發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及抗trka受體抗體及其用途，包括人源化抗trka抗體，和使用抗trka抗體治療的方法。一方面，本發(fā)明涉及具有增強的抑制性質(zhì)的人源化抗trka抗體用于治療神經(jīng)瘤和/或骨相關(guān)疼痛的方法。再一方面，本發(fā)明涉及具有增強的抑制性質(zhì)的人源化抗trka抗體，其包含重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、人輕鏈恒定區(qū)和人igg4重鏈恒定區(qū)變體，所述抗體表現(xiàn)出改變的交換性質(zhì)。發(fā)明背景神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin)屬于肽生長因子家族(bardeya(1994)j.neurobiol.25(11):1329-33)，結(jié)構(gòu)上與ngf家族第一成員相關(guān)(levi-montalcinir(1987)emboj.6(5):1145-54)。神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)外周神經(jīng)元和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元分化和存活、以及突觸傳遞。此外，nfg在多種非神經(jīng)元組織和細胞，例如免疫細胞上起作用。nfg通過存在于靶細胞中的兩個膜受體起作用，低親和力p75受體，和具有酪氨酸激酶活性的140kda高親和力跨膜糖蛋白trka(kaplandretal.,(1991)science252(5005):554-8；kleinretal.,(1991)cell65(1):189-97)。trka在神經(jīng)嵴的神經(jīng)元中、在交感神經(jīng)元中、以及在基底前腦和紋狀體的膽堿能神經(jīng)元中表達，在這些位置其是ngf活性的關(guān)鍵介質(zhì)(holtzmandmetal.,(1992)neuron9(3):465-78；vergevmetal.,(1992)j.neurosci.12(10):4011-22)。trka也在一些非神經(jīng)元組織和細胞，包括b淋巴細胞中表達(torciametal.,(1996)cell85(3):345-56)。神經(jīng)生長因子(ngf)最初作為發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中感覺和交感神經(jīng)元的存活因子被鑒定(gorinpd&johnsonem(1979)pnasusa,76(10):5382-6)。在成體中，ngf不是生存所必需的，但在幾種急性和慢性疼痛狀態(tài)中對于疼痛和痛覺過敏的產(chǎn)生具有關(guān)鍵作用。ngf在損傷的和發(fā)炎的組織中高表達，并且傷害感受神經(jīng)元上trka的激活可以通過多種機制觸發(fā)和強化疼痛信號傳導。在動物模型中炎癥相關(guān)疼痛可以通過中和ngf生物活性而顯著降低(woolfcjetal.,(1994)neuroscience62(2):327-31；mcmahonsbetal.,(1995)nat.med.1(8):774-80；koltzenburgmetal.,(1999)eur.j.neurosci.11(5):1698-704)，提示該神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的增加是產(chǎn)生該完全的痛覺過敏反應(yīng)所必需的。值得注意的，其他神經(jīng)營養(yǎng)因子的抑制不導致對該誘導的痛覺過敏的拮抗作用，提示該效應(yīng)特異于ngf(mcmahonsbetal.,(1995)nat.med.1(8):774-80)；此外，ngf抑制也在不同的神經(jīng)病理性相關(guān)疼痛過程中導致鎮(zhèn)痛作用(koltzenburgmetal.,(1999)eur.j.neurosci.11(5):1698-704；rolsetal.,(1999)pain79(2-3):265-74；theodosioumetal.,(1999)pain,81(3):245-55；christensenmd&hulseboschce(1997)exp.neurol.147(2):463-75)。在疼痛治療上存在尚未滿足的巨大醫(yī)學需求。主要的鎮(zhèn)痛藥類別，非類固醇抗炎藥(nsaid)和阿片類藥物，因其功效和耐受性而受限(heftiffetal.,(2006)trendspharmacol.sci.27(2):85-91)。不足30％的慢性疼痛患者可以使用目前的治療獲得充分的緩解，而且存在許多副作用，尤其是在長期施用的情況下(kalsoeetal.,(2004)pain112(3):372-80)。認識到ngf在成體的疼痛機制中具有中心作用，使得有機會開發(fā)一種全新的疼痛療法。靶向trka而非ngf可以是一種更好的治療選擇，因為該受體不干擾由p75受體介導的ngf功能(p75受體在神經(jīng)發(fā)育中具有廣泛的功能)。本發(fā)明人評價了在深部軀體疼痛，尤其是骨相關(guān)疼痛的治療方法中使用人源化抗trka抗體的功效和安全性，其中所述骨相關(guān)疼痛可以是例如由外部創(chuàng)傷所致的骨損傷引起的疼痛、或由累及骨的病變導致的疼痛(例如可以導致骨損傷的癌癥)、或由導致骨相關(guān)疼痛的不適當神經(jīng)支配和/或其他影響引起的疼痛。本發(fā)明人還評價了在治療神經(jīng)瘤引起的疼痛的方法中使用人源化抗trka抗體的功效和安全性，其中所述神經(jīng)瘤因創(chuàng)傷或其他病變而不當形成。發(fā)明概述本公開一般地涉及人源化抗trka抗體、其制備和使用方法。一方面，本公開提供人源化抗trka抗體或其片段，其包含：a)包含選自seqidno:1-5的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和b)包含選自seqidno:6-13的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2包含至少一個氨基酸取代，和/或其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非cdr區(qū)在選自由37、42和89組成的組的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置利用kabat中所述的編號系統(tǒng)給出。在再一方面，本公開提供編碼人源化抗trka抗體或其片段的分離核酸、包含該分離核酸的載體、和包含該分離的核酸或載體的宿主細胞。本公開還提供產(chǎn)生人源化抗trka抗體或其片段的方法。在其他方面，本公開提供包含人源化抗trka抗體或其片段的組合物和包含與治療劑連接的人源化抗trka抗體或其片段的免疫綴合物。尤其是，本發(fā)明涉及與人trka結(jié)合的人源化抗trka抗體或其片段用于治療骨相關(guān)疼痛，其中所述抗trka抗體或其片段包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域1、2和3以及輕鏈可變結(jié)構(gòu)域1、2和3，且重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自seqidno:1-5的序列，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自seqidno:6-13的序列，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非cdr區(qū)在選自由37、42和89組成的組的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置利用kabat中所述的編號系統(tǒng)給出。在其他方面，本公開提供人源化抗trka抗體或其片段、組合物或免疫綴合物，用于藥物、用于治療疼痛、用于治療慢性疼痛、用于治療急性疼痛、用于治療與以下一項或多項相關(guān)的疼痛：胰腺炎、腎結(jié)石、子宮內(nèi)膜異位、ibd、克羅恩氏病、術(shù)后粘連、膽囊結(jié)石、頭疼、痛經(jīng)、肌肉骨骼疼痛、扭傷、內(nèi)臟痛、卵巢囊腫、前列腺炎、膀胱炎、間質(zhì)性膀胱炎、術(shù)后疼痛、偏頭疼、三叉神經(jīng)痛、來自燒傷和/或傷口的疼痛、與創(chuàng)傷相關(guān)的疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、與肌肉骨骼疾病相關(guān)的疼痛、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、關(guān)節(jié)周圍病變、腫瘤疼痛、來自骨轉(zhuǎn)移的疼痛、hiv感染，用于治療癌癥、神經(jīng)元病癥、阿爾茨海默病、糖尿病、糖尿病性腎病、病毒病癥、hiv介導的病癥、麻瘋、或炎癥，以及用于診斷或預后。在再一方面，本公開涉及用于治療深部軀體疼痛(deepsomaticpain)，尤其是骨相關(guān)疼痛的方法，其至少包括步驟：向有需要的個體施用有效量的本發(fā)明人源化抗trka抗體或其片段。根據(jù)本發(fā)明，骨相關(guān)疼痛旨在指，個體因與一個或多個骨相關(guān)的損傷、退化或任何病變而經(jīng)歷的任何疼痛感覺。疼痛可以表現(xiàn)為麻木感、麻刺感、蠕痛感、熱感或冷感、或緊縮感、鈍痛例如壓迫或緊縮感、悶痛感、或麻刺感，銳痛例如戳、擊、撕裂或穿刺疼痛，疼痛可以是持續(xù)的、跳動的、或時間間隔規(guī)則或不規(guī)則的間歇性的，或僅在該區(qū)域被觸碰時出現(xiàn)。更特別地，骨相關(guān)疼痛可以是骨折(bonefrature)、骨裂(bonechip)、骨斷(bonebreak)、或任何其他損失或炎癥的后果。這可以因意外事件引起，或因過度使用或重復移動損傷處所致，或由骨衰弱引起，所述骨衰弱可以因激素缺乏、感染、骨癌、轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤、白血病、骨髓瘤或其他累及血液或骨相關(guān)細胞的癌癥、或因骨供血中斷導致。根據(jù)本發(fā)明，骨相關(guān)疼痛可以是累及骨的病變的后果。累及骨的病變是指，直接或間接地影響個體的一個或多個骨從而導致疼痛感覺的任何病變。病變的例子包括癌癥、感染、和免疫系統(tǒng)功能障礙。尤其是，骨相關(guān)疼痛可以與骨癌，尤其是繼發(fā)性骨癌和/或轉(zhuǎn)移性癌細胞相關(guān)，或由其導致。備選地，骨相關(guān)疼痛可以由一個或多個神經(jīng)瘤引起，尤其是由骨癌或任何其他病變導致的神經(jīng)瘤。特別地，本發(fā)明方法包括，施用有效量的本發(fā)明人源化抗trka抗體或其片段，以最小化或減少異常神經(jīng)萌芽和/或神經(jīng)瘤的形成或大小。根據(jù)本發(fā)明，有效量的人源化抗trka抗體或其片段旨在指，當由臨床醫(yī)師或其他有資格的醫(yī)藥從業(yè)人員施用給個體時，在該有需要的個體中足以導致一種或多種疼痛感覺得以緩解或停止的量。再一方面，本公開涉及本發(fā)明人源化抗trka抗體或其片段用于治療深部軀體疼痛，尤其是骨相關(guān)疼痛或神經(jīng)瘤相關(guān)疼痛。更特別地，骨相關(guān)疼痛可以是骨折、骨裂、骨折斷、或任何其他損失或炎癥的后果。這可以因意外事件引起，或因過度使用或重復移動損傷處所致，或由激素缺乏、感染、骨癌、轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤、白血病、骨髓瘤或其他累及血液或骨相關(guān)細胞的癌癥或骨供血中斷導致的骨衰弱引起。根據(jù)本發(fā)明，骨相關(guān)疼痛可以由累及骨的病變引起。累及骨的病變是指，直接或間接地影響個體的一個或多個骨從而導致疼痛感覺的任何病變。病變的例子包括癌癥、感染、和免疫系統(tǒng)功能障礙。尤其是，骨相關(guān)疼痛可以與骨癌，尤其是繼發(fā)性骨癌和/或轉(zhuǎn)移性癌細胞相關(guān)，或由其導致。備選地，骨相關(guān)疼痛可以由一個或多個神經(jīng)瘤引起，尤其是由骨癌或任何其他病變導致的神經(jīng)瘤。特別地，本發(fā)明涉及，在治療中使用本發(fā)明人源化抗trka抗體或其片段，以最小化或降低異常神經(jīng)萌芽和/或神經(jīng)瘤的形成或大小。再一方面，本公開提供治療炎性疼痛(inflammatorypain)、骨關(guān)節(jié)炎疼痛(osteoarthriticpain)和神經(jīng)病理性疼痛(neuropathicpain)的方法。一方面，在體內(nèi)急性炎性痛覺過敏模型中，以0.01mg/kg劑量施用人源化抗trka抗體導致了急性炎性痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)。另一方面，在體內(nèi)慢性炎性痛覺過敏模型中，以0.01mg/kg劑量施用人源化抗trka抗體導致了慢性炎性痛覺過敏的顯著和持續(xù)逆轉(zhuǎn)。另一方面，在體內(nèi)慢性骨關(guān)節(jié)炎痛覺過敏模型中，以0.01mg/kg劑量施用人源化抗trka抗體導致了慢性骨關(guān)節(jié)炎痛覺過敏的顯著和持續(xù)逆轉(zhuǎn)。再一方面，在體內(nèi)神經(jīng)病理性疼痛的慢性壓迫性損傷模型中，以1.0mg/kg劑量施用人源化抗trka抗體導致了神經(jīng)病理性疼痛的顯著逆轉(zhuǎn)。再一方面，本公開提供包含人源化抗trka抗體或其片段、組合物或綴合物的制品。再一方面，本公開提供包含人源化抗trka抗體或其片段、組合物或綴合物的藥盒。由于蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)的有機和無機藥物更大且更復雜，這也引發(fā)了與生產(chǎn)穩(wěn)定有效的含抗體藥物制劑相關(guān)的特殊問題。為了使蛋白保留生物學活性，制劑必須完好地保存蛋白氨基酸的至少核心序列的構(gòu)象完整性，并同時保護蛋白的多個功能基團不被降解。蛋白質(zhì)降解途徑可以涉及化學不穩(wěn)定性(即，任何涉及到修飾蛋白質(zhì)、通過鍵形成或斷裂導致新化學實體的過程)或物理不穩(wěn)定性(即，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變)?；瘜W不穩(wěn)定性可以因脫酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫鍵交換引起。物理不穩(wěn)定性可以因變性、聚集、沉淀或吸附引起。根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供穩(wěn)定的水性藥物制劑，其包含治療有效量的抗trka抗體、緩沖劑、表面活性劑和張力調(diào)節(jié)劑(tonicifyingagent)，其中制劑ph為大約5至大約7。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體包含：a)包含選自seqidno:1-5的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和b)包含選自seqidno:6-13的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2包含至少一個氨基酸取代和/或其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非cdr區(qū)在選自由37、42和89組成的組的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出(kabateaetal.,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationn°91-3242)。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少0.1mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少0.2mg/ml至175mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少1mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少10mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少100mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，抗trka抗體以至少150mg/ml的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明此方面，緩沖劑選自：檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、三(三(羥甲基)氨基甲烷)。根據(jù)本發(fā)明此方面，穩(wěn)定劑/張力調(diào)節(jié)劑選自：乙酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、乙酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鉀、氯化鉀、蔗糖、多元醇、糖類、氨基酸例如組氨酸、精氨酸和甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、賴氨酸、谷氨酸，胺類和海藻糖。根據(jù)本發(fā)明此方面，表面活性劑選自：tween20/40/80、聚山梨酸酯20/80、泊洛沙姆、十二烷基硫酸鈉。根據(jù)本發(fā)明此方面，制劑的ph為5.75。根據(jù)本發(fā)明此方面，制劑的ph為6.0。根據(jù)本發(fā)明此方面，制劑還可以包含一種或多種賦形劑和填充劑。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，提供調(diào)節(jié)至ph6.0的抗trka抗體的低濃度水性制劑，包含：10mg/ml抗trka抗體；25mm檸檬酸鹽；150mmnacl；0.05％tween80。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，提供調(diào)節(jié)至ph6.0的抗trka抗體的低濃度水性制劑，包含：至少10mg/ml抗trka抗體；50mm組氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，提供調(diào)節(jié)至ph5.75或6.0的抗trka抗體的高濃度水性制劑，包含：100mg/ml抗trka抗體；50mm組氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，提供調(diào)節(jié)至ph5.75或6.0的抗trka抗體的高濃度水性制劑，包含：150mg/ml抗trka抗體；50mm組氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。本發(fā)明人在開發(fā)這些制劑時克服了與一般含蛋白(尤其是抗體)的水性液體制劑相關(guān)的問題。在該研究項目過程中嘗試的幾種備選制劑在5℃、25℃、或40℃缺乏長期穩(wěn)定性，尤其是在不含上列特定組分組合的幾種備選制劑中抗體出現(xiàn)了降解和明顯的不穩(wěn)定性。此外，就可以每劑施用的抗trka抗體量以及劑量數(shù)兩個方面而言，該皮下施用制劑的開發(fā)也增加了可能的給藥方案。此外，初步數(shù)據(jù)還表明，根據(jù)本發(fā)明的皮下施用制劑是一種通過先前測試的方法和制劑更為有效的施用抗trka抗體的方式。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，以至少0.1mg/kg體重的劑量，尤其是至少0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、或30mg/kg劑量，將制劑施用給有需要的個體。根據(jù)本發(fā)明再一方面，向有需要的患者施用制劑一次。根據(jù)本發(fā)明再一方面，向有需要的患者施用制劑，其中兩次給藥之間間隔至少1小時，優(yōu)選地兩次給藥之間間隔至少4小時/6小時/12小時/24小時。根據(jù)本發(fā)明再一方面，按需向有需要的患者施用制劑。根據(jù)本發(fā)明再一方面，制劑在5℃穩(wěn)定至少1年，優(yōu)選至少2年。根據(jù)本發(fā)明再一方面，制劑在25℃穩(wěn)定至少3個月、優(yōu)選6個月，最優(yōu)選1年。根據(jù)本發(fā)明再一方面，制劑在40℃穩(wěn)定至少1個月、優(yōu)選3個月。其中穩(wěn)定性可以使用選自以下的一種或多種方法測量：測定制劑的澄清度、著色度、乳濁度、和微粒雜質(zhì)(可見顆粒)的變化；280nm波長光吸收測量以確定制劑中存在的蛋白質(zhì)的濃度；sds-page凝膠顯影以確定抗體的重量改變和/或降解；通過elisa確定抗體結(jié)合性質(zhì)的任何變化；通過hplc-cex確定制劑中正/負抗體物質(zhì)組成的變化；通過hplc-ief，利用毛細管電泳確定制劑中存在的抗體的等電聚焦譜的改變；通過hplc-sec分析，確定制劑中抗體的改變。根據(jù)本發(fā)明再一方面，制劑包含一定量的抗trka抗體，由此制劑可以以至少0.1mg/kg體重的劑量，尤其是至少0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg,10mg/kg或30mg/kg的劑量，施用給有需要的個體。根據(jù)本發(fā)明另一方面，還提供治療個體疼痛的方法，包括施用包含治療有效量的抗trka抗體的本發(fā)明制劑。附圖簡述圖1：抗trka抗體的表面等離子體共振測量。數(shù)據(jù)表示為反應(yīng)數(shù)(縮寫為ru；y軸)vs.時間(x軸)(圖1a)mnac13抗體。(圖1b)bxhvh5vl1抗體。(圖1c)gbrvh5(v37a)vl1抗體。(圖1d)gbrvh5(k3q,v37a)vl1抗體。圖2：使用差示掃描量熱法測量的抗trka抗體熱穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)表示為超額摩爾熱容(excessmolarheatcapacity，縮寫為cp[kcal/mol/℃]；y軸)vs.溫度(x軸)。(圖2a)mnac13抗體(fab片段tm是tm1，在74℃)。(圖2b)bxhvh5vl1抗體(fab片段tm是tm3，在76.5℃)。(圖2c)gbrvh5(v37a)vl1抗體(fab片段tm是tm1，在73.6℃)。(圖2d)gbrvh5(k3q,v37a)vl1抗體(fab片段tm是tm1，在73℃)。(圖2e)圖2c和圖2d的疊加。(圖2f)圖2b和圖2d的疊加。(圖2g)圖2a和圖2d的疊加。圖3：抗trka抗體的功能生物活性。人源化抗trka抗體對ngf誘導的tf-1細胞增殖的影響；數(shù)據(jù)表示為％增殖反應(yīng)(y軸)vs.抗體濃度(μg/ml；x軸)。(圖3a)gbrvh5(v37a)vl1,gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.bxhvh5vl1。(圖3b)gbrvh5(v37a)vl1,gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.mnac13。(圖3c)gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p。(圖3d)bxhvh5vl1,bxhvh5vl3,gbrvh5(v37a)vl1vs.gbrvh5(v37a)vl3。(圖3e)bxhvh5vl1,bxhvh3vl1,gbrvh5(v37a)vl1vs.gbrvh3(v37a)vl1。圖4：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)急性炎性爪疼。向amb1小鼠的一只后爪足底注射cfa，誘導急性炎性痛覺過敏，并測量為％同側(cè)(注射的)和對側(cè)(未注射的)爪上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在cfa注射(0hr)后23hr取承重讀數(shù)，之后在cfa后24hr開始處理，單次i.p.注射0.0001(白色柱)、0.001(水平影線柱)、0.01(格紋柱)和0.1mg/kg(菱形影線柱)抗trka抗體、或0.1mg/kg同種型對照抗體(黑色柱)，之后在給藥后4,8,24,48,72,96和120hr測量承重。作為陽性對照，用10mg/kg吲哚美辛(indomethacin)p.o.處理小鼠(垂直影線柱)。圖5：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)慢性炎性關(guān)節(jié)疼。通過向amb1小鼠的一個后肢膝關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa，誘導關(guān)節(jié)的慢性炎性痛覺過敏，并測量為％同側(cè)(注射的)和對側(cè)(未注射的)肢上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在臨cfa注射前(初次用于實驗(naive))和在cfa后第3、7和10天取承重讀數(shù)，之后在cfa后第13天開始處理，單次i.p.注射0.01(空心正方，虛線)、1(實心三角)和10mg/ml(空心圓)抗trka抗體、或10mg/kg同種型對照抗體(實心圓)，之后在給藥后4,8,24,48,72,96hr測量承重(括號中)。作為陽性對照，自第13天起用60mg/kg塞來昔布(celecoxib)一天兩次處理小鼠(空心菱形)，在cfa后第13天在給藥后1和8hr測量承重，然后在cfa后第14-17天在給藥后1hr測量承重。圖6：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)慢性骨關(guān)節(jié)炎疼痛。向amb1小鼠的一個后肢膝關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)內(nèi)注射mia，誘導慢性骨關(guān)節(jié)炎痛覺過敏，并測量為％同側(cè)(注射的)和對側(cè)(未注射的)肢上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在臨mia注射前和mia注射后第3、7和10天取基線(bl)承重讀數(shù)，之后在mia后第14天開始處理，單次i.p.注射1(空心三角)、10(空心菱形)和100μg/kg(實心圓，虛線)抗trka抗體、或10mg/kg同種型對照抗體(實心正方)(圖6a)。作為比對物對照，在mia后第14天用曲馬多(tramadol)10mg/kg或普瑞巴林(pregabalin)30mg/kgp.o.處理動物，之后在mia后第16-22天每隔一天用曲馬多30mg/kg或普瑞巴林100mg/kg處理動物(圖6b)。在mia后第14天在給藥后4、8和24小時，以及之后對于抗體處理組在每24小時，對于曲馬多和普瑞巴林處理組在給藥后1和24小時，使用承重評估了所有動物。圖7：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理性疼痛。通過慢性壓迫性損傷amb1小鼠坐骨神經(jīng)，誘導慢性神經(jīng)病理性痛覺過敏和異常性痛覺，并分別測量為爪回縮所需的閾值力(g)和從冷卻板縮回爪的延遲時間(sec)。在手術(shù)前以及在手術(shù)后7天在處理開始(0hr)前當天，取讀數(shù)。然后單次i.p.注射1000μg/kg同種型對照抗體(實心三角)或10(實心圓),100(實心正方)和1000μg/kg(實心菱形)抗trka抗體，處理動物。在此7天的給藥后時期中，每日一次施用普瑞巴林(實心倒三角)30mg/kg/10mlp.o.或鹽水(空心圓)。在4h,24h和之后每隔一天直至給藥后第7日，記錄給藥后讀數(shù)。在所有的日子，在普瑞巴林或鹽水給藥后1h記錄給藥后讀數(shù)。圖8：形態(tài)度量分析經(jīng)處理的新生amb1小鼠的右scg(4只小鼠/處理＝4神經(jīng)節(jié)/處理)，所述小鼠自出生后第1日起用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(標記gbr)(三角),tanezumab(正方)或pbs(圓)處理4周。以單因素方差分析(one-wayanova)和dunnett事后檢驗，與pbs處理比較，進行統(tǒng)計學分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.圖9：形態(tài)度量分析經(jīng)處理的成年amb1小鼠的左和右scg(8-9只小鼠/處理＝15-18神經(jīng)節(jié)/處理)，其中所述小鼠用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(標記gbr)(三角),tanezumab(正方)或pbs(圓)處理4周。