體401. 11. 158競(jìng)爭(zhēng)與⑶Id的結(jié)合。
3. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分結(jié)合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結(jié)合的表位相同的⑶Id表位。
4. 如權(quán)利要求3所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116 的殘基 141 至 143。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116的殘基87至93和141至143。
6. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分包含具有選自 SEQ ID 勵(lì)1、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、40、41、42、43、44和45的 序列和至少95%與之相同的序列的V H域。
7. 如權(quán)利要求6所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述VH域的所述序列是 SEQIDN0:148*SEQIDN0:150。
8. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分包含具有選自SEQ ID N02、4、6、46、49和62的序列和至少95%與之相同的序列的VL 域。
9. 如權(quán)利要求8所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述VL域的序列是SEQ ID NO:149 或 SEQ ID NO:4。
10. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID N0:125)。
11. 如權(quán)利要求10所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128),GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155),GEIYDFYKSYMDV (SEQ IDN0:156)、GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)*GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR2序 列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、 EINPSGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:133)*EINHAGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:134)。
13. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID N0:136)。
14. 如權(quán)利要求13所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128)、GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155)、GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID N0:156)、GEIYDFWKSYLDV (SEQ ID N0:129)或 GEIYDFYNSYMDV (SEQ ID N0:130)。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR2序列是 IWNSAI(SEQIDN0:137)、NHSGS(SEQIDN0:138)、NPSGS(SEQIDN0:139)*NHAGS(SEQ ID NO:140)。
16. 結(jié)合人CDld的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 部分包含八域，所述八域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述CDR1序列是RASQHISSWLA(SEQIDN0:141)或ASSSGAVSSGNFPN(SEQID NO:142)。
17. 如權(quán)利要求16所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR3序列是 QQANRFPLT(SEQIDN0:143)*LLYFGDTQLGV(SEQIDN0:144)。
18. 如權(quán)利要求16或17所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR2序列是 AASSLQS(SEQIDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
19. 如權(quán)利要求6至18中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自以下的VH和VL序列對(duì)：SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、 SEQIDN0:23和SEQIDN0:46、SEQIDN0:24和SEQIDN0:47、SEQIDN0:5和SEQID N0:6、SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:26和 SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:27和SEQ IDN0:50、SEQIDN0:28和SEQIDN0:51、SEQIDN0:29和SEQIDN0:52、SEQIDN0:30 和 SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:58、 SEQ ID NO :36 和 SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :37 和 SEQ IDNO :60、SEQ ID NO :38 和 SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:40 和 SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:42 和 SEQIDN0:64、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4、SEQIDN0:7和SEQIDN0:4、SEQIDN0:8和 SEQIDN0:4、SEQIDN0:9和SEQIDN0:4、SEQIDN0:43和SEQIDN0:65、SEQIDN0:44 和 SEQ ID N0:66 與 SEQ ID N0:45 和 SEQ ID N0:67。
20. 如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合具有如使用基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定測(cè)得為〇· 5ng/ml至20ng/ ml 的 EC50 的人 CDld。
21. 如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分包含人kappa鏈恒定區(qū)。
22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分包含人lambda鏈恒定區(qū)。
23. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分包含IgGl或IgG4恒定區(qū)。
