優(yōu)先權(quán)聲明

根據(jù)35u.s.c.§119(e)，本申請(qǐng)要求保護(hù)2014年11月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)62/074,053的權(quán)益，所述申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

政府支持聲明

本發(fā)明使用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的基金號(hào)ai057157、ai097560、ai107731和ai109761下的政府支持進(jìn)行。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及這樣的登革病毒疫苗，其誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自單個(gè)來(lái)源的多于一種登革病毒血清型的中和抗體。

發(fā)明背景

登革病毒(denv)為一種蚊媒黃病毒，其以空前的速度傳播并已在50多個(gè)國(guó)家形成較大的健康及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有的防御全部四種denv血清型的denv疫苗必須作為四種病毒或者四種重組蛋白的“四價(jià)”制劑遞送，意圖其各自提供針對(duì)所述血清型的防御。近期在泰國(guó)的大型2b期試驗(yàn)中，提供臨床上有意義保護(hù)的最先進(jìn)的四價(jià)減活嵌合病毒的失敗，強(qiáng)調(diào)了在所述四價(jià)混合物中適當(dāng)混合血清型以實(shí)現(xiàn)均衡的抗體應(yīng)答仍為未知的(sabchareon等，2012)。認(rèn)為病毒干擾導(dǎo)致失敗，因?yàn)橐环N或多種病毒血清型在競(jìng)爭(zhēng)中勝過(guò)其他血清型。

本發(fā)明通過(guò)提供以下嵌合登革病毒來(lái)克服本領(lǐng)域中的前述缺陷，所述嵌合登革病毒誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自單個(gè)來(lái)源的多于一種登革病毒血清型的中和抗體。

發(fā)明概述

在一方面，本發(fā)明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被與以下登革病毒血清型反應(yīng)的抗體識(shí)別，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型4，和所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)。

在又一方面，本發(fā)明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入來(lái)自以下登革病毒血清型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸取代，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型4，和所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來(lái)自登革病毒血清型2。

在另一方面，本發(fā)明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被與以下登革病毒血清型反應(yīng)的抗體識(shí)別，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型2，和所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)。

本文亦提供在受試者(例如，有需要的受試者)中產(chǎn)生對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

本文另外提供在受試者(例如，有需要的受試者)中治療登革病毒感染的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

本文進(jìn)一步提供在受試者(例如，有需要的受試者)中預(yù)防與登革病毒感染相關(guān)的病癥的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

作為另一方面，本發(fā)明提供保護(hù)受試者免受登革病毒感染影響的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

在另外的方面，本發(fā)明提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的組合物；b)在黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含上述特定e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；和c)檢測(cè)步驟(b)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體的存在。

本發(fā)明另外提供了在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定的登革病毒血清型或其組合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗體的存在的方法，其包括：a)在黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自已給予本發(fā)明的特定e糖蛋白的受試者的生物樣品與包含所述e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；和b)檢測(cè)步驟(a)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體的存在。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗體，所述方法包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予受試者包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的免疫原性組合物；b)在黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；c)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和d)如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)所述特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體。

本文進(jìn)一步提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗體，所述方法包括：a)在黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自已給予包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的免疫原性組合物的受試者的生物樣品與包含所述e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；b)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和c)如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)所述特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體。

本發(fā)明亦提供在樣品中檢測(cè)針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使所述樣品與本發(fā)明的特定e糖蛋白接觸；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在所述樣品中檢測(cè)針對(duì)所述特定登革病毒血清型或其組合的抗體。

本文另外提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的抗體的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的組合物；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本發(fā)明的又一方面提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的免疫原性組合物的受試者的生物樣品與所述e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本發(fā)明另外提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的抗體，所述方法包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予包含本發(fā)明的特定e糖蛋白的免疫原性組合物的受試者的生物樣品與所述e糖蛋白接觸；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定以下免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)所述特定登革病毒血清型或其組合的抗體。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案為鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體，所述方法包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予受試者包含特定e糖蛋白的免疫原性組合物；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定以下免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)所述特定登革病毒血清型或其組合的中和抗體。

本文另外提供包含本發(fā)明的e糖蛋白的登革病毒顆粒、黃病毒顆粒和/或病毒樣顆粒(vlp)。

本文亦提供編碼本發(fā)明的e糖蛋白的分離的核酸分子，以及編碼本發(fā)明的登革病毒顆粒、黃病毒顆?；騰lp的分離的核酸分子。

本發(fā)明亦提供包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明的e糖蛋白的組合物，以及亦提供包含在藥學(xué)上可接受載體中的本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體(vector)、本發(fā)明的顆粒和/或本發(fā)明的群體的組合物。

本發(fā)明另外提供本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的登革病毒顆粒、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物，其單獨(dú)或以任何組合用于制備在受試者中產(chǎn)生對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)的藥劑、用于在有需要的受試者中治療登革病毒感染、用于在受試者中預(yù)防登革病毒感染和/或保護(hù)受試者免受登革病毒感染的影響。

本文亦提供本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的登革病毒顆粒、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物的用途，其單獨(dú)或以任何組合用于在受試者中產(chǎn)生對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)、在有需要的受試者中治療登革病毒感染、在受試者中預(yù)防登革病毒感染和/或保護(hù)受試者免受登革病毒感染的影響。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.denv3和4的感染性cdna克隆的設(shè)計(jì)以及重組denv4/3病毒的產(chǎn)生。(a)包含用于生成次基因組片段(subgenomicfragment)的限制酶的denv3和denv4感染性克隆設(shè)計(jì)的基因組示意圖。次基因組片段的大小指出在denv基因組中進(jìn)行切斷以避開(kāi)細(xì)菌不穩(wěn)定性和毒性的位置。(b)通過(guò)移植denv3序列分別產(chǎn)生denv4m12、m14和m16在denv4e蛋白中改變的氨基酸。氨基酸編號(hào)代表距離denv4的e蛋白起始位置的殘基。指出aa轉(zhuǎn)入denv4m12(c；綠色殘基)、denv4m14(d；綠色+藍(lán)綠色殘基)和denv4m16(e；綠色+藍(lán)綠色+橙色殘基)中的denv3e蛋白二聚體的緞帶結(jié)構(gòu)。顏色對(duì)應(yīng)于(b)中突顯的aa殘基。

圖2.rdenv4/3在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性。(a)使denv3、denv4、denv4m12、denv4m14和denv4m16在c6/36細(xì)胞上增殖至觀察到最大細(xì)胞病理(通常在接種后4天)，并將其收集用于vero-81細(xì)胞滴定。感染滴度表示成ffu/ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。(b)wt和rdenv病毒在vero-81細(xì)胞上的感染斑大小和形態(tài)。

圖3.rdenv4/3在節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性。(a)以moi=0.01接種到c6/36細(xì)胞上的denv3、denv4、denv4m12、denv4m14和denv4m16的多步生長(zhǎng)曲線分析。如所述的對(duì)c6/36細(xì)胞滴定細(xì)胞培養(yǎng)上清液。(b)wt和rdenv在c6/36細(xì)胞上的感染斑大小和形態(tài)。

圖4.hmab5j7對(duì)rdenv4/3的結(jié)合和中和。(a)denv3特異性hmab5j7對(duì)denv3、denv4、denv4m14和denv4m16的elisaod值。5j7不結(jié)合denv4m12且顯示與wtdenv4相同的曲線(未顯示數(shù)據(jù))。在vero-81(b)和u937-dc-sign(c)上對(duì)denv3、denv4、denv4m12、m14和m16的中和試驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示為中和50%的病毒感染性所需的μg/ml。

圖5.多克隆denv3血清中和。(a-d)在vero-81細(xì)胞上針對(duì)denv3、denv4、denv4m12和denv4m14測(cè)定從初次denv3感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv3體液免疫反應(yīng)的敏感性。(e-g)在u937-dc-sign細(xì)胞上針對(duì)denv3、denv4、denv4m14和denv4m16測(cè)定從初次denv3感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv3體液免疫反應(yīng)的敏感性。

圖6.多克隆denv4血清中和。(a)在vero-81細(xì)胞上針對(duì)denv3、denv4、denv4m12和denv4m14測(cè)定從初次denv4感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv4體液免疫反應(yīng)的敏感性。(b-d)在u937-dc-sign細(xì)胞上針對(duì)denv3、denv4、denv4m14和denv4m16測(cè)定從初次denv4感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv4體液免疫反應(yīng)的敏感性。

圖7.異型血清中和。(a、b)在vero-81細(xì)胞上針對(duì)denv1、denv3、denv4m12和denv4m14測(cè)定從初次denv1感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)非特異性體液免疫反應(yīng)的敏感性。(c、d)在vero-81細(xì)胞上針對(duì)denv2、denv3、denv4m12和denv4m14測(cè)定從初次denv2感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv4體液免疫反應(yīng)的敏感性。

圖8.denv1和2的感染性cdna克隆的設(shè)計(jì)及重組denv2/1病毒的產(chǎn)生。(a)包含用于生成次基因組片段的限制酶的denv1和denv2感染性克隆設(shè)計(jì)的基因組示意圖。次基因組片段的大小指出在denv基因組中進(jìn)行切斷以避開(kāi)細(xì)菌不穩(wěn)定性和毒性的位置。(b)通過(guò)移植denv1序列產(chǎn)生denv2-1f4e在denv2e蛋白中改變的氨基酸。氨基酸編號(hào)代表距離denv2的e蛋白起始位置的殘基。(c)aa轉(zhuǎn)入denv2-1f4e的denv2e蛋白二聚體的緞帶結(jié)構(gòu)。

圖9.rdenv2/1的生長(zhǎng)特性。使denv1、denv2和denv2-1f4e在c6/36細(xì)胞上增殖至觀察到最大細(xì)胞病理(通常在接種后4天)，并將其收集用于使用vero-81(a)或c6/36(b)細(xì)胞滴定。感染滴度表示成ffu/ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。(c)以moi=0.01接種到c6/36細(xì)胞上的denv1、denv2和denv2-1f4e的多步生長(zhǎng)曲線分析。如所述的對(duì)c6/36細(xì)胞滴定細(xì)胞培養(yǎng)上清液。(d)wt和denv2-1f4e病毒在c6/36細(xì)胞上的感染斑大小和形態(tài)。

圖10.hmab1f4對(duì)rdenv2/1的結(jié)合和中和。(a)denv1特異性hmab1f4對(duì)denv1、denv2和denv2-1f4e的elisaod值。在c6/36(b)和u937-dc-sign(c)上對(duì)denv1、denv2和denv2-1f4e的中和試驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示成中和50%的病毒感染性所需的μg/ml。

圖11.多克隆denv1和denv2血清中和。(a和b)在u937-dc-sign細(xì)胞上針對(duì)denv1、denv2和denv2-1f4e測(cè)定從初次denv1感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv1體液免疫反應(yīng)的敏感性。(c-e)在u937-dc-sign細(xì)胞上針對(duì)denv1、denv2和denv2-1f4e測(cè)定從初次denv2感染恢復(fù)的人類供者收集的血清，以評(píng)價(jià)對(duì)denv2體液免疫反應(yīng)的敏感性。

圖12.鼠科動(dòng)物存活率。使用3.3x10⁶ffudenv1、denv2或denv2-1f4e腹膜內(nèi)接種c57bl/6背景下的干擾素α/β/γ缺陷型小鼠。對(duì)小鼠監(jiān)測(cè)體重減輕和臨床疾病達(dá)56天。

圖13.dv4-ediii-dv2病毒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。(a)denv2和denv4線性包膜蛋白結(jié)構(gòu)域iii(ediii)序列(整個(gè)e序列的第296-395個(gè)殘基，總計(jì)99個(gè)aa)的氨基酸比對(duì)。denv2和denv4之間不同的殘基以灰色突顯。含有來(lái)自denv3的ediii的重組denv4病毒rdenv4/2，將來(lái)自denv4的不同殘基替換成來(lái)自denv2的殘基，以淺灰色突顯。(b)denv2e蛋白二聚體的草圖(左)和空間填充(右)晶體結(jié)構(gòu)模型，將交換的殘基著色。(c)用于處理denv基因組的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)，上圖=denv2，下圖=denv4。將denv基因組分成四個(gè)質(zhì)粒盒(plasmidcassette)，其可獨(dú)立突變、連接在一起并電穿孔進(jìn)入細(xì)胞以產(chǎn)生重組病毒。denv4-a盒含有包膜蛋白基因，用灰色突顯ediii。在denv4主鏈中將ediii殘基替換成來(lái)自denv2的殘基，產(chǎn)生dv4-ediii-dv2病毒。

圖14.具有類似成熟特性的denv4和dv4-ediii-dv2病毒體。使病毒在c6/36細(xì)胞中生長(zhǎng)，收集培養(yǎng)上清液并離心去除任何細(xì)胞碎片。使樣品在12%sds-page凝膠上跑膠并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗體探測(cè)印跡。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或者prm分解。在denv4或dv4-ediii-dv2樣品中均未檢出prm條帶。

圖15.dv4-ediii-dv2相對(duì)于親代病毒在vero細(xì)胞中具有2個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)衰減。(a)以moi=0.01感染vero-81細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后對(duì)vero-81細(xì)胞滴定。(b)denv在vero-8細(xì)胞中形成感染斑(denv2、denv4和dv4-ediii-dv2分別在感染后5天、4天和6天進(jìn)行固定)。dv4-ediii-dv2空斑小于兩種親代病毒。

圖16.dv4-ediii-dv2在c6/c36細(xì)胞中沒(méi)有生長(zhǎng)衰減。(a)以moi=0.01感染c6/c36細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后用c6/c36細(xì)胞滴定。(b)denv在c6/c36細(xì)胞中形成感染斑(denv2、denv4和dv4-ediii-dv2分別在感染后4天、3天和5天進(jìn)行固定)。在生長(zhǎng)更多天的情況下，dv4-ediii-dv2空斑達(dá)到與親代病毒相當(dāng)?shù)拇笮　?/p>

圖17.通過(guò)型特異性denv2人mab結(jié)合和中和dv4-ediii-dv2的轉(zhuǎn)移。(a)與四價(jià)表位結(jié)合的強(qiáng)中和性dv2mab(人mab2d22)的概述表。(b)先前產(chǎn)生的2d22逃逸突變體導(dǎo)致位于ediii的一個(gè)逃逸突變r(jià)323g。(c)elisa測(cè)定顯示轉(zhuǎn)移了部分2d22與dv4-ediii-dv2的結(jié)合，其高于親代dv4的水平，但不及dv2水平。(d)交叉反應(yīng)的對(duì)照抗體2j20的elisa結(jié)合，顯示相當(dāng)水平的病毒存在并維持病毒結(jié)構(gòu)完整性。(e)使用2d22進(jìn)行基于vero-81的空斑減少中和試驗(yàn)(frnt)并計(jì)算frnt50(中和50%的感染所需的抗體濃度)值。(f)使用2d22進(jìn)行基于u937+dc-sign的中和試驗(yàn)(neut)并計(jì)算neut50值。在兩個(gè)試驗(yàn)(e、f)中，dv4-ediii-dv2獲得水平高于dv2的對(duì)2d22的中和。dv4在任一試驗(yàn)中均未被最大濃度的2d22中和。