以單因素方差分析(one-wayanova)和dunnett事后檢驗，與pbs處理比較，進行統(tǒng)計學分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖10：經(jīng)處理的成年amb1小鼠的所有scg神經(jīng)元細胞體的直徑的頻率曲線，其中所述小鼠用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(標記gbr)(1904個神經(jīng)元,圓),pbs(1547個神經(jīng)元,正方)或tanezumab(1420個神經(jīng)元,菱形)處理。使用graphpadprism和標準參數(shù)進行分箱(bining)。圖11：來自pbs處理的成年動物的scg、來自tanezumab處理的動物的scg(最小)、來自gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(標記gbr)處理的動物的scg(最大)的代表性h&e染色切片。黑色箭頭標記神經(jīng)元細胞體。圖12：通過慢性壓迫性損傷amb1小鼠的坐骨神經(jīng)誘導神經(jīng)病理性疼痛。機械痛覺過敏(a)測量為爪回縮所需的閾值力，冷異常性痛覺(b)測量為從冷板回縮腳爪的延遲時間(sec)。處理開始(0h)當天，在手術(shù)前(-7d)以及在手術(shù)后7天在處理開始(0h)前當天取讀數(shù)。然后，單次i.p.注射鹽水對照(圓)或0.3(三角)和1mg/kg(倒三角)gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(標記gbr)或0.3(正方)和1mg/kg(菱形)tanezumab，處理動物。在4h,第1天以及之后每隔一天直至給藥后第9天記錄給藥后讀數(shù)，并在給藥后第14天記錄最終讀數(shù)。圖13：在amb1小鼠膝關(guān)節(jié)中多次關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa，誘導慢性炎性關(guān)節(jié)疼痛。d0:第一次cfa注射日；d3,d10,d17,d24:第一次cfa注射后第3,10,17和24天。箭頭指示在第0,7,14和21天關(guān)節(jié)內(nèi)注射(pbs或cfa)。4h,8h,24h,48h,76h,96h和120h:在d24給藥后4,8,24,48,76,96和120小時。*:p<0.05,相比于cfa+賦形劑組,單因素方差分析。假模(sham)+賦形劑組(菱形)，n＝6；cfa+賦形劑組(正方)，n＝8；cfa+gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(三角)和cfa+tanezumab(交叉)組，n＝10。圖14：在骨折后第2,5,7,14和20天，縱向體內(nèi)監(jiān)測小鼠。術(shù)后值與術(shù)前值相關(guān)。a)活性評估；b)手術(shù)肢的地面反作用力(grf)的分析。結(jié)果表示為平均值±sem；n＝5-7；星號表示p<0.05,抗-trkavs.pbs。圖15：骨折的股骨以番紅-o/快綠染色的代表性組織學切片和骨痂(callus)組成的評價。a-c:pbs-處理,d-f:抗-ngf抗體,g-i:抗-trka抗體；比例尺＝500μm。j-l:在第7(j),14(k)和25(l)天組織形態(tài)度量評價骨痂組成。結(jié)果表示為平均值±sem；n＝5-8；白色柱：pbs處理，淺灰色柱：抗ngf抗體；黑灰色柱：抗trka抗體。圖16：在以pbs、抗ngf抗體或抗trka抗體處理的小鼠中在25天的愈合期后骨折骨痂的抗彎剛度。結(jié)果表示為平均值±sem；n＝6-8。圖17：低濃度(10mg/ml)制劑在5℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖18：低濃度(10mg/ml)制劑在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖19：低濃度(10mg/ml)制劑在40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖20：高濃度(100mg/ml)制劑a(ph5.75)在5℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖21：高濃度(100mg/ml)制劑a(ph5.75)在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖22：高濃度(100mg/ml)制劑a(ph5.75)在40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖23：高濃度(100mg/ml)制劑b(ph6)在5℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖24：高濃度(100mg/ml)制劑b(ph6)在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖25：高濃度(100mg/ml)制劑b(ph6)在40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖26：高濃度(150mg/ml)制劑a(ph5.75)在5℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖27：高濃度(150mg/ml)制劑a(ph5.75)在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖28：高濃度(150mg/ml)制劑a(ph5.75)在40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖29：高濃度(150mg/ml)制劑b(ph6)在5℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖30：高濃度(150mg/ml)制劑b(ph6)在25℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖31：高濃度(150mg/ml)制劑b(ph6)在40℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本公開涉及人源化抗trka抗體或其片段、其制備和使用方法。術(shù)語"trka",“人trka”,"trka受體"或“人trka受體”在本文中等同使用，如無其它特別說明，意指"人trka"。人trka在本文中包括人trka的變體、同種型、和物種同源物。因此，本公開的抗體可以在一些情況下與來自非人的其它物種的trka交叉反應(yīng)。在一些實施方案中，抗體可以完全特異于一種或多種人trka蛋白，并可以不顯示物種的或其它類型的非人交叉反應(yīng)性。trka也稱作高親和力神經(jīng)生長因子受體或神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體1型或trk1-轉(zhuǎn)化性酪氨酸激酶蛋白或原肌球蛋白相關(guān)激酶a或酪氨酸激酶受體或酪氨酸激酶受體a或trk-a或gp140trk或p140-trka或mtc或trk。trka是受體酪氨酸激酶，通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元和神經(jīng)神經(jīng)元的增殖、分化和存活，參與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟。trka是ngf(trka的主要配體)的高親和力受體；其也可以結(jié)合ntf3/神經(jīng)營養(yǎng)因子-3并被激活。四種已知的人trka同種型的完整氨基酸序列可以見于uniprot/swiss-prot登錄號p04629(consortiumtu,(2012)nucleicacidsres.40(d1):d71-d5)。這四種同種型通過可變剪切產(chǎn)生：同種型trka-i存在于大多數(shù)非神經(jīng)元組織中(uniprot/swiss-prot登錄號p04629-2)，而同種型trka-ii主要在神經(jīng)元細胞中表達(uniprot/swiss-prot登錄號p04629-1)，同種型trka-iii特異地由多能神經(jīng)干細胞和神經(jīng)嵴祖先細胞表達(uniprot/swiss-prot登錄號p04629-4)。第四同種型與同種型trka-ii在殘基1-71位不同并缺失殘基393-398，被稱作同種型3(uniprot/swiss-prot登錄號p04629-3)。第四同種型在殘基1-71不同于同種型trka-ii并且缺少殘基393至398，被稱為同種型3(uniprot/swiss-prot登錄號p04629-3)。trka-ii同種型是trka的主要已知同種型。同種型trka-i對ntf3神經(jīng)營養(yǎng)因子具有增強的反應(yīng)性，而同種型trka-iii具有組成型活性并且不結(jié)合ngf。在一個優(yōu)選實施方案中，本文中所用trka同種型是具有seqidno:72的trka-ii同種型及包含seqidno:25序列的其胞外區(qū)。術(shù)語“抗trka抗體或其片段”或“人源化抗trka抗體或其片段”在本文中包括結(jié)合人trka，例如分離形式的人trka的抗體或其片段，尤其是結(jié)合trka-ii同種型(seqidno:72)的抗體或其片段，更特別地結(jié)合trka-ii同種型的人trka胞外區(qū)(seqidno:25)的單價形式的抗體或其片段，且親和力(kd)值為500nm或更小，優(yōu)選地350nm或更小，更優(yōu)選地150nm或更小，甚至更優(yōu)選地100nm或更小，最優(yōu)選地50nm或更小，尤其是30nm或更小。通常，人源化抗trka抗體或其片段能夠抑制trka的功能性激活和/或能夠阻斷或降低一種或多種由ngf與trka的結(jié)合誘導的生物活性。在本文中，“抗ngf抗體”是指能夠結(jié)合ngf，優(yōu)選人ngf的抗體。通常，抗ngf抗體能夠抑制trka的功能性激活和/或能夠阻斷或降低trka的一種或多種生物活性?？筺gf抗體與ngf(例如hngf)的結(jié)合親和力可以為500nm或更小，優(yōu)選100nm或更小。通常，抗ngf抗體應(yīng)當表現(xiàn)出以下特征中的任一或多個：(a)結(jié)合ngf并抑制ngf生物活性和/或由ngf信號傳導功能介導的下游途徑；(b)阻斷或降低ngf受體激活(包括trka受體二聚化和/或自磷酸化)；(c)增加ngf清除；(d)抑制(減少)ngf合成、產(chǎn)生或釋放?？筺gf抗體是本領(lǐng)域已知的，參見例如pct公布號wo01/78698,wo01/64247,us專利號5,844,092,5,877,016和6,153,189；hongo等，(2000)hybridoma,19:215-227；genbank登錄號u39608,u39609,l17078或l17077。術(shù)語“能夠抑制trka的功能性激活的人源化抗trka抗體或其片段”在本文中指，顯示出以下特征之任一或多個的人源化抗trka抗體：(a)結(jié)合trka并抑制trka生物活性和/或由ngf結(jié)合或ntf3/神經(jīng)營養(yǎng)因子3信號傳導功能介導的下游途徑；(b)防止、緩解或治療任何疼痛方面；(c)阻斷或減少trka的激活、或二聚體化和/或自磷酸化；(d)增加trka清除；(e)抑制或降低trka合成和/或細胞表面表達。術(shù)語“能夠阻斷或降低trka的一種或多種生物活性的人源化抗trka抗體或其片段”在本文中指，可以直接或間接地降低、抑制、中和或破壞trka生物活性的人源化抗trka抗體。術(shù)語“trka的生物活性”或“trka生物活性”在本文中涉及，但不限于，以下之任一或多項：能夠結(jié)合ngf或其他神經(jīng)營養(yǎng)因子；能夠同源二聚化或異源二聚體化和/或自磷酸化；能夠激活ngf誘導的信號傳導途徑；能夠促進細胞分化、增殖、存活、生長、遷移和其他細胞生理學變化，包括(在神經(jīng)元的情況下，包括外周和中樞神經(jīng)元)神經(jīng)元形態(tài)改變、突觸形成、突觸功能、神經(jīng)遞質(zhì)和/或神經(jīng)肽釋放、和損傷后再生；以及能夠介導疼痛和與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌癥疼痛。術(shù)語“ic50”在本文用于描述半最大抑制濃度(ic50)，其是化合物抑制生物學功能(例如人源化抗trka抗體抑制ngf誘導的tf-1細胞增殖)的有效性的量度。本文中使用的術(shù)語“抗體”包括全長抗體、及其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。抗體，特別是天然存在的抗體，是以一或多拷貝的y形單元存在的糖蛋白，所述單元由四條多肽鏈組成。每個“y”形含有2個相同的重鏈(h)拷貝和2個相同的輕鏈(l)拷貝，重鏈和輕鏈因其相對分子量而得名。每條輕鏈與重鏈配對，而每條重鏈與另一條重鏈配對。共價的鏈間二硫鍵和非共價相互作用將這些鏈連接在一起?？贵w，特別是天然存在的抗體，含有可變區(qū)，其是兩個拷貝的抗原結(jié)合位點。木瓜蛋白酶(一種蛋白水解酶)將“y”形切割成3個獨立的分子，2個被稱為“fab”片段(fab＝抗原結(jié)合片段)，一個被稱為“fc”片段或“fc區(qū)”(fc＝可結(jié)晶的片段)。fab片段由完整的輕鏈和部分重鏈組成。重鏈含有1個可變結(jié)構(gòu)域(重鏈可變區(qū)或vh)和3或4個恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2、ch3和ch4，取決于抗體類型或同種型)。在ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域被稱為鉸鏈區(qū)，其使得y形抗體分子的2個fab臂之間具有柔性，允許其打開和閉合以適應(yīng)于結(jié)合相隔固定距離的2個抗原決定簇。iga、igd和igg的重鏈都具有4個結(jié)構(gòu)域，即，1個可變結(jié)構(gòu)域(vh)和3個恒定結(jié)構(gòu)域(ch1-3)。ige和igm的重鏈具有1個可變結(jié)構(gòu)域和4個恒定結(jié)構(gòu)域(ch1-4)。抗體的恒定區(qū)可以介導與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和補體系統(tǒng)經(jīng)典通路的第一成分(c1q)。每條輕鏈通常通過1個共價二硫鍵與重鏈連接。每條輕鏈含有1個可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或vl)和1個輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域可以是κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，在本文中稱為igkc，或者可以是λ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，在本文中稱為iglc。igkc在本文中與cκ或ck等價使用，具有相同的含義。iglc在本文中與cλ或cl等價使用，具有相同的含義。本文中使用的術(shù)語“iglc結(jié)構(gòu)域”指所有的λ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，例如，選自iglc1、iglc2、iglc3、iglc6和iglc7的所有λ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。vh和vl區(qū)可以進一步細分為命名為互補決定區(qū)(cdr)的超變區(qū)，其間散布了更保守的、命名為框架區(qū)(fr或fw或“非cdr區(qū)”)的區(qū)域。每個vh和vl都包括3個cdr和4個fr，按下列順序從氨基端至羧基端排列：frl、cdrl、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。由恒定區(qū)的基因決定，抗體被分為不同類別，也稱為同種型。人恒定輕鏈分為κ(ck)和λ(cλ)輕鏈。重鏈分為mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)，分別定義了抗體的同種型igm、igd、igg、iga和ige。因此，本文中使用的“同種型”意指，由恒定區(qū)的化學和抗原特征定義的任何免疫球蛋白類別和/或亞類。已知的人免疫球蛋白同種型是iggl(ighg1),igg2(ighg2),igg3(ighg3),igg4(ighg4),igal(igha1),iga2(igha2),igm(ighm),igd(ighd),和ige(ighe)。所謂的人免疫球蛋白假-γighgp基因代表了另外的人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因，該基因已被測序，但由于改變的轉(zhuǎn)換區(qū)(switchregion)而不編碼蛋白質(zhì)(bensmanam等人，(1988)nucleicacidsres.16(7):3108)。盡管具有改變的轉(zhuǎn)換區(qū)，人免疫球蛋白假-γighgp基因仍具有所有的重鏈恒定區(qū)(ch1-ch3)和鉸鏈的可讀框。其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的所有可讀框編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，可以與具有預測的結(jié)構(gòu)特征的所有人免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域，良好地對齊。該另外的假-γ同種型在本文中被稱為iggp或ighgp。還報道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域p1和p2假基因(ighep1和ighep2)。igg類是最常用于治療目的的。在人中，該類別包括亞類iggl、igg2、igg3和igg4。在小鼠中，該類別包括亞類iggl、igg2a、igg2b、igg2c和igg3。術(shù)語“嵌合抗體”或“嵌合抗trka抗體”在本文中包括可變區(qū)序列源自一種物種而恒定區(qū)序列源自另一種物種的抗體，例如，可變區(qū)序列源自小鼠抗體而恒定區(qū)序列源自人抗體的抗體。術(shù)語“人源化抗體”或“人源化抗trka抗體”在本文中包括，已在人框架序列上嫁接了源自另一哺乳動物物種例如小鼠種系的cdr序列的抗體。可以在人框架序列中以及在源自另一哺乳動物物種種系的cdr序列中進行額外的框架區(qū)修飾。本文使用的術(shù)語“fab”或“fab區(qū)”涵蓋包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。fab可以指分離的這一區(qū)域，或位于全長抗體或抗體片段中的這一區(qū)域。本文使用的術(shù)語“fc”或“fc區(qū)”包括這樣的多肽，所述多肽包含除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的抗體恒定區(qū)。因此，fc指iga、igd和igg的最后2個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、以及ige和igm的最后3個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、和這些結(jié)構(gòu)域n端的柔性鉸鏈。對于iga和igm，fc可以包括j鏈。對于igg，fc包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域cγ2和cγ3、和cγl與cγ2之間的鉸鏈。雖然fc區(qū)的邊界可以改變，但人igg重鏈fc區(qū)通常定義為包括殘基c226或p230至其羧基端，其中根據(jù)eu編號系統(tǒng)(edelmangmetal.,(1969)pnasusa63(1):78-85)編號。對于人igg1，fc區(qū)在本文中定義為包括殘基p232至其羧基端，其中根據(jù)eu編號系統(tǒng)編號。fc可以指分離的這一區(qū)域，或位于fc多肽(例如抗體)中的這一區(qū)域。本文中術(shù)語“鉸鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈區(qū)”涵蓋包含抗體第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間氨基酸的柔性多肽?！般q鏈區(qū)”在本文中是長度為6-62個氨基酸的序列區(qū)，僅存在于iga、igd和igg中，包含了橋接2條重鏈的半胱氨酸殘基。結(jié)構(gòu)上，iggch1結(jié)構(gòu)域終止于eu位置220，iggch2結(jié)構(gòu)域始于殘基eu位置237。因此，對于igg，抗體鉸鏈在本文中被定義為包括位置221(在igg1中d221)至231(igg1中a231)，其中根據(jù)eu編號系統(tǒng)編號。術(shù)語“親本抗體”、“親本免疫球蛋白”、“親代抗體”或“親代免疫球蛋白”，在本文中可互換使用，包括隨后可以被修飾以產(chǎn)生變體的未修飾抗體。所述親本抗體可以是天然抗體、或天然抗體的變體或工程化形式。親本抗體可以指抗體本身、包含親本抗體的組合物、或編碼其的氨基酸序列?！坝H本鼠抗體”或“相應(yīng)的親本鼠抗體”在本文中意指，被修飾以產(chǎn)生變體的、結(jié)合人trka的抗體或免疫球蛋白，尤其是wo00/73344公開的鼠抗體mnac13。術(shù)語“變體抗體”或“抗體變體”在本文中包括與親本相比由于至少一個氨基酸修飾而不同于親本抗體序列的抗體序列。變體抗體序列在本文中與親本抗體序列優(yōu)選具有至少約80％、最優(yōu)選至少約90％、更優(yōu)選至少約95％氨基酸序列同一性。抗體變體可以指抗體本身、包含該抗體變體的組合物、或編碼其的氨基酸序列。術(shù)語“氨基酸修飾”在本文中包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”在本文中是指，親本多肽序列中特定位置處的氨基酸被另一氨基酸置換。例如，取代r94k是指變體多肽，在本案中重鏈可變框架區(qū)變體，其中位置94的精氨酸被賴氨酸置換。對于前例，94k是指以賴氨酸進行位置94的取代。出于本文的目的，多重取代典型地通過斜線分開。例如，r94k/l78v指，包含取代r94k和l78v的雙重變體?！鞍被岵迦搿被颉安迦搿痹诒疚闹惺侵?，在親本多肽序列中特定位置處添加氨基酸。例如，插入-94是指在位置94插入。“氨基酸缺失”或“缺失”在本文中是指，去除親本多肽序列中特定位置處的氨基酸。例如，r94-是指缺失位置94的精氨酸。在本文中，術(shù)語“保守修飾”或“保守性序列修飾”旨在指，該氨基酸修飾不顯著地影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征。保守性修飾包括氨基酸取代、插入和缺失。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)引入本發(fā)明抗體，例如定點誘變和pcr介導的誘變。保守氨基酸取代是指，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的另一氨基酸殘基置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本發(fā)明抗體的cdr區(qū)中或框架區(qū)中的一個或多個氨基酸殘基可以替換為來自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基，并可以測試該改變的抗體(變體抗體)保留的功能。對于所有人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，根據(jù)“eu編號系統(tǒng)”(edelmangm等,同上引文)編號。對于人κ免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(igkc)，根據(jù)“eu編號系統(tǒng)”(edelmangm等,同上引文)編號。對于人λ免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(iglc1,iglc2,iglc3,iglc6,和iglc7)，根據(jù)“kabat編號系統(tǒng)”編號(kabatea等,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationn°91-3242)，描述于dariavachp等,(1987)pnasusa84(24):9074-8和frangioneb等,(1985)pnasusa82(10):3415-9。術(shù)語“可變結(jié)構(gòu)域”是指介導抗原結(jié)合并限定特定抗體對特定抗原的特異性的結(jié)構(gòu)域。在天然抗體中，抗原結(jié)合位點由定義特異性的兩個可變結(jié)構(gòu)域組成：一個位于重鏈中，在本文中稱作重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)，另一位于輕鏈中，在本文中稱作輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)。一些情況下，特異性可以僅存在于兩個結(jié)構(gòu)域的僅一個中，例如在來自駝科動物(camelids)的重鏈抗體的單域抗體中。v區(qū)通常大約110個氨基酸長度，由稱作框架區(qū)(fr或“非cdr區(qū)”)的15-30個氨基酸的相對不變氨基酸序列鏈和稱作“高變區(qū)”的7-17個氨基酸長度的極度可變的較短區(qū)域組成，其中框架區(qū)被高變區(qū)分隔開。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含4個fr,這些fr大部分采取β片層構(gòu)型，通過形成環(huán)的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過fr而緊靠在一起，與來自另一鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見kabatea等，同上引文)。本文中術(shù)語“高變區(qū)”是指，負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基，后者具有最大的序列變異性和/或參與抗原識別。對于所有可變結(jié)構(gòu)域，根據(jù)kabat(kabatea等，同上引文)進行編號。有多種cdr定義在使用，并包括在本文中。kabat定義基于序列的變異性，是最常使用的cdr定義(kabatea等，同上引文)。chothia則是指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia&leskj(1987)molbiol196:901-917)。abm定義是kabat和chothia定義的折衷，用于oxfordmolecular的abm抗體模建軟件(martinacr等,(1989)pnasusa86:9268–9272；martinacr等,(1991)methodsenzymol.203:121–153；pedersenjt等,(1992)immunomethods1:126–136；reesar等,(1996)insternbergm.j.e.(ed.),proteinstructureprediction.oxforduniversitypress,oxford,141–172)。近來引入了接觸定義(maccallumrm等,(1996)jmolbiol262:732-745)，其基于對蛋白數(shù)據(jù)庫中可得的復合物結(jié)構(gòu)的分析。(國際immunogenetics信息系統(tǒng))的cdr定義(http://www.imgt.org)基于對所有物種的所有免疫球蛋白和t細胞受體v-regions的imgt編號(國際immunogenetics信息系統(tǒng)；lefrancmp等,(1999)nucleicacidsres.27(1):209-12；ruizm等,(2000)nucleicacidsres.28(1):219-21；lefrancmp(2001)nucleicacidsres.29(1):207-9；lefrancmp(2003)nucleicacidsres.31(1):307-10；lefrancmp等,(2005)dev.comp.immunol.29(3):185-203；kaasq等,(2007)briefingsinfunctionalgenomics&proteomics,6(4):253-64)。在本發(fā)明中提及的所有互補決定區(qū)(cdr)優(yōu)選按如下進行定義(根據(jù)kabatea等人進行編號，同上引文)：lcdr1:24-34；lcdr2:50-56；lcdr3:89-98；hcdr1:26-35；hcdr2:50-65；hcdr3:95-102?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的“非cdr區(qū)”稱作框架區(qū)(fr)。在本文中vl區(qū)的“非cdr區(qū)”包含氨基酸序列：1-23(frl),35-49(fr2),57-88(fr3),和99-107(fr4)。