24. 如權(quán)利要求23所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離的抗體或其抗 原結(jié)合部分含有包含S228P突變的IgG4恒定區(qū)。
25. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分是抗體。
26. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結(jié)合部分是Fab、F (ab) 2、scFv或結(jié)構(gòu)域抗體。
27. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中修飾所述 抗體或其抗原結(jié)合部分以調(diào)節(jié)功能特性，所述功能特性選自抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性、補(bǔ)體依 賴(lài)性細(xì)胞毒性、血清半衰期、生物分布和與Fc受體結(jié)合。
28. 組合物，其包含如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分， 和藥學(xué)上可接受的載體。
29. 分離的DNA分子，其編碼如權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié) 合部分。
30. 如權(quán)利要求29所述的分離的DNA分子，其中所述DNA分子的序列選自SEQ ID NO. 10至18和68至115或至少95%與之相同的序列或在中等至高度嚴(yán)格條件下與之雜交 的序列。
31. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其產(chǎn)生如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合部分。
32. 如權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞用如權(quán)利要求29或30所述的DNA 分子轉(zhuǎn)化。
33. 在人類(lèi)對(duì)象中治療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的方法，其包括向所述對(duì)象施 用如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分或如權(quán)利要求28所述 的組合物。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述病況選自牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎、原發(fā)性膽汁 性肝硬變、動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫性肝炎、缺血再灌注損傷、與鐮狀細(xì) 胞病相關(guān)的肺部炎癥或機(jī)能障礙、和哮喘。
35. 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分用于制備用于治 療涉及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況的藥物的用途。
36. 檢測(cè)樣品中存在人或食蟹猴CDld的方法，所述方法包括使懷疑含有CDld的樣品與 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，在允許所述抗體或其抗 原結(jié)合部分結(jié)合CDld的條件下接觸，以形成復(fù)合物并檢測(cè)所述樣品中所述復(fù)合物的存在。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中樣品中的所述CDld是細(xì)胞膜結(jié)合的CDld。
38. 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其用于治療涉 及NKT細(xì)胞效應(yīng)子功能的病況。
39. 檢測(cè)細(xì)胞樣品中人CDld陽(yáng)性細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括將細(xì)胞群體與如權(quán) 利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸，以允許所述抗體或其抗 原結(jié)合部分結(jié)合CDld陽(yáng)性細(xì)胞以形成復(fù)合物，并檢測(cè)所述抗體或其抗原結(jié)合部分-細(xì)胞復(fù) 合物的存在。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細(xì)胞樣品是外周血樣品或細(xì)胞系樣品。
41. 從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性結(jié)合人CDld的CDld結(jié)合蛋白的方法，所述 ⑶Id結(jié)合蛋白與選自401. 1U402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上的結(jié)合， 所述方法包括： 在足以允許CDld結(jié)合蛋白結(jié)合所述突變蛋白以形成CDld結(jié)合蛋白-人CDld突變蛋 白復(fù)合物和允許排除多種沒(méi)有結(jié)合所述人CD 1 d突變蛋白的CD 1 d結(jié)合蛋白的條件下，使所 述多種⑶Id結(jié)合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID NO: 116的 位置87至93和141至143的氨基酸已經(jīng)被這些位置處的相應(yīng)的小鼠氨基酸取代，并且從 所述排除的多種CDld結(jié)合蛋白中收集沒(méi)有結(jié)合人CDld突變蛋白的CDld結(jié)合蛋白，其中所 述收集的⑶Id結(jié)合蛋白特異性結(jié)合人⑶Id并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少 一種抗體競(jìng)爭(zhēng)在⑶Id上的結(jié)合。
42.從多種CDld結(jié)合蛋白中選擇特異性結(jié)合人CDld的CDld結(jié)合蛋白的方法，所述方 法包括： 在足以允許⑶Id結(jié)合蛋白結(jié)合h⑶ldmu以形成⑶Id結(jié)合蛋白-h⑶ldmu復(fù)合物和允 許排除多種沒(méi)有結(jié)合hCDldmu的CDld結(jié)合蛋白的條件下，使所述多種CDld結(jié)合蛋白與其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經(jīng)被這些位置 處的相應(yīng)小鼠序列替代的h⑶ldmu (SEQIDNO: 119)接觸，并從所述排除的多種⑶Id結(jié)合蛋 白中收集沒(méi)有結(jié)合至所述hCDldmu的CDld結(jié)合蛋白，其中所述收集的CDld結(jié)合蛋白特異 性結(jié)合人CDld(SEQIDNO:116)或mCDldhu(SEQIDNO:118)。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK104144700SQ201280050432
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】J.K.納姆比亞爾, L.D.波頓, A.克拉克, A.J.波, D.塔姆瓦基斯, G.科普斯達(dá)斯, A.G.多伊勒, M.波拉德, H.穆斯塔發(fā) 申請(qǐng)人:特瓦制藥澳大利亞私人有限公司