圖18.dv4-ediii-dv2獲得對(duì)許多額外的dv2型特異性mab的中和。(a、b、e)具有逃逸突變體或丙氨酸掃描突變殘基(來(lái)自表2)的denve蛋白二聚體晶體結(jié)構(gòu)，分別指出為dvc3.7的第382位殘基、dvc10.16的第311位殘基、以及dvc13.6的第101和108位殘基。(c、d、f-i)對(duì)各mab的vero-81frnt試驗(yàn)。例外的是3f9，dv4-ediii-dv2與給定mab的中和以與親代dv2病毒相等或更高的水平轉(zhuǎn)移。3f9不結(jié)合dv4-ediii-dv2(未顯示elisa結(jié)合數(shù)據(jù))。

圖19.dv4-ediii-dv2未被dv型特異性ediiimab中和。(a)具有在第331和361位殘基指出的丙氨酸掃描突變殘基(來(lái)自表2)的denve蛋白二聚體晶體結(jié)構(gòu)。(b)vero-81frnt試驗(yàn)顯示dv-e88不能中和dv4-ediii-dv2或dv2，但是可中和親代dv4。

圖20.dv4-ediii-dv2獲得對(duì)多克隆denv2免疫血清的中和。(a-l)vero-81frnt試驗(yàn)顯示獲得對(duì)dv4-ediii-dv2的多克隆免疫血清中和，其與dv2中和的水平相當(dāng)，表明將ediii從dv2轉(zhuǎn)移到dv4中足以轉(zhuǎn)移大部分的denv2中和。*=fnrt50<20

圖21.dv$-ediii-dv2保持對(duì)多克隆denv4免疫血清的中和。(a-f)vero-81frnt試驗(yàn)顯示dv4-ediii-dv2保持大部分中和，表明從dv2轉(zhuǎn)移ediii不會(huì)干擾dv4中和表位。*=fnrt50<20

圖22.dv4-ediii-dv2獲得dv2血清中和并保留dv4血清中和。(a)在圖19中顯示的dv2多克隆中和數(shù)據(jù)的概述。(b)在圖20中顯示的dv4多克隆中和數(shù)據(jù)的概述。fnrt50<20的樣品以19的血清稀釋因子作圖。

圖23.dv4-ediii-dv2未獲得對(duì)異型多克隆免疫血清的中和。vero-81frnt試驗(yàn)顯示未獲得高于親代dv2或dv4中和滴度的對(duì)異型(a)denv1或(b)denv3多克隆免疫血清的中和。fnrt50<20的樣品以19的血清稀釋因子作圖。

圖24.rdenv4/2病毒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。(a)可將來(lái)自denv2(右)的殘基移入denv4主鏈，產(chǎn)生重組denv4/2病毒(rdenv4/2)。(b)用于處理denv基因組的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)。上圖=denv2，下圖=denv4。將denv基因組分成四個(gè)質(zhì)粒盒，其可獨(dú)立突變、連接在一起并電穿孔進(jìn)入細(xì)胞以產(chǎn)生重組病毒。denv4-a盒含有進(jìn)行突變的包膜蛋白基因。將denv4殘基替換成來(lái)自denv2的殘基，產(chǎn)生rdenv4/2病毒，其完全在denv4基因主鏈上構(gòu)建。

圖25.用于通過(guò)rt-pcr的血清型鑒定的新方法及denv4主鏈重組病毒的驗(yàn)證。(a)用于血清型特異性rt-pcr的rt-pcr引物的設(shè)計(jì)。引物使用靶向高度保守的3’端ns1基因的通用正義寡核苷酸。血清型特異性反義引物靶定高度差異的ns2a基因。(b)使病毒在c6/36細(xì)胞中生長(zhǎng)，收集培養(yǎng)上清液并離心去除任何細(xì)胞碎片。使用qiagenqiamp病毒rna小量制備試劑盒分離病毒rna。將pcr運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，并在1.5%超純瓊脂糖凝膠上分析pcr產(chǎn)物。將對(duì)照rna(dv1/dv2/dv3/dv4)和水作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照跑膠。預(yù)期產(chǎn)物大?。篸v1=205bp，dv2=539bp，dv3=455bp，dv4=401bp。

圖26.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性區(qū)分rdenv4/2與親代denv4。(a)設(shè)計(jì)用以區(qū)分rdenv4/2(下)與親代denv4(上)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)。引入denv4e基因組中以產(chǎn)生rdenv4/2的突變(以星號(hào)表示)破壞denv4中存在的xmni限制酶位點(diǎn)。(b)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并用xmni消化。在1.5%超純瓊脂糖凝膠上分析消化產(chǎn)物。預(yù)期產(chǎn)物大?。何聪L(zhǎng)=1031bp，消化產(chǎn)物=931bp和113bp。

圖27.denv4和rdenv4/2病毒體具有類似的成熟特性。使病毒在c6/36細(xì)胞中生長(zhǎng)，收集培養(yǎng)上清液并離心去除任何細(xì)胞碎片。使樣品在12%sds-page凝膠上跑膠并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗體探測(cè)印跡。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或者prm分解。在denv4或rdenv4/2樣品中均未檢出prm條帶。

圖28.rdenv4/2相對(duì)于親代病毒在vero細(xì)胞中具有2個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)衰減。(a)以moi=0.01感染vero-81細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后用vero-81細(xì)胞滴定。(b)denv在vero-81細(xì)胞中形成感染斑(denv2、denv4和rdenv4/2分別在感染后5天、4天和6天進(jìn)行固定)。rdenv4/2空斑小于兩種親代病毒。

圖29.rdenv4/2在c6/c36細(xì)胞中無(wú)生長(zhǎng)衰減且形成與親代病毒類似的感染斑。(a)以moi=0.01感染c6/c36細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后對(duì)c6/c36細(xì)胞滴定。(b)denv在c6/c36細(xì)胞上形成感染斑(denv2、denv4和rdenv4/2分別在感染后4天、3天和5天進(jìn)行固定)。在生長(zhǎng)更多天的情況下，rdenv4/2空斑達(dá)到與親代病毒相當(dāng)?shù)拇笮　?/p>

圖30.通過(guò)型特異性denv2人mab結(jié)合和中和rdenv4/2的轉(zhuǎn)移。(a)與四價(jià)表位結(jié)合的強(qiáng)中和性dv2mab(人mab2d22)的概述表。(b)elisa測(cè)定顯示轉(zhuǎn)移了部分2d22與rdenv4/2的結(jié)合，其高于親代dv4的水平，但不及dv2水平。(c)交叉反應(yīng)的對(duì)照抗體2j20的elisa結(jié)合，顯示相當(dāng)水平的病毒存在和保持病毒完整性。(d)使用2d22進(jìn)行基于vero-81的空斑減少中和試驗(yàn)(frnt)并計(jì)算frnt50(中和50%的感染所需的抗體濃度)值。(e)使用2d22進(jìn)行基于u937+dc-sign的中和試驗(yàn)(neut)并計(jì)算neut50值。在兩個(gè)試驗(yàn)(e、f)中，rdenv4/2得到水平高于dv2的對(duì)2d22的中和。dv4在任一試驗(yàn)中均未被最大濃度的2d22中和。

圖31.rdenv4/2獲得對(duì)denv2多克隆免疫血清的中和，同時(shí)保留對(duì)denv4多克隆血清的中和。vero-81frnt試驗(yàn)顯示rdenv4/2(a)獲得水平與親代denv2相當(dāng)?shù)膶?duì)denv2多克隆免疫血清的中和。(b)rdenv4/2未顯示喪失通過(guò)denv4多克隆免疫血清的中和。rdenv4/2顯示未獲得高于親代denv2或denv4中和滴度的對(duì)異型(c)denv1和(d)denv3多克隆免疫血清的中和。如所指示的將來(lái)自具有自然感染或?qū)嶒?yàn)疫苗接種的個(gè)體的血清編碼。fnrt50<20的樣品以19的血清稀釋因子作圖。

圖32a.重組denv4/2序列的比對(duì)。顯示了野生型denv2、重組dv4-ediii-dv2和野生型denv4的氨基酸序列，連同共有序列和氨基酸保守百分比。

圖32b.重組denv2/1序列的比對(duì)。顯示了野生型denv1、重組denv2-1f4e和野生型denv2的氨基酸序列，連同共有序列和氨基酸保守百分比。

圖32c.重組denv4/3序列的比對(duì)。顯示了野生型denv3、重組denv4m12、denv4m14、denv4m16和野生型denv4的氨基酸序列，連同共有序列和氨基酸保守百分?jǐn)?shù)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明是基于以下意外發(fā)現(xiàn)：可將定義一種或多種denv血清型的一個(gè)或多個(gè)表位區(qū)轉(zhuǎn)移到不同denv血清型的蛋白質(zhì)主鏈中，以產(chǎn)生含有靶向多種血清型的抗體的嵌合分子，從而作為多價(jià)(例如二價(jià)、三價(jià)或四價(jià))疫苗起作用，所述多價(jià)疫苗可誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自單個(gè)來(lái)源或少于四種來(lái)源的兩種、三種或四種不同denv血清型的中和抗體。因此，本發(fā)明提供用于構(gòu)建包含氨基酸取代的嵌合登革病毒e糖蛋白主鏈的平臺(tái)，所述取代引入被各自的抗體識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)表位(epitome)，所述抗體與一種或多于一種登革病毒血清型反應(yīng)，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同。

在一些實(shí)施方案中，所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型1。在一些實(shí)施方案中，所述登革病毒e糖蛋白主鏈可來(lái)自登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。

在一些實(shí)施方案中，所述與登革病毒血清型反應(yīng)的抗體(所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同)，為與登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4反應(yīng)的抗體。

在一些實(shí)施方案中，可將來(lái)自一種或多種各自的登革病毒血清型的一個(gè)或多個(gè)登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域引入不同登革病毒血清型的登革病毒e糖蛋白主鏈中。

應(yīng)理解的是，均可使用用于所述登革病毒e糖蛋白主鏈的第一登革病毒血清型與如分別在第二、第三和/或第四登革病毒血清型中所鑒定的登革病毒表位或登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的任何組合，前提是所述第一登革病毒血清型和所述第二、第三和/或第四登革病毒血清型為不同的(即，所述第二、第三和/或第四血清型不為與所述第一登革病毒血清型相同的血清型，和/或所述第二、第三和/或第四登革病毒血清型彼此為不同的)。

因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被與以下登革病毒血清型反應(yīng)的抗體識(shí)別，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型4，和所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體5j7，而在一些實(shí)施方案中，所述e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成、或者由以下氨基酸序列組成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(wt_denv4，seqidno:1)，

其中所述氨基酸序列包含全部或者并非全部的任意組合的下列氨基酸取代：

t49e、k51t、e52q、v53l、l55t、t58k、y59l、s122l、g123e、k124p、t126e、n128k、l129v、i132y、m199l、k200t、t205a、l207m、k210r、l214f、a222s、v270i、d271q、s272n、g273s、d274g、n276t、h277s和m278i，且其中所述氨基酸序列可進(jìn)一步包含任意組合的一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸取代：a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q和v362p。

在一些實(shí)施方案中，上文描述為4/3登革病毒糖蛋白的嵌合登革病毒e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成、或者由以下氨基酸序列組成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m12，seqidno:2)，

或者氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkteatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfsclepiegkvvqyenleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m14，seqidno:3)，

或者氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkteatqlatlrklcieasisnittdtrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfsclepiegkvvqyenleytvvvtvhngdqhavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgattsephwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsikkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsptnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m16，seqidno:4)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入來(lái)自以下登革病毒血清型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸取代，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型4，和所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來(lái)自登革病毒血清型2。

在一些實(shí)施方案中，登革病毒血清型4的登革病毒e糖蛋白主鏈包含引入被抗體識(shí)別的表位的氨基酸取代，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體2d22。

在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?yàn)閑糖蛋白結(jié)構(gòu)域iii，而在一些實(shí)施方案中，上文描述為4/2的嵌合登革病毒e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成、或者由以下氨基酸序列組成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(dv4-ediii-dv2，seqidno:5)。

在一些實(shí)施方案中，所述嵌合登革病毒e糖蛋白可包含氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(wt_denv4，seqidno:1)，

其中所述氨基酸序列可包含全部或者并非全部的任意組合的下列氨基酸取代：

t300s、s303t、s307k、d309v、m312i、t320i、v322i、k323r、k325q、a329d、a331s、v335i、i337f、r340t、v342l、n343e、e345r、k346h、v348l、v351l、s353t、s354v、t355n、l357i、a358v、e359t、n360e、t361k、n362d、v364p、t365v、l369a、v379i、g383e、n384p、s385g、a386q、t388k、h390n和r393k。

本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括互換病毒(reciprocalexchangevirus)，即，具有引入來(lái)自登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如結(jié)構(gòu)域iii)的氨基酸取代的登革病毒血清型2的登革病毒e糖蛋白。登革病毒血清型主鏈和來(lái)自不同登革病毒血清型的取代登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的任何其他組合均被納入為本發(fā)明的實(shí)施方案，其包括例如組合1/2、1/3、1/4、1/2/3、1/2/4、1/3/4、1/2/3/4、2/1、2/3、2/4、2/1/3、2/1/4、2/3/4、2/1/3/4、3/1、3/2、3/4、3/1/2、3/1/4、3/2/4、3/1/2/4、4/1、4/2、4/3、4/1/3、4/1/2、4/3/2或4/3/2/1(其中各組合的第一個(gè)數(shù)字定義所述主鏈的血清型，和各組合的第二、三或四個(gè)數(shù)字定義引入所述主鏈中的表位或結(jié)構(gòu)域的血清型)。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供包含以下登革病毒e糖蛋白主鏈的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主鏈包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被與以下登革病毒血清型反應(yīng)的抗體識(shí)別，所述登革病毒血清型與所述登革病毒e糖蛋白主鏈的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主鏈來(lái)自登革病毒血清型2，和所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體1f4，而在一些實(shí)施方案中，所述嵌合登革病毒e糖蛋白包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成、或者由以下氨基酸序列組成：