在本文中vh區(qū)的“非cdr區(qū)”包含氨基酸序列：1-25(frl),36-49(fr2),66-94(fr3),和103-113(fr4)。本文中使用的術(shù)語“全長抗體”包括，構(gòu)成抗體的天然生物學形式的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。例如，在大多數(shù)哺乳動物(包括人和小鼠)中，igg類的全長抗體是四聚體，由相同的2對組成，每對兩條免疫球蛋白鏈，每一對具有1條輕鏈和1條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域vl和cl，每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域vh、ch1(cγ1)、ch2(cγ2)和ch3(cγ3)。在一些哺乳動物中，例如駱駝和羊駝，igg抗體可以僅由2條重鏈組成，每條重鏈包含與fc區(qū)連接的可變結(jié)構(gòu)域?？贵w片段在本文中是指抗原結(jié)合片段，包括，但不限于，(i)由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fab片段，包括fab’和fab’-sh；(ii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iii)由單個抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(iv)由單可變結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(wardetal(1989)nature341:544-546)；(v)f(ab')2片段——包含2個相連的fab片段的二價片段；(vi)單鏈fv分子(scfv)，其中vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域通過肽接頭相連，所述接頭允許2個結(jié)構(gòu)域締合形成抗原結(jié)合位點(birdetal(1988)science242:423-426；hustonetal(1988)pnasusa85:5879-5883)；(vii)雙特異性單鏈fv二聚體(pct/us92/09965)；(viii)“二體抗體(diabody)”或“三體抗體(triabodies)”——通過基因融合構(gòu)建的多價或多特異性片段(tomlinsonietal.,(2000)methodsenzymol326:461-479；wo94/13804；holligeretal.,(1993)pnasusa90:6444-6448)；和(ix)與相同或不同抗體遺傳融合的scfv(coloma&morrison(1997)naturebiotech15:159-163)。術(shù)語“效應(yīng)子功能”在本文中包括由抗體fc區(qū)與fc受體或配體相互作用引起的生物化學事件。效應(yīng)子功能包括fcγr介導的效應(yīng)子功能，例如adcc(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)和adcp(抗體依賴性細胞介導的吞噬作用)，和補體介導的效應(yīng)子功能例如cdc(補體介導的細胞毒性)?？贵w的效應(yīng)子功能可以通過如下方式改變：改變，即增強或降低，優(yōu)選增強抗體對效應(yīng)分子例如fc受體或補體成分的親和力。結(jié)合親和力通常可以通過修飾效應(yīng)分子結(jié)合位點來改變，并且在該情況下適宜的是定位目的位點并以合適的方式修飾該位點的至少一部分。也可以考慮，改變抗體上的效應(yīng)分子結(jié)合位點無需顯著改變整體的結(jié)合親和力，而是可以改變相互作用的幾何學，從而使得效應(yīng)機制在非有效結(jié)合中無效。還可以考慮，也可以通過修飾非直接參與效應(yīng)分子結(jié)合而是參與效應(yīng)子功能行使的位點，來改變效應(yīng)子功能。通過改變抗體的效應(yīng)子功能，可以控制免疫反應(yīng)的多個方面，例如，增強或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，獲得可能的診斷和治療有效效果。在本文中，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如靈長類動物，綿羊、狗、貓、馬、母牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。優(yōu)選，受試者是人。本發(fā)明抗體本發(fā)明第一方面提供，人源化抗trka抗體或其片段，其包含：a)包含選自seqidnos:1-5的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和b)包含選自seqidnos:6-13的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2包含至少一個氨基酸取代，和/或其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非cdr區(qū)在選自由37、42和89組成的組的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2包含至少一個保守氨基酸取代。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的非cdr區(qū)在選自由37、42和89組成的組的氨基酸位置包含保守氨基酸取代。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2包含序列seqidno:15。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自seqidnos:1,3和5的序列，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自seqidnos:6和8的序列。在一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合，所述組合包含選自seqidno:1和seqidno:6、seqidno:3和seqidno:6、seqidno:3和seqidno:8、seqidno:5和seqidno:6、以及seqidno:5和seqidno:8的序列；優(yōu)選seqidno:5和seqidno:6的序列或seqidno:5和seqidno:8的序列；更優(yōu)選seqidno:5和seqidno:6的序列。在一些實施方案中，本公開提供的人源化抗trka抗體或其片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域不包含seqidno:71的序列。在一些實施方案中，本公開提供的人源化抗trka抗體或其片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域缺少位置87的絲氨酸，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，本公開提供的人源化抗trka抗體或其片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域在位置87包含蘇氨酸，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2的氨基酸取代包含在選自由50,60和62組成的組，優(yōu)選選自由60和62組成的組、的氨基酸位置的氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2的氨基酸取代不包含選自由y50a、p60a和t62s組成的組的氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，如果人源化抗trka抗體或片段在重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)中的氨基酸取代是a49s，則人源化抗trka抗體或片段在重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2中的氨基酸取代不是y50a。在一些實施方案中，人源化抗trka抗體或片段在重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)中的氨基酸取代不是a49s，和/或人源化抗trka抗體或片段在重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr2中的氨基酸取代不是y50a。在一些實施方案中，抗體或其片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由v37a、g42e和v89l組成的組的氨基酸取代，優(yōu)選v37a，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，抗體包含含有seqidno:3序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由v37a、t40a、g42e、r44g、a49s和v89l組成的組的氨基酸取代，優(yōu)選選自v37a、t40a、g42e、r44g和v89l，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合，所述組合包含seqidno:3和seqidno:6序列或包含seqidno:3和seqidno:8序列，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由v37a、t40a、g42e、r44g、a49s和v89l組成的組的氨基酸取代，優(yōu)選選自v37a、t40a、g42e、r44g和v89l，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由k3q、v37a、g42e、a49s、v89l和r94k組成的組的氨基酸取代，優(yōu)選選自k3q、v37a、g42e、v89l和r94k，更優(yōu)選包含氨基酸取代k3q和v37a，最優(yōu)選包含氨基酸取代v37a，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。等同最優(yōu)選的是這樣的實施方案，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由v37a和k3q,v37a組成的組的氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。在一些實施方案中，抗體包含含有seqidno:5序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由k3q、v37a、g42e、a49s、v89l和r94k組成的組的氨基酸取代，優(yōu)選選自k3q、v37a、g42e、v89l和r94k，更優(yōu)選包含氨基酸取代k3q和v37a，最優(yōu)選包含氨基酸取代v37a，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。等同最優(yōu)選的實施方案是，其中抗體包含含有seqidno:5序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域非cdr區(qū)的氨基酸取代包含選自由v37a和k3q,v37a組成的組的氨基酸取代，其中每個組成員的氨基酸位置使用kabat中所示編號系統(tǒng)給出。再一方面，本發(fā)明提供人源化抗trka抗體或其片段，其包含：a)包含選自seqidnos:31-49的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和b)包含選自seqidnos:6-13的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:32,36,39,43,48和49的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和b)包含選自seqidnos:6-13或選自seqidnos:6和8的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:32,36,48和49的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和b)包含序列seqidno:6或seqidno:8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:32和36的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和b)包含seqidno:6的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含seqidno:36的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和b)包含seqidno:6的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合，所述組合選自序列組合seqidno:32和seqidno:6、seqidno:32和seqidno:8、seqidno:36和seqidno:6、seqidno:48和seqidno:6、seqidno:49和seqidno:6、以及seqidno:49和seqidno:8，優(yōu)選選自序列組合seqidno:32和seqidno:6、seqidno:32和seqidno:8、seqidno:36和seqidno:6、seqidno:49和seqidno:6、以及seqidno:49和seqidno:8；最優(yōu)選選自序列組合seqidno:36和seqidno：6。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段還包含重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)，優(yōu)選重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)。優(yōu)選，重鏈恒定區(qū)是人來源的，并可以是例如人igg1(ighg1),igg2(ighg2),igg3(ighg3),igg4(ighg4),iga1(igha1),iga2(igha2),igm(ighm),igd(ighd),或ige(ighe)同種型。更優(yōu)選，重鏈恒定區(qū)是人ighg1同種型或人ighg4同種型。優(yōu)選，輕鏈恒定區(qū)是人來源的，并可以是人κ(ck)或人λ(cλ)輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段還包含重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)，其中重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)是人ighg1同種型的或人ighg4同種型的。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段還包含重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)，其中重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)是人ighg4同種型的，且其中鉸鏈區(qū)包含氨基酸取代s228p，其中氨基酸位置使用eu編號系統(tǒng)給出。再一方面，本發(fā)明提供人源化抗trka抗體或其片段，其包含：a)包含選自seqidnos:50-70的序列的重鏈，和b)包含選自seqidnos:29和30的序列的輕鏈。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:51,52,56,57,60,64,69和70的序列的重鏈，和b)包含選自seqidnos:29和30，優(yōu)選seqidno:29的序列的輕鏈。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:51,52,56,57,69和70的序列的重鏈，和b)包含選自seqidnos:29和30，優(yōu)選seqidno:29的序列的輕鏈。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:51,52,56,57和70的序列的重鏈，和b)包含選自seqidnos:29和30，優(yōu)選seqidno:29的序列的輕鏈。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含選自seqidnos:51,52,56和57的序列的重鏈，和b)包含選自seqidnos:29和30，優(yōu)選seqidno:29的序列的輕鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段包含：a)包含seqidno:57的序列的重鏈，和b)包含seqidno:29的序列的輕鏈。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段是全長抗體。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段是抗體片段，選自fab、fab′、fab′-sh、fd、fv、dab、f(ab')2、scfv、雙特異性單鏈fv二聚體、二體抗體、三體抗體、和與相同或不同抗體遺傳融合的scfv；優(yōu)選scfv或fab；更優(yōu)選scfv二聚體或二體抗體或f(ab')2。一些實施方案中，人源化trka抗體或其片段包含變體fc區(qū)，其相對于親本抗體fc區(qū)包含至少一個氨基酸修飾，其中含有變體fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出不同于親本抗體的效應(yīng)子功能。fc區(qū)中的氨基酸修飾典型地改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，例如血清半衰期、補體固定、與fc受體或配體結(jié)合相關(guān)的效應(yīng)子功能、和/或抗原依賴性細胞的細胞毒性。下面列出的fc區(qū)修飾依據(jù)fc區(qū)殘基的eu編號給出。一個實施方案中，修飾ch1的鉸鏈區(qū)從而改變例如增加或降低鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)量。該方法進一步描述在us專利號5,677,425(bodmer等)。改變ch1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)量可以例如促進輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩(wěn)定性。另一實施方案中，突變抗體fc鉸鏈區(qū)以降低抗體的生物學半衰期。更特別地，向fc-鉸鏈片段的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)中引入一個或多個氨基酸突變，從而相對于天然fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域的spa結(jié)合，該抗體具有削弱的葡萄球菌蛋白a(spa)結(jié)合。該方法更詳細地描述于美國專利號6,165,745(ward等)。另一實施方案中，修飾抗體以增加其生物學半衰期。各種方案都是可以的。例如，可以引入下述突變中的一個或多個：t252l、t254s和t256f，如美國專利號6,277,375(ward)中所述?；蛘撸瑸榱嗽黾由飳W半衰期，可以在ch1或cl區(qū)中改變抗體，以包含取自iggfc區(qū)ch2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)的挽救受體結(jié)合表位，參見美國專利號5,869,046和6,121,022(presta等)。再一實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基取代為不同的氨基酸殘基，改變fc區(qū)，從而改變抗體的(一種或多種)效應(yīng)子功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234,235,236,237,297,318,320和322的一個或多個氨基酸取代為不同的氨基酸殘基，從而抗體具有改變的效應(yīng)子配體親和力但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。待改變親和力的效應(yīng)子配體可以是，例如，fc受體或補體的c1成分。該方法描述于winter等人的美國專利號5,624,821和5,648,260。在另一例子中，可以將選自氨基酸殘基329,331和332的一個或多個氨基酸取代為不同氨基酸殘基，從而抗體具有改變的c1q結(jié)合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性(cdc)。該方法描述于idusogie等人的美國專利號6,194,551。在另一例子中，可以改變ch2結(jié)構(gòu)域n端區(qū)域中氨基酸位置231至238中的一個或多個氨基酸殘基，由此改變抗體固定補體的能力。該方法描述于bodmer等人的pct公布wo94/29351。再一例子中，可以通過修飾位于以下位置的一個或多個氨基酸，修飾fc區(qū)以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(adcc)的能力和/或增加抗體對fcγ受體的親和力：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,309,312,315,320,322,324,326,327,329,330,331,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439。該方法描述于presta的pct公布wo00/42072。此外，可以化學修飾本發(fā)明抗體(例如，可以將一個或多個化學結(jié)構(gòu)部分附著到抗體上)，或可以修飾本發(fā)明抗體以改變其糖基化。本發(fā)明抗體的性質(zhì)一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段能夠抑制trka的功能性激活。一些實施方案中，人源化抗trka抗體能夠阻斷或降低trka的一種或多種生物學活性。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段結(jié)合人trka，且親和力(kd)值為500nm或更小，優(yōu)選350nm或更小，更優(yōu)選150nm或更小，甚至更優(yōu)選100nm或更小，最優(yōu)選50nm或更小，尤其是30nm或更小，所述親和力值可以例如使用biacore2000儀器(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,switzerland)或本領(lǐng)域已知的等同儀器，通過將抗體捕獲在儀器傳感器芯片上，使用重組單價人trka胞外域(seqidno:25)作為分析物，通過表面等離子體共振(spr)測量。本文中，與使用trka受體的親和力測量相關(guān)的表述“單價”是指這樣的人trka受體結(jié)構(gòu)域(如人trka胞外域)，(不同于例如在將該結(jié)構(gòu)域氨基酸端融合至免疫球蛋白fc部分時發(fā)生的人為二聚體化或多聚體化)所述結(jié)構(gòu)域不發(fā)生人為二聚體化或多聚體化，或(不同于例如該結(jié)構(gòu)域與其天然配體ngf結(jié)合時發(fā)生的天然二聚體)所述結(jié)構(gòu)域不發(fā)生天然二聚體化。評估抗體對例如人trka的結(jié)合親和力的標準測定試驗是本領(lǐng)域已知的，包括例如elisas,biacore,western印跡,ria,流式細胞術(shù)分析。適宜的測定試驗在實施例中詳細描述。抗體的結(jié)合動力學(例如結(jié)合親和力如kd)也可以通過本領(lǐng)域已知的標準測定試驗，例如通過scatchard或系統(tǒng)分析來評估。相對結(jié)合親和力ki可以通過本領(lǐng)域已知的標準競爭測定試驗來評估。可以在tf-1細胞增殖試驗中，評價工程化抗trka抗體抑制trka功能性激活的能力。半最大抑制濃度(ic50)，作為化合物抑制生物學功能的有效性的量度，可以用于選擇優(yōu)選的抗體。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段在tf-1細胞增殖試驗中與相應(yīng)的親本鼠抗體相比具有至少相當或更低的ic50，其中所述ic50可以例如使用因子依賴性人紅白血病細胞系tf-1，通過抗體阻斷細胞表面trka/β-ngf介導的細胞增殖的能力來度量(kitamuratetal.,(1989)jcellularphysiology140(2):323-34)。優(yōu)選地，人源化抗trka抗體或其片段在tf-1細胞增殖試驗中具有1μg/ml或更低、更優(yōu)選0.75μg/ml,甚至更優(yōu)選0.5μg/ml或更低,最優(yōu)選0.3μg/ml或更低,尤其是0.1μg/ml或更低的ic50。一些實施方案中，人源化抗trka抗體或其片段具有大于65℃，優(yōu)選大于70℃的fab片段熱穩(wěn)定性溫度。對于fab片段熱穩(wěn)定性的分析，可以使用差示掃描量熱測量，其中鑒定在全長igg中的fab片段的中點熔解溫度。該類量熱測量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以根據(jù)例如garber&demarest(2007)bbrc355:751-7實施。令人驚訝的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人源化抗體的fab片段熱穩(wěn)定性溫度與親本鼠抗體的fab片段熱穩(wěn)定性溫度相當，同時具有相當?shù)挠H和力(通過spr測量)和改善的效能(通過tf-1細胞增殖試驗測量)。因此，本公開也提供人源化抗trka抗體，其具有與親本鼠抗體相當?shù)膄ab片段熱穩(wěn)定性溫度、以及相當?shù)娜藅rka親和力和改善的抑制性質(zhì)?！芭c親本鼠抗體具有相當?shù)膄ab片段熱穩(wěn)定性溫度”，在此上下文中使用時是指，人源化抗trka抗體或其片段的fab片段熱穩(wěn)定性溫度在親本鼠抗體的fab片段熱穩(wěn)定性溫度的±20％范圍內(nèi),優(yōu)選在±15％范圍內(nèi),更優(yōu)選在±10％范圍內(nèi),甚至更優(yōu)選在±5％范圍內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明人源化抗體的fab片段熱穩(wěn)定性溫度比親本鼠抗體的fab片段熱穩(wěn)定性溫度低不超過15％?！跋喈?shù)娜藅rka親和力”，在此上下文中使用時是指，人源化抗trka抗體或其片段的親和力在親本鼠抗體的±20％范圍內(nèi),優(yōu)選在±15％范圍內(nèi),更優(yōu)選在±10％范圍內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明人源化抗體的kd比親本鼠抗體的kd低至少5％，優(yōu)選至少10％。本公開還提供可以用于治療疼痛的人源化抗trka抗體或其片段。在急性炎性痛覺過敏小鼠中測試了人源化抗trka抗體的效力(見實施例2)，其中通過向后爪足底注射完全弗氏佐劑(cfa)誘導所述急性炎性痛覺過敏。以0.01mg/kg或以上劑量施用人源化抗trka抗體造成了顯著的痛覺過敏逆轉(zhuǎn)，這與使用nsaid吲哚美辛時觀察到的類似。在慢性炎性痛覺過敏小鼠中測試了人源化抗trka抗體的效力(見實施例3)，其中通過向膝關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa誘導所述慢性炎性痛覺過敏。以0.01mg/kg或以上的單劑量施用人源化抗trka抗體產(chǎn)生了痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)，這與多次給藥cox-2選擇性nsaid塞來昔布時觀察到的相當。在慢性骨關(guān)節(jié)炎性痛覺過敏小鼠中測試了人源化抗trka抗體的效果(參見實施例4)，其中通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射碘乙酸鈉(mia)到膝關(guān)節(jié)中誘導所述慢性骨關(guān)節(jié)炎性痛覺過敏。以0.01mg/kg或以上的單劑量施用人源化抗-trka抗體產(chǎn)生痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)，這與通過多次給藥阿片類藥物曲馬多和普瑞巴林所觀察到的相當。在坐骨神經(jīng)慢性壓迫誘導的神經(jīng)病理性疼痛小鼠中測試了人源化抗trka抗體的效果(cci模型；參見實施例5)。以0.01mg/kg或以上的單劑量施用人源化抗trka抗體產(chǎn)生機械性痛覺過敏和冷異常性疼痛的顯著逆轉(zhuǎn)，在測試的最高劑量1mg/kg時該逆轉(zhuǎn)與多次給藥普瑞巴林所觀察到的相當。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案提供人源化抗-trka抗體用于治療患有急性炎性疼痛，慢性炎性疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛和/或神經(jīng)病理性疼痛的患者。核酸，載體和宿主細胞本公開還提供編碼抗trka抗體及其片段的分離核酸、載體和包含該核酸或載體的宿主細胞。核酸可以存在于全細胞，細胞裂解物中或可以是部分純化的或基本上純的形式。當通過標準技術(shù)(包括堿/sds處理，cscl條帶，柱層析，瓊脂糖凝膠電泳及其他本領(lǐng)域已知的技術(shù))將核酸從其他細胞成分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質(zhì))中純化出來后，核酸是“分離的”或“成為基本上純的”，所述技術(shù)參見例如ausubelf等人，編(1987)currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingandwileyinterscience，newyork。本發(fā)明的核酸可以是例如dna或rna，并且可以含有或可以不含有內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸是cdna分子。本發(fā)明的核酸可以使用標準分子生物學技術(shù)獲得，例如可以通過標準pcr擴增或cdna克隆技術(shù)獲得編碼抗體輕鏈和重鏈或編碼vh和vl片段的cdna。對于從免疫球蛋白基因文庫(例如，使用噬菌體展示技術(shù))獲得的抗體，可以從文庫回收編碼抗體的一個或多個核酸。將外源核酸引入宿主細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且將隨所用的宿主細胞而變化。技術(shù)包括但不限于葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，氯化鈣處理，聚乙烯亞胺介導的轉(zhuǎn)染，聚凝胺(polybrene)介導的轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合，電穿孔，病毒或噬菌體感染，脂質(zhì)體包封多核苷酸，以及直接將dna顯微注射入細胞核。在哺乳動物細胞的情況下，轉(zhuǎn)染可以是瞬時的或穩(wěn)定的。在一些實施方案中，編碼抗-trka抗體及其片段的分離核酸包含選自seqidno：73-116的核酸序列，通常是選自seqidno：113,114,115和116的編碼輕鏈可變區(qū)或輕鏈的核酸分子和/或選自seqidno：73-112的編碼重鏈可變區(qū)或重鏈的核酸分子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是選自seqidno：113和114的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸分子和/或選自seqidnos:74,78,81,85,90和91的編碼重鏈可變區(qū)的核酸分子。更優(yōu)選的是選自seqidno：74和78的編碼重鏈可變區(qū)的核酸分子和/或選自seqidno：113和114的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸分子。最優(yōu)選的是包含seqidno：74或78核酸序列的編碼重鏈可變區(qū)的核酸分子和/或包含seqidno：113核酸序列的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸分子。本發(fā)明的其它優(yōu)選的核酸分子是選自seqidno：115和116的編碼輕鏈的核酸分子和/或選自seqidno：93,94,98,99,102,106,111和112的編碼重鏈的核酸分子。更優(yōu)選的是，包含seqidno：93,94,98和99核酸序列的編碼重鏈的核酸分子和/或選自seqidno：115和116的編碼輕鏈的核酸分子。最優(yōu)選的是，包含seqidno：93,94,98和99核酸序列的編碼重鏈的核酸分子和/或包含seqidno：115核酸序列的編碼輕鏈的核酸分子。一旦獲得了編碼vh和vl區(qū)段的dna片段，則可以通過標準重組dna技術(shù)進一步操縱這些dna片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化成全長抗體鏈基因，或轉(zhuǎn)化成與上述片段相對應(yīng)的片段基因，像例如fab片段基因，或轉(zhuǎn)化成scfv基因。在這些操作中，編碼vl或vh的dna片段可操作地連接到編碼另一蛋白質(zhì)(例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一dna片段上。在本文中使用的術(shù)語“可操作地連接”旨在表示，連接兩個dna片段，使得由兩個dna片段編碼的氨基酸序列保持符合讀框。通過將編碼vh的分離dna與編碼重鏈恒定區(qū)(ch1，ch2和ch3)的另一dna分子可操作地連接，可以將編碼vh區(qū)的分離dna轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如kabat，ea等人，同上引文)，并且通過標準pcr擴增可以獲得包含這些區(qū)域的dna片段。重鏈恒定區(qū)可以是igg1，igg2，igg3，igg4，iga，ige，igm或igd恒定區(qū)，但最優(yōu)選是igg4恒定區(qū)，優(yōu)選人ighg4恒定區(qū)，其中鉸鏈區(qū)包含氨基酸取代s228p。對于fab片段重鏈基因，編碼vh的dna可以可操作地連接到僅編碼重鏈ch1恒定區(qū)的另一dna分子。通過將編碼vl的dna與編碼輕鏈恒定區(qū)cl的另一dna分子可操作地連接，可以將編碼vl區(qū)的分離dna轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如kabatea等人，同上引文)，并且通過標準pcr擴增可以獲得包含這些區(qū)域的dna片段。在優(yōu)選的實施方案中，輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，優(yōu)選κ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scfv基因，編碼vh-和vl的dna片段可操作地連接到編碼柔性接頭，例如編碼氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段，從而vh和vl序列可被表達為連續(xù)的單鏈蛋白，其中vl和vh區(qū)通過柔性接頭連接(參見例如bird等人，同上；huston等人，同上；mccafferty等，(1990)nature348：552-554)。已經(jīng)開發(fā)出用于產(chǎn)生抗體的抗體片段的各種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段是通過完整抗體的蛋白水解消化衍生的(參見例如morimoto等，(1992)j.biochem.biophysicalmethods，24：107-117和brennan等，(1985)science，229：81)。然而，這些片段現(xiàn)在可以由重組宿主細胞直接產(chǎn)生。例如，可以從上述抗體噬菌體文庫中分離抗體片段?；蛘?，可以從大腸桿菌中直接回收fab'-sh片段并化學偶聯(lián)以形成f(ab')2片段(carter等，(1992)bio/technology，10：163-167)。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細胞培養(yǎng)物中直接分離f(ab')2片段。生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)，參見例如，wo93/16185；美國專利號5,571,894和5,587,458?？贵w片段也可以是例如“美國專利號5,641,870”所述的“線性抗體”。編碼本發(fā)明抗體的核酸可以并入載體，優(yōu)選表達載體中以表達蛋白質(zhì)。多種表達載體可用于蛋白質(zhì)表達。表達載體可以包含自我復制性染色體外載體或整合到宿主基因組中的載體。構(gòu)建表達載體以與宿主細胞類型相容。因此，在本發(fā)明中使用的載體，優(yōu)選表達載體包括但不限于能夠在哺乳動物細胞，細菌，昆蟲細胞，酵母和體外系統(tǒng)中表達蛋白質(zhì)的載體。如本領(lǐng)域已知的，各種表達載體可以通過商業(yè)途徑或其他方式獲得，并可用于本發(fā)明中表達抗體。表達載體通常包含與控制或調(diào)節(jié)序列、選擇性標記、任何融合配偶體和/或其他元件可操作地連接的蛋白質(zhì)。本文中“可操作地連接”是指，將核酸置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括，可以控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列描述于例如goeddel(geneexpressiontechnology，methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，ca(1990))中。通常，這些表達載體包括與編碼抗體的核酸可操作地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸，并且通常適用于用于表達蛋白質(zhì)的宿主細胞。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子序列，核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，以及增強子或激活劑序列。如本領(lǐng)域中也已知的，表達載體通常含有選擇基因或標記，以允許選擇含有表達載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。選擇基因是本領(lǐng)域公知的，并且將隨所用的宿主細胞而變化。例如，通常選擇性標記基因可以對導入了載體的宿主細胞賦予藥物(例如g418，潮霉素或氨甲喋呤)抗性。優(yōu)選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因(與氨甲喋呤選擇/擴增一起用于dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于g418選擇)。用于克隆或表達本文載體中的dna的合適宿主細胞是原核細胞，酵母或高等真核細胞。用于此目的的合適的原核生物包括真細菌，包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)如埃希氏桿菌屬(escherichia)，例如大腸桿菌(e.coli)，腸桿菌屬(enterobacter)，克雷伯氏菌屬(klebsiella)，變形桿菌屬(proteus)，沙門氏菌屬(salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌屬(serratia)，例如粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans)和志賀氏菌屬(shigella)，以及芽孢桿菌屬(bacilli)如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)和地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)，假單胞菌屬(pseudomonas)如銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)和鏈霉菌屬(streptomyces)。合適的大腸桿菌克隆宿主包括大腸桿菌294(atcc31,446)，大腸桿菌b，大腸桿菌x1776(atcc31,537)和大腸桿菌w3110(atcc27,325)。除了原核生物之外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是合適的克隆或表達宿主。釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。用于表達本發(fā)明重組抗體的宿主細胞優(yōu)選是哺乳動物宿主細胞，包括中國倉鼠卵巢細胞(cho細胞)(包括在urlaub&chasin(1980)pnasusa77：4216-4220中描述的dhfr-cho細胞，其與dhfr可選擇標記一起使用，參見例如，kaufman&sharp(1982)j.mol.biol.159：601-621中所述)，nso骨髓瘤細胞，cos細胞，sp2細胞和hek293-ebna1細胞(目錄號：crl-10852)。特別是，為了與nso骨髓瘤細胞一起使用，另一個優(yōu)選的表達系統(tǒng)是wo87/04462，wo89/01036和ep0338841中公開的gs基因表達系統(tǒng)?？贵w的構(gòu)建和制備抗trka多肽產(chǎn)生的抗體可以通過免疫動物獲得，即通過使用眾所周知的常規(guī)方案，向動物，優(yōu)選非人動物施用該多肽，參見例如handbookofexperimentalimmunology，weirdm(編輯)，vol4，blackwellscientificpublishers，oxford，england(1986)。可以免疫許多溫血動物，例如兔，小鼠，大鼠，綿羊，牛，駱駝或豬。然而，小鼠，兔，豬和大鼠，特別是小鼠，通常是最合適的。也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組dna技術(shù)來產(chǎn)生抗體。另外，還可以通過酶學或化學切割天然抗體來產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的人源化抗體可以通過將來自非人動物(例如小鼠)vh和/或vl區(qū)的一個或多個cdr或其部分轉(zhuǎn)移到來自人vh和/或vl區(qū)的一個或多個框架區(qū)上來構(gòu)建。優(yōu)選地，可以通過如下方式構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體：將wo00/73344中公開的鼠mnac13抗體的vh和/或vl區(qū)的一個或多個cdr或其部分轉(zhuǎn)移到來自人vh和/或vl區(qū)的一個或多個框架區(qū)上。任選地，當需要或期望降低抗體的免疫原性和/或保持結(jié)合親和力時，可以將存在于vh和/或vl區(qū)中的人框架殘基置換為相應(yīng)的非人(例如小鼠)殘基。任選地，存在于cdr中的非人氨基酸殘基可以被置換為人殘基?？梢曰谌缟纤鲋苽涞姆侨藛慰寺】贵w的序列，制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體?？梢詮母信d趣的非人雜交瘤獲得編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna，并使用標準分子生物學技術(shù)工程化改造成以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見例如cabilly等人的美國專利號4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠cdr區(qū)插入人框架中(參見例如，winter的美國專利no.5,225,539和queen等人的美國專利no.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)?？梢詷?gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于潛在受體分子可變區(qū)和鼠抗體的重鏈可變區(qū)之間的同源性考慮，選擇該重鏈可變區(qū)的人受體分子。優(yōu)選種系候選人受體分子，以降低潛在的免疫原性。種系數(shù)據(jù)庫由通讀至重鏈fw3區(qū)末并部分地進入cdr3序列的抗體序列組成。為了選擇fw4區(qū)域，可以搜索從所選種系分子生成的成熟抗體序列的數(shù)據(jù)庫，或者可以使用來自人供體的從所選種系分子生成的抗體序列。人受體分子優(yōu)選選自與鼠供體分子相同的重鏈類別，并具有與鼠供體分子的可變區(qū)相同的規(guī)范(canonical)結(jié)構(gòu)類型。對于選擇重鏈可變區(qū)的人受體分子，第二考慮因素包括鼠供體分子和人受體分子之間在cdr長度上的同源性。優(yōu)選通過對v-base數(shù)據(jù)庫進行同源物檢索來選擇人受體抗體分子，但也可以使用諸如kabat數(shù)據(jù)庫和公共ncbi數(shù)據(jù)庫的其它數(shù)據(jù)庫?？梢詷?gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于潛在受體分子可變區(qū)和鼠抗體的輕鏈可變區(qū)之間的同源性考慮，選擇該輕鏈可變區(qū)的人受體分子。優(yōu)選種系候選人受體分子，以降低潛在的免疫原性。種系數(shù)據(jù)庫由通讀至重鏈fw3區(qū)末并部分地進入cdr3序列的抗體序列組成。為了選擇fw4區(qū)域，可以搜索從所選種系分子生成的成熟抗體序列的數(shù)據(jù)庫，或者可以使用來自人供體的從所選種系分子生成的抗體序列。人受體分子優(yōu)選選自與鼠供體分子相同的輕鏈類別，并具有與鼠供體分子的可變區(qū)相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。對于選擇輕鏈可變區(qū)的人受體分子，第二考慮因素包括鼠供體分子和人受體分子之間在cdr長度上的同源性。優(yōu)選通過對v-base數(shù)據(jù)庫進行同源物檢索來選擇人受體抗體分子，但也可以使用諸如kabat數(shù)據(jù)庫和公共ncbi數(shù)據(jù)庫的其它數(shù)據(jù)庫。當通過例如將基因?qū)氩溉閯游锼拗骷毎幸灾亟M抗體形式生產(chǎn)抗體時，可以將宿主細胞培養(yǎng)足夠長時間，以允許抗體在宿主細胞中表達或者更優(yōu)選地允許抗體分泌到生長宿主細胞的培養(yǎng)基中，由此產(chǎn)生抗體。用于產(chǎn)生結(jié)合人trka的抗體的宿主細胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如ham'sf10(sigma-aldrichchemiegmbh，buchs，瑞士)，極限基礎(chǔ)培養(yǎng)基(mem；sigma-aldrichchemiegmbh)，rpmi-1640(sigma-aldrichchemiegmbh，basel，瑞士)，ex-cell293，hek293-無血清培養(yǎng)基(sigma，buchs，瑞士)和dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基((dmem；sigma-aldrichchemiegmbh))適用于培養(yǎng)宿主細胞?？梢允褂脴藴实鞍准兓椒◤呐囵B(yǎng)基中回收抗體?？贵w可以可操作地連接到融合配偶體以使得可以例如靶向、純化、篩選、展示表達的蛋白質(zhì)等。融合配偶體可以通過接頭序列與抗體序列連接。接頭序列通常包含少量氨基酸，通常少于10個氨基酸，但也可以使用更長的接頭。典型地，選擇柔性并且抗降解的接頭序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以使用各種各樣的序列中的任何一種作為接頭。例如，常見的接頭序列包含氨基酸序列g(shù)gggs。融合配偶體可以是靶向序列或信號序列，其將抗體和任何相關(guān)聯(lián)的融合配偶體定向至所需的細胞位置或細胞外介質(zhì)。如本領(lǐng)域已知的，某些信號序列可以將蛋白質(zhì)靶向分泌到生長培養(yǎng)基中，或者靶向至位于細胞的內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)空間。融合配偶體也可以是編碼肽或蛋白質(zhì)的序列，其中所述肽或蛋白質(zhì)使得純化和/或篩選能夠進行。這樣的融合配偶體包括但不限于，聚組氨酸標簽(his標簽)(例如h6和h10或用于固定化金屬親和層析(imac)系統(tǒng)(例如ni2+親和柱))的其他標簽)，gst融合體，mbp融合體，strep-標簽，細菌酶bira的bsp生物素化靶序列，和由抗體靶向的表位標簽(例如c-myc標簽，flag標簽等)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，這些標簽可用于純化，篩選或兩者?？箃rka抗體的表征和純化可以使用測定試驗測量與人trka的結(jié)合和/或測量阻斷trka與其配體ngf結(jié)合的能力，來篩選抗體。結(jié)合測定試驗的一個實例是elisa。另外，表面等離子體共振(spr)分析(如在實施例中使用的)可用于測量抗體結(jié)合動力學的結(jié)合和解離速率常數(shù)。阻斷試驗的一個實例是基于流式細胞術(shù)的測定試驗，其測量對ngf與trka結(jié)合的阻斷。對于評估抗trka抗體功能活性的測定試驗，例如可以使用tf-1細胞增殖測定試驗，其中使用因子依賴性人紅白血病細胞系tf-1測定抗體阻斷細胞表面trka/β-ngf介導的細胞增殖的能力(kitamuratetal.,(1989)j.cellularphysiology140(2):323-34)。本發(fā)明的抗體可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式分離或純化。標準純化方法包括，使用諸如fplc和hplc系統(tǒng)在大氣壓或高壓下進行的色譜技術(shù)，包括離子交換，疏水相互作用，親和，尺寸排阻或凝膠過濾和反相色譜。純化方法還包括電泳，免疫學，沉淀，透析和色譜聚焦技術(shù)。超濾和滲濾技術(shù)，與蛋白質(zhì)濃縮相結(jié)合，也是有用的。為了純化trka抗體，可以在例如，轉(zhuǎn)瓶中生長所選擇的宿主細胞用于單克隆抗體純化?？梢赃^濾和濃縮上清液，之后用蛋白a-瓊脂糖凝膠(pharmacia，piscataway，nj)進行親和層析。洗脫的抗體可以通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查，以確保純度。因此，本發(fā)明優(yōu)選的抗體是與人trka結(jié)合的分離和/或純化的抗體。免疫綴合物另一方面，本發(fā)明提供與治療劑如細胞毒素，藥物(例如免疫抑制劑)或放射毒素連接的、人trka結(jié)合性抗trka抗體或其片段。這種綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包含一種或多種細胞毒素的免疫綴合物被稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死細胞)的任何藥劑。例子包括紫杉醇(taxol)，細胞松弛素b(cytochalasinb)，短桿菌肽d(gramicidind)，溴化乙錠(ethidiumbromide)，依米丁(emetine)，絲裂霉素(mitomycin)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(tenoposide)，長春新堿(vincristine)，長春花堿(vinblastine)，秋水仙素(colchicin)，多柔比星(doxorubicin)，柔紅霉素(daunorubicin)，二羥基蒽環(huán)二酮(dihydroxyanthracindione)，米托蒽醌(mitoxantrone)，光神霉素(mithramycin)，放線菌素d(actinomycind)，1-脫氫睪酮(1-dehydrotestosterone)，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)，普魯卡因(procaine)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如，氨甲喋呤(methotrexate)，6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)，6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，達卡巴嗪(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)，噻替派(thioepa)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，美法侖(melphalan)，卡莫司汀(carmustine(bsnu))和洛莫司汀(lomustine(ccnu))，環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)，白消安(busulfan)，二溴甘露糖醇(dibromomannitol)，鏈脲霉素(streptozotocin)，絲裂霉素c(mitomycinc)和順-二氯二胺鉑(ii)(cis-dichlorodiamineplatinum(ii)(ddp))順鉑(cisplatin))，蒽環(huán)類(anthracyclines)(例如柔紅霉素(daunorubicin)(原為：道諾霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin)))，抗生素(例如，更生菌素(dactinomycin)(原為：放線菌素(actinomycin))，博來霉素(bleomycin)，光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin(amc)))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)?？梢耘c本發(fā)明的抗體連接的治療性細胞毒素的其它實例包括倍癌霉素(duocarmycins)，加利車霉素(calicheamicins)，美登素(maytansines)和奧里斯他汀(auristatins)及其衍生物。加利車霉素抗體綴合物的一個實例是可商購的(americanhomeproducts)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域可獲得的接頭技術(shù)將細胞毒素與本發(fā)明的抗體連接。已經(jīng)用于將細胞毒素與抗體綴合的接頭類型的實例包括但不限于腙，硫醚，酯，二硫化物和含肽接頭?？梢赃x擇接頭，例如易于在溶酶體區(qū)室中通過低ph斷裂的接頭，或易被蛋白酶切割的接頭，所述蛋白酶可以是例如在腫瘤組織中優(yōu)先表達的蛋白酶例如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶b，c，d)。關(guān)于細胞毒素類型、接頭和用于將治療劑與抗體綴合的方法的進一步討論，也參見saitog等,(2003)adv.drugdeliv.rev.55:199-215；trailpa等,(2003)cancerimmunol.immunother.52:328-337；payneg(2003)cancercell3:207-212；allentm(2002)nat.rev.cancer2:750-763；pastani&kreitmanrj(2002)curr.opin.investig.drugs3:1089-1091；senterpd&springercj(2001)adv.drugdeliv.rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素連接以產(chǎn)生細胞毒性放射性藥物，也稱為放射免疫綴合物?？梢耘c抗體綴合用于診斷或治療用途的放射性同位素實例包括但不限于碘-131，銦-111，釔-90和镥-177。制備放射免疫綴合物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射免疫綴合物的實例是可商購的，包括(edecpharmaceuticals)和(corixapharmaceuticals)，并且類似的方法可用于從本發(fā)明抗體制備放射免疫綴合物。本發(fā)明的抗體免疫綴合物可用于修飾給定的生物反應(yīng)，并且藥物部分不應(yīng)被解釋為限于經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。此類蛋白質(zhì)可包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素，蓖麻毒蛋白a，假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，例如淋巴因子，白細胞介素-1(il-1)，白細胞介素-2(il-2)，白細胞介素-6(il-6)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)，粒細胞集落刺激因子(g-csf)或其他生長因子。將這些治療劑與抗體連接的技術(shù)是眾所周知的，參見例如arnon等,"癌癥治療中用于藥物的免疫靶向的單克隆抗體",monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等,(編),pp.243-56(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等,"抗體用于藥物遞送",controlleddrugdelivery(第二版),robinson等.