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtnpavlrkycieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfickhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckknmegkvvqpenlkysvivtvhsgeehavgndttehgttatitpqaptseiqltdygaltlecsprtgldfnemvllqmedkawlvhrqwfldlplpwlpgadtqesnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttlftghlkcrlrmdklqlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(denv2-1f4e，seqidno:6)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述嵌合e糖蛋白可包含登革病毒血清型1、登革病毒血清型2或登革病毒血清型3的登革病毒e糖蛋白主鏈，其包含任意組合的一個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個(gè)或全部15個(gè))下列氨基酸取代，以引入與單克隆抗體5h2反應(yīng)的來(lái)自登革病毒血清型4的表位：第155位殘基上的a、第160位殘基上的v、第161位殘基上的t、第162位殘基上的a、第163位殘基上的m、第168位殘基上的s、第170位殘基上的s、第171位殘基上的v、第173位殘基上的v、第174位殘基上的k、第176位殘基上的p、第177位殘基上的d、第180位殘基上的e、第291位殘基上的k和第293位殘基上的r。氨基酸編號(hào)是基于本文提供的wt_denv4的氨基酸序列。

本發(fā)明提供本發(fā)明的嵌合登革病毒e糖蛋白的另外的非限制性實(shí)例，其可用于本文提供的序列章節(jié)中的本文所述的組合物和方法。

本發(fā)明亦提供各種治療方法，包括例如在受試者中產(chǎn)生對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

本文另外提供的是在受試者中治療登革病毒感染的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在受試者中預(yù)防與登革病毒感染相關(guān)的病癥的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

本文亦提供的是保護(hù)受試者免受登革病毒感染影響的方法，其包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的e糖蛋白、本發(fā)明的黃病毒顆粒、本發(fā)明的vlp、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的群體和/或本發(fā)明的組合物及其任何組合。

本發(fā)明亦提供各種診斷方法，包括例如在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含上文步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；和c)檢測(cè)步驟(b)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體的存在。

本文進(jìn)一步提供的是在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含上文步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；和c)檢測(cè)步驟(b)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體的存在。

本發(fā)明亦提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含上文步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；和c)檢測(cè)步驟(b)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體的存在。

本文亦提供的是在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)步驟(a)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體的存在。

此外，本發(fā)明提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)步驟(a)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體的存在。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體的存在的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)步驟(a)中的中和，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體的存在。

本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體，所述方法包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；c)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和d如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體。

此外，本發(fā)明提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體，所述方法包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；c)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和d如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體，所述方法包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸；c)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和d如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體，所述方法包括：a)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與包含e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和c)如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體。

此外，本發(fā)明提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體，所述方法包括：a在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與包含e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和c)如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體。

本文另外提供的是鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體，所述方法包括：a)在所述黃病毒顆粒的中和可被檢測(cè)的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與包含e糖蛋白的黃病毒顆粒接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)確定所述生物樣品是否包含這樣的抗體，其中和包含步驟(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒；和c)如果所述生物樣品包含這樣的抗體，其中和包含(a)的e糖蛋白的黃病毒顆粒，則將所述免疫原性組合物鑒定為在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使所述樣品與下列組合物接觸：包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在所述樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本發(fā)明亦提供在樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使所述樣品與下列組合物接觸：包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在所述樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本文亦提供的是在樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使所述樣品與下列組合物接觸：包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在所述樣品中檢測(cè)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體。

本文進(jìn)一步提供的是在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本文另外提供的是在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體。

在又另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體的方法，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體。

本文另外提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與e糖蛋白接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與e糖蛋白接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在來(lái)自受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體的方法，其包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與e糖蛋白接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而在來(lái)自所述受試者的生物樣品中鑒定針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體，所述方法包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與e糖蛋白接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的抗體。

本文進(jìn)一步提供的是鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體，所述方法包括：a在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予包含權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的e糖蛋白的免疫原性組合物的受試者的生物樣品與所述e糖蛋白接觸；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的抗體。

本文亦提供的是鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體，所述方法包括：a)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自已給予下列免疫原性組合物的受試者的生物樣品與e糖蛋白接觸：包含e糖蛋白的免疫原性組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和b)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的抗體。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型3反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型3和/或4的中和抗體。

本發(fā)明另外提供鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型4反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型2和/或4的中和抗體。

本文亦提供的是鑒定免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體，其包括：a)以有效誘導(dǎo)對(duì)e糖蛋白的抗體反應(yīng)的量給予所述受試者包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型1反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入被抗體識(shí)別的表位，所述抗體與登革病毒血清型2反應(yīng)，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和/或包含e糖蛋白的組合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主鏈，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b在抗原/抗體復(fù)合物可形成的條件下，使來(lái)自所述受試者的生物樣品與(a)的e糖蛋白接觸；和c)檢測(cè)抗原/抗體復(fù)合物的形成，從而鑒定這樣的免疫原性組合物，其在所述受試者中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒血清型1和/或2的中和抗體。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定針對(duì)移植表位或結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體的量的方法。例如，可通過(guò)比較denv4m14與親代denv4的中和來(lái)測(cè)定靶定5j7區(qū)的denv3抗體，預(yù)期的是，denv3抗體可中和某部分denv4m14，但不可中和親代denv4。

本發(fā)明亦提供包含本發(fā)明的嵌合e糖蛋白的登革病毒顆粒、黃病毒顆粒和病毒樣顆粒(vlp)。本發(fā)明的登革病毒e糖蛋白可存在于完整病毒顆粒(例如死病毒顆粒或減活病毒顆?；蛘咧亟M登革病毒載體)或病毒樣顆粒(vlp)中，其可任選為完整的登革病毒顆?；虻歉锊《緑lp。

亦提供的是編碼本發(fā)明的e糖蛋白的分離的核酸分子，編碼本發(fā)明的登革病毒顆粒、黃病毒顆?；騰lp的分離的核酸分子，包含本發(fā)明的核酸分子的載體和包含本發(fā)明的登革病毒顆粒和/或黃病毒顆粒的登革病毒顆粒和/或黃病毒顆粒的群體。

本文進(jìn)一步提供的是包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明e糖蛋白的組合物、包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明核酸分子的組合物、包含本發(fā)明病毒顆粒的組合物、包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明群體的組合物以及包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明vlp的組合物。

在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)將鑒定為登革病毒表位和/或登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分的某些(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)等)或全部氨基酸取代引入登革病毒e糖蛋白主鏈或黃病毒e糖蛋白主鏈中，來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的嵌合體的生成。并非需要取代每個(gè)鑒定為登革病毒表位或登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分的氨基酸來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白。例如，在一些實(shí)施方案中，可在本發(fā)明嵌合體的生成中，在鑒定為登革病毒表位或登革病毒結(jié)構(gòu)域的部分的連續(xù)氨基酸序列的任一端，包含另外的取代和/或省去約1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的取代。根據(jù)本文的教導(dǎo)且根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定產(chǎn)生所需構(gòu)象表位或結(jié)構(gòu)域所必需的取代數(shù)量。在本文所述氨基酸序列中提供的氨基酸殘基編號(hào)，是基于各自的denv血清型的各個(gè)未修飾的(即野生型)e糖蛋白氨基酸序列，如在本文中所提供。然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)容易理解的是，可在其他登革病毒e糖蛋白氨基酸序列或其他黃病毒e糖蛋白氨基酸序列中容易地鑒定等同的氨基酸位置并將其用于產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供這樣的嵌合黃病毒e糖蛋白，其中進(jìn)行氨基酸取代以將一個(gè)或多個(gè)登革病毒表位引入來(lái)自并非為登革病毒的黃病毒的黃病毒e糖蛋白中。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含嵌合e糖蛋白的黃病毒e糖蛋白，所述嵌合e糖蛋白包含并非為登革病毒e糖蛋白主鏈的黃病毒e糖蛋白主鏈，其中所述黃病毒e糖蛋白主鏈包含引入一個(gè)或多個(gè)表位的氨基酸取代，所述表位被與登革病毒反應(yīng)的各自的抗體識(shí)別。

可使用的黃病毒的非限制性實(shí)例包括黃熱病病毒(yfv)(例如genbank^?數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)jx503529)、日本腦炎病毒(jev)(例如genbank^?數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)u14163)、西尼羅病毒(wnv)(例如genbank^?數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)dq211652)以及目前已知或后續(xù)鑒定的任何其他黃病毒。

本領(lǐng)域已知的是，產(chǎn)生登革病毒疫苗的許多嘗試導(dǎo)致非中和抗體的產(chǎn)生，在后續(xù)暴露給自然感染或疫苗時(shí)，其可增加病理的可能性。提供工程改造表位的另一種方式為遞送摻入另一種黃病毒顆?；騰lp中的全部或一部分登革病毒e蛋白。在代表性的實(shí)施方案中，所述異源黃病毒為西尼羅病毒或黃熱病病毒?？蓪⑺鰁蛋白的部分植入所述異源黃病毒主鏈的e蛋白中，例如以減少針對(duì)存在于所述登革病毒e蛋白和/或其他登革病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的非中和表位的非中和性登革病毒抗體的產(chǎn)生。

因此，嵌合黃病毒或嵌合黃病毒vlp可以適當(dāng)?shù)臉?gòu)象呈現(xiàn)所述四價(jià)登革病毒表位，同時(shí)減少針對(duì)所述登革病毒e蛋白的其他部分和/或在所述嵌合黃病毒或黃病毒vlp中不存在的其他結(jié)構(gòu)蛋白的非中和抗體的產(chǎn)生。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述黃病毒e糖蛋白或登革病毒e糖蛋白的個(gè)體和構(gòu)象表位可存在于合成的主鏈或支持結(jié)構(gòu)上，由此在所述合成的主鏈或支持結(jié)構(gòu)內(nèi)的表位模擬所述e糖蛋白、病毒顆?；騰lp內(nèi)的表位的構(gòu)象和排列。

在本發(fā)明的再其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供模擬本發(fā)明的e糖蛋白的個(gè)體和構(gòu)象表位的肽mimitopes(參見(jiàn)meloen等，(2000)j.mol.recognit.13，352-359)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)以及針對(duì)本發(fā)明的e糖蛋白的個(gè)體和構(gòu)象表位的一種或多種抗體來(lái)鑒定mimitopes，所述技術(shù)包括但不限于表面刺激、隨機(jī)肽文庫(kù)或噬菌體展示文庫(kù)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的登革病毒肽、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、登革病毒多肽或黃病毒多肽的核酸分子(例如分離的核酸分子)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的嵌合黃病毒顆?；蚯逗宵S病毒病毒樣顆粒(vlp)(例如所述黃病毒顆粒的病毒外殼)的核酸分子(例如分離的核酸分子)。

亦提供的是包含本發(fā)明的核酸分子的核酸載體。

亦提供的是包含單獨(dú)的或任何組合的本發(fā)明的載體、核酸分子、登革病毒蛋白、登革病毒肽、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、黃病毒蛋白、黃病毒肽、黃病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp和/或嵌合黃病毒顆粒。

本發(fā)明亦提供包含單獨(dú)的或任何組合的本發(fā)明的細(xì)胞、載體、核酸分子、登革病毒蛋白、嵌合登革病毒vlp、嵌合登革病毒顆粒、嵌合黃病毒vlp和/或嵌合黃病毒顆粒的免疫原性組合物。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是單價(jià)體。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物為多價(jià)體(例如二價(jià)體、三價(jià)體或四價(jià)體)，用于任意組合的登革病毒血清型den1、den2、den3和/或den4?？蓪⒈景l(fā)明的登革病毒嵌合e糖蛋白單獨(dú)或以任何組合給予受試者，包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的這類免疫方案的初免和加強(qiáng)的任何組合。本發(fā)明的登革病毒嵌合e糖蛋白可以是1/2、1/3、1/4、1/2/3、1/2/4、1/3/4、1/2/3/4、2/1、2/3、2/4、2/1/3、2/1/4、2/3/4、2/1/3/4、3/1、3/2、3/4、3/1/2、3/1/4、3/2/4、3/1/2/4、4/1、4/2、4/3、4/1/3、4/1/2、4/3/2或4/3/2/1(其中各組合的第一個(gè)數(shù)字定義所述主鏈的血清型，和各組合的第二、三或四個(gè)數(shù)字定義引入所述主鏈中的表位或結(jié)構(gòu)域的血清型)。在一些實(shí)施方案中，使用初免/加強(qiáng)組合，其導(dǎo)致給予代表全部四種登革病毒血清型的抗原。所述初免/加強(qiáng)方案可包括以任何順序給予抗原的任何組合以實(shí)現(xiàn)該結(jié)果。初免/加強(qiáng)方案的非限制性實(shí)例可包括在第0天初免，且分別在3個(gè)月和6個(gè)月加強(qiáng)，或者在6個(gè)月和1年加強(qiáng)。亦可對(duì)該方案進(jìn)行修改以包含僅在3個(gè)月、6個(gè)月或1年的一次加強(qiáng)。

本發(fā)明包括在受試者中產(chǎn)生對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包括單獨(dú)或以任何組合給予所述受試者有效量的本發(fā)明的登革病毒蛋白、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp、嵌合黃病毒顆粒、核酸分子、載體、細(xì)胞和/或免疫原性組合物。

在一些實(shí)施方案中，可有利地實(shí)施本發(fā)明以誘導(dǎo)對(duì)den1、den2、den3和den4血清型中的一種、兩種、三種或全部四種的免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可單獨(dú)或以任何組合和/或順序給予受試者本發(fā)明的登革病毒嵌合e糖蛋白和/或編碼本發(fā)明的登革病毒嵌合e糖蛋白的核酸分子，以誘導(dǎo)對(duì)全部四種denv血清型的免疫反應(yīng)(例如均衡的免疫反應(yīng)，其中測(cè)定的登革熱免疫的參數(shù)對(duì)于全部四種denv血清型而言幾乎為等同的)。本領(lǐng)域眾所周知的是，因血清型之間的干擾問(wèn)題，設(shè)計(jì)有效且安全的多價(jià)登革熱疫苗具有挑戰(zhàn)性。例如，免疫反應(yīng)可能僅主要針對(duì)靶標(biāo)血清型中的某些。然后需要多次疫苗接種以嘗試實(shí)現(xiàn)對(duì)所有血清型的反應(yīng)；然而，在登革病毒的情況下，該方式可能有危險(xiǎn)，因?yàn)橄蚴茉囌咧貜?fù)給予預(yù)先存在的抗體可導(dǎo)致更嚴(yán)重的并發(fā)癥和/或疾病，例如登革出血熱。

本發(fā)明的又一方面為治療登革病毒感染的方法，其包括單獨(dú)或以任何組合或任何組合順序給予所述受試者有效量的本發(fā)明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、登革病毒肽、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp、嵌合黃病毒顆粒、核酸分子、載體、細(xì)胞和/或免疫原性組合物。