(編),pp.623-53(marceldekker,inc.1987)；thorpe,"癌癥治療中細胞毒性劑的抗體運載體:綜述",monoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等.(編),pp.475-506(1985)；"有關(guān)癌癥治療中放射性標記抗體治療性應(yīng)用的分析、結(jié)果和未來前景",monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等.(編),pp.303-16(academicpress1985)和thorpe等,immunol.rev.62:119-58(1982)。另一方面，本發(fā)明提供與治療劑如細胞毒素，藥物(例如免疫抑制劑)或放射毒素一起施用的、與人trka結(jié)合的抗-trka抗體或其片段。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗體或其片段和藥學上可接受的載體的組合物，例如藥物組合物。這樣的組合物可以包括一種或組合的(例如兩種或更多種不同的)本發(fā)明抗體和/或免疫綴合物、和/或如上所述的治療劑如細胞毒素，藥物(例如免疫抑制劑)或放射毒素。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含結(jié)合靶抗原上的不同表位或具有互補活性的抗體(或免疫綴合物)的組合。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合治療(即，與其它藥劑組合)中施用，見下文進一步的概述。如本文所用，“藥學上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細菌和抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腸胃外，脊髓或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。取決于給藥途徑，活性化合物，即抗體或免疫綴合物可以包被在材料中以保護化合物免受可能使化合物失活的酸和其它天然條件的作用。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域已知的。任何常規(guī)介質(zhì)或試劑，除非與活性化合物不相容，否則均可以考慮用于本發(fā)明的藥物組合物中。組合物中還可以并入增補的活性化合物。另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的人源化抗-trka抗體或其片段和另外的藥物活性劑的組合物。優(yōu)選地，藥物活性劑是以下中的一種或多種：a)鎮(zhèn)痛劑，b)另一種抗trka抗體，c)ngf，d)抗癌劑，e)抗ngf抗體，如下文進一步概述。另一方面，本發(fā)明提供包含免疫綴合物和藥學上可接受載體的組合物，其中所述免疫綴合物包含與治療劑連接的與人trka結(jié)合的抗體或其片段?？梢允褂玫拿庖呔Y合物和治療劑如上所述。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸，半胱氨酸鹽酸鹽，硫酸氫鈉，焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯，丁基化羥基苯甲醚(bha)，丁基化羥基甲苯(bht)，卵磷脂，沒食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸，乙二胺四乙酸(edta)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物中的合適水性和非水性載體的實例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合適的混合物，植物油，例如橄欖油和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。適當?shù)牧鲃有钥梢岳缤ㄟ^使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑，和通過使用表面活性劑，來保持。這些組合物還可以含有助劑，如防腐劑，潤濕劑，乳化劑和分散劑。為確保防止微生物存在，可以使用上述滅菌方法以及通過包含各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等來實現(xiàn)。此外，也可能期望在組合物中包括等滲劑如糖，氯化鈉等。此外，可注射藥物形式的延長吸收可以通過包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)。治療用途和其他用途本發(fā)明的抗體可用于藥物中治療各種疾病/病癥(如下面所列各種類別)。因此，本發(fā)明提供治療下述病癥的方法，其包括給有需要的受試者，適宜地哺乳動物受試者，特別是人類受試者，施用治療有效量的本文所述抗體或衍生物，由此治療該病癥。本發(fā)明還提供本文所述的抗體或衍生物在制備用于治療下述病癥的藥物中的用途。這里的術(shù)語“治療”包括治療現(xiàn)有的病癥/病況。它也包括預防性治療。它還包括改善一種或多種不良癥狀，即使患者的給定病癥/病癥沒有獲得治愈。例如，可以緩解或減輕疼痛。一個優(yōu)選的醫(yī)藥用途是治療疼痛。根據(jù)國際疼痛研究協(xié)會(“iasp”)，疼痛通常被定義為“與實際或潛在的組織損傷有關(guān)的或者根據(jù)該損傷描述的令人不愉快的感覺和情感體驗，或兩者兼而有之”。在所有形式的疼痛中，基本的要素是?；母唛撝凳荏w和神經(jīng)纖維的激活，以警告生物體潛在的組織損傷。炎性細胞和過程的參與是許多疼痛狀態(tài)的常見因素。術(shù)語“急性疼痛”是指立即的、通常高閾值的疼痛，由例如割傷，壓傷，燒傷等損傷引起或由化學刺激引起。本文所用的術(shù)語“慢性疼痛”是指，除了急性疼痛以外的、炎性和神經(jīng)病理性來源的其他疼痛。慢性疼痛常被認為具有相對較長的持續(xù)時間，例如數(shù)月或數(shù)年，并且可以是連續(xù)的或間斷的。本發(fā)明的抗體可用于治療慢性疼痛或急性疼痛。優(yōu)選治療慢性疼痛。疼痛可以例如是以下任何一項或可以與之相關(guān)：炎性疼痛(inflammatorypain)，外科手術(shù)后疼痛(post-surgicalpain)，術(shù)后疼痛(post-operativepain)(包括牙痛(dentalpain))，神經(jīng)病理性疼痛(neuropathicpain)，周圍神經(jīng)病變(peripheralneuropathy)，糖尿病性神經(jīng)病變(diabeticneuropathy)，糖尿病性腎病(diabeticnephropathy)，骨折疼痛(fracturepain)，痛風關(guān)節(jié)疼痛(goutjointpain)，皰疹后神經(jīng)痛(post-herpeticneuralgia)，癌癥疼痛(cancerpain)，骨關(guān)節(jié)炎或類風濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，坐骨神經(jīng)痛(sciatica)，與鐮狀細胞危象相關(guān)的疼痛(painsassociatedwithsicklecellcrises)，頭痛(如偏頭痛(migraines)，緊張性頭痛(tensionheadache)，叢集性頭痛(clusterheadache))，痛經(jīng)(dysmenorrhea)，子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)，子宮肌瘤(uterinefibroids)，肌肉骨骼疼痛(musculoskeletalpain)，慢性腰痛(chroniclowbackpain)，纖維肌痛(fibromyalgia)，扭傷(sprains)，內(nèi)臟痛(visceralpain)，卵巢囊腫(ovariancysts)，前列腺炎(prostatitis)，慢性盆腔疼痛綜合征(chronicpelvicpainsyndrome)，膀胱炎(cystitis)，間質(zhì)性膀胱炎(interstitialcystitis)，疼痛性膀胱綜合征(painfulbladdersyndrome)和/或膀胱疼痛綜合征(bladderpainsyndrome)，與慢性非細菌性前列腺炎相關(guān)的疼痛(painassociatedwithchronicabacterialprostatitis)，切口疼痛(incisionalpain)，偏頭痛(migraine)，三叉神經(jīng)痛(trigeminalneuralgia)，來自燒傷和/或傷口的疼痛，與創(chuàng)傷相關(guān)的疼痛，與肌肉骨骼疾病相關(guān)的疼痛，強直性脊柱炎(ankylosingspondilitis)，關(guān)節(jié)周圍病變(periarticularpathologies)，骨轉(zhuǎn)移疼痛(painfrombonemetastases)，hiv疼痛(painfromhiv)，紅斑性肢痛病(erythromelalgia)或由胰腺炎或腎結(jié)石引起的疼痛，惡性黑素瘤(malignantmelanoma)，干燥綜合征(sjogren'ssyndrome)，哮喘(asthma)(例如，不受控制的哮喘伴嚴重氣道高反應(yīng)性(uncontrolledasthmawithsevereairwayhyper-responsiveness))，頑固性咳嗽(intractablecough)，脫髓鞘疾病(demyelinatingdiseases)，慢性酒精中毒(chronicalcoholism)，中風(stroke)，丘腦疼痛綜合征(thalamicpainsyndrome)，由毒素引起的疼痛，化療疼痛，炎性腸病(inflammatoryboweldisorders)，腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome)，炎癥性眼病(inflammatoryeyedisorders)，炎性或不穩(wěn)定性膀胱病癥(inflammatoryorunstablebladderdisorders)，牛皮癬(psoriasis)，具有炎癥成分的皮膚不適(skincomplaints)，曬傷(sunburn)，心臟炎(carditis)，皮炎(dermatitis)，肌炎(myositis)，神經(jīng)炎(neuritis)，膠原血管疾病(collagenvasculardiseases)，慢性炎性病癥，炎性疼痛和相關(guān)的痛覺過敏和異常性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛和相關(guān)痛覺過敏或異常性疼痛，糖尿病性神經(jīng)病疼痛(diabeticneuropathypain)，灼痛(causalgia)，通過交感神經(jīng)維持的疼痛(sympatheticallymaintainedpain)，傳入神經(jīng)阻滯綜合征(deafferentationsyndromes)，上皮組織損傷或功能障礙，呼吸、胃腸道、泌尿生殖器或血管區(qū)域的內(nèi)臟運動性紊亂(disturbancesofvisceralmotility),，過敏性皮膚反應(yīng)(allergicskinreactions)，瘙癢癥(pruritis)，白癜風(vitiligo)，一般胃腸道疾病，結(jié)腸炎(colitis)，胃潰瘍(gastriculceration)，十二指腸潰瘍(duodenalulcers)，血管舒縮性(vasomotor)或過敏性鼻炎，支氣管疾病，消化不良(dyspepsia)，胃食管反流(gastroesophagealreflux)，胰腺炎(pancreatitis)，內(nèi)臟痛(visceralgia)和骨纖維結(jié)構(gòu)發(fā)育不良(fibrousdysplasiaofbone)(fd)。疼痛可以例如是以下任何一種或與之相關(guān)：胰腺炎，腎結(jié)石，子宮內(nèi)膜異位癥，ibd，克羅恩病，手術(shù)后粘連，膽囊結(jié)石，頭痛，痛經(jīng)，肌肉骨骼疼痛，扭傷，內(nèi)臟痛，卵巢囊腫，前列腺炎，膀胱炎，間質(zhì)性膀胱炎，術(shù)后疼痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，燒傷和/或傷口疼痛，與創(chuàng)傷相關(guān)的疼痛，神經(jīng)病理性疼痛，與肌肉骨骼疾病相關(guān)的疼痛，類風濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，關(guān)節(jié)周圍病變，腫瘤疼痛，骨轉(zhuǎn)移疼痛，hiv感染。已知有各種模型用于評估疼痛并且可用于篩選抗體/其衍生物。例如，可以使用傷害感受熱板試驗，例如在wo00/73344中所公開的。該實驗可以根據(jù)mcmahon等人，1995(naturemed.1：774-780)，使用抗體/衍生物作為免疫粘附素進行。將抗體/衍生物皮下輸注入成年大鼠的后爪為期三周或通過滲透微型泵輸注?？梢允褂脽岚逶囼?eddy&leimbach(1953)j.pharm.exp.ther.107：385-393)——該試驗?zāi)M炎癥或神經(jīng)部分損傷后的痛覺過敏情況，間隔地評估傷害感受靈敏度。在這種情況下，傷害感受刺激誘發(fā)反應(yīng)(舔爪和/或跳躍)，所述反應(yīng)被認為比簡單反射具有更高的綜合協(xié)調(diào)性。根據(jù)該試驗，將動物放入具有加熱到所需溫度(通常為56℃)的板作為基底的欄中。在對照動物(用非相關(guān)抗體處理)和用抗-trka抗體/衍生物處理的動物中測量兩種反應(yīng)(舔爪和跳躍)中任一種的延遲期。作為熱板試驗的備選方案，可以評估對福爾馬林的傷害感受反應(yīng)。該試驗由porro&cavazzuti，1993(prog.neurobiol，41：565-607)公開，并用于wo06/137106。其涉及，在測試之前施用給定候選物，通過分析任何隨后的舔爪減少來評估疼痛反應(yīng)的減少。鹽水通常用作陰性對照。痛覺過敏的評估可以使用承重方法來確定。小鼠通常在兩肢之間均等地分配體重。在對肢體進行疼痛刺激之后，例如通過局部注射完全弗氏佐劑(cfa)或碘代乙酸鈉(mia)到后爪(足底內(nèi)，intraplantar)或膝關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)內(nèi))，重量會被重新分配以減少放置在注射肢體上的重量和增加放置在未注射的肢體上的重量。使用雙足平衡測痛儀(incapacitancetester)測量承重，其中將后爪放置在分開的傳感器上，并記錄由兩個后肢施加的平均力。承重可用于評估由足底內(nèi)注射cfa引起的急性炎性痛覺過敏，由關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa引起的慢性炎性痛覺過敏、或由關(guān)節(jié)內(nèi)注射mia引起的慢性骨關(guān)節(jié)炎性痛覺過敏，如分別在實施例2,3和4中所述。機械痛覺過敏的評估可以通過多種方法進行，例如，vonfrey絲或randall-selitto痛覺計(analgesiometer)。響應(yīng)于通過randall-selitto痛覺計的楔形探針施加到后爪足背表面或通過vonfrey絲施加到后爪足底表面的遞增壓力，測量爪回縮閾值。在對照動物和用抗-trka抗體/衍生物處理的動物中測量后爪回縮的延遲期。這些方法可用于評估慢性壓迫損傷(cci)動物模型引起的機械痛覺過敏，見實施例5中詳述。cci模型也是眾所周知的動物模型。它涉及坐骨神經(jīng)的慢性壓迫，并且用于在嚙齒動物例如小鼠或大鼠中誘導神經(jīng)病理性性質(zhì)的慢性疼痛。該模型由bennett&xie于1998年在pain33：87-107中描述。其已經(jīng)在例如wo06/131592中使用。許多神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)的一個主要特征是，通常無害的冷刺激開始引起疼痛。對非疼痛刺激的反應(yīng)增加被稱為異常性疼痛。因此，可以用異常性疼痛的冷板試驗來測量誘導的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)的程度，見實施例5中詳細描述。將動物放入具有冷卻至所需溫度的板的欄中，該溫度可以在-5℃至15℃的范圍內(nèi)。在對照動物和用抗-trka抗體/衍生物處理的動物中測量后爪回縮的延遲期。通常，在5℃及以下的表面溫度，回縮的延遲期變得與基線不同。本發(fā)明抗體可用于治療癌癥，神經(jīng)元病癥，阿爾茨海默氏病，糖尿病，糖尿病性腎病，病毒性疾病，hiv介導的病癥，麻風或炎性疾病。此外，抗體還可用于治療可能與增加的ngf水平相關(guān)的其它疾病，包括例如紅斑狼瘡，帶狀皰疹(shingles)，帶狀皰疹后神經(jīng)痛(postherpeticneuralgia)和痛覺過敏。各種癌癥表達trka。trka與ngf的相互作用可參與腫瘤發(fā)展(例如前列腺癌和胰腺癌的發(fā)展)。實際上在某些形式的癌癥中，過量的ngf可以促進神經(jīng)纖維的生長和浸潤。通過阻斷ngf的作用，可以顯著減少神經(jīng)瘤的形成。此外，作為簡單提供阻斷作用的備選方案，可以將抗體與細胞毒性劑偶聯(lián)，并可用于靶向表達trka的癌細胞。然而，將抗體與毒素偶聯(lián)并非必需的。adcc(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)可以由免疫應(yīng)答引起，其中抗體通過包被靶細胞可以使其易受免疫系統(tǒng)攻擊(例如通過t細胞，通過補體激活等)。優(yōu)選治療的癌癥是前列腺癌，甲狀腺癌，肺癌，催乳素瘤(prolactinoma)，黑素瘤或骨癌疼痛，包括與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌癥疼痛。待治療的優(yōu)選癌癥是骨癌疼痛，包括與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌癥疼痛?？贵w也可用于治療包括神經(jīng)變性疾病的各種神經(jīng)元病癥，例如，抗體可用于減少神經(jīng)瘤的形成。它們也可用于治療阿爾茨海默病或用于神經(jīng)再生治療。本發(fā)明的抗體可用于這些治療中，以減少不希望的ngf激動劑作用(另見下文的“組合療法”部分)。此外，如上所述，抗體可用于治療神經(jīng)病理性疼痛。這可與神經(jīng)系統(tǒng)的病變或功能障礙有關(guān)。ngf在糖尿病和麻風病治療上具有潛在用途，但ngf具有不希望的激動劑性質(zhì)，包括增加疼痛敏感性，而這可以通過使用本發(fā)明的抗體予以避免。另一個應(yīng)用是治療炎癥。ngf在炎癥過程發(fā)生的周圍位置由肥大細胞，成纖維細胞和其他細胞類型釋放。特別是，肥大細胞看起來發(fā)揮了重要作用。它們產(chǎn)生ngf，同時在其表面表達功能性trka受體。看起來，ngf/trka系統(tǒng)通過自分泌陽性反饋機制介導肥大細胞活化，從而允許疼痛產(chǎn)生性炎癥信號被局部放大?？梢灾委煹难装Y的實例包括尿道和盆腔區(qū)域的炎癥形式，骨關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，結(jié)腸炎，炎性腸病，膀胱炎，濕疹，接觸性皮炎，關(guān)節(jié)炎，包括慢性關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，牛皮癬和哮喘。本發(fā)明的抗體可用于如上所述的治療中以減少ngf的不期望的激動劑作用。本發(fā)明的抗體或其衍生物可與一種或多種其它活性劑，例如藥物活性劑在組合治療中一起使用。它們可用于藥物中同時，順序或協(xié)調(diào)施用。例如，抗體或衍生物可以與鎮(zhèn)痛藥，如鎮(zhèn)痛阿片類或非阿片類鎮(zhèn)痛劑組合。在wo06/137106中公開了，少量的能夠阻斷trka生物活性的分子可以增強阿片類物質(zhì)的鎮(zhèn)痛作用。這類鎮(zhèn)痛阿片類物質(zhì)包括一種或多種選自以下的化合物：嗎啡(morphine)，可待因(codeine)，二氫可待因二乙酰嗎啡(dihydrocodeinediacetylmorphine)，氫可酮(hydrocodone)，氫嗎啡酮(hydromorphone)，左啡諾(levorphanol)，羥嗎啡酮(oxymorphone)，阿芬太尼(alfentanil)，丁丙諾啡(buprenorphine)，布托啡芬(butorphanol)，芬太尼(fentanyl)，舒芬太尼(sufentanyl)，哌替啶(meperidine)，美沙酮(methadone)，萘丁美酮(nabumetone)，丙氧芬(propoxyphene)，戊唑星(pentazocine)；及其藥學上可接受的衍生物(例如其藥學上可接受的鹽)。合適的非阿片類鎮(zhèn)痛劑包括非類固醇炎癥藥物(nsaid)以及其它鎮(zhèn)痛藥如對乙酰氨基酚(acetaminophen)。常用治療急性炎性疼痛的nsaid包括阿司匹林(asprin)，布洛芬(ibuprofen)，吲哚美辛(indomethacin)，萘普生(naproxen)和酮洛芬(ketoprofen)，治療慢性炎性疼痛的包括塞來昔布(celecoxib)和美洛昔康(meloxicam)。再一組合是本發(fā)明的一種或多種抗體與一種或多種其它抗體的組合。優(yōu)選的組合是與一種或多種其它抗trka和/或抗ngf抗體的組合。相對于用單一抗體的治療，這樣的組合可以在一種或多種本文所述病癥的治療中提供增加的功效。例如，可以使用在本文所用的試驗程序中發(fā)現(xiàn)最為有效的兩種或更多種抗體的組合。再一組合是本發(fā)明的抗體與ngf的組合。如上所述，已經(jīng)提出使用ngf治療各種疾病，包括阿爾茨海默氏病，糖尿病，麻風病等，但已經(jīng)注意到由于針對周圍靶標的激動劑特性引起了疼痛敏感性的增加。再次，通過使用本發(fā)明的抗體或衍生物，可以降低疼痛敏感性，從而使得基于ngf的療法更有吸引力。再一組合是本發(fā)明的抗體與抗癌劑如烷化劑，抗代謝物，拓撲異構(gòu)酶ii抑制劑，拓撲異構(gòu)酶i抑制劑，抗有絲分裂藥物或鉑衍生物的組合。本發(fā)明的抗體可以通過任何合適的途徑施用。這包括(但不限于)腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，氣管內(nèi)，口服，腸內(nèi)，胃腸外，鼻內(nèi)或真皮給藥。典型地可以通過注射(腹膜內(nèi)或顱內(nèi)——通常在腦室中——或心包內(nèi)或囊內(nèi))液體制劑或通過吞咽固體制劑(以丸劑，片劑，膠囊劑的形式)或液體制劑(以乳液和溶液的形式)，施用抗體以局部應(yīng)用。腸胃外給藥的組合物通常包含溶解在相容的、優(yōu)選水性的溶液中的免疫球蛋白溶液。這些制劑中抗體/衍生物的濃度可以從小于0.005％至15-20％w/v變化。這主要根據(jù)液體的體積、粘度等，以及根據(jù)所需的特定給藥方式來選擇?；蛘撸梢灾苽淇贵w以固體形式施用。抗體可以與不同的惰性或賦形物質(zhì)組合，其可以包括配體如微晶纖維素，明膠或阿拉伯膠；受體(recipient)如乳糖或淀粉；試劑諸如藻酸，primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂，膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷和水楊酸甲酯。其他藥物施用系統(tǒng)包括水凝膠，羥甲基纖維素，脂質(zhì)體，微囊，微乳液，微球等。如果病癥是局域化的，則直接在病癥累及部位/緊靠該部位進行局部注射是優(yōu)選的施用方式?？箃rka抗體適宜全身施用。全身施用可以通過注射進行，例如連續(xù)靜脈輸注，快速靜脈濃注，皮下或肌內(nèi)注射。備選地，也可以使用其它施用形式(例如經(jīng)口，經(jīng)粘膜，通過吸入，舌下等)。然而，如果需要，可以通過在受累組織附近局部給藥(例如關(guān)節(jié)內(nèi)注射或皮下、肌內(nèi)注射)，遞送抗體/衍生物?？?trka抗體/衍生物可以適宜地配制成適合于預定給藥途徑的藥物組合物。注射用溶液適宜地含有溶解或分散在水性介質(zhì)(如注射用水)中的抗體/衍生物，所述介質(zhì)酌情可以含有合適的緩沖液和摩爾濃度調(diào)節(jié)劑(例如磷酸鹽，鹽和/或葡萄糖)。治療方案(即劑量，時間和重復)可以表示為，經(jīng)由選擇的給藥途徑、對產(chǎn)品的單次或重復施用(例如注射)。劑量施用的間隔可以根據(jù)臨床反應(yīng)的程度和持續(xù)時間、以及具體個體和個體臨床史進行修改。適宜地，抗trka抗體/衍生物具有長的作用持續(xù)時間。特別地，如從動物研究確定的，抗體的臨床效果可以在施用后延長至多達21天。此外，施用后，抗trka抗體表現(xiàn)出臨床益處的時間可以，比在相關(guān)生物基質(zhì)例如血清或血漿中可以檢測到其存在的時間長。鑒于預期的長作用時間(即，效應(yīng)適宜地持續(xù)至少一周，或優(yōu)選至少兩周，例如至少三周或至少四周)，合適地可以以不超過每周一次的頻率，例如不超過每兩周一次或每三周一次或每四周一次，將抗體/衍生物施用于受試者?？箃rka抗體/衍生物的合適日劑量通常為0.1mg/kg至10mg/kg體重。用于治療急性和慢性炎性疼痛的抗-trka抗體合適劑量為至少0.01mg/kg(參見實施例2和3)。用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的抗-trka抗體合適劑量為至少0.01mg/kg(參見實施例4)。用于治療神經(jīng)病理性疼痛的抗-trka抗體合適劑量為至少0.01mg/kg，優(yōu)選0.1mg/kg，最優(yōu)選1mg/kg(參見實施例5)。這些劑量僅與小鼠的體內(nèi)狀況有關(guān)。本發(fā)明涉及人源化抗-trka抗體在治療急性炎性疼痛中的用途，其中痛覺過敏可以被有效地逆轉(zhuǎn)至與施用nsaid所觀察到的程度相同的程度。本發(fā)明還涉及人源化抗-trka抗體在治療慢性炎性疼痛中的用途，其中痛覺過敏可以被有效地逆轉(zhuǎn)到與施用nsaid所觀察到的程度相同的程度。本發(fā)明還涉及人源化抗trka抗體在治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛中的用途，其中痛覺過敏可以被有效地逆轉(zhuǎn)到與施用普瑞巴林和阿片劑所觀察到的程度相同的程度。本發(fā)明還涉及人源化抗-trka抗體在治療神經(jīng)病理性疼痛中的用途，其中痛覺過敏可以被有效地逆轉(zhuǎn)到與施用普瑞巴林所觀察到的程度相同的程度?，F(xiàn)具體就腫瘤的給藥而言，施用可以是直接和局部注射到腫瘤或腫瘤部位附近的組織中。對于全身給藥，劑量可以從每天0.05mg/kg到每天500mg/kg，但在該范圍的較低區(qū)域中的劑量是優(yōu)選的，因為它們更易于施用。可以校準劑量，例如以保證抗體/衍生物在血漿中的特定水平(約5-30mg/ml，優(yōu)選在10-15mg/ml之間)和保持該水平一段給定時間直到達到臨床結(jié)果。用于測量或評估胰腺或前列腺腫瘤階段的有效方法可以基于對血液中前列腺特異性抗原(psa)的測量，基于對生存時間的測量(對于胰腺腫瘤)，基于對減緩或抑制擴散的測量(對于兩種腫瘤類型情況下的轉(zhuǎn)移)。對于在腫瘤部位的直接注射，劑量取決于不同的因素，包括腫瘤的類型、階段和體積以及許多其他變量。根據(jù)腫瘤體積，典型的治療劑量可以從0.01mg/ml至10mg/ml注射劑量間變化，這些劑量可以以必要的頻率施用。無論治療的性質(zhì)如何，與非人源化抗體相比，人源化抗體的清除可以緩慢得多，并需要更低的劑量來維持血漿中的有效水平。此外，使用高親和力抗體時，與具有較低親和力的抗體相比，施用可以以較低的頻率和較少的量進行。每種抗體/衍生物的治療有效劑量可以由熟練醫(yī)師在治療期間確定。如果需要，可以減少劑量(例如以降低副作用)或增加劑量(以增加治療效果)。在施用前，本發(fā)明抗體的制劑可通過冷凍或凍干來儲存。然后，可以在臨使用前在合適的緩沖液中重構(gòu)。鑒于凍干和重構(gòu)可能導致活性喪失，可以通過對抗體的施用水平進行校準來作出補償。(對于常規(guī)免疫球蛋白，igm抗體傾向于比igg抗體具有更大的活性損失。)也可以指定保存期限，以避免使用經(jīng)過一定儲存時間后的抗體。本發(fā)明的抗體或其衍生物可以用于上述就醫(yī)藥用途所討論的任何疾病/病癥的診斷或預后。例如，可以用于促進trka陽性腫瘤標志物的檢測(作為阿爾茨海默病等爆發(fā)的早熟標志)。也可用于診斷cipa(“先天性痛覺不敏感合并無汗癥”)。cipa是一種遺傳性隱性常染色體綜合征，其特征為復發(fā)性間歇發(fā)熱，脫水，缺乏對傷害感受性刺激的反應(yīng)，智力低下和自殘傾向。該疾病由trka基因突變引起。實際上，本發(fā)明的抗體或衍生物可用于涉及trka異常表達(與健康個體或健康組織樣品中的trka表達相比)或trka相關(guān)異?；钚缘?、范圍寬泛的各種病癥的診斷或預后。因此，本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括方法，所述方法包括獲得來自患者的生物樣品并使樣品與本發(fā)明的抗體或衍生物接觸。如果需要，可以固定抗體/衍生物。該方法然后可以包括以定量或定性的方式測定抗體/衍生物與所述樣品的結(jié)合。如果需要，這可以參考和/或相對于陽性對照(指示健康狀態(tài))或陰性對照(指示病癥的存在/可能性)進行。為了診斷目的，抗體可以用可檢測的標記物標記，或者可以不標記。(本文中使用的術(shù)語“標記物”包括標記、或任何其它可檢測部分/可觸發(fā)可檢測變化的部分。)制品和藥盒在本公開的另一個實施方案中，包含本發(fā)明的抗體或其片段、組合物或免疫綴合物的制品，用于治療一種或多種上述疾病/病癥。所述制品可以包括容器和在容器上或與容器結(jié)合的標簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶，小瓶或注射器。容器可以由各種材料形成，例如玻璃或塑料。容器容納可以有效治療病癥的組合物，并且可以具有無菌進入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性劑可以是本文所述的抗體。標簽或包裝插頁可以指明組合物可用于治療所選的狀況。此外，制品可以包括(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本文的抗體，和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包含該抗體之外的治療劑。本公開的該實施方案中制品可以進一步包括指明第一和第二組合物可以組合使用的包裝插頁。這樣的治療劑可以是前面章節(jié)中描述的任何輔助治療(例如，溶血栓劑，抗血小板劑，化學治療劑，抗血管生成劑，抗激素化合物，心臟保護劑和/或哺乳動物免疫功能的調(diào)節(jié)劑，包括細胞因子)?；蛘呋蛄硗猓破房梢赃M一步包含第二(或第三)容器，其包含藥學上可接受的緩沖劑，例如抑菌注射用水(bwfi)，磷酸鹽緩沖鹽水，林格溶液和葡萄糖溶液。它還可以包括從商業(yè)和用戶的觀點期望的其它材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，過濾器，針頭和注射器。包含本發(fā)明的抗體、組合物或免疫綴合物和使用說明書的藥盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該藥盒可以進一步含有一種或多種另外的試劑，例如免疫抑制試劑、細胞毒性劑或放射毒性劑，或本發(fā)明的一種或多種另外的抗體(例如，與第一抗體結(jié)合trka抗原上不同表位、具有互補活性的抗體)。在不進一步描述的情況下，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已經(jīng)可以使用前述描述和以下舉例說明性示例，制備和利用本公開的試劑和實施所要求保護的方法。提供以下實施例以便于本公開的實施，但是這些實施例不應(yīng)解釋為以任何方式限制本公開的其余部分。實施例本文描述的人源化抗trka抗體代表一個新的抗trka抗體亞組，其在抑制trka的功能性激活方面高度有效。在wo00/73344中公開的稱為mnac13的抗-trka小鼠單克隆抗體、及在wo09/098238中公開的其人源化變體，不能達到相同的抑制水平，而在某些情況下這是期望的，例如對于治療疼痛和相關(guān)的癌癥疼痛，其中高水平的抑制可導致治療效果的提高。因此，需要開發(fā)可以高度抑制trka的人源化抗trka抗體。針對抗體介導的對trka功能性激活的抑制作用，其評估方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括tf-1細胞增殖測定試驗，其中使用因子依賴性人紅白血病細胞系tf-1，測定抗體阻斷細胞表面trka/β-ngf介導的細胞增殖的能力(kitamurat等人，(1989)j.cellularphysiology140(2)：323-34)。在wo09/098238中公開的人源化抗體已經(jīng)在tf-1增殖測定中表現(xiàn)出抑制活性，其中在mnac13小鼠抗體的人源化變體中bxhvh5vl1候選物具有最高抑制程度。此外，使用表面等離子體共振(spr)技術(shù)，已經(jīng)證明，wo09/098238中公開的人源化抗體與trka的細胞外區(qū)域直接結(jié)合。因此，為了設(shè)計小鼠mnac13抗體的新人源化變體，使所述變體與bxhvh5vl1人源化變體相比具有改善的人trka結(jié)合親和力以及更重要地在tf-1細胞增殖測定中具有提高的抑制效力，使用了wo09/098238中公開的人源化抗體的一個選定子集作為工程化的起點。“bxh”之后的字母是vh或vl或兩者。vh或vl分別表示具有特定重鏈可變結(jié)構(gòu)域(由具體數(shù)字指示)的ighg1同種型重鏈，例如bxhvh5，或具有特定輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(由具體數(shù)字指示)的κ同種型輕鏈，bxhvl1。當在“bxh”之后給出帶具體數(shù)字的vh以及帶具體數(shù)字的vl時，例如bxhvh5vl1，其表示由特定重鏈和輕鏈組合組成的特定抗體分子，例如，bxhvh5vl1抗體是指具有bxhvh5重鏈和bxhvl1輕鏈的抗體?；趙o09/098238中描述的vh和vl可變結(jié)構(gòu)域的選定子集新工程化構(gòu)建的人源化變體，稱為“gbr”抗體。相同的命名系統(tǒng)對于gbr抗體是有效的。在本文所用的可變重鏈結(jié)構(gòu)域中實施的具體取代在括號中進一步指出。除非另有說明，所有g(shù)br抗體均為ighg1重鏈同種型，具有κ同種型輕鏈。實施例1：抗體工程化從wo09/098238中公開的40種抗體中，選擇5種人源化抗體作為工程的輸入：具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh1(seqidno：1)和輕鏈可變區(qū)vl1(seqidno：6)的bxhvh1vl1，具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh3(seqidno：3)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域vl1的bxhvh3vl1，具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh3和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域vl3(seqidno：8)的bxhvh3vl3，具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh5(seqidno：5)和輕鏈可變區(qū)vl1的bxhvh5vl1，以及具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh5和輕鏈可變區(qū)vl1的bxhvh5vl3。本文所用的mnac13小鼠抗體具有seqidno：20的重鏈可變結(jié)構(gòu)域mnac13vh、seqidno：21的重鏈和seqidno：22的輕鏈。令人驚訝的是，所有工程化抗體均受益于重鏈可變結(jié)構(gòu)域中37位纈氨酸至丙氨酸的簡單改變(小鼠回復突變)(kabat編號(kabatea等人，同上引文))。如通過spr測量的，該取代具有在所有工程化抗體中廣泛增強對人trka的親和力的獨特性質(zhì)。更重要的是，對于大多數(shù)變體，該相同取代導致在tf-1細胞增殖測定中效力的增加，而且出乎意料地，當引入到與vl1結(jié)構(gòu)域配對的vh5結(jié)構(gòu)域中(gbrvh5(v37a)vl1抗體)時，與bxhvh5vl1人源化抗體相比，這是十倍的增加。值得注意的是，相同的gbrvh5(v37a)vl1抗體，與mnac13小鼠抗體相比，在tf-1細胞增殖測定中也顯示出了三倍的效力增加。由于人源化抗體中小鼠來源的殘基數(shù)量的增加可以引起其免疫原性風險增加(hardingfa等，(2010)mabs2(3)：256-65)，因此進一步研究以減少工程化抗體中的小鼠殘基數(shù)量。在gbrvh5(v37a)vl1抗體中3位小鼠殘基賴氨酸變化為谷氨酰胺，導致gbrvh5(k3q，v37a)vl1抗體，其與bxhvh5vl1人源化抗體相比具有相同數(shù)目的小鼠殘基，但結(jié)合親和力增加，并具有與親代小鼠mnac13抗體相當?shù)膄ab熱穩(wěn)定性，以及增加的抑制效力。最后，由于抗體介導的效應(yīng)子功能可能不利于其中僅需要trka阻斷的治療，所以希望開發(fā)出可抑制trka、但不介導免疫細胞殺傷trka表達細胞的抗trka抗體。人ighg4同種型不攜帶效應(yīng)子功能如adcc或cdc，因此當不需要效應(yīng)子功能或效應(yīng)子功能不利于治療時，它是特別合適的抗體形式。然而，天然存在的人ighg4同種型有一個缺點，被稱為“fab交換”現(xiàn)象，其中天然存在的人ighg4抗體已知在體內(nèi)可以交換重鏈(labrijnaf等，(2009)nat.biotechnol.27(8)：767-71)。阻斷重組和內(nèi)源人ighg4之間重鏈交換的方法是本領(lǐng)域已知的，并且已知交換可以通過如下方式有效地阻斷：將鉸鏈區(qū)中位置228處的絲氨酸殘基取代為脯氨酸殘基(eu編號，edelmangm等人，同上引文)，從而模擬人ighg1同種型中的構(gòu)象鉸鏈結(jié)構(gòu)(lewiskb等，(2009)mol.immunol.46(16)：3488-94)。gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1被格式化為ighg4s228p免疫球蛋白形式用于上述治療目的，并顯示出與其ighg1同種型對應(yīng)物相當?shù)男Я?，從而使得gbrvh5(v37a)vl1ighg4s228p和gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p抗體適用于其中僅需要阻斷trka的人類治療。方法設(shè)計工程化變體使用結(jié)構(gòu)同源物建模服務(wù)器swiss-model(arnoldk等人，(2006)bioinformatics22(2)：195-201；http：//swissmodel.expasy.org)，設(shè)置為自動化模式,計算了vh5-vl1可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ?d模型。檢索到的模型模板是實驗解析的mnac13fab3d結(jié)構(gòu)(pdb代碼1seq，www.pdb.org，bermanhm等人，(2000)nucleicacidsres.28(1)：235-42，covaceuszachs等，(2005)proteins58(3)：717-27)。mnac13vh，vh1，vh3，vh5和種系vh3-023*01(seqidno：23)結(jié)構(gòu)域的序列比對顯示，在位置3、5、19、37、40、42、44、49、50、52a、53、60、62、74、82a、83、84、89和94(kabat編號)不同的氨基酸內(nèi)容。模型分析使得可以基于位置對cdr區(qū)和/或重鏈-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組裝(packing)的推定影響來選擇位置的子集。該位置子集為：3，37，40，42，44，49，50，60，62，89和94(kabat編號)。由此，工程化抗體具有在上述可變結(jié)構(gòu)域序列(分別具有seqidno：1,3,5的vh1，vh3和vh5)中在單個或多個位置包含取代的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述位置選自上述位置子集。更具體地，工程化抗體由與兩個先前提及的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域vl1或vl3(seqidno6和8)之一配對的上述取代的重鏈可變結(jié)構(gòu)域組成。分子生物學使用wo09/098238中描述的bxhvh1，bxhvh3和bxhvh5的載體dna作為pcr模板，通過標準誘變技術(shù)，產(chǎn)生了工程化重鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼dna序列(cdna)。類似地，從wo09/098238中描述的bxhvl1和bxhvl3的載體dna，直接擴增了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdna。使用pcr裝配技術(shù)，將可變結(jié)構(gòu)域cdna進一步組裝在其相應(yīng)恒定結(jié)構(gòu)域cdna序列的上游。最后，將完整的重鏈和輕鏈cdna分別連接至基于修飾的pcdna3.1載體(invitrogen，ca，usa)的獨立載體中，所述載體攜帶cmv啟動子和牛生長激素多聚腺苷酸化信號。對于輕鏈特異性載體，通過使用bamhi和bsiwi限制酶位點將目的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdna連接在κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域cdna前，從而允許κ同種型輕鏈表達；而對重鏈特異性載體進行工程化，使用bamhi和sali限制酶位點將目的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdna連接到編碼ighg1ch1，ighg1鉸鏈區(qū)，ighg1ch2和ighg1ch3恒定結(jié)構(gòu)域的cdna序列前面。在重鏈和輕鏈表達載體兩者中，由含有bamhi位點的鼠vj2c前導肽驅(qū)動分泌。bsiwi限制酶位點位于κ恒定結(jié)構(gòu)域中；而sali限制酶位點位于ighg1ch1結(jié)構(gòu)域中。通過在上述重鏈特異載體中將編碼ighg1ch1，ighg1鉸鏈區(qū)，ighg1ch2和ighg1ch3恒定結(jié)構(gòu)域的cdna序列替換為編碼ighg4ch1、具有s228p取代的ighg4鉸鏈區(qū)、ighg4ch2和ighg4ch3恒定結(jié)構(gòu)域的cdna序列，獲得具有取代s228p的ighg4免疫球蛋白形式。取代s228p通過標準pcr誘變技術(shù)，引入人ighg4重鏈cdna模板中?？贵w生產(chǎn)對于抗體的瞬時表達，使用聚乙烯亞胺(polyplus轉(zhuǎn)染，illkirchcedex，france)，將等量的重鏈和輕鏈載體共轉(zhuǎn)染入懸浮適應(yīng)化的hek293-ebna1細胞(目錄號：crl-10852)中。典型地，用含有50μg編碼重鏈的表達載體和50μg編碼輕鏈的表達載體的dna-混合物，轉(zhuǎn)染密度為0.8-1.2百萬細胞/ml的100ml懸浮細胞。在將編碼抗體基因的重組表達載體導入宿主細胞后，通過進一步培養(yǎng)細胞4至5天，產(chǎn)生抗體，以允許抗體分泌到培養(yǎng)基(ex-cell293，hek293-無血清培養(yǎng)基；sigma，buchs，switzerland)中，所述培養(yǎng)基補充有0.1％pluronicacid，4mm谷氨酰胺和0.25μg/ml遺傳霉素)。使用重組蛋白astreamline介質(zhì)(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)從無細胞上清液中純化抗體，并在測定之前緩沖交換成磷酸鹽緩沖鹽水。使用差示掃描量熱法進行穩(wěn)定性測試在vp-dsc差示掃描微量熱計(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)上進行量熱測量。細胞體積為0.128ml，加熱速率為200℃/h，過壓保持在65p.s.i。所有抗體在pbs(ph7.4)中以1mg/ml的濃度使用。通過與省略了蛋白質(zhì)的含有相同緩沖液的重復樣品進行比較，估計了每種蛋白質(zhì)的摩爾熱容。使用標準程序分析偏摩爾熱容和熔融曲線。在origin軟件(v7.0，gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)中使用非二態(tài)(non-twostate)模型進一步分析之前，對溫譜圖進行基線校正和濃度歸一化。spr的親和力測量使用spr分析，測量不同抗體(小鼠和人源化抗體)的結(jié)合動力學的結(jié)合和解離速率常數(shù)。在室溫下，在biacore2000儀器(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)上測量小鼠抗體和人源化變體的結(jié)合動力學，并用biaevaluation軟件(v4.1，gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)進行分析。由于抗體是二價分子，因此最好將抗體固定在傳感器芯片上。如果使用抗體作為分析物，除了親和力之外，spr測量值還將帶有效價因素。雖然biacore評估軟件可以模建二價性并提取親和力常數(shù)，但優(yōu)選盡可能地使用單價分析物來規(guī)避任何價性偏差。為此目的，消化在hek293-ebna1細胞中制備的重組人trka-fc融合蛋白(seqidno：24)，產(chǎn)生單價形式的人trka胞外區(qū)。該融合蛋白由融合到ighg1fc區(qū)的人trka胞外區(qū)(seqidno：25)組成，其中在兩個區(qū)之間包含蛋白酶特異性切割序列(tev切割蛋白酶氨基酸序列：enlyfqs)。蛋白酶切割后，使用標準色譜技術(shù)，包括蛋白質(zhì)-a步驟以去除fc片段，將單價形式的人trka胞外區(qū)進一步純化至均質(zhì)。最后，將單價人trka胞外區(qū)蛋白質(zhì)的緩沖液交換為pbs，然后在biacore運行緩沖液中稀釋用于親和力測定。樣品純度、均質(zhì)性和分子量通過sds-page和大小排阻分析證實?？贵w通過捕獲其fc部分來固定，以允許在傳感器芯片表面上正確取向。使用單克隆小鼠抗人igg(fc)抗體傳感器芯片捕獲所有人源化抗體(無論其同種型)(人抗體捕獲試劑盒，目錄號br-1008-39，gehealthcareeuropegmbh)，并且使用多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白傳感器芯片捕獲mnac13小鼠抗體(小鼠抗體捕獲試劑盒，目錄號br-1008-38，gehealthcareeuropegmbh)。數(shù)據(jù)(傳感圖：fc2-fc1)擬合1:1langmuir模型(具有傳質(zhì)，盡管傳質(zhì)試驗中傳質(zhì)限制很小)?？紤]每次測量開始時在捕獲的抗體上的實驗變異，在所有擬合中，將rmax值設(shè)置為局部的。解離時間至少為350秒。進行一式三份重復測量，并包括零濃度樣品用于參考。使用chi2和殘差值來評估實驗數(shù)據(jù)和各結(jié)合模型之間擬合的質(zhì)量。tf-1細胞增殖測定將懸浮適應(yīng)化的tf-1細胞(號：crl-2003)培養(yǎng)在含有10％fcs和5ng/mlrhuβngf(重組人β-ngf，r&dsystemseuropeltd，abingdon，uk)的完全rpmi培養(yǎng)基中。對于測定，將tf-1細胞在沒有人β-ngf的完全rpmi中孵育5小時。在該饑餓步驟之后，將細胞離心并接種在具有各種濃度的各種抗體和固定濃度的重組β-ngf的平底96孔板中。將tf-1細胞以7000個細胞/孔的密度接種，并且總抗體-細胞混合物體積為200μl，具有5ng/ml人β-ngf(終濃度)。在37℃加上co2補充，孵育該混合物4天。在第3天，將比色染料alamarblue(abdserotec，morphosysabdgmbh，düsseldorf，germany)加入到每個孔中，孵育條件沒有任何變化。在第4天，在bio-teksynergytm2分光光度計/微板讀數(shù)儀(biotekinstrumentsgmbh，luzern，switzerland)上，使用530至560nm激發(fā)波長和590nm發(fā)射波長，讀取熒光。進行實驗至少兩次，并且針對每個抗體濃度進行一式三份重復測量。結(jié)果工程化構(gòu)建基于bxhvh5vl1的新人源化抗trka抗體基于vh5-vl1可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ?d模型，選擇了在不同重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh1，vh3和vh5)中共同的一組3d位置，用于小鼠到人以及人到小鼠突變；該組位置由以下位置組成：3，37，40，42，44，49，50，60，62，89和94(kabat編號)。關(guān)于本文使用的取代組合，其工程化策略所基于的是不同取代的互補性(就取代在cdr區(qū)和/或可變結(jié)構(gòu)域組裝(packing)和/或免疫原性上的推定影響而言)。在第一種方法中，在ighg1同種型形式中，在bxhvh5vl1候選物中工程化了小鼠到人和人到小鼠的突變。進行的小鼠到人突變包括以下取代：k3q，t40a，r44g，a49s，y50a，p60a，t62s和r94k。基于這些單取代或取代組合的一些工程化抗trka抗體的生產(chǎn)產(chǎn)量和親和力分別顯示在表1和2中。組合大多數(shù)或所有小鼠到人突變，導致了生產(chǎn)產(chǎn)量差，完全喪失與trka的結(jié)合。例如，小鼠到人取代a49s與y50a的組合誘導了結(jié)合的完全喪失，而且該結(jié)合喪失不能被其他小鼠到人取代拯救；而且小鼠到人取代k3q、t40a、r44g、和r94k，單獨或與其他小鼠到人取代組合，不導致親和力的任何改善。進行的人到小鼠突變包括以下取代：v37a，g42e和v89l。人到小鼠取代v37a具有最積極的影響，導致親和力增加至少兩倍(kd降低至少兩倍)(表2和圖1)；對于gbrvh5(v37a)vl1ighg1抗體，記錄到2.5倍的親和力增加。當將人到小鼠取代v37a與小鼠到人取代p60a和t62s組合時，親和力的這種增加被消除，但是當與小鼠到人取代k3q和/或r44g進行組合時親和力的這種增加得以維持?？傊?，這些結(jié)果確定了位置49和50的重要性(在允許結(jié)合方面)以及人到小鼠取代v37a的獨特性質(zhì)(將bxhvh5vl1的親和力提高至少兩倍)。由于抗體介導的效應(yīng)子功能可能不利于僅需要阻斷trka的治療，所以將gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1重新格式化為具有s228p取代的上述ighg4同種型。兩個工程化抗體都顯示出與其ighg1同種型對應(yīng)物相似的親和力，表明v37a取代引起的親和力改善不受同種型轉(zhuǎn)換的影響?；赽xhvh1vl1，bxhvh3vl1,bxhvh3vl1和bxhvh5vl3構(gòu)建新人源化抗trka抗體在第二種方法中，將v37a取代引入源自wo09/098238的其他選擇的候選物中，并且以bxhvh5vl1和mnac13抗體為基準，通過spr檢測了工程化抗trka抗體的親和力。表3和4分別顯示了v37a取代抗體的產(chǎn)量和親和力。雖然工程化抗體在其生產(chǎn)產(chǎn)量方面存在差異，但所有工程化抗體在引入v37a取代后都表現(xiàn)出了親和力的提高。對于bxhvh3vl1，bxhvh1vl1，bxhvh3vl3和bxhvh5vl3，親和力分別提高了8％，20％，30％和55％。因此，人到小鼠取代v37a不僅在bxhvh5vl1中引入時導致了親和力增加，而且最出乎意料地也在所有人源化變體中導致了親和力增加。值得注意的是，gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1，以ighg1或ighg4s228p同種型形式，具有與mnac13小鼠抗體的測定親和力相匹配的親和力(表2和表4)；與bxhvh5vl1抗體相比，兩者均增加至少兩倍(kd分別降低2.5至2.7倍)。表3和圖2包括在工程化抗體中測量的fab部分的熔解溫度。單克隆抗體熔解曲線是其同種型所特征性，但是fab片段的中點熔解溫度(tm)甚至在全長免疫球蛋白中也可以容易地鑒定(garbere和demarestsj(2007)biochem.biophys。res。commun。355(3)：751-7)。使用fab部分的中點熔解來監(jiān)測工程化候選物的穩(wěn)定性。gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1fab片段分別展示了在73.6和73℃的單個過渡，兩者具有相當?shù)臒岱€(wěn)定性，并且該fab過渡的形狀和幅度與通常針對緊湊折疊的fab片段所觀察到的協(xié)同解折疊一致，表明該工程化方法在保持fab穩(wěn)定性方面是成功的。當比較gbrvh5(v37a)vl1或gbrvh5(k3q，v37a)vl1的fabtm與mnac13fabtm(74℃)時，這進一步得到舉例證明，tm差異在1℃或以下。工程化抗trka抗體的功能測試測定工程化抗trka抗體在tf-1細胞增殖測定中抑制trka功能性激活的能力(圖3)。計算每個曲線的半最大抑制濃度(ic50)——化合物抑制生物學功能的有效性的量度，結(jié)果列于表5。注意，gbrvh1(v37a)vl1由于其通過srp測量具有較低的親和力而未測定。發(fā)現(xiàn)gbrvh5(v37a)vl1是最佳表現(xiàn)者，之后是具有相同ic50的gbrvh5(k3q，v37a)vl1，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p和gbrvh3(v37a)vl1。gbrvh3(v37a)vl3和gbrvh5(v37a)vl3抗體具有略高的ic50，但是所有測試的工程化抗體的表現(xiàn)均優(yōu)于bxhvh5vl1，其中g(shù)brvh5(v37a)vl1十倍優(yōu)于bxhvh5vl1。值得注意的是，與mnac13小鼠抗體相比，gbrvh5(v37a)vl1抗體在tf-1細胞增殖測定中也顯示出了三倍的效力增加。當與該小鼠親本抗體相比時，所有v37a變體具有相當或更好的ic50。表1：來自選擇的基于bxhvh5vl1的工程化抗-trka抗體的產(chǎn)量；除非另有說明，所有抗體均為ighg1同種型。(*)具有s228p取代的ighg4同種型。+包括如實施例1所述的小鼠到人和人到小鼠突變。表2：選擇的基于bxhvh5vl1的工程化抗trka抗體的親和力；除非另有說明，所有抗體均為ighg1同種型。(*)具有s228p取代的ighg4同種型。n.b.表示無結(jié)合。表3：來自選擇的工程化抗trka抗體的生產(chǎn)產(chǎn)量和fab熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)；所有抗體均為ighg1同種型。表4：v37a工程化抗trka抗體的親和力；所有抗體均為ighg1同種型?？?trka抗體kon(1/ms)koff(1/s)kd(nm)mnac136.02x1041.09x10-318bxhvh1vl13.13x1041.33x10-2426gbrvh1(v37a)vl11.96x1046.63x10-3338bxhvh3vl14.65x1046.19x10-3133gbrvh3(v37a)vl13.82x1044.71x10-3123bxhvh3vl33.14x1044.59x10-3134gbrvh3(v37a)vl33.1x1042.95x10-395bxhvh5vl11.04x1054.26x10-340.9gbrvh5(v37a)vl11.4x1052.25x10-316gbrvh5(k3q，v37a)vl11.7x1052.62x10-315.4gbrvh5vl36.23x1043.95x10-363gbrvh5(v37a)vl37.45x1042.05x10-328表5：v37a工程化抗trka抗體的tf-1細胞增殖測定ic50；除非另有說明，所有抗體均為ighg1同種型。(＊)具有s228p取代的ighg4同種型。n.d.表示未測定。抗-trka抗體ic50(μg/ml)mnac130.23bxhvh5vl10.73gbrvh1(v37a)vl1n.d.gbrvh3(v37a)vl10.15gbrvh3(v37a)vl30.29gbrvh5(v37a)vl10.075gbrvh5(k3q，v37a)vl10.15gbrvh5(k3q，v37a)vl1(*)0.15gbrvh5(v37a)vl30.22實施例2：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)通過足底內(nèi)注射cfa誘發(fā)的爪急性炎性痛覺過敏。將完全弗氏佐劑(cfa)足底內(nèi)注射入小鼠的一只后爪，引起急性炎性痛覺過敏，其可以使用承重方法進行評估。初次用于實驗的(naive)小鼠通常將體重均等地分配在兩只后爪之間。然而，當cfa注射的后爪發(fā)炎和疼痛時，重量被重新分配，以減輕放置在注射的爪(同側(cè))上的重量，并增加在非注射(對側(cè))后爪上的重量。方法使用雙足平衡測痛儀(incapacitancetester)(lintoninstruments，uk)測量通過每個后肢承受的重量。將小鼠放置在平衡測痛儀中，后爪分開放置在單獨的傳感器上，并且記錄兩秒鐘內(nèi)由兩個后肢施加的平均力。使初次用于實驗的(naive)amb1小鼠在其飼養(yǎng)籠中適應(yīng)操作室，隨意取食和飲水。通過將小鼠trka的外顯子1替換為其人對應(yīng)物的外顯子1而產(chǎn)生amb1小鼠，由此該小鼠僅表達人trka蛋白。經(jīng)幾天適應(yīng)平衡測痛儀。在誘導損傷之前取基線承重記錄。炎性痛覺過敏通過足底內(nèi)注射cfa(20ul的1.5mg/ml溶液)到左后爪來誘導。