本發(fā)明的又一方面為預(yù)防登革病毒感染的方法，其包括單獨(dú)或以任何組合或任何組合順序給予所述受試者有效量的本發(fā)明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、登革病毒肽、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp、嵌合黃病毒顆粒、核酸分子、載體、細(xì)胞和/或免疫原性組合物。

本發(fā)明的又一方面為保護(hù)受試者免受登革病毒感染影響的方法，其包括單獨(dú)或以任何組合或任何組合順序給予所述受試者有效量的本發(fā)明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、登革病毒肽、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp、嵌合黃病毒顆粒、核酸分子、載體、細(xì)胞和/或免疫原性組合物。

對(duì)于“保護(hù)受試者免受登革病毒感染的影響”，其意指所述受試者不會(huì)形成由登革病毒感染導(dǎo)致的疾病或病癥，或者即便所述受試者的確形成由登革病毒感染導(dǎo)致的疾病或病癥，與未給予本發(fā)明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、登革病毒肽、嵌合登革病毒顆粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黃病毒vlp、嵌合黃病毒顆粒、核酸分子、載體、細(xì)胞和/或免疫原性組合物的受試者在登革病毒感染時(shí)將經(jīng)歷的相比，所述疾病或病癥在所述受試者中嚴(yán)重性更小和/或癥狀減少和/或更不嚴(yán)重。

存在登革病毒的四種血清型(denv-1、denv-2、denv-3和denv-4)。在各血清型中均存在許多不同的毒株或基因型。本發(fā)明的登革病毒表位和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于任何登革病毒，包括目前已知或者后續(xù)鑒定的所有血清型、毒株和基因型。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述登革病毒為unc1017株(den1)、西太平洋74株(den1)、s16803株(den2)、unc2005株(den2)、s16803株(den2)、unc3001株(den3)、unc3043(來(lái)自菲律賓的den3059.ap-2株，1984年)、unc3009株(den3，d2863，斯里蘭卡1989年)、unc3066(den3，1977年來(lái)自波多黎各的1342株)、ch53489株(den3)、unc4019株(den4)或tvp-360(den4)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，登革病毒多肽(例如所述e蛋白)的“免疫原活性片段”包括下列氨基酸、基本上由下列氨基酸組成或者由下列氨基酸組成：至少約6、8、10、12、15、20、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450個(gè)或更多個(gè)氨基酸，任選連續(xù)的氨基酸，和/或少于約495、475、450、425、400、350、300、250、200、150、100、75或50個(gè)氨基酸，任選連續(xù)的氨基酸，其包括前述氨基酸的任何組合，只要下限小于上限便可，且所述“免疫原活性的片段”在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)(例如與所述天然抗原反應(yīng)的igg和/或iga)，任選保護(hù)性免疫反應(yīng)，以及誘導(dǎo)與本文所述的四價(jià)登革病毒表位特異性結(jié)合的抗體(例如中和抗體)的產(chǎn)生。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“表位”意指氨基酸序列中的氨基酸殘基的特定組合，在以適當(dāng)?shù)臉?gòu)象存在時(shí)，其給抗體(例如b細(xì)胞表位)或t細(xì)胞受體(例如t細(xì)胞表位)提供反應(yīng)部位。

可使用本領(lǐng)域已知的許多表位作圖技術(shù)來(lái)鑒定包含b細(xì)胞表位的給定多肽的部分(參見(jiàn)例如分子生物學(xué)方法中的表位作圖方案(epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology)，第66卷，glenne.morris編輯，1996，humanapress，totowa，n.j.)。例如，可通過(guò)例如在固體支持物上同時(shí)合成大量的肽(所述肽對(duì)應(yīng)于所述蛋白質(zhì)分子的部分)并在所述肽仍與所述支持物結(jié)合的同時(shí)使所述肽與抗體反應(yīng)，來(lái)鑒定線性表位。所述技術(shù)為本領(lǐng)域已知的且描述于例如美國(guó)專利號(hào)4,708,871；geysen等，(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:3998-4002；geysen等(1986)molec.immunol.23:709-715。

類似地，諸如通過(guò)如x射線晶體學(xué)和2維核磁共振確定氨基酸的空間構(gòu)象，可容易地鑒定構(gòu)象表位。使用標(biāo)準(zhǔn)抗原性及親水性圖，例如使用如可獲自牛津大學(xué)分子組的omiga版本1.0軟件程序計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)抗原性及親水性圖，亦可鑒定蛋白質(zhì)的抗原區(qū)。該計(jì)算機(jī)程序使用hopp/woods法(hopp等，proc.natl.acad.sciusa(1981)78:3824-3828)用于確定抗原性概況和kyte-doolittle技術(shù)(kyte等，j.mol.biol.(1982)157:105-132)用于親水性圖。

通常，涉及刺激受試者免疫系統(tǒng)的細(xì)胞臂的t細(xì)胞表位為約8-25個(gè)氨基酸的短肽。鑒定t細(xì)胞表位的常見(jiàn)方式為使用重疊合成肽，并使用例如酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(elispot)分析這些肽的集合或單個(gè)肽，其被來(lái)自對(duì)目標(biāo)抗原有免疫性的動(dòng)物的t細(xì)胞識(shí)別。這些重疊肽亦可用于諸如刺激細(xì)胞因子釋放或分泌的其他試驗(yàn)中，或者通過(guò)構(gòu)建包含所述肽的主要組織相容性(mhc)四聚體來(lái)評(píng)價(jià)。亦可基于其響應(yīng)通過(guò)來(lái)自目標(biāo)抗原的不同片段的刺激而刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力來(lái)鑒定所述免疫原活性片段。

可實(shí)施本發(fā)明以用于預(yù)防、治療和/或診斷目的。此外，可實(shí)施本發(fā)明以產(chǎn)生用于任何目的的抗體，例如診斷或研究目的，或者用于通過(guò)轉(zhuǎn)移給另一受試者進(jìn)行被動(dòng)免疫。

本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的一種或多種組合物的試劑盒。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)充分理解的是，本發(fā)明的試劑盒可包含一個(gè)或多個(gè)容器和/或貯器以容納所述試劑盒的試劑(例如抗體、抗原、核酸)，連同適當(dāng)?shù)木彌_液和/或稀釋劑和/或其他溶液以及用于使用所述試劑盒的說(shuō)明書，如在本領(lǐng)域應(yīng)是眾所周知的。所述試劑盒可進(jìn)一步包含佐劑和/或其他免疫刺激劑或免疫調(diào)節(jié)劑，如在本領(lǐng)域中為眾所周知的。

本發(fā)明的組合物和試劑盒亦可包含其他的醫(yī)學(xué)試劑、藥學(xué)試劑、載體、稀釋劑、免疫刺激細(xì)胞因子等。制備所述劑型的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言為已知的，或者將是顯而易見(jiàn)的。

給予受試者可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何途徑進(jìn)行。作為非限制性實(shí)例，所述給予途徑可以是經(jīng)吸入(例如口和/或鼻吸入)、經(jīng)口、頰(例如舌下)、直腸、陰道、局部(包括給予氣道)、眼內(nèi)、透皮、經(jīng)胃腸外(例如肌內(nèi)[例如給予骨骼肌]、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等)、皮下(包括給予足墊)、真皮內(nèi)、胸膜內(nèi)、腦內(nèi)和/或鞘內(nèi)途徑。

本發(fā)明的表位、多肽、vlp和病毒載體可以其本身遞送或通過(guò)遞送編碼所述表位、多肽、vlp和病毒載體的核酸(例如dna)來(lái)遞送。

可將諸如免疫調(diào)節(jié)趨化因子和細(xì)胞因子(優(yōu)選ctl誘導(dǎo)細(xì)胞因子)等免疫調(diào)節(jié)化合物同時(shí)給予受試者。

細(xì)胞因子可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法給予。可將外源細(xì)胞因子給予所述受試者，或者使用適當(dāng)?shù)妮d體將編碼細(xì)胞因子的核酸遞送給所述受試者，以及給予體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。在具體的實(shí)施方案中，病毒佐劑表達(dá)所述細(xì)胞因子。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可給予本發(fā)明的組合物的多次劑量(例如兩次、三次或更多次)而不具有可檢測(cè)的致病性(例如登革休克綜合征/登革出血熱)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多價(jià)疫苗不會(huì)導(dǎo)致免疫干擾，例如誘導(dǎo)了針對(duì)存在的所有抗原的均衡免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述均衡反應(yīng)導(dǎo)致針對(duì)denv-1、denv-2、denv-3和denv-4的保護(hù)性免疫。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可將所述多價(jià)疫苗給予已存在抗登革熱母體抗體的受試者。

應(yīng)理解的是，本發(fā)明可以不同的形式實(shí)施，且不應(yīng)理解為受限于本文所述的實(shí)施方案。相反，提供這些實(shí)施方案以使本公開(kāi)內(nèi)容將是充分且完整的，并向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分表達(dá)本發(fā)明的范圍。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。本文中用于本發(fā)明的描述的術(shù)語(yǔ)，僅以描述具體實(shí)施方案為目的，且并非意圖其為本發(fā)明的限制。

本文使用的不定冠詞或定冠詞"a"、"an"或"the"可意指一個(gè)或多于一個(gè)。例如“a”細(xì)胞可意指單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。

本文使用的“和/或”是指且包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)列舉項(xiàng)目的任何及所有可能的組合，以及當(dāng)以擇一方式理解時(shí)(“或”)，是指不含所述組合。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”，當(dāng)涉及諸如劑量的量(例如脂肪酸的量)等可測(cè)量值時(shí)，意指包括規(guī)定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%乃至±0.1%的變差。

本文使用的連接詞“基本上由……組成”意指權(quán)利要求的范圍要理解為包括在所述權(quán)利要求中記載的規(guī)定物質(zhì)或步驟，“以及并未實(shí)質(zhì)上影響要求保護(hù)的發(fā)明的基本特征和新特征的物質(zhì)或步驟”。參見(jiàn)inreherz，537f.2d549，551-52，190u.s.p.q.461，463(ccpa1976)(在原文中強(qiáng)調(diào))；亦參見(jiàn)mpep§2111.03。因此，當(dāng)用于本發(fā)明的權(quán)利要求中時(shí)，不意圖將術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”理解成等同于“包括”。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”包括rna和dna二者，包括cdna、基因組dna、合成的(例如化學(xué)合成的)dna以及rna和dna的嵌合體。所述核酸可以是雙鏈的或單鏈的。所述核酸可使用核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成。所述核苷酸可用于例如制備改變了堿基配對(duì)能力或增加了核酸酶抗性的核酸。

除非另外指明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”包括肽和蛋白質(zhì)(包括融合蛋白)二者。

“融合蛋白”為在以下情況下產(chǎn)生多肽：未發(fā)現(xiàn)自然融合在一起的編碼兩種(或更多種)不同多肽的兩個(gè)異源核苷酸序列或其片段以正確的翻譯可讀框被融合在一起。

“重組”核酸、多核苷酸或核苷酸序列為通過(guò)基因工程技術(shù)產(chǎn)生的核酸、多核苷酸或核苷酸序列。

“重組”多肽產(chǎn)生自重組核酸、多肽或核苷酸序列。

本文使用的“分離的”多核苷酸(例如“分離的核酸”或“分離的核苷酸序列”)意指與天然存在的生物或病毒的至少某些其他組分至少部分分離的多核苷酸，例如通常發(fā)現(xiàn)與所述多核苷酸結(jié)合的細(xì)胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或者其他多肽或核酸。任選但并非必要的是，與起始材料相比，所述“分離的”多核苷酸以更大的濃度存在(例如為富集的)(例如至少約兩倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一萬(wàn)倍或更大濃度)。在代表性實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸為至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%純化的或更純。

“分離的”多肽意指與天然存在的生物或病毒的至少某些其他組分至少部分分離的多肽，例如通常發(fā)現(xiàn)與所述多肽結(jié)合的細(xì)胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或者其他多肽或核酸。任選但并非必要的是，與起始材料相比，所述“分離的”多肽以更大的濃度存在(例如為富集的)(例如至少約兩倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一萬(wàn)倍或更大濃度)。在代表性實(shí)施方案中，所述分離的多肽為至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%純化的或更純。

此外，“分離的”細(xì)胞為通常與其天然結(jié)合的其他組分部分地或完全地分離的細(xì)胞。例如，分離的細(xì)胞可以是培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或藥學(xué)上可接受的載體中的細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“免疫原”和“抗原”在本文中可交換使用，且意指細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)可涉及的任何化合物(包括多肽)。在具體的實(shí)施方案中，免疫原或抗原可誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒感染影響的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

本文使用的“有效量”是指足以產(chǎn)生所需效果的本發(fā)明的載體、核酸、表位、多肽、細(xì)胞、顆粒、vlp、組合物或制劑的量，所述效果可以是治療效果和/或有益效果。所述有效量將隨著受試者的年齡、總體狀況、待治療病況的嚴(yán)重性、給予的具體藥物、治療的持續(xù)時(shí)間、任何共存治療的性質(zhì)、使用的藥學(xué)上可接受的載體以及在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)和專業(yè)知識(shí)內(nèi)的類似因素而不同。適當(dāng)時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過(guò)參考相關(guān)文本及文獻(xiàn)和/或通過(guò)使用例行試驗(yàn)來(lái)確定任何個(gè)案中的“有效量”。

除非另外指明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)“致免疫量”或“有效免疫劑量”意指足以在治療的受試者中誘導(dǎo)比未免疫受試者的固有免疫更強(qiáng)的免疫反應(yīng)(其可任選為保護(hù)性反應(yīng))的量或劑量。任何具體情況下的致免疫量或有效免疫劑量，通?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法確定。

術(shù)語(yǔ)“疫苗”、“疫苗接種”和“免疫接種”在本領(lǐng)域中為充分理解的，且在本文中可交換使用。例如，術(shù)語(yǔ)疫苗、疫苗接種或免疫接種可理解為增加受試者對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)(例如通過(guò)提供主動(dòng)免疫反應(yīng))并從而增強(qiáng)其抵抗、戰(zhàn)勝感染和/或從感染恢復(fù)的能力(即保護(hù)性免疫反應(yīng))的過(guò)程或組合物。

對(duì)于術(shù)語(yǔ)“治療”("treat"、"treating"或"treatmentof")(及其語(yǔ)法變化)，其意指受試者病況的嚴(yán)重性得到減輕、至少部分改進(jìn)或改善和/或?qū)崿F(xiàn)在至少一項(xiàng)臨床癥狀上的某種緩解、減輕或減少和/或延緩疾病或病癥的進(jìn)展。在代表性實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“治療”(及其語(yǔ)法變化)是指在存在或不存在其他臨床疾病體征的情況下，病毒血癥嚴(yán)重性的減輕和/或病毒血癥進(jìn)展的延緩。