采取處理前承重讀數(shù)來評估cfa后23小時的痛覺過敏。然后在拉丁方設(shè)計中根據(jù)cfa窗口對動物進行排序和隨機化分組。cfa后24小時，通過單次腹膜內(nèi)注射0.1mg/kg同種型對照或0.0001,0.001,0.01和0.1mg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228pi.p.(10ml/kg劑量體積)，處理動物。非選擇性nsaid吲哚美辛以10mg/kgp.o用作陽性對照(5ml/kg劑量體積)。在抗體/藥物處理后第4、8、24、48、72、96和120小時讀取承重讀數(shù)。盲法進行行為評估。對于同側(cè)和對側(cè)后爪采集承重(g)讀數(shù)，并表示為％承重差異(％ipsi/contra)。通過在每個時間點比較處理組與同種型對照組，分析數(shù)據(jù)。以重復測量方差分析(repeatedmeasuresanova)進行統(tǒng)計學分析，然后使用invivostat進行planned比較檢驗(p<0.05被認為顯著)。結(jié)果cfa足底內(nèi)注射引起了顯著的痛覺過敏，如cfa后23小時檢測,承重從同側(cè)向?qū)?cè)后爪遷移，導致％ipsi/contra比值下降(圖4)。在cfa后24小時開始的同種型對照處理，顯示對痛覺過敏沒有影響。與同種型對照相比，使用0.01和0.1mg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在給藥后4-48小時，觀察到痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)。0.001mg/kg或以下劑量的抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p在逆轉(zhuǎn)痛覺過敏方面無效。吲哚美辛(10mg/kg)在測試的所有時間點顯示了對痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)。總之，抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，類似于吲哚美辛，導致了爪急性炎性痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)。此外，施用的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的有效劑量(0.01和0.1mg/kg)，比吲哚美辛的有效劑量(10mg/kg)，低許多倍，表明抗trka抗體可以以比該病癥的標準治療低得多的劑量施用。實施例3：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)由關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa引起的膝關(guān)節(jié)慢性炎性痛覺過敏關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa到小鼠后肢膝關(guān)節(jié)之一，誘導慢性炎性痛覺過敏，其可以使用承重方法進行評估。當cfa注射的關(guān)節(jié)發(fā)炎和疼痛時，重量被重新分配，以減輕放置在注射(同側(cè))關(guān)節(jié)肢體上的重量，以及增加未注射(對側(cè))關(guān)節(jié)肢體上的重量。在此動物模型中這些跡象的出現(xiàn)被認為是臨床相關(guān)的，因為它們反映了慢性炎性關(guān)節(jié)疼痛(所述疼痛與諸如骨關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎之類的潛在病癥相關(guān))患者所顯示的癥狀。方法使初次用于實驗的amb1小鼠在飼養(yǎng)籠中適應(yīng)操作室，隨意取食和飲水。通過將小鼠trka的外顯子1替換為人對應(yīng)物的外顯子1而產(chǎn)生amb1小鼠，由此這些小鼠僅表達人trka蛋白。習慣平衡測痛儀。臨在cfa注射前取基線承重讀數(shù)。使用在無菌條件下3:1混合的異氟烷和氧氣麻醉動物。剃刮膝蓋區(qū)域并用稀釋的hibiscrub溶液清潔。左膝注射10μl10mg/mlcfa。允許動物在溫暖的環(huán)境中恢復，然后返回飼養(yǎng)籠。在cfa后第4,7和10天使用承重方法評估動物的炎性痛覺過敏發(fā)展。根據(jù)cfa后第10天的測量，根據(jù)動物的cfa窗，對動物進行排序并隨機分配至處理組。在cfa后13天，當痛覺過敏已經(jīng)確立時，單次注射同種型對照抗體(10mg/kg，腹膜內(nèi))或抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p(0.01、1和10mg/kg，腹膜內(nèi))，處理動物。cox-2選擇性nsaid塞來昔布以60mg/kgp.o作為陽性對照，每天兩次。對于抗體處理組，在給藥后4,8,24和96小時測量承重。對于塞來昔布處理組，在cfa后第13天在給藥后1和8小時測量承重，然后在cfa后14-17天在給藥后1小時測量承重。盲法進行行為評估。對于同側(cè)和對側(cè)后肢，取承重(g)讀數(shù)，并表示為％承重差異(％ipsi/contra)。通過在每個時間點比較處理組與同種型對照組，分析數(shù)據(jù)。以重復測量方差分析進行統(tǒng)計分析，然后使用invivostat進行planned比較檢驗(p<0.05認為是顯著的)。結(jié)果如通過同側(cè)向?qū)?cè)后肢的承重轉(zhuǎn)移(導致％ipsi/contra比值下降)所檢測到的，從第3天開始，cfa注射膝關(guān)節(jié)引起了明顯且持久的痛覺過敏(圖5)。同種型對照抗體處理對痛覺過敏無影響。使用塞來昔布(60mg/kg)，在處理過程中，在給藥后1小時觀察到痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)。單次注射0.01,1和10mg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在給藥后4-72小時觀察到痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)，在96小時與同種型對照相比，只有最高的兩個劑量是顯著的?？傊瑔蝿?.01mg/kg或以上的抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，類似于多劑塞來昔布，導致了膝關(guān)節(jié)慢性炎性痛覺過敏的顯著且持久的逆轉(zhuǎn)。而且，與多劑60mg/kg的塞來昔布相比，只需要單劑0.01mg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p即可達到效果，這表明抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p可以以比nsaid塞來昔布(目前的標準護理)低得多的劑量和低的頻率施用。實施例4：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)由關(guān)節(jié)內(nèi)注射mia引起的膝關(guān)節(jié)慢性骨關(guān)節(jié)炎痛覺過敏關(guān)節(jié)內(nèi)注射碘乙酸鈉(mia)至小鼠膝關(guān)節(jié)，導致出現(xiàn)與局部關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)的慢性痛覺過敏伴軟骨退化。因此，在mia模型中測量的痛覺過敏非常類似于骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)疼痛。此外，軟骨退化導致具有神經(jīng)病理樣特征的慢性神經(jīng)元損傷。普瑞巴林(一種抗驚厥藥物)是推薦的治療神經(jīng)病理性疼痛的一線藥物，因此在此用作比較化合物。曲馬多(一種弱μ-阿片樣受體激動劑)越來越多地用于治療oa，這是因為與nsaid不同，曲馬多不引起胃腸道出血或腎臟問題，也不影響關(guān)節(jié)軟骨。為此，與普瑞巴林一起，使用曲馬多作為抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的比較物。方法使初次用于實驗的amb1小鼠在飼養(yǎng)籠中適應(yīng)操作室，隨意取食和飲水。通過將小鼠trka的外顯子1替換為人對應(yīng)物的外顯子1，產(chǎn)生amb1小鼠，由此這些小鼠僅表達人trka蛋白。經(jīng)幾天習慣平衡測痛儀。取基線承重讀數(shù)。使用在無菌條件下3:1混合的異氟烷和氧氣麻醉動物。剃刮膝蓋區(qū)域并用稀釋的hibiscrub溶液清潔。將5μl100mg/ml(500μg)mia或鹽水(假模)注射到左后腿的膝關(guān)節(jié)中。允許動物在溫暖的環(huán)境中恢復，然后返回飼養(yǎng)籠。在mia后第3-23天，使用承重，定期間隔評估動物膝關(guān)節(jié)痛覺過敏的發(fā)展。在mia后第14天，進行承重測量，動物按照其mia反應(yīng)窗口進行排序并隨機分配至處理組，然后單次腹膜內(nèi)注射1、10、100μg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p或100μg/kg同種型對照抗體(5ml/kg劑量體積)進行處理。作為比較物對照，動物在mia后第14天用10mg/kg曲馬多或30mg/kg普瑞巴林p.o.(5ml/kg劑量體積)進行處理，然后在mia后第16-22天每隔一天以30mg/kg曲馬多或100mg/kg普瑞巴林(5ml/kg劑量體積)處理。在mia后第14天在給藥后4、8和24小時使用承重評估所有動物，之后抗體處理組每24小時評估，曲馬多和普瑞巴林處理組在給藥后1和24小時評估。盲法進行行為評估。對于同側(cè)和對側(cè)后肢采集承重(g)讀數(shù)，并表示為％承重差異(％ipsi/contra)。通過在每個時間點(mia后第3-14天)比較處理組與假模組，分析數(shù)據(jù)，了解mia對痛覺過敏的影響。通過在每個時間點比較處理組與同種型對照組，分析給藥后數(shù)據(jù)。以重復測量方差分析進行統(tǒng)計分析，然后使用invivostat進行planned比較檢驗(p<0.05認為顯著)。結(jié)果如通過同側(cè)向?qū)?cè)后肢的承重轉(zhuǎn)移(導致％ipsi/contra比值下降)所檢測到的，將500μg的mia注射到膝關(guān)節(jié)中，從第3天開始，引起了明顯的痛覺過敏。在每個時間點與同種型對照相比，單次注射10和100μg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在給藥后4小時至7天，觀察到痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)(圖6a)。1μg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p對痛覺過敏無影響。曲馬多(10mg/kg)和普瑞巴林(30mg/kg)在mia后第14天在給藥后1小時沒有作用，但在給藥后4小時顯示出顯著逆轉(zhuǎn)痛覺過敏(圖6b)。由于在mia后第14天在給藥后1小時缺乏效果，故將曲馬多增加至30mg/kg，普瑞巴林增加至100mg/kg，兩者在mia后第16，18和20天在給藥后1小時均表現(xiàn)出顯著逆轉(zhuǎn)痛覺過敏?？傊?，單劑10μg/kg或以上劑量的抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，類似于多劑曲馬多和普瑞巴林，導致了膝關(guān)節(jié)慢性骨關(guān)節(jié)炎性痛覺過敏的顯著和持久逆轉(zhuǎn)。此外，與在遠高得多的劑量(分別30mg/kg和100mg/kg)使用的兩種藥物(曲馬多和普瑞巴林)的多劑給藥相比，只需單劑10μg/kg抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p即可達到效果。因此，抗trka抗體可以以比曲馬多和普瑞巴林低得多的劑量和低的給藥頻率施用。實施例5：人源化抗trka抗體逆轉(zhuǎn)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷引起的外周神經(jīng)病理性痛覺過敏和異常性疼痛外周神經(jīng)病理性疼痛是由周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，功能障礙或疾病引起的慢性疼痛形式。它通常包括痛覺過敏(對疼痛刺激的反應(yīng)增加)以及異常性疼痛(對非疼痛刺激的疼痛反應(yīng))。神經(jīng)病理性疼痛可以通過外周神經(jīng)的實驗性損傷在動物中誘發(fā)，這通?？梢酝ㄟ^松散結(jié)扎由坐骨神經(jīng)的慢性壓迫性損傷(cci)來實現(xiàn)(bennett&xie(1998)pain，33：87-107)。由于普瑞巴林是推薦的一線神經(jīng)病理性疼痛治療藥物，因此在此將其用作比較化合物。方法在氯胺酮-賽拉嗪(100和10mg/kg/10ml，i.p.)麻醉下，在雄性和雌性amb1小鼠中進行cci手術(shù)。通過將小鼠trka的外顯子1替換為人對應(yīng)物的外顯子1，產(chǎn)生amb1小鼠，由此這些小鼠僅表達人trka蛋白。在剃去毛發(fā)后，在股中段水平無菌暴露左坐骨神經(jīng)。在神經(jīng)分支前1-2毫米處圍繞坐骨神經(jīng)放置三根松散結(jié)扎線(使用4-0黑色絲線)。皮膚縫合后，用聚乙烯吡咯酮碘溶液處理手術(shù)部位。動物被允許在接下來的七天進行恢復。在實驗前一天，使動物適應(yīng)測量裝置(冷板)，并記錄給藥前的爪回縮閾值(0小時)。然后將動物重新分成六組。第二天，單次腹膜內(nèi)注射同種型對照抗體(1000μg/kg/10ml)或不同劑量的抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p(10、100和1000μg/kg/10ml)，處理動物。在7天的給藥后時期，每天一次施用普瑞巴林(30mg/kg/10ml，p.o.)或鹽水。在4h、24h，然后每隔一天記錄給藥后讀數(shù)，直至給藥后第7天。在所有日子在普瑞巴林或鹽水施用后1小時記錄給藥后讀數(shù)。首先記錄機械性痛覺過敏的給藥后讀數(shù)，5分鐘后記錄冷異常性疼痛的讀數(shù)。使用動態(tài)足底觸覺測量器(plantarvonfreyinstrument；ugobasilesrl，意大利),將機械性痛覺過敏測量為引發(fā)爪回縮所需的閾值力(g)。冷異常性疼痛測量為以秒計從冷板回縮爪所花的時間(iitclifescienceinc.，usa)。結(jié)果cci手術(shù)后7天，分別通過爪回縮閾值和爪回縮延遲時間的急劇下降，觀察到小鼠表現(xiàn)出了顯著的機械痛覺過敏(圖7a)和冷異常性疼痛(圖7b)?？贵wgbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的所有劑量都導致了機械痛覺過敏的逆轉(zhuǎn)(如通過爪回縮閾值的增加所見)(圖7a)、和冷異常性疼痛的逆轉(zhuǎn)(如通過爪回縮延遲期的增加所見)(圖7b)。逆轉(zhuǎn)的程度和持續(xù)時間明顯是劑量依賴性的，并且對于兩個讀數(shù)，與1mg/kg(1000μg/kg)最高劑量的普瑞巴林相當。與多劑30mg/kg普瑞巴林相比，1mg/kg劑量的抗體gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p當以單劑施用時是有效的，再次說明與普瑞巴林標準治療相比，抗trka抗體可以以較低的劑量和較低的給藥頻率施用。實施例6：抗trka抗體對新生兒發(fā)育過程中感覺和交感神經(jīng)元的影響ngf/trka信號傳導是發(fā)育過程中感覺和交感神經(jīng)元存活所關(guān)鍵必需的(bibel和barde，2000genesdev14(23)：2919-37)。相應(yīng)地，在胚胎期或新生兒期間通過主動或被動免疫阻斷ngf，可以導致這些神經(jīng)元的顯著損失以及神經(jīng)元細胞體和相關(guān)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)如交感神經(jīng)節(jié)的明顯萎縮(cattaneo，(2013)procnatlacadsciusa.2013年3月26日；110(13)：4877-85)。相反，用ngf處理新生兒動物導致交感神經(jīng)元的肥大和增生，導致交感神經(jīng)節(jié)增大(levi-montalciniandbooker,1960aprocnatlacadsciusa.mar；46(3):373-84.；levi-montalciniandcohen,1960annnyacadsci.1960mar29；85:324-41；banksetal.,1975jphysiol.may；247(2):289-98)。為了確定與抗ngf抗體相比，新生兒期間抗trka抗體處理對交感神經(jīng)元的存活和形態(tài)的影響，在對人trka敲入(amb1)小鼠4周處理后，進行了位于頸上神經(jīng)節(jié)(scg)中的交感神經(jīng)元的詳細定量和形態(tài)度量分析。人trka敲入小鼠被需要是因為gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p與嚙齒動物trka具有弱交叉反應(yīng)性。新生兒小鼠自出生后第1天起，用100mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p、一種基于tanezumab序列的抗ngf(該抗體與小鼠ngf具有完全交叉反應(yīng))(cattaneo，2010curropinmolther，12,94-106)或pbs，每周一次腹膜內(nèi)(i.p.)處理4周。在處理結(jié)束時，將小鼠用氯胺酮[(parke-davis)75mg/kg體重]和賽拉嗪[(streuli)10mg/kg體重]的混合物麻醉，然后灌注0.9％nacl、及之后在0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.3)中新鮮制備的4％多聚甲醛。解剖頸部右頸上神經(jīng)節(jié)(superiorcervicalganglion,scg)，在塑料包埋盒中用泡沫保護，并在4℃下相同的固定劑中后固定24小時。解剖scg的周圍動脈，以便允許在組織學過程中更好地識別。然后將其包埋在石蠟(tca44-720mediteautomate)中，并用徠卡切片機(3μm薄切片；leicarm2135)切片。制備連續(xù)切片帶，將每第10個(成年)或第20個(新生兒)切片封固在“superfrostplus”(menzel)玻片上，并用蘇木精和伊紅(h&e)染色。用hamamatsu(nanozoomer)載玻片掃描系統(tǒng)掃描切片，并用40x物鏡放大。圖片(.ndpi)在ndp-viewer2軟件中以10x或20x物鏡放大，然后以jpeg格式導出，用于體積確定。神經(jīng)節(jié)的體積根據(jù)cavalieri方法(生物結(jié)構(gòu)中的體積估計；coldspringharbprotoc2012nov1；2012(11)：1129-39；doi：10.1101/pdb.top071787)確定。使用具有適當插件(“網(wǎng)格”和“細胞計數(shù)器”)的imagej軟件進行體積測定。選擇網(wǎng)格尺寸以獲得每個神經(jīng)節(jié)約100點或更多。體積計算如下：神經(jīng)節(jié)體積＝神經(jīng)節(jié)組織上的點數(shù)x網(wǎng)格面積×厚度×切片之間的距離。根據(jù)成核劑原理(thenucleator，jmicrosc。1988jul；151(pt1)：3-21)，確定細胞的平均體積。物體的面積(a)和半徑(r)與其體積(v)相關(guān)，這也適用于諸如細胞的不規(guī)則物體。因此，通過測量大量細胞的面積，可以獲得神經(jīng)節(jié)中平均細胞體積的非常好的近似值。測量每個神經(jīng)節(jié)的100個或更多個隨機選擇的細胞的面積。對于每個區(qū)域(a)，計算半徑(r＝√(a/π))，然后計算體積(體積＝(4/3)π*r3)。所有體積的平均值被取為神經(jīng)節(jié)的平均細胞體積。根據(jù)以下公式計算一個神經(jīng)節(jié)中的細胞數(shù)：神經(jīng)節(jié)的總細胞體積/神經(jīng)節(jié)的平均細胞體積。細胞密度按照下列公式計算：神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)/神經(jīng)節(jié)體積。與pbs處理相比，用tanezumab處理新生小鼠導致scg神經(jīng)元細胞直徑顯著減少，整個scg的萎縮和每個神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞數(shù)量的顯著減少(圖8)。相比之下，與pbs處理相比，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p處理導致scg神經(jīng)元細胞直徑顯著增加，整個scg的肥大，以及每個神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞數(shù)量的顯著增加。實施例7：抗trka抗體對成年期的交感神經(jīng)元存活的影響新生兒期后，感覺神經(jīng)元存活與ngf無關(guān)。然而，對于交感神經(jīng)元，ngf在成年期繼續(xù)調(diào)節(jié)其形態(tài)。在成年嚙齒動物中，通過主動或被動免疫阻斷ngf可以導致交感神經(jīng)元細胞體萎縮，總體上促成交感神經(jīng)節(jié)的萎縮(levi-montalciniandbooker,1960bprocnatlacadsciusa.mar；46(3):384-91；angelettietal.,1971a.brainres.apr2；27(2):343-55；bjerreetal.,1975brainres.jul11；92(2):257-78；goedertetal,1978brainres.jun9；148(1):264-8；ottenetal.,1979brainres.oct26；176(1):79-90.；gorinandjohnson,1980brainres.1980sep29；198(1):27-42.；johnsonetal.,1982；ruitetal.,1990jneurosci.jul；10(7):2412-9.)另一方面，用ngf處理成年嚙齒類動物導致交感神經(jīng)元肥大，但與新生兒的處理不同，不導致增生(levi-montalciniandbooker,1960bprocnatlacadsciusa.mar；46(3):384-91；angelettietal.,1971bjultrastructres.1971bjul；36(1):24-36.；buekerandschenkein,1964annnyacadsci.oct9；118:183-205.)。為了確定成年期間gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p處理與抗ngf相比對交感神經(jīng)元存活和形態(tài)的影響，用100mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，tanezumab或pbs腹膜內(nèi)處理成年(2.5月齡)小鼠，每周一次，進行4周，并且如實施例6所述分析左和右scg。用tanezumab處理成年小鼠導致scg神經(jīng)元細胞直徑顯著減少、整體scg的萎縮，但與新生兒不同，不影響每個神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞數(shù)(圖9)。gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p處理導致scg神經(jīng)元細胞直徑顯著增加、整體scg的肥大、但是再次，每個神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞數(shù)不受影響。tanezumab的萎縮作用在新生兒和成年中達到相似的程度，而gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的肥大效應(yīng)在新生兒中比在成體中要明顯得多(比較圖8和9)。盡管gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p對scg神經(jīng)元細胞直徑的影響在成年小鼠中是顯著的，但gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p處理的小鼠的細胞直徑范圍與pbs處理的動物完全重疊，而tanezumab處理的動物中顯著比例的scg神經(jīng)元細胞直徑位于pbs處理的動物的范圍之外并且低于該范圍(圖10)。視覺上，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p處理的動物的scg神經(jīng)元細胞體看上去與pbs處理的動物相似，而tanezumab處理的動物的scg神經(jīng)元細胞體出現(xiàn)皺縮和凝縮的細胞質(zhì)(圖11)。用tanezumab獲得的結(jié)果與以前的研究一致，證明ngf阻斷可以導致新生兒中交感神經(jīng)元細胞的損失以及在新生兒和成年中交感神經(jīng)元細胞體和神經(jīng)節(jié)的萎縮。gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p對scg的肥大效應(yīng)以及在新生兒中對scg的增生效應(yīng)，與針對ngf處理所報道的類似。因此，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p和tanezumab明顯地在新生兒和成年動物兩者中對交感神經(jīng)元產(chǎn)生相反的作用，但gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的作用在成年動物中減小。實施例8：抗-trka抗體對外周神經(jīng)病理性疼痛的作用外周神經(jīng)病理性疼痛是由周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷/功能障礙/疾病引起的慢性疼痛形式(bridges等人，(2001)brjanaesth.ul；87(1)：12-26)。它通常包括痛覺過敏(對疼痛刺激的反應(yīng)增加)以及異常性疼痛(對非疼痛刺激的疼痛反應(yīng))。神經(jīng)病理性疼痛可以通過實驗性損傷外周神經(jīng)在動物中誘發(fā)，這通?？梢酝ㄟ^松散結(jié)扎由坐骨神經(jīng)的慢性壓迫性損傷(cci)來實現(xiàn)。在雄性和雌性amb1小鼠中，將機械性痛覺過敏測量為引起爪回縮所需的閾值力(g)，將冷異常性疼痛測量為從冷板縮回爪的時間(秒)。然后在氯胺酮-賽拉嗪(100和10mg/kg/10ml，i.p.)麻醉下進行cci手術(shù)。在剃去毛發(fā)后，在股中段水平無菌暴露左坐骨神經(jīng)。在神經(jīng)分支前1-2毫米處圍繞坐骨神經(jīng)放置三根松散結(jié)扎線(使用4-0黑絲)。皮膚縫合后，用聚乙烯吡咯酮碘溶液處理手術(shù)部位。動物被允許在接下來的七天恢復。使動物適應(yīng)測量裝置(冷板)，并記錄給藥前的爪回縮閾值(0小時)。然后，單次腹膜內(nèi)注射0.3和1mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p、tanezumab或鹽水，處理動物。在第4h、第1天、然后每隔一天直到給藥后第9天，記錄給藥后的讀數(shù)，并在給藥后14d獲取最后讀數(shù)。首先記錄機械性痛覺過敏的給藥后讀數(shù)，5分鐘后記錄冷異常性疼痛的讀數(shù)。cci手術(shù)(0h)后7天，小鼠顯示出明顯的機械性異常性疼痛(圖12a)和冷異常性疼痛(圖12b)，分別表現(xiàn)為其爪回縮閾值和爪回縮延遲時間的急劇下降。兩種劑量的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p都導致了機械性痛覺過敏的持久逆轉(zhuǎn)(如通過爪回縮閾值的增加所見)和冷異常性疼痛的持久逆轉(zhuǎn)(如通過爪回縮延遲期的增加所見)。在相當?shù)膭┝肯?，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p明顯地，比基于tanezumab的抗ngf抗體，造成了機械痛覺過敏和冷異常性疼痛的更高逆轉(zhuǎn)。實施例9：抗trka抗體對異常感覺和交感神經(jīng)萌芽的影響在小鼠中數(shù)周多次關(guān)節(jié)內(nèi)注射完全弗氏佐劑(cfa)引起持久膝關(guān)節(jié)炎癥，導致關(guān)節(jié)內(nèi)的異位感覺和交感神經(jīng)元萌芽以及傷害感受行為(ghilardietal.,2012arthritisrheum.jul；64(7):2223-32)。類似的異位萌芽在骨癌疼痛的小鼠模型中也被觀察到，并且已經(jīng)被提出參與疼痛的維持(jimenez-andradeetal.,2011pain.nov；152(11):2564-74)。在兩個模型中，抗ngf治療減少異位神經(jīng)元萌芽和傷害感受行為，表明ngf在該過程中的作用(jimenez-andradeetal.,2011pain.nov；152(11):2564-74；ghilardietal.,2012arthritisrheum.jul；64(7):2223-32)。為了在多重cfa膝關(guān)節(jié)疼痛模型中與基于tanezumab的抗ngf抗體比較來評估gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的作用，用3％異氟烷混合95％氧氣輕度麻醉成年雌性amb1小鼠。向左膝關(guān)節(jié)注射10μlcfa(h37ra；difcolaboratories，usa，2.5mg/ml，在礦物油中，sigma)。注射cfa后，將動物返回飼養(yǎng)籠。進行定期觀察以監(jiān)測注射后動物的狀況。在第7、14和21天重復cfa注射。一組動物(n＝6)用10μl磷酸鹽緩沖溶液(pbs)進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射，以用作為假模對照。通過訓練小鼠直立在incapacitancemeter(承重儀器，linton)的墊片上2-3分鐘，使小鼠適應(yīng)實驗環(huán)境三天。記錄左側(cè)(同側(cè))和右側(cè)(對側(cè))后爪在5秒內(nèi)施加的重量負荷的平均值。進行三次測量，并計算每個時間點的平均值。在第一次注射cfa前當天(第0天)檢查放置在墊片上的體重的基線值，并在第3、10、17和24天每次后續(xù)注射后3天再次評估，并在第24天在化合物給藥后4、8、24、48、72、96和120小時再次評估。將行為實驗得到的數(shù)據(jù)計算為承重比的平均值±s.e.m(wbr＝同側(cè)承重/對側(cè)承重×100)。隨機選擇一組6只小鼠作為假模對照，每7天接受1次pbs注射至左膝關(guān)節(jié)，為期21天，共4次注射(假模cfa組)，并在第一次膝關(guān)節(jié)注射后的第24天接受i.p.賦形劑。其他小鼠在第0、7、14和21天接受共4次cfa注射。在第24天，承重比小于70％的小鼠隨機分到賦形劑對照組，1mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p組和1mg/kgtanezumab組。所有賦形劑/化合物均腹膜內(nèi)給藥，單劑5ml/kg。如通過承重自同側(cè)向?qū)?cè)后爪的遷移所檢測到的，多次關(guān)節(jié)內(nèi)注射cfa引起持久的痛覺過敏，導致％ipsi/contra比值下降到約50％(圖13)。在第24天當痛覺過敏已經(jīng)良好建立時，單次i.p.注射后，與賦形劑對照相比，1mg/kg的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p造成了顯著的痛覺過敏逆轉(zhuǎn)，而基于tanezumab的抗ngf抗體以相同的劑量沒有顯著效果。實施例10：抗trka抗體對骨愈合的影響介紹充分的骨折相關(guān)疼痛治療對患者的健康是很重要的。然而，目前可用的鎮(zhèn)痛藥可能會產(chǎn)生相當大的副作用。用于治療中度至重度疼痛的阿片樣物質(zhì)通常會導致惡心、鎮(zhèn)靜作用和嗜睡以及呼吸抑制。此外，可能發(fā)生阿片樣物質(zhì)成癮，并且不清楚該類物質(zhì)是否會影響骨折愈合。相對地，經(jīng)常處方用于治療輕度至中度肌肉骨骼疼痛的非類固醇抗炎藥(nsaid)已被證明具有相當大的胃腸道副作用(dibetal.(2014),scandjgastroenterol,49,785-9)。nsaid的抗炎作用基于對環(huán)加氧酶(cox)-2的選擇性或非選擇性抑制，從而阻斷從花生四烯酸合成前列腺素(pg)。然而，pge-2對骨骼具有多效性，而且cox-2功能對于骨愈合是必需的(blackwell等(2010)trendsendocrinolmetab，21,294-301；simon等，(2002)jboneminerres，17，963-76)。在嚙齒動物中，有很強的證據(jù)表明，在愈合期間應(yīng)用nsaid會干擾骨折愈合(spiroetal.,(2010)jorthopres,28,785-791；krischaketal.,(2007a)archorthoptraumasurg,127,453-8:krischaketal.,(2007b)archorthoptraumasurg,127,3-9)。此外，nsaid在人體中也被認為對骨愈合具有負面影響。治療骨折相關(guān)疼痛的另一種方法可以是阻斷神經(jīng)生長因子(ngf)/神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體1型(trka)信號傳導。使用抗ngf單克隆抗體阻斷該信號傳導途徑被證明對于治療慢性腰痛和關(guān)節(jié)病有效(katz等，(2011)pain，152,2248-2258；mckelvey等，(2013)jneurochem，124,276-89)。ngf與trka的結(jié)合導致受體二聚化和通過受體自身磷酸化的受體激活?？梢酝ㄟ^應(yīng)用選擇性結(jié)合并中和ngf的特異性抗體或通過應(yīng)用trk受體激酶活性的小分子量抑制劑來破壞配體-受體相互作用(kumarandmahal,(2012)jpainres,5,279-87:watsonetal.,(2008).biodrugs,22,349-359)。ngf/trka信號傳導對骨折修復的影響尚未得到充分闡釋。最近，兩項研究報道了，通過應(yīng)用中和性抗ngf單克隆抗體或小分子量trk激酶抑制劑阻斷ngf/trka信號傳導后，疼痛相關(guān)行為的顯著減少(koewleretal.,(2007)jboneminerres,22,1732-42.:,ghilardietal.,(2011)bone,48,389-98)。然而，兩項研究均報告了骨痂大小的增加，并且在一份報告中還指出愈合后的骨的生物力學性質(zhì)的輕微降低(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42)，可能說明對骨折愈合過程的干擾。由于兩項研究觀察到的影響相對微小，因此需要進一步澄清。因此，我們通過在機械定義的骨干骨折-愈合小鼠模型中分別應(yīng)用靶向ngf和trka的中和性單克隆抗體，來解決這個問題。方法抗體中和性抗ngf單克隆抗體是基于tanezumab的人igg2，并且與小鼠ngf完全交叉反應(yīng)(cattaneo,(2010)curropinmolther,12,94-106)。中和性抗trka抗體為gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p。動物模型與飼養(yǎng)動物實驗根據(jù)國家和國際實驗動物護理和使用指南進行，并得到當?shù)貍惱砦瘑T會(tübingen，第1144號)的批準。雄性amb1小鼠在小鼠trka基因座處敲入人trka，并從charlesriver(charlesriveritalia，calco，italy)獲得。將小鼠以每組最多四只動物分組籠養(yǎng)，在23℃和55±10％濕度下，14小時光照和10小時暗周期。標準的嚙齒動物食物和水可以隨意取得。在無菌條件下進行外科手術(shù)。研究設(shè)計為了研究ngf-trka信號阻斷對骨折愈合的影響，如前詳述(等，(2010)jorthopres，28,1456-62)，對13周齡小鼠的右股骨進行標準化的截骨術(shù)。簡言之，在全身麻醉(2vol％異氟烷，abbott，wiesbaden，germany)下，使用gigli線鋸(risystem，達沃斯，瑞士)在右股骨的中骨體中產(chǎn)生截骨缺口。使用外部固定器(剛度3n×mm-1；risystem，達沃斯，瑞士)穩(wěn)定截骨。在手術(shù)前，小鼠接受單劑抗生素(克林霉素-2-二氫磷酸鹽，45mg×kg-1；克林霉素，ratiopharm,ulm,germany)。對于鎮(zhèn)痛，手術(shù)前后1天通過飲用水提供鹽酸曲馬多(25mg×l-1,grünenthal,aachen,germany)。在手術(shù)前，將小鼠隨機分配至三個組，以施用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，paalaboratories，linz，austria)(對照組，n＝24)、抗ngf抗體(n＝25)或抗-trka抗體(n＝24)(兩種抗體均由glenmarkpharmaceuticalsltd，switzerland提供)。以10mg×kg-1體重的濃度腹膜內(nèi)給予抗體。這些物質(zhì)在手術(shù)后第1、6和11天施用。手術(shù)后7、14或25天對小鼠進行安樂死，取出手術(shù)的和對側(cè)的股骨?；顒雍偷孛娣醋饔昧Φ臏y量為了確定施用的抗體的鎮(zhèn)痛作用，評估了手術(shù)后小鼠的活動和手術(shù)肢體的垂直地面反作用力(grf)，這是因為疼痛會導致活動減少以及推測的截骨肢體的負荷減少。在手術(shù)后第2、5、7、14和20天進行分析。為了評估垂直grf，允許小鼠自由移動通過在地板(he6x6，amti，watertown，ma，usa)中含有力板的丙烯酸玻璃通道。由盲法觀察者記錄手術(shù)肢體在直立期的峰值垂直grf，按每個時間點每只小鼠最少四次測量來平均。使用裝配到專用籠的紅外線束系統(tǒng)(actimot，tsesystemsgmbh，badhomburg，germany)，過夜記錄小鼠的活動。術(shù)后測量值與術(shù)前測量值相關(guān)。生物力學測試為了研究機械性能，在第25天取出的完好股骨和截骨的股骨上進行了如前所述的無損三點彎曲試驗(等，(2010)jorthopres，28,1456-62；wehrle等人，(2014)jorthopres，32,1006-13)。簡而言之，股骨的近端固定在鋁圓柱體上，鋁柱體又固定在三點彎曲裝置(z10，zwickroell，ulm，germany)的鉸鏈接頭上。股骨髁不加固定地放置在彎曲支架上。在矢狀面上向股骨中骨體施加軸向負荷。根據(jù)力偏轉(zhuǎn)曲線(force-deflectioncurve)的線性區(qū)域的斜率(k)，計算彎曲剛度。當骨折骨痂不正好位于支架之間的中點時，考慮負荷矢量(loadvector)與近端(a)和遠端(b)支架之間的距離(l/2)。彎曲剛度(ei)根據(jù)不對稱彎曲公式計算：ei＝k((a2b2)×3l-1)。微計算機斷層掃描(μct)使用μct裝置(skyscan1172，skyscan，kontich，belgium)掃描第14天和第25天收獲的股骨，以50kv電壓和200μa，以每像素8μm的分辨率進行掃描。在每次掃描中，掃描具有規(guī)定的羥基磷灰石(ha)密度(250和750mg×cm-3)的兩個模體(phantom)，以確定骨礦物質(zhì)密度(bmd)。在第14天，對整個骨痂進行了總體積(tv)，骨體積(bv)，骨體積分數(shù)(bv/tv)和bmd的分析。在第25天，對兩個感興趣的區(qū)域，整個骨痂和之前的截骨缺口，進行了上述參數(shù)的分析。為了區(qū)分礦化組織和非礦化組織，應(yīng)用了對應(yīng)于641.9mgha×cm-3的全局閾值(morgan等，(2009)bone，44,335-44)。組織形態(tài)測定在4％福爾馬林中固定股骨24小時，在20％乙二胺四乙酸(ph7.2-7.4)中脫鈣10-12天，并將其包埋在石蠟(paraplast，leicabiosystems，wetzlar，germany)中。切割厚度為6μm的縱切片，并使用番紅-o和快綠進行染色。使用光學顯微鏡(leicadmi6000b；softwaremetamorph，leicamicrosystems，mannheim，germany)以50倍放大率進行組織組成的評估。在所有時間點，分析由骨膜骨痂和截骨缺口組成的整個骨痂的纖維組織、軟骨和骨的相對量。統(tǒng)計分析結(jié)果表示為平均值±標準誤差(sem)。使用shapiro-wilk檢驗，檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。對于數(shù)據(jù)分析，使用spss統(tǒng)計軟件(版本21，ibmcorp，chicago，il，usa)。使用方差分析，進行組的比較。使用fisher的lsd檢驗，進行事后分析。p≤0.05，視為顯著。結(jié)果活動和grf評估在手術(shù)前天和手術(shù)后2、5、7、14和20天評估小鼠的活動和垂直grf。正如預期的那樣，所有組在手術(shù)后活動都有所下降。在第2天，與pbs處理的動物相比，抗-trka抗體處理的小鼠顯示出顯著更高的活動度(圖14a)，表明抗體處理的小鼠遭受較少的疼痛。pbs與抗ngf抗體或抗ngf抗體和抗-trka抗體處理之間無顯著性差異。在稍后的時間點，沒有檢測到顯著的組間差異(圖14a)。在第2天，在所有處理組中，垂直grf的分析顯示降低到術(shù)前值的83-90％(圖14b)。垂直grf到第5天進一步下降，然后緩慢升高直至第20天，在此時grf達到手術(shù)前值的90-100％。在任何給定時間點，組之間沒有顯著差異(圖14b)。ngf-trka信號傳導阻斷對骨折愈合的影響骨痂組成的組織形態(tài)度量評估在第7、14和25天進行。代表性的切片如圖15a-i所示。在任何時間點，我們均沒有檢測到處理組之間骨痂組成的任何統(tǒng)計學顯著性差異(圖15j-l)。使用μct對第14天的骨痂進行三維評估，顯示骨痂大小、bv、bv/tv或bmd無顯著性差異(表6)。在分析截骨或整個骨痂時，在第25天發(fā)現(xiàn)同樣的情況(表7)。與pbs施用相比，抗ngf抗體或抗-trka抗體不顯著影響骨痂的彎曲剛度(使用無損三點彎曲試驗確定)(圖16)。表6：截骨術(shù)后第14天骨折骨痂的μct分析。tv,總骨痂體積；bv,骨體積；bv/tv,骨體積/骨痂體積；bmd,骨礦物質(zhì)密度。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem；n＝7-8.表7：在25天的愈合期后用pbs、抗ngf抗體或抗-trka抗體處理的小鼠的截骨和全骨折骨痂的μct分析。tv，總骨癡體積；bv，骨體積；bv/tv，骨體積/骨癡體積；bmd，骨礦物質(zhì)密度。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem；n＝78總之，數(shù)據(jù)表明阻斷ngf/trka信號并沒有負面影響骨折愈合。討論與結(jié)論減少骨折相關(guān)疼痛是患者治療中的一個重要問題。然而，使用nsaid的常見處理似乎不利于骨折愈合。在這里，調(diào)查了是否阻斷ngf/trka信號傳導用于鎮(zhèn)痛會影響骨折愈合。我們的結(jié)果表明，使用選擇性抗體，骨再生不受ngf/trka信號傳導阻斷的影響，骨痂形成和成熟在用中和性抗ngf或抗-trka抗體處理的動物中正常發(fā)生。在第7、14和25天通過組織學或在第14和25天通過μct分析評估，觀察到在用pbs、抗ngf或抗-trka抗體處理的動物中骨痂組成沒有顯著差異。此外，彎曲剛度不受影響，表明通過ngf/trka阻斷的鎮(zhèn)痛作用就骨愈合而言可能是安全的。有證據(jù)表明，ngf/trka信號傳導可以調(diào)節(jié)骨形成和愈合，因為ngf及其受體trka都被骨細胞表達(asaumi等，(2000)bone，26,625-33)。體外數(shù)據(jù)提示ngf/trka在前成骨細胞mc3t3-e1中的抗凋亡作用(mogi等，(2000)lifesci，67,1197-206)和ngf-處理后這些細胞中堿性磷酸酶的誘導，由此促進成骨細胞分化(yada等人，(1994)biochembiophysrescommun，205,1187-93)。小鼠中的研究表明，骨折愈合期間trka在增生的、成熟的和肥大的軟骨細胞以及成骨細胞中表達(asaumi等，(2000)bone，26,625-33)。此外，證實了在骨化前沿(ossificationfront)附近ngf在增生的、成熟的和肥大的軟骨細胞和成骨細胞中表達。雖然這些發(fā)現(xiàn)意味著在骨折愈合期間ngf/trka信號傳導的功能，但確切的作用尚未闡明。已經(jīng)證明，局部ngf應(yīng)用改善了大鼠肋骨骨折模型中的骨折愈合(grills等，(1997)jorthopres，15,25-42)。雖然潛在的機制尚未得到廣泛的研究，但作者推測交感神經(jīng)支配的增加刺激了骨祖先細胞向軟骨細胞的分化(grillsetal，(1997)jorthopres，15,25-42)。在骨折愈合期間通過應(yīng)用中和性抗ngf單克隆抗體或小分子量trk激酶抑制劑進行ngf信號傳導阻斷后，報道了顯著更大骨痂的形成(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42：ghilardi等，(2011)bone，48,389-98)。這些發(fā)現(xiàn)意味著愈合過程的輕微延遲。然而，我們的發(fā)現(xiàn)與其他研究結(jié)果(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42：ghilardietal。(2011)bone，48,389-98)一起提示，該信號傳導途徑在骨折愈合期間在骨細胞及其前體中具有次要作用(如果有作用的話)。為了評估抗體處理的鎮(zhèn)痛作用，我們縱向確定了小鼠的活動和手術(shù)肢體的grf。在手術(shù)后第2天，與pbs處理的動物相比，抗trka抗體處理的小鼠被發(fā)現(xiàn)具有顯著更高的活動度。在用抗ngf抗體處理的小鼠中也存在更大活動度的趨勢，但是沒有達到統(tǒng)計學顯著性。相比之下，當比較兩種抗體時，我們沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學上的顯著性差異，因此說明至少相當?shù)逆?zhèn)痛效果。這些活動結(jié)果得到koewler等人jboneminerres，22,1732-42的觀察結(jié)果的確認，他們報告了施用中和抗ngf抗體后疼痛相關(guān)行為的顯著減少(koewler等，2007jboneminerres，22,1732-42)。一般地，發(fā)現(xiàn)在愈合期間用抗-trka抗體處理的小鼠，與pbs處理相比，具有更大活動度的趨勢。這可能表明，接受pbs的小鼠受到手術(shù)和手術(shù)后疼痛的影響比接受了鎮(zhèn)痛抗體之一的動物大，表明在整個愈合過程中充分的早期疼痛控制對小鼠的健康具有積極作用。由垂直grf表示的手術(shù)肢體負載在任何時間點均沒有顯示出顯著的組間差異。這也與其他人的報告一致(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42)。我們提出，grf的輕微減少可能與骨折相關(guān)的疼痛無關(guān)。我們推測，在手術(shù)期間肌肉的解剖改變了功能，從而導致該減少的負載?？傊?，結(jié)果表明，使用特異性抗體阻斷ngf/trka信號傳導對嚙齒動物的骨折愈合沒有負面影響，因為抗體處理不改變生物力學性質(zhì)和骨痂組成。實施例11-低濃度水性制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)并測試了調(diào)節(jié)至ph6.0的抗trka抗體的第一低濃度液體制劑，其包含：10mg/ml抗trka抗體，其包含含有seqidno：5的輕鏈可變序列和含有seqidno：7的重鏈可變區(qū)；25mm檸檬酸鹽；150mmnacl；0.05％吐溫80。本發(fā)明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的時間點(以月計)，在5℃，25℃和40℃下使用多個標準，表征了該抗trka抗體的穩(wěn)定性。具體地，在相關(guān)時間點通過如下方式表征了制劑中存在的抗體：確定制劑或其部分的澄清度，著色程度，乳濁度和顆粒污染(可見顆粒)；通過波長280nm的光吸收測量，確定制劑中存在的蛋白質(zhì)的濃度；通過sds-page凝膠可視化，確定抗體的重量變化和/或降解；通過elisa，確定抗體的結(jié)合特性的任何變化；通過hplc-cex，確定制劑中正/負抗體物質(zhì)組成的變化；通過hplc-ief，借組毛細管電泳確定制劑中存在的抗體的等電聚焦譜的變化；通過hplc-sec分析，確定制劑中抗體的變化。使用標準技術(shù)對制劑的性質(zhì)和其中的抗體進行評估。在每種情況下，至少在一個或多個時間點和t0值和/或針對用作標準材料(為了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制目的)的抗體先前建立的標準之間進行比較。圖17中針對5℃，圖18針對25℃，圖19針對40℃，提供了穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。實施例12-高濃度水性制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)并測試了調(diào)節(jié)至ph5.75或6.0的抗trka抗體的液體制劑，其包含：100mg/ml抗trka抗體，其包含含有seqidno：5的輕鏈可變序列和含有seqidno：7的重鏈可變區(qū)；50mm組氨酸；150mmnacl；0.05％吐溫80。本發(fā)明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的時間點(以月計)，在5℃，25℃和40℃下使用多個標準，表征了該抗trka抗體的穩(wěn)定性。具體地，在一個或多個時間點通過如下方式表征了制劑中存在的抗體：確定制劑的澄清度，著色程度，乳濁度和顆粒污染(可見顆粒)的變化；通過波長280nm的光吸收測量，確定制劑中存在的蛋白質(zhì)的濃度；通過sds-page凝膠可視化，確定抗體的重量變化和/或降解；通過elisa，確定抗體的結(jié)合特性的任何變化；通過hplc-cex，確定制劑中正/負抗體物質(zhì)組成的變化；通過hplc-ief，借組毛細管電泳，確定制劑中存在的抗體的等電聚焦譜的變化；通過hplc-sec分析，確定制劑中抗體的變化。在每種情況下，在每個時間點和t0值以及針對用作標準材料(為了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制目的)的抗體先前建立的標準之間進行比較。提供調(diào)整至ph5.75的制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，圖20中為5℃，圖21中為25℃和圖22中為40℃。提供調(diào)節(jié)至ph6的制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，圖23中為5℃，圖24為25℃，圖25中為40℃。實施例13-高濃度水性制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)并測試了抗trka抗體的第一低濃度液體制劑，其包含：150mg/ml抗trka抗體，其包含含有seqidno：5的輕鏈可變序列和含有seqidno：7的重鏈可變區(qū)；50mm組氨酸；150mmnacl；0.05％吐溫80。本發(fā)明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的時間點(以月計)，在5℃，25℃和40℃下使用多個標準，表征了該抗trka抗體的穩(wěn)定性。具體地，在一個或多個時間點通過如下方式表征了制劑中存在的抗體：確定制劑的澄清度，著色程度，乳濁度和顆粒污染(可見顆粒)的變化；通過波長280nm的光吸收測量，確定制劑中存在的蛋白質(zhì)的濃度；通過sds-page凝膠可視化，確定抗體的重量變化和/或降解；通過elisa，確定抗體的結(jié)合特性的任何變化；通過hplc-cex，確定制劑中正/負抗體物質(zhì)組成的變化；通過hplc-ief，借組毛細管電泳，確定制劑中存在的抗體的等電聚焦譜的變化；通過hplc-sec分析，確定制劑中抗體的變化。在每種情況下，在每個時間點和t0值以及針對用作標準材料(為了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制目的)的抗體先前建立的標準之間進行比較。提供調(diào)整至ph5.75的制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，圖26中為5℃，圖27中為25℃和圖28中為40℃。提供調(diào)節(jié)至ph6的制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，圖29中為5℃，圖30中為25℃，圖31中為40℃。實施例14：100mg/ml和150mg/ml制劑的亞可見顆粒(sub-visibleparticle)，粘度和可注射性為了進一步表征本發(fā)明的高濃度液體制劑的性質(zhì)，進行另一系列實驗以確定亞可見顆粒的存在以及制劑的粘度和可注射性。對在5℃下儲存9至12個月的樣品進行實驗。-亞可見顆粒損害治療性蛋白質(zhì)功效的一個方式是誘導不想要的免疫應(yīng)答，導致抗體介導的蛋白質(zhì)活性中和或生物利用度變化。眾所周知，治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)聚集體可以增強免疫原性，因此，在評估產(chǎn)品質(zhì)量時，這種影響是考慮的重要危險因素。這樣的聚集體在制劑中表現(xiàn)為亞可見顆粒。蛋白質(zhì)通常從部分解折疊的分子聚集，所述部分解折疊分子可以是分子的天然狀態(tài)集合的一部分。盡管產(chǎn)品制劑被開發(fā)以最大化和保持以天然狀態(tài)存在的蛋白質(zhì)分子的比例，但仍可能形成顯著量的聚集體，特別是在藥學上相關(guān)的時間尺度上和壓力條件下。存在于給定產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)顆粒的水平和尺寸可以因與治療性蛋白質(zhì)的商業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的許多因素而改變。已知具有重復抗原陣列的大蛋白組裝體(其中蛋白質(zhì)分子具有天然構(gòu)象)在誘導免疫應(yīng)答時通常是最強效的。而且，開發(fā)更有效的疫苗的努力已經(jīng)表明，將抗原蛋白質(zhì)吸附到由其它材料(例如膠態(tài)鋁鹽或聚苯乙烯)組成的納米或微粒上，可以大大增加免疫原性。將這些應(yīng)用于治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品，一直存在這樣的爭議：含有天然樣構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子的大聚集體會成為在患者中引起不利免疫反應(yīng)的最大風險。亞可見顆粒分析的標準試驗規(guī)定，尺寸>10μm的顆粒被控制在或低于6000個顆粒/ml，>25μm的顆粒被限制在等于或小于600個顆粒/ml。使用制造商提供的方案，使用hiac系統(tǒng)(beckmancoulterlifesciences)進行亞可見顆粒分析。測量基于光阻(lightobscuration)進行，并且涉及基于顆粒的幾何形狀的顆粒測量。表6hiac亞可見分析所有制劑都充分地處于亞可見顆粒的接受水平之下，觀察到的顆粒缺乏良好地指示了配制抗體的高水平蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。-粘度使用單克隆抗體作為治療劑通常需要遞送大劑量的蛋白質(zhì)。這種濃溶液與許多問題相關(guān)，包括溶液粘度。雖然對于注射溶液的可接受粘度沒有行業(yè)標準，但通常將25-30mpa.s之間的值視為軟上限，粘度大于50mpa·s通常需要非標準的施用技術(shù)/設(shè)備以允許執(zhí)行注射。使用haakereostress1(thermoscientific)使用制造商提供的方案進行粘度分析。表7粘度令人驚訝的是，150mg/ml制劑a(50mm組氨酸，150mmnacl，吐溫80-0.05％，ph5.75,150mg/ml)顯示出優(yōu)越的特性，其粘度接近測試的100mg/ml制劑的粘度。第二測試的150mg/ml制劑(50mm組氨酸，150mmnacl，吐溫80-0.05％，ph6,150mg/ml)也顯示出良好的性能，并且好于可比較的市售150mg/ml治療性抗體制劑。-可注射性可注射性是任何腸胃外劑型的關(guān)鍵產(chǎn)品性能參數(shù)。這是指注射治療劑從注射前小瓶易于通過皮下注射針進行轉(zhuǎn)移的能力?？勺⑸湫园ㄖT如抽取的容易性，堵塞和發(fā)泡趨勢、以及劑量量測的準確性等因素?？梢酝ㄟ^針的幾何形狀，即內(nèi)徑，長度，開口形狀以及注射器(4)的表面光潔度來影響可注射性。這對于自注射裝置(例如裝有非常細針的筆和自動注射器)尤其重要。事實上，患者可以使用采用29-31-g針的筆式注射器。就預裝注射器而言，用于皮下給藥的常規(guī)針頭配置為27g和25g(4,5)。在減少注射疼痛的同時，細針需要增加注射藥物的力。目前，在藥典中沒有規(guī)定任何藥典檢測程序，但一般來說，對于人類注射來說，低于5-8n的力被認為是可以接受的。使用ta-xtplus(stablemicrosystems)使用制造商提供的方案進行可注射性分析。表8可注射性27g針的可注射性數(shù)據(jù)良好，30g針的可注射性優(yōu)異。當前第1頁12當前第1頁12