本文使用的“治療有效的”量為足以治療(如本文所定義的)所述受試者的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，所述治療效果無(wú)需是完全的或治愈的，只要給所述受試者提供某些益處便可。

術(shù)語(yǔ)“防止”、“預(yù)防”或“……的預(yù)防”(及其語(yǔ)法變化)是指在受試者中預(yù)防和/或延遲疾病、病癥和/或臨床癥狀的發(fā)生和/或進(jìn)展，和/或相對(duì)于未使用本發(fā)明的方法所發(fā)生的情況，減輕所述疾病、病癥和/或臨床癥狀的發(fā)生和/或進(jìn)展的嚴(yán)重性。在代表性實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“防止”、“預(yù)防”或“……的預(yù)防”(及其語(yǔ)法變化)是指在存在或不存在其他臨床疾病體征的情況下，在受試者中預(yù)防和/或延遲病毒血癥的發(fā)生和/或進(jìn)展。所述預(yù)防可以是完全的，例如完全不存在所述疾病、病癥和/或臨床癥狀。所述預(yù)防亦可以是部分的，例如與未使用本發(fā)明所發(fā)生的情況相比，所述疾病、病癥和/或臨床癥狀在所述受試者中更少發(fā)生和/或發(fā)生的嚴(yán)重性和/或進(jìn)展更小。

本文使用的“預(yù)防有效的”量為足以在所述受試者中預(yù)防(如本文所定義的)所述疾病、病癥和/或臨床癥狀的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，預(yù)防的水平無(wú)需為完全的，只要向所述受試者提供某些益處便可。

通過(guò)本發(fā)明的方法治療和/或預(yù)防登革病毒感染的功效，可通過(guò)檢測(cè)臨床改善來(lái)確定，如通過(guò)在所述受試者的癥狀和/或臨床參數(shù)(例如病毒血癥)上的改變來(lái)指示的臨床改善，如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。

除非另外指明，否則術(shù)語(yǔ)“保護(hù)”、“保護(hù)的”、“防護(hù)”和“保護(hù)性的”(及其語(yǔ)法變化)包括在受試者中預(yù)防和治療登革病毒感染的方法二者，而不論其針對(duì)登革病毒的一種或多種毒株、基因型或血清型。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“保護(hù)性”免疫反應(yīng)或“保護(hù)性”免疫是指給所述受試者提供某些益處的免疫反應(yīng)，所述益處在于其預(yù)防或減少疾病的發(fā)生率和/或嚴(yán)重性和/或持續(xù)時(shí)間或感染的任何其他表現(xiàn)。例如，在代表性實(shí)施方案中，保護(hù)性免疫反應(yīng)或保護(hù)性免疫導(dǎo)致減少的病毒血癥，而不論是否伴隨臨床疾病?；蛘?，保護(hù)性免疫反應(yīng)或保護(hù)性免疫可用于存在疾病的治療性治療。

“主動(dòng)免疫反應(yīng)”或“主動(dòng)免疫”特征在于“在遇到免疫原之后宿主組織和細(xì)胞的參與。其包括淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織中免疫活性細(xì)胞的分化和增殖，其導(dǎo)致抗體合成或細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)性的發(fā)展，或二者?！県erbertb.herscowitz，免疫生理學(xué)：抗體形成中的細(xì)胞功能和細(xì)胞相互作用(immunophysiology:cellfunctionandcellularinteractionsinantibodyformation)，immunology:basicprocesses117(josepha.bellanti編輯，1985)?；蛘咭?guī)定的是，主動(dòng)免疫反應(yīng)是在經(jīng)由感染或經(jīng)由疫苗接種暴露給免疫原之后由宿主引發(fā)?？蓪⒅鲃?dòng)免疫與被動(dòng)免疫進(jìn)行對(duì)比，所述被動(dòng)免疫通過(guò)“將預(yù)先形成的物質(zhì)(抗體、轉(zhuǎn)移因子、胸腺移植物、白介素-2)從主動(dòng)免疫的宿主中轉(zhuǎn)移給未免疫宿主”來(lái)獲得。同上。

本發(fā)明的“受試者”包括易受登革病毒感染的任何動(dòng)物。所述受試者一般為哺乳動(dòng)物受試者(例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、靈長(zhǎng)類等)、馴養(yǎng)或商品動(dòng)物(例如奶牛、馬、山羊、驢、綿羊等)或者家畜(例如貓、狗、雪貂等)。在具體實(shí)施方案中，所述受試者為靈長(zhǎng)類受試者、非人靈長(zhǎng)類受試者(例如黑猩猩、狒狒、猴、大猩猩等)或者人。本發(fā)明的受試者可以是已知或認(rèn)為其處于登革病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。或者，根據(jù)本發(fā)明的受試者亦可包括未預(yù)先知曉或未疑似受登革病毒感染或者并非需要針對(duì)登革病毒感染的治療的受試者。

可對(duì)受試者進(jìn)行處理以用于任何目的，例如用于引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)或者用于在所述受試者中引發(fā)抗體的產(chǎn)生，可將所述抗體收集并用于諸如研究或診斷目的等其他目的，或者用于給予其他受試者以產(chǎn)生其中的被動(dòng)免疫等。

受試者包括任何年齡的雄性和/或雌性，包括新生兒、幼年、成年和老年受試者。對(duì)于人受試者，在代表性實(shí)施方案中，所述受試者可以是嬰兒(例如小于約12個(gè)月、10個(gè)月、9個(gè)月、8個(gè)月、7個(gè)月、6個(gè)月或更小)、幼童(例如至少約12、18或24個(gè)月和/或小于約36、30或24個(gè)月)或兒童(例如至少約1、2、3、4或5歲和/或小于約14、12、10、8、7、6、5或4歲)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述受試者為從約0至3、4、5、6、9、12、15、18、24、30、36、48或60月齡、從約3至6、9、12、15、18、24、30、36、48或60月齡、從約6至9、12、15、18、24、30、36、48或60月齡、從約9至12、15、18、24、30、36、48或60月齡、從約12至18、24、36、48或60月齡、從約18至24、30、36、48或60月齡或者從約24至30、36、48或60月齡的受試人。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述受試者具有針對(duì)登革病毒的母體抗體。

“需要本發(fā)明的方法的受試者”可以是已知或疑似受登革病毒感染或者處于受登革病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。

亦提供包含本發(fā)明的登革病毒表位、多肽、嵌合黃病毒vlp或嵌合黃病毒顆粒、核酸、載體、細(xì)胞或組合物及藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑(例如免疫原性制劑)，并且可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行配制，用于在藥物載體中給予。參見(jiàn)例如remington，藥學(xué)科學(xué)及實(shí)踐(remington、thescienceandpracticeofpharmacy)(最新版)。在制備根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物中，除其他物質(zhì)之外，通常將本發(fā)明的組合物與藥學(xué)上可接受的載體混合。對(duì)于“藥學(xué)上可接受的載體”，意指與所述藥物組合物中的其他成分相容且對(duì)所述受試者無(wú)害或無(wú)毒的載體。所述載體可以是固體或液體，或二者，且優(yōu)選與本發(fā)明的組合物一起配制成單位劑量制劑，例如片劑，其可占所述組合物重量的約0.01或0.5%-約95%或99%。所述藥物組合物通過(guò)任何眾所周知的藥學(xué)技術(shù)制備，包括但不限于混合所述組分，任選包含一種或多種配合劑。在某些實(shí)施方案中，所述藥學(xué)上可接受的載體為無(wú)菌的，且根據(jù)用于包含所述載體的藥物組合物的管理指導(dǎo)方針，其被視為適于給予受試人。

此外，根據(jù)本發(fā)明的組合物的“藥學(xué)上可接受的”組分，例如鹽、載體、賦形劑或稀釋劑，為這樣的組分，其(i)與所述組合物的其他成分相容，因?yàn)槠淇膳c本發(fā)明的組合物組合，而不會(huì)致使所述組合物不適于其預(yù)期目的，和(ii)適于本文所提供的受試者使用而沒(méi)有過(guò)度的不利副作用(例如毒性、刺激性和變應(yīng)性反應(yīng))。當(dāng)其風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)所述組合物提供的益處時(shí)，副作用為“過(guò)度的”。藥學(xué)上可接受的組分的非限制性實(shí)例包括任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸緩沖鹽水溶液、水、諸如油/水乳劑等乳劑、微乳劑和各種類型的濕潤(rùn)劑。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含一種或多于一種佐劑。本發(fā)明的佐劑可以是氨基酸序列的形式，和/或編碼佐劑的核酸序列的形式。當(dāng)為核酸形式時(shí)，所述佐劑可以是編碼本發(fā)明的多肽或片段或表位的核酸的組分和/或包含編碼本發(fā)明的多肽或片段或表位的組合物的單獨(dú)組分。根據(jù)本發(fā)明，所述佐劑亦可以是作為佐劑起作用的肽、蛋白質(zhì)片段或完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列，和/或所述佐劑可以是編碼作為佐劑起作用的肽、蛋白質(zhì)片段或完整蛋白質(zhì)的核酸。本文使用的“佐劑”描述了這樣的物質(zhì)，其可以是能夠與本發(fā)明的組合物組合以在受試者中增強(qiáng)、改進(jìn)或以其他方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的任何免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。

在另外的實(shí)施方案中，所述佐劑可以是但不限于免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(包括但不限于gm/csf、白介素-2、白介素-12、干擾素-γ、白介素-4、腫瘤壞死因子-α、白介素-1、血細(xì)胞生成因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子)、由含5%(重量/體積)角鯊烯(dasf，parsippany，n.j.)、2.5%普郎尼克l121聚合物(aldrichchemical，milwaukee)和0.2%聚山梨酯(吐溫80，sigma)的磷酸緩沖鹽水組成的syntex佐劑制劑1(saf-1)。合適的佐劑亦可包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)、磷酸鋁或algannmulin，但亦可以是鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可以是酰化酪氨酸或?；?、陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖或聚膦腈的不溶性混懸劑。

其他佐劑為本領(lǐng)域眾所周知的，且包括但不限于mf59、lt-k63、lt-r72(pal等，vaccine24(6):766-75(2005))、qs-21、弗氏佐劑(完全和不完全)、氫氧化鋁、n-乙酰基-胞壁?；?l-蘇氨?；?d-異谷酰胺(thr-mdp)、n-乙?；?去甲胞壁酰基-l-丙氨?；?d-異谷酰胺(cgp11637，稱為nor-mdp)、n-乙酰胞壁?；?l-丙氨酰基-d-異谷酰胺基-l-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基膦酰氧基)-乙胺(cgp19835a，稱為mtp-pe)和ribi，其在2%角鯊烯/吐溫80乳劑中含有從細(xì)菌中提取的三個(gè)組分，單磷酰脂質(zhì)a、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(mpl+tdm+cws)。

另外的佐劑可包括例如單磷酰脂質(zhì)a(優(yōu)選3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)a，3d-mpl)連同鋁鹽的組合。強(qiáng)化的佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)a和皂苷衍生物的組合，特別是如在pct公布號(hào)wo94/00153中所公開(kāi)的qs21和3d-mpl的組合，或者如在pct公布號(hào)wo96/33739中所公開(kāi)的其中使用膽固醇淬滅qs21的更不致反應(yīng)的組合物。在水包油乳劑中包含qs213d-mpl&生育酚的特別有效的佐劑制劑，描述于pct公布號(hào)wo95/17210。此外，本發(fā)明的核酸組合物可通過(guò)包含編碼所述抗原的核苷酸序列和提供佐劑功能的核苷酸序列(例如cpg序列)來(lái)包含佐劑。所述cpg序列或基序，為本領(lǐng)域眾所周知的。

用于與本發(fā)明一起使用的佐劑，例如免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可在給予受試者本發(fā)明的組合物之前給予、同時(shí)給予和/或在給予本發(fā)明的組合物之前和/或之后的數(shù)小時(shí)內(nèi)、幾小時(shí)內(nèi)、和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天內(nèi)給予。

此外，諸如免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等佐劑的任何組合，可在給予本發(fā)明的免疫原性組合物之前、之后和/或與之同時(shí)共同給予所述受試者。例如，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的組合可由兩種或更多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子組成，例如gm/csf、白介素-2、白介素-12、干擾素-γ、白介素-4、腫瘤壞死因子-α、白介素-1、血細(xì)胞生成因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子。佐劑或佐劑組合的效果，可使用如本文所述及本領(lǐng)域所已知的標(biāo)準(zhǔn)程序，在存在和不存在所述佐劑或佐劑組合的情況下，通過(guò)測(cè)定響應(yīng)給予受試者本發(fā)明的組合物而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)來(lái)確定。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述佐劑包括如描述于例如美國(guó)專利號(hào)7,862,829的甲病毒屬佐劑。

可在數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年的時(shí)程內(nèi)進(jìn)一步給予加強(qiáng)劑量。在慢性感染中，起始高劑量接著加強(qiáng)劑量可以是有利的。

本發(fā)明的藥物制劑可任選包含其他醫(yī)學(xué)試劑、藥學(xué)試劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、載體、稀釋劑、鹽、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

對(duì)于注射，所述載體通常將是液體。對(duì)于其他給予方法，所述載體可以是固體或液體。對(duì)于吸入給予，所述載體將是可呼吸的，且通常呈固體或液體微粒形式。

根據(jù)已知技術(shù)，可對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行配制以在藥物載體中給予。參見(jiàn)例如remington，藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐(remington、thescienceandpracticeofpharmacy)(第9版，1995)。在制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，通常將所述vlp與除其他之外的可接受的載體混合。所述載體可以是固體或液體、或二者，且任選與所述化合物一起配制成單位劑量制劑，例如片劑?？墒褂酶鞣N藥學(xué)上可接受的水性載體，例如水、緩沖的水、0.9%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸、無(wú)熱原水、無(wú)熱原磷酸緩沖鹽水溶液、抑菌水或cremophorel[r](basf，parsippany、n.j.)等。這些組合物可通過(guò)常規(guī)技術(shù)滅菌。本發(fā)明的制劑可通過(guò)任何眾所周知的藥學(xué)技術(shù)制備。

所述藥物制劑可進(jìn)行包裝以直接使用，或者進(jìn)行凍干，所述凍干制劑通常在給予之前與無(wú)菌水溶液組合。可將所述組合物進(jìn)一步包裝到單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶。

根據(jù)常規(guī)藥學(xué)技術(shù)，可對(duì)所述藥物制劑進(jìn)行配制以用于通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法給予。例如，可對(duì)所述組合物進(jìn)行配制以鼻內(nèi)給予、經(jīng)吸入(例如口腔吸入)給予、經(jīng)口給予、經(jīng)頰(例如舌下)給予、直腸給予、陰道給予、局部給予、鞘內(nèi)給予、眼內(nèi)給予、透皮給予、經(jīng)胃腸外給予(例如肌內(nèi)[例如骨骼肌]、靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、胸膜內(nèi)、腦內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)給予)或局部給予(例如給予皮膚和黏膜表面二者，包括氣道表面)。

對(duì)于鼻內(nèi)或吸入給予，可將所述藥物制劑配制成氣霧劑(該術(shù)語(yǔ)包括液體和干粉氣霧劑二者)。例如，所述藥物制劑可連同表面活性劑和推進(jìn)劑以細(xì)碎形式提供。所述組合物的常見(jiàn)百分比為0.01-20%重量，優(yōu)選1-10%。所述表面活性劑一般為無(wú)毒的且溶于所述推進(jìn)劑。代表所述物質(zhì)的有含6-22個(gè)碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)酐的酯或偏酯?？墒褂没旌硝?，例如混合或天然的甘油酯。所述表面活性劑可組成所述化合物重量的0.1-20%，優(yōu)選0.25-5%。所述組合物的剩余物質(zhì)一般為推進(jìn)劑。需要時(shí)，載體亦可包含在內(nèi)，如使用卵磷脂用于鼻內(nèi)遞送。液體顆粒的氣霧劑可通過(guò)任何合適的方式產(chǎn)生，例如使用壓力驅(qū)動(dòng)的氣霧劑霧化器或者超聲霧化器，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,501,729。固體顆粒的氣霧劑同樣可通過(guò)制藥領(lǐng)域已知的技術(shù)，使用任何固體微粒藥劑氣霧發(fā)生器來(lái)產(chǎn)生。鼻內(nèi)給予亦可通過(guò)滴加給予鼻面進(jìn)行。

注射用制劑可以常規(guī)形式制備，任選作為液體溶液或混懸劑、適于在注射之前在液體中溶解或懸浮的固體形式，或者作為乳劑?；蛘撸梢跃植糠绞蕉皇侨矸绞浇o予所述藥物制劑，例如以長(zhǎng)效或持續(xù)釋放制劑的方式。

即用的注射溶液和混懸劑可制備自前文所述種類的無(wú)菌粉劑、顆粒劑和片劑。例如，可提供在密封容器中的單位劑型的本發(fā)明的注射用穩(wěn)定無(wú)菌制劑。所述制劑可以凍干物的形式提供，其可使用合適的藥學(xué)上可接受的載體復(fù)溶以形成適于注射到受試者中的液體組合物。所述單位劑型可以是約1μg-約10克的所述制劑。當(dāng)所述制劑基本上不溶于水時(shí)，可將足以在水性載體中乳化所述制劑的量的足量的乳化劑包含在內(nèi)，所述乳化劑為藥學(xué)上可接受的。磷脂酰膽堿為一種所述有用的乳化劑。

適于口服給予的藥物制劑可以獨(dú)立單位存在，例如膠囊劑、扁囊劑、錠劑或片劑，作為粉劑或顆粒劑；作為水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑；或者作為水包油或油包水乳劑。口服遞送可通過(guò)將本發(fā)明的化合物與能夠承受動(dòng)物腸道中的消化酶降解的載體復(fù)合來(lái)進(jìn)行。所述載體的實(shí)例包括塑料膠囊或片劑，如本領(lǐng)域所已知的。所述制劑通過(guò)任何合適的藥學(xué)方法制備，其包括使所述蛋白質(zhì)與合適載體(其可含有如上所述的一種或多種配合劑)開(kāi)始結(jié)合的步驟。一般而言，通過(guò)將所述化合物與液體或細(xì)碎的固體載體或二者均勻且充分地混合，并隨后在需要時(shí)對(duì)所得混合物塑型來(lái)制備所述藥物制劑。例如，任選使用一種或多種配合劑，通過(guò)壓制粉劑或顆粒劑并塑型來(lái)制備片劑。壓制片劑通過(guò)在合適機(jī)器中壓制呈自由流動(dòng)形式的制劑來(lái)制備，例如粉劑或顆粒劑，任選與粘合劑、滑潤(rùn)劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑混合。模制片劑通過(guò)在合適機(jī)器中對(duì)使用惰性液體粘合劑濕潤(rùn)的粉狀蛋白質(zhì)塑型來(lái)制備。

適于經(jīng)頰(舌下)給予的藥物制劑包括將所述化合物包含在矯味基底(通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)中的錠劑；和諸如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠等惰性基底中的軟錠劑。

適于胃腸外給予的藥物制劑可包括無(wú)菌水性和非水性注射液，所述制劑優(yōu)選與預(yù)期受者的血液等滲。這些制劑可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，其致使所述組合物與預(yù)期受者的血液等滲。水性和非水性無(wú)菌混懸劑、溶液劑和乳劑可含有助懸劑和增稠劑。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油等植物油以及諸如油酸乙酯等注射用有機(jī)酯。水性載體包括水、醇溶液/水溶液、乳劑或混懸劑，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外溶媒包括氯化鈉溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)溶媒包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物(例如基于林格右旋糖的電解質(zhì)補(bǔ)充物)等。亦可存在防腐劑及其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。

適于直腸給予的藥物制劑任選作為單位劑量栓劑存在。這些制劑可通過(guò)將所述活性藥物與一種或多種常見(jiàn)固體載體(例如可可脂)混合并隨后對(duì)所得混合物塑型來(lái)制備。

適于局部施用給皮膚的藥物制劑優(yōu)選采用軟膏劑、乳膏劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑的形式?？墒褂玫妮d體包括但不限于石油凝膠、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮增強(qiáng)劑及其兩種或更多種的組合。在一些實(shí)施方案中，例如局部遞送可通過(guò)將本發(fā)明的藥物制劑與能夠進(jìn)入皮膚的親脂性試劑(例如dmso)混合來(lái)進(jìn)行。

適于透皮給予的藥物制劑可以是適于與所述受試者的表皮長(zhǎng)時(shí)間保持緊密接觸的獨(dú)立貼片(patch)的形式。適于透皮給予的制劑亦可通過(guò)離子電滲療法遞送(參見(jiàn)例如pharmaceuticalresearch3:318(1986))并通常采用所述化合物的緩沖水溶液的形式。合適的制劑可包含檸檬酸鹽或bis/tris緩沖液(ph6)或者乙醇/水，并且可含有0.1-0.2m有效成分。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒顆粒的劑量可以是約10³-約10⁸空斑形成單位/空斑形成單位(pfu/ffu)的范圍。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的vlp的劑量可以是約500微克-約500毫克的范圍。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的劑量可以是約10⁰-約10⁴微生物+/-佐劑的范圍。

此外，所述組合物可配制成脂質(zhì)體制劑。使用的脂質(zhì)層可以是任何常見(jiàn)組合物的脂質(zhì)層，且可任選含膽固醇或者可不含膽固醇。例如通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)超聲處理和勻漿技術(shù)，可在大小上減小產(chǎn)生的脂質(zhì)體。

可將所述脂質(zhì)體制劑凍干以產(chǎn)生凍干劑，其可使用藥學(xué)上可接受的載體(例如水)復(fù)溶，以重新產(chǎn)生脂質(zhì)體混懸液。

本發(fā)明的免疫原性制劑可任選為無(wú)菌的，且可進(jìn)一步在密閉的病原體不可滲透的容器中提供。

實(shí)施例

實(shí)施例1.復(fù)合四價(jià)血清型特異性中和抗體表位在登革熱3和4之間的移植揭示多克隆中和反應(yīng)的決定子。

登革病毒(denv)為全世界范圍內(nèi)最顯著的人類蟲(chóng)媒病毒疾病，每年有超過(guò)3億例感染；然而對(duì)denv感染的人類免疫反應(yīng)的決定子很大程度上仍為未知的。因此，我們著手開(kāi)發(fā)用以表征對(duì)于人類的denv感染的抗體(ab)反應(yīng)的工具。使用反求遺傳學(xué)，我們開(kāi)發(fā)了用于4種denv血清型的感染克隆(ic)，其允許我們研究ab-病毒相互作用。一組單克隆ab(mab)的表征鑒定了denv3的強(qiáng)效的型特異性中和ab。使用結(jié)構(gòu)導(dǎo)向法，鑒定了包含導(dǎo)致逃脫中和反應(yīng)的突變的包膜(e)蛋白結(jié)構(gòu)域i/ii(edi/ii)鉸鏈區(qū)的12?區(qū)，并將其從denv4移植到denv3中(rdenv3/4)以評(píng)價(jià)該表位對(duì)人類的多克隆免疫反應(yīng)的作用。有趣的是，該rdenv3/4獲得對(duì)通過(guò)人denv4免疫血清中和的完全敏感性，但變得耐受denv3血清，表明該edi/ii鉸鏈區(qū)含有型特異性中和反應(yīng)的主要決定子。對(duì)denv4進(jìn)行所述互換移植時(shí)，未保留mab結(jié)合且在中和特性上沒(méi)有明顯變化，表明受者denv血清型中的鄰接殘基在所述病毒體表面的表位展示中起作用。盡管向denv4中添加來(lái)自denv3的5個(gè)氨基酸殘基能夠恢復(fù)mab結(jié)合和中和，但是多克隆血清中和在很大程度上仍未改變。最后，我們將包含跨越多個(gè)e二聚體的復(fù)合四價(jià)表位移入denv4中(rdenv4/3)。該denv4/3為有活性的且生長(zhǎng)至高感染滴度，以及表現(xiàn)出對(duì)denv3免疫血清的敏感性，而對(duì)denv4的中和反應(yīng)在很大程度上仍未改變。這些結(jié)果提供對(duì)型特異性中和反應(yīng)的決定子的理解，其可引導(dǎo)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)合理設(shè)計(jì)的denv疫苗平臺(tái)。

實(shí)施例2.獲得登革熱3和登革熱4二者的型特異性中和決定子的重組登革病毒4的開(kāi)發(fā)和表征

用于重組denv4生成的反求遺傳學(xué)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)

我們先前已闡述了用于產(chǎn)生重組denv3(rdenv3)的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)的生成和表征(圖1，圖a)。利用類似的技術(shù)，我們開(kāi)發(fā)了用于1989年在斯里蘭卡分離且屬于基因組i的denv4的臨床隔離群的cdna感染性克隆(ic)系統(tǒng)。為了防止在大腸桿菌(ecoli)中的細(xì)菌質(zhì)粒擴(kuò)增期間產(chǎn)生不穩(wěn)定性和毒性，將所述denv基因組亞克隆成4個(gè)不同的片段(圖1，圖a)。利用位于所述denv4基因組中的核苷酸(nt)位置3216(pflmi；識(shí)別序列：ccaaacagtgg，seqidno:7)、5482(draiii；caccaggtg)和8855(pflmi；ccagattttgg，seqidno:8)上的天然存在的ii類限制酶位點(diǎn)來(lái)裂解所述基因組cdna。此外，使用所述細(xì)菌載體中在t7啟動(dòng)子序列上游的ecorv位點(diǎn)來(lái)生成所述基因組的5’端，同時(shí)將所述載體中的bsmbi位點(diǎn)用于3’基因組末端(圖1，圖a)。在細(xì)菌擴(kuò)增含基因組cdna片段的質(zhì)粒之后，使用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化，用t4dna連接酶連接，并使用含5’帽類似物的t7rna聚合酶轉(zhuǎn)錄。然后使體外轉(zhuǎn)錄的rna電穿孔進(jìn)入vero-81或bhk-21細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)4-6天，在所述時(shí)間收集上清液，通過(guò)離心使其澄清，并傳代到c6/36(白紋伊蚊(aedesalbopictus))細(xì)胞上達(dá)另外4天。再次收集上清液且使其澄清，并進(jìn)行滴定以用作工作病毒貯液。rdenv4顯示與親代天然隔離群相同的表型特性(生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、峰值感染滴度和感染斑形態(tài)/大小)。

將型特異性中和denv3mab表位移植到denv4中

先前研究已鑒定了對(duì)denv3特異的強(qiáng)效的型特異性人單克隆抗體(hmab)(5j7)。然而，這些研究?jī)H鑒定了來(lái)自該hmab的導(dǎo)致逃脫denv3中和的單點(diǎn)突變。為了進(jìn)一步表征該hmab表位，我們?cè)噲D使用我們的新反求遺傳學(xué)平臺(tái)，將包含該表位的氨基酸(aa)殘基從denv3移植到denv4中。使用已公布和未公布的逃逸突變二者作為向?qū)В瑢霭さ鞍捉Y(jié)構(gòu)域i/ii(edi/ii)鉸鏈區(qū)的約12埃圓周在所述denv3e蛋白晶體結(jié)構(gòu)上重疊成接近抗體表位:互補(bǔ)位結(jié)合區(qū)的覆蓋面積。在denv3和denv4之間進(jìn)行aa和nt比對(duì)之后，鑒定出血清型內(nèi)變體aa并選擇將其從denv3移植到denv4中。對(duì)所述denv4ic中的nt序列進(jìn)行修飾以促使aa變化匹配denv3，并合成獲得這些變化的次基因組cdna(biobasic；amherst，ny)。如上所述生成rdenv，并回收病毒用于表型表征。為了使成功移植表位的概率達(dá)到最大，生成以下3種不同的rdenv，其各自含有序貫添加的denv3殘基并因此移植更大的理論表位覆蓋面積。這些rdenv命名為denv4m12、denv4m14和denv4m16，分別具有漸增大小的移植的denv3序列(圖1，圖b-c)。值得注意的是，denv3移植到denv4m16中，包含5j7的假定復(fù)合四價(jià)表位，且據(jù)我們所知代表首次將該性質(zhì)的表位在不同病毒之間移植。

rdenv4/3為有活性的且在體外表現(xiàn)出不同的適合度特征

在電穿孔并隨后在c6/36細(xì)胞上傳代之后，成功回收了全部3種rdenv4/3病毒(denv4m12、m14和m16)。發(fā)現(xiàn)來(lái)自c6/36細(xì)胞的峰值感染滴度(且通過(guò)對(duì)vero-81細(xì)胞的空斑形成試驗(yàn)來(lái)測(cè)定)與親代wtdenv3和denv4ic的峰值感染滴度相當(dāng)(圖2，圖a)。denv4m12和m14顯示與wtdenv3類似的峰值滴度，其均比該系統(tǒng)中wtdenv4的峰值滴度低約1log10。然而，denv4m16顯示更大衰減的生長(zhǎng)表型，峰值滴度達(dá)到約2x10⁶ffu/ml，其約為wtdenv3的1/50以及wtdenv4的1/300(圖2，圖a)。相應(yīng)地，rdenv中的感染斑大小亦小于其wt親代。denv4m12和m14空斑小于wt，但仍顯著大于denv4m16，其在vero-81細(xì)胞上形成非常小的針尖空斑(圖2，圖b)。

亦在c6/36蚊細(xì)胞上進(jìn)行類似的適合度分析。對(duì)denvm12、m14、m16以及親代wtdenv3和denv4進(jìn)行多步生長(zhǎng)曲線法(moi=0.01)(圖3，圖a)。一般而言，在早期時(shí)間點(diǎn)(<接種后96小時(shí)(hrpost-inoculation,hpi))未見(jiàn)顯著的適合度缺陷，然而在96和120hpi，denv4m14落后于wt，然后在144hpi劇增。此外，denv4m16在120hpi顯示減小的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，以及隨后具有比其他毒株低約2log10的感染滴度。在各種情況下，細(xì)胞健康可在此衰減中起作用，并因此需要進(jìn)一步研究。然而，這些數(shù)據(jù)的確指出，至少在感染的早期時(shí)間點(diǎn)，與wtdenv相比，所述rdenv未在節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)衰減。有趣的是，與vero細(xì)胞相比，denv4m12、m14和m16的感染斑(圖3，圖b)未顯示與wtdenv3或4相比或相互之間的在大小或形態(tài)上的實(shí)質(zhì)差異。這與生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)較好地相關(guān)，并表明rdenv衰減的決定子一般可能是對(duì)vero-81和/或哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異的細(xì)胞類型。這些數(shù)據(jù)指出，含有移植的denv3區(qū)的rdenv4病毒有活性且表現(xiàn)出適于進(jìn)一步表征的生長(zhǎng)特征。

rdenv4/3顯示對(duì)hmab5j7的不同程度的反應(yīng)性

進(jìn)行試驗(yàn)以確定所述3種rdenv中針對(duì)hmab5j7的表位從denv3移植到denv4中的水平。進(jìn)行elisa以評(píng)價(jià)所述denv3特異性hmab5j7與wt和rdenv病毒二者的結(jié)合。這些結(jié)果顯示5j7結(jié)合wtdenv3，但不結(jié)合denv4，其與先前數(shù)據(jù)一致。有趣的是，5j7完全不能結(jié)合denv4m12，而denv4m14和m16二者均顯示足以利于以接近或超過(guò)wtdenv3的水平結(jié)合5j7的denv3表位(圖4，圖a)。這些數(shù)據(jù)指出，不超過(guò)4種aa(在denv4m12和m14之間移植aa上的差別)負(fù)責(zé)提供5j7與denv4m14的結(jié)合。作為對(duì)這些結(jié)合研究的推論，使用5j7進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)對(duì)rdenv4組的中和的敏感性。與elisa結(jié)合數(shù)據(jù)相一致，denv4m12未能用5j7中和，而denv4m14和m16二者均在與wtdenv3相當(dāng)?shù)腶b濃度下被5j7中和(圖4b和c)。值得注意的是，這些結(jié)果在認(rèn)為是獲得對(duì)高度不同的(成熟對(duì)比不成熟)病毒顆粒的中和敏感性的2種不同細(xì)胞系(vero-81和表達(dá)dc-sign的u937)中為一致的(對(duì)于denv4m14)，表明這些rdenv的顆粒成熟狀態(tài)可能不影響5j7中和。

rdenv4/3具有對(duì)多克隆血清中和的二價(jià)敏感性

為了評(píng)價(jià)對(duì)我們的rdenv4/3組對(duì)多克隆抗體中和的敏感性，將收集自初次denv感染之后的恢復(fù)期患者的供者血清用于空斑減少試驗(yàn)(vero-81)和基于流式細(xì)胞術(shù)的試驗(yàn)(u937-dc-sign)。正如elisa結(jié)合和5j7hmab中和試驗(yàn)一樣，denv4m12在vero細(xì)胞中未顯示對(duì)通過(guò)denv3特異性血清進(jìn)行中和的增加的敏感性(圖5，圖d)。然而，denv4m14在vero細(xì)胞中顯示幾乎與wtdenv3相同且顯著高于wtdenv4的中和表型(圖5，圖a-c)，表明該rdenv4/3病毒已獲得對(duì)通過(guò)人的自然denv3感染產(chǎn)生的多克隆抗體反應(yīng)進(jìn)行中和的敏感性。此外，該表型在u937-dc-sign細(xì)胞中得到證實(shí)，并擴(kuò)展至denv4m16(圖5，圖e-g)，其中通過(guò)denv3抗血清的兩種rdenv多克隆中和均與wtdenv3相當(dāng)，而wtdenv4即便在最低血清稀釋度(1:20)的情況下亦未被中和。因denv4m16在vero細(xì)胞上較小的空斑表型所致，在該細(xì)胞類型中的中和試驗(yàn)在技術(shù)上具挑戰(zhàn)性并因此對(duì)于該rdenv的中和數(shù)據(jù)僅限于u937-dc-sign，因?yàn)榛诹魇郊?xì)胞術(shù)的試驗(yàn)即便在減毒病毒上亦可容易地進(jìn)行。總結(jié)這些數(shù)據(jù)，表明denv4m14和m16已獲得denv3型特異性中和的多克隆決定子并在中和敏感性上表現(xiàn)出二價(jià)。

除獲得對(duì)我們的rdenv對(duì)denv3多克隆中和的敏感性之外，我們亦關(guān)注確定denv4m12、m14和m16對(duì)denv4中和敏感性的保留和/或喪失。為此，使用收集自恢復(fù)期的初次denv4患者的血清在vero(圖6，圖a)和u937-dc-sign(圖6，圖b-d)中進(jìn)行中和試驗(yàn)。當(dāng)denv4m12在vero細(xì)胞中顯示略低于wtdenv4的中和滴度時(shí)(圖6，圖a)，denv4m14和m16在兩種細(xì)胞類型中均具有與wtdenv4相等或超過(guò)其的中和滴度(圖6，圖a-d)。該重大發(fā)現(xiàn)表明，用于denv3和denv4的型特異性中和的決定子為所述e糖蛋白上不起眼(discreet)的成分，且二者的決定子aa序列可進(jìn)行組合而不會(huì)彼此改變。因此，denv4m14和m16具有用作用于疫苗診斷或引導(dǎo)開(kāi)發(fā)新型和/或改良的候選疫苗二者的重要試劑的潛力。

rdenv4/3多克隆中和敏感性為特異的

為排除用所述方式改良的該組rdenv4/3病毒以非特異性方式增加其對(duì)中和的敏感性的可能性，使用收集自恢復(fù)期的人類患者的初次denv1和denv2血清進(jìn)行中和試驗(yàn)。初次denv1血清在vero細(xì)胞中完全不能中和denv4m12或m14，與高水平中和的wtdenv1形成直觀對(duì)比(圖7，圖a-b)。此外，denv2血清亦不能中和denv4m14，盡管一個(gè)試樣的確以遠(yuǎn)低于wtdenv2的水平中和denv4m12(圖7，圖c-d)。總結(jié)這些結(jié)果，表明在denv4背景下獲得的denv3中和敏感性對(duì)于denv3而言為特異的，且并非為使所述rdenv組對(duì)異型血清中和更敏感的總體結(jié)構(gòu)變化所致。

實(shí)施例3.獲得登革熱1和登革熱2的型特異性中和決定子的重組登革病毒2的開(kāi)發(fā)和表征

用于重組denv1和denv2生成的反求遺傳學(xué)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)

我們先前已闡述了用于產(chǎn)生重組denv3(rdenv3)的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)的生成和表征(圖1，圖a)。利用類似的技術(shù)，我們開(kāi)發(fā)了用于denv1西太平洋1974(westpac74)連同2007年在尼加拉瓜分離自流行病的denv2的臨床隔離群(v1210)的cdna感染性克隆(ic)系統(tǒng)。為了防止在大腸桿菌中的細(xì)菌質(zhì)粒擴(kuò)增期間產(chǎn)生不穩(wěn)定性和毒性，將兩個(gè)基因組亞克隆成4個(gè)不同片段(圖8，圖a)。利用位于所述denv1基因組中的核苷酸(nt)位置2052(pflmi；識(shí)別序列：ccaccttttgg，seqidno:9)、4215(pflmi；ccactagctgg，seqidno:10)和8563(pflmi；ccaaaccatgg，seqidno:11)的天然存在的ii類限制酶位點(diǎn)來(lái)裂解所述基因組cdna。此外，使用所述細(xì)菌載體中在t7啟動(dòng)子序列上游的ecorv位點(diǎn)來(lái)生成所述基因組的5’端，同時(shí)將所述載體中的sapi位點(diǎn)用于3’基因組末端(圖8，圖a)。對(duì)于denv2，在位置2340(片段a和載體之間的draiii；識(shí)別序列：cactgtgtg)產(chǎn)生第一次基因組裂解。為了保持基因組序列，將draiii位點(diǎn)(cacnnngtg)用于a片段的3’端，同時(shí)將alwni(cagnnnctg)位點(diǎn)用于b片段的5’端。通過(guò)使所述識(shí)別位點(diǎn)的載體區(qū)中的內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列(且并非所述denv基因組序列)產(chǎn)生突變，這兩種限制酶消化物的連接產(chǎn)物保持天然denv基因組序列而未向所述denv基因組中引入突變，以利于消化。將nt4662(draiii；cacgtggtg)和7414(draiii；cacactgtg)上另外的基因組連接處用于裂解所述基因組cdna。此外，使用所述細(xì)菌載體中在t7啟動(dòng)子序列上游的spei位點(diǎn)來(lái)生成所述基因組的5’端，同時(shí)將所述載體中的ecii位點(diǎn)用于3’基因組末端(圖8，圖a)。在細(xì)菌擴(kuò)增含基因組cdna片段的質(zhì)粒之后，使用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化，用t4dna連接酶連接，并使用含5’帽類似物的t7rna聚合酶轉(zhuǎn)錄。然后將體外轉(zhuǎn)錄的rna電穿孔進(jìn)入vero-81或bhk-21細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)4-6天，在所述時(shí)間收集上清液，通過(guò)離心使其澄清，并傳代到c6/36(白紋伊蚊)細(xì)胞上達(dá)另外4天。再次收集上清液且使其澄清，并進(jìn)行滴定以用作工作病毒貯液。rdenv1和rdenv2顯示與親代天然隔離群相同的表型特性(生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、峰值感染滴度和感染斑形態(tài)/大小)(未顯示數(shù)據(jù))。

將強(qiáng)效的中和性denv1mab表位移植到denv2ic中

先前研究已鑒定了對(duì)denv1特異的強(qiáng)效的型特異性人單克隆抗體(hmab)(1f4)。利用與denv1結(jié)合的該mab的晶體結(jié)構(gòu)，以及鑒定的接觸氨基酸(aa)殘基，我們?cè)噲D使用我們的新反求遺傳學(xué)平臺(tái)，將包含該表位的aa殘基從denv1移植到denv2中。在denv1和denv2之間進(jìn)行aa和nt比對(duì)之后，鑒定了血清型內(nèi)變體aa并選擇將其從denv1移植到denv2中。對(duì)所述denv2ic中的nt序列進(jìn)行修飾以促使aa變化匹配denv1(圖8，圖b-c)，并合成獲得這些變化的次基因組cdna(biobasic；amherst，ny)。如上所述生成rdenv，并回收病毒用于表型表征。將該rdenv命名為denv2-1f4e(圖8，圖b-c)。

rdenv2/1病毒為有活性的且在體外表現(xiàn)出不同的適合度特征

在電穿孔并隨后在c6/36細(xì)胞上傳代之后，成功回收了rdenv2/1。對(duì)來(lái)自c6/36細(xì)胞的峰值感染滴度進(jìn)行測(cè)定并發(fā)現(xiàn)其與親代wtdenv1和denv2ic在c6/36細(xì)胞上的峰值感染滴度相當(dāng)(圖9，圖a)，但是在vero細(xì)胞上高度衰減(約3log10)(圖9，圖a)。使用多步生長(zhǎng)曲線(moi=0.01)在c6/36蚊細(xì)胞上進(jìn)行適合度分析(圖9，圖c)。一般而言，在早期時(shí)間點(diǎn)(<接種后96小時(shí)(hpi))未見(jiàn)顯著的適合度缺陷。denv2-1f4e在96hpi顯示滴度下降，但這只是獨(dú)立的落后，因?yàn)樵?20hpi及之后，滴度與wtdenv1和2相當(dāng)(圖9，圖c)。細(xì)胞健康可在此獨(dú)立的衰減時(shí)間點(diǎn)起作用，并因此需要進(jìn)一步研究。然而，這些數(shù)據(jù)的確指出，與wtdenv1和2相比，denv2-1f4e未在節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)衰減。與生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)的是，與wtdenv1或2相比，denv2-1f4e(圖9d)的確但圖未顯示在感染斑的大小或形態(tài)上的實(shí)質(zhì)差異。這些數(shù)據(jù)指出，含有移植的denv1的區(qū)的rdenv2-1f4e為有活性的且表現(xiàn)出適于進(jìn)一步表征的生長(zhǎng)特征。

hmab1f4結(jié)合rdenv2/1

進(jìn)行測(cè)定以確定所述denv2-1f4e中從denv1移植到denv2中的用于hmab1f4的表位的水平。進(jìn)行elisa以評(píng)價(jià)所述denv1特異性hmab1f4與wt和rdenv病毒二者的結(jié)合。這些結(jié)果顯示1f4結(jié)合wtdenv1，但不結(jié)合denv2，其與先前數(shù)據(jù)一致。有趣的是，1f4以與wtdenv1相當(dāng)?shù)乃浇Y(jié)合denv2-1f4e(圖10，圖a)。這些數(shù)據(jù)指出，在與denv1結(jié)合的1f4的晶體結(jié)構(gòu)中鑒定的殘基，足以在denv1和2之間移植單克隆ab結(jié)合。作為對(duì)這些結(jié)合研究的推論，使用1f4和denv2-1f4e進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)。與elisa結(jié)合數(shù)據(jù)相一致，denv2-1f4e被與wtdenv1相當(dāng)?shù)腶b濃度的1f4中和(圖10，圖b-c)。值得注意的是，這些結(jié)果在2種不同的細(xì)胞系(c6/36和表達(dá)dc-sign的u937)中為一致的。

rdenv2/1具有對(duì)多克隆血清中和的二價(jià)敏感性

為了評(píng)價(jià)對(duì)我們的rdenv2/1病毒對(duì)多克隆抗體中和的敏感性，將收集自初次denv1感染之后的恢復(fù)期患者的供者血清用于基于流式細(xì)胞術(shù)(u937-dc-sign)的試驗(yàn)。因denv2-1f4e在vero細(xì)胞上較小的空斑表型所致，在此細(xì)胞類型中的中和試驗(yàn)在技術(shù)上具挑戰(zhàn)性并因此對(duì)于該rdenv的中和數(shù)據(jù)僅限于u937-dc-sign，因?yàn)榛诹魇郊?xì)胞術(shù)的試驗(yàn)即便在減毒病毒上亦可容易地進(jìn)行。正如elisa結(jié)合和1f4hmab中和試驗(yàn)一樣，denv2-1f4e在u937-dc-sign細(xì)胞中顯示與wtdenv1幾乎相同且顯著高于wtdenv2的中和表型(圖11，圖a-b)，表明該rdenv2/1病毒已獲得對(duì)通過(guò)人的自然denv1感染產(chǎn)生的多克隆抗體反應(yīng)進(jìn)行中和的敏感性。這些數(shù)據(jù)連同hmab1f4數(shù)據(jù)，表明denv2-1f4e已獲得denv1型特異性中和的多克隆決定子并在中和敏感性上表現(xiàn)出二價(jià)。

除獲得我們的rdenv對(duì)denv1多克隆中和的敏感性之外，我們亦關(guān)注確定denv2-1f4e對(duì)denv2中和敏感性的保留和/或喪失。為此，使用收集自恢復(fù)期的初次denv2患者的血清在u937-dc-sign(圖11，圖c-e)中進(jìn)行中和試驗(yàn)。值得注意的是，denv2-1f4e在所有情況下均具有與wtdenv2相等或超過(guò)其的中和滴度。該發(fā)現(xiàn)表明，用于denv1和denv2的型特異性中和的決定子為所述e糖蛋白上不起眼的成分，且二者的決定子aa序列可進(jìn)行組合而不會(huì)彼此改變。因此，denv2-1f4e具有用作用于疫苗診斷或引導(dǎo)開(kāi)發(fā)新型和/或改良的候選疫苗二者的重要試劑的潛力。

rdenv2/1在denv發(fā)病機(jī)制的鼠模型中為衰減的

為了評(píng)價(jià)我們的嵌合rdenv的衰減水平，我們?cè)赿env疾病的無(wú)免疫應(yīng)答小鼠模型中將denv2-1f4e的致死率與其親代wtdenv1和denv1進(jìn)行比較。對(duì)缺少干擾素α/β受體和干擾素γ受體二者的c57bl/6腹膜內(nèi)接種3.3x10⁶ffu(c6/36滴度)的denv1、denv2或denv2-1f4e。對(duì)小鼠稱重并監(jiān)測(cè)56dpi直至研究結(jié)束。如在圖12中所示，盡管接種wtdenv1和denv2的小鼠顯示>80%死亡率，但接受等同劑量的denv2-1f4e的小鼠并未死于感染(p=0.0076)，表明該rdenv的高度衰減。這些數(shù)據(jù)表明生成二價(jià)病毒的denv的嵌合引發(fā)了可適于疫苗開(kāi)發(fā)的體內(nèi)衰減水平。

實(shí)施例4.使用嵌合重組登革病毒定位血清型2中和性人抗體反應(yīng)

登革病毒(denv；dv)為全世界范圍內(nèi)最顯著的人類蟲(chóng)媒病毒病原體，每年預(yù)計(jì)3.9億例感染和9600萬(wàn)例有癥狀病例。幾乎半數(shù)世界人口處于疾病風(fēng)險(xiǎn)中，但仍沒(méi)有獲準(zhǔn)用以治療或預(yù)防登革熱病的疫苗或治療法。登革熱感染可表現(xiàn)為登革熱，其為以嚴(yán)重的骨和關(guān)節(jié)痛為特征的一種自限性發(fā)熱疾病，或者更嚴(yán)重的形式已知為登革出血熱和登革休克綜合征，其強(qiáng)調(diào)不適當(dāng)?shù)哪?、血管滲漏，以及在最嚴(yán)重的情況下為通常致命的多器官衰竭。登革病毒以四種不同的血清型存在，并且一種血清型感染不會(huì)提供免受其它血清型的后續(xù)感染的保護(hù)。事實(shí)上，對(duì)單個(gè)登革病毒血清型的免疫與在受另一種血清型感染之后增加的嚴(yán)重疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其為疫苗設(shè)計(jì)的致混淆因素。傳統(tǒng)的疫苗接種策略利用四種不同病毒的混合物來(lái)引發(fā)對(duì)各血清型的等同的免疫反應(yīng)，然而迄今為止未能始終如一地實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。因此，迫切需要用于輔助我們理解對(duì)登革熱感染的復(fù)雜免疫反應(yīng)的診斷工具，以及指導(dǎo)和產(chǎn)生新疫苗設(shè)計(jì)的新技術(shù)。本發(fā)明報(bào)道闡述了含有異種血清型的關(guān)鍵抗原組分的一組新型重組嵌合登革病毒，其可用于表征對(duì)多種血清型的人抗體反應(yīng)，以及亦用于生成能夠在單個(gè)病毒接種物的情況下引發(fā)對(duì)多種血清型的免疫反應(yīng)的新型多價(jià)候選疫苗。我們相信該抗原移植策略與用于其它人類和動(dòng)物病原體的多種疫苗平臺(tái)相容，且重要的是，其代表在登革病毒疫苗開(kāi)發(fā)中的重要突破。

rdenv4/2病毒的生成

為了鑒定denv2和denv4之間不同的氨基酸殘基，將包膜蛋白結(jié)構(gòu)域iii(ediii)區(qū)的氨基酸序列(第296-395位氨基酸)進(jìn)行比對(duì)(圖13，圖a)。突顯denv2和denv4之間不同的殘基，總共40個(gè)，并通過(guò)進(jìn)行盡可能小的核苷酸變化將來(lái)自denv4的所述殘基替換成來(lái)自denv2的所述殘基。所述40個(gè)不同的氨基酸跨越整個(gè)ediii，包括表面暴露殘基、內(nèi)部殘基和所述結(jié)構(gòu)域邊緣上的殘基，其有可能與其它單體和二聚體相互作用(圖13，圖b)。重組病毒的生成利用了用于產(chǎn)生親代野生型病毒的四片段克隆策略。denv-4a質(zhì)粒盒含有包膜糖蛋白，用灰色突顯ediii(圖13，圖c)。與重組denv-4a一起使用denv-4b、c和d質(zhì)粒盒，可生成dv4-ediii-dv2病毒。向所述重組病毒中引入40個(gè)氨基酸變化，所述氨基酸中的14個(gè)引入電荷變化(表1)。六個(gè)殘基增加負(fù)電荷，八個(gè)殘基引入更多的正電荷。

重組病毒具有與親代denv4類似的成熟特性

對(duì)病毒進(jìn)行免疫印跡法以測(cè)定病毒上存在的e和prm蛋白的比率(圖14)。denv2顯示與e相比高水平的prm，表明其為高度未成熟病毒，這是因?yàn)椴煌耆チ值鞍酌讣庸せ騪rm分解所致。denv4和dv4-ediii-dv2二者均不可檢出prm，表明這些病毒為高度成熟的。然而，因在denv2和所述2種denv4主鏈病毒之間測(cè)得的在e蛋白的量上的顯著差異，我們不能排除在這些病毒體的表面上存在某些prm。

重組病毒在vero細(xì)胞中衰減，但在蚊細(xì)胞中不衰減

根據(jù)使用多步生長(zhǎng)曲線的檢驗(yàn)，與denv2和denv4親代病毒相比，dv4-ediii-dv2在vero細(xì)胞中具有2log10生長(zhǎng)衰減(圖15，圖a)。dv4-ediii-dv2在vero細(xì)胞中形成感染斑，形態(tài)介于兩種親代病毒之間(圖1，圖5b)。盡管在vero細(xì)胞中感染另外的1-2天，但dv4-ediii-dv2空斑仍未達(dá)到親代病毒空斑的大小。

盡管在vero細(xì)胞中存在生長(zhǎng)衰減，但dv4-ediii-dv2在c6/36細(xì)胞中未顯示衰減(圖16，圖a)。如在vero細(xì)胞中所觀察到的，dv4-ediii-dv2c6/36感染斑顯示介于兩種親代病毒之間的形態(tài)。在感染另外的1-2天后，這些空斑達(dá)到與兩種野生型病毒相當(dāng)?shù)拇笮　?/p>

denv2ediii的移植，足以轉(zhuǎn)移2d22結(jié)合和中和

2d22為對(duì)denv2具高度型特異性的人單克隆抗體(mab)(圖17，圖a)。先前通過(guò)在2d22存在下在vero細(xì)胞中進(jìn)行denv2傳代來(lái)產(chǎn)生逃逸突變。該逃逸突變?cè)趀diii中間具有一個(gè)點(diǎn)突變r(jià)323g(圖17，圖b)，表明denve的該區(qū)可能包含在所述2d22表位中。elisa結(jié)合顯示dv4-ediii-dv2已獲得與2d22的部分結(jié)合，其高于dv4水平但不及dv2水平(圖17，圖c)。與交叉反應(yīng)denvmab2j20的結(jié)合(圖17，圖d)，顯示在結(jié)合試驗(yàn)中存在相當(dāng)水平的病毒，以及dv4-ediii-dv2形態(tài)得到保持。

使用兩種細(xì)胞類型和兩個(gè)試驗(yàn)來(lái)分析通過(guò)2d22的中和。在2d22存在下感染vero-81細(xì)胞，并計(jì)算中和50%的空斑所需的抗體的量(frnt50)。denv2需要約0.1ng/ul的2d22來(lái)中和50%的病毒，而denv4在所用抗體的最大濃度(5ng/ul)下仍未被中和(圖17，圖e)。移植ediii足以轉(zhuǎn)移對(duì)通過(guò)2d22的中和的敏感性，如可見(jiàn)于約0.01ng/ulfrnt50值。使用基于u937+dc-sign流式細(xì)胞術(shù)的中和試驗(yàn)證實(shí)了這些結(jié)果(圖17，圖f)，其測(cè)定了在抗體存在下通過(guò)數(shù)量減少的感染細(xì)胞的中和。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明2d22含有作為其表位的部分的ediii。

dv4-ediii-dv2獲得對(duì)通過(guò)另外的denv2mab的中和的敏感性

使用另外6個(gè)denv2mab的組進(jìn)一步表征dv4-ediii-dv2(表2)。這些mab中的許多不結(jié)合重組ediii(rediii)，包括我們已顯示含有ediii作為其表位的部分的2d22(圖17)。很可能2d22使用僅存在于整個(gè)e單體、e二聚體或完整病毒結(jié)構(gòu)中的復(fù)合表位，這解釋了僅不與rediii結(jié)合的原因。很可能該組中的其它mab具有相同的要求。諸如對(duì)于結(jié)合而言重要的殘基等另外的信息亦包含在表格中，所述殘基通過(guò)生成逃逸突變或者通過(guò)掃描丙氨酸突變來(lái)確定。

對(duì)于dvc3.7產(chǎn)生一個(gè)點(diǎn)突變v382g，其位于ediii的側(cè)脊(圖18，圖a)。dv4-ediii-dv2對(duì)通過(guò)dvc3.7的中和敏感，其類似于denv2，但親代denv4并不敏感(圖18，圖c)。對(duì)于dvc10.16產(chǎn)生一個(gè)點(diǎn)突變e311k，其位于ediii的a鏈(圖18，圖b)。如對(duì)于dvc3.7所見(jiàn)，dv4-ediii-dv2從親代denv4獲得對(duì)dvc10.16的中和，其低于denv2中和所需的水平。丙氨酸掃描突變發(fā)生顯示dvc13.6結(jié)合所需的edii中的融合環(huán)的第101和108位(圖18，圖e)。dv4-ediii-dv2通過(guò)dvc13.6中和(圖18，圖f)。這些數(shù)據(jù)表明，dvc13.6denv2表位可從ediii跨越到edii的融合環(huán)區(qū)中。另兩個(gè)mab中和dv4-ediii-dv2，其類似于denv2但與denv4不同(圖18，圖g-h)。出人意料的是，結(jié)合rediii的3f9(表2)，不論移植的結(jié)構(gòu)域，均不結(jié)合或中和dv4-ediii-dv2(圖18，圖i)。這表明3f9的表位需要ediii，但也可能是僅存在于denv2中卻不存在于dv4-ediii-dv2中的ediii之外的另外的殘基。

dv4-ediii-dv2喪失對(duì)denv4ediii特異性mab的中和

dv4-e88為具有已知ediii表位和通過(guò)逃逸突變定位的特異性殘基331和361的小鼠dv4型特異性mab(表2和圖19，圖a)。正如預(yù)期的，dv4-e88中和dv4但不中和dv2。因?yàn)閐env4的ediii已替換成來(lái)自denv2的ediii，所以喪失了通過(guò)dv4-e88中和dv4-ediii-dv2。

dv4-ediii-dv2獲得對(duì)denv2多克隆免疫血清的中和

為了測(cè)試存在于多克隆免疫血清中的抗體是否識(shí)別ediii，針對(duì)dv4-ediii-dv2測(cè)試了12個(gè)denv2多克隆免疫血清(圖20，圖a-l)。dv4-ediii-dv2獲得對(duì)通過(guò)denv2血清的中和的敏感性，其與denv2相當(dāng)。denv4未被最高測(cè)試濃度的任何血清中和。不論使用不同血清的中和滴度的范圍(范圍從約50至約3,000)，平均dv4-ediii-dv2中和滴度高于denv2(圖22，圖a)。

dv4-ediii-dv2保留對(duì)denv4多克隆免疫血清的中和

denv4多克隆免疫血清以類似于denv4的中和滴度中和dv4-ediii-dv2(圖21，圖a-f)。這些數(shù)據(jù)表明主要的denv4中和表位與denv2不同，且在將denv2ediii引入denv4中時(shí)未受干擾。如對(duì)于denv2多克隆免疫血清所見(jiàn)，dv4-ediii-dv2平均中和滴度與denv4的相當(dāng)(圖22，圖b)。

dv4-ediii-dv2未獲得對(duì)異型多克隆免疫血清的中和

為了測(cè)試dv4-ediii-dv2是否被異型denv1或denv3多克隆免疫血清中和，使用來(lái)自恢復(fù)期的denv1和denv3供者的血清進(jìn)行相同的frnt試驗(yàn)。盡管在某些情況下dv4-ediii-dv2獲得水平高于親代denv4中和滴度的對(duì)中和的輕微敏感性，但其不超過(guò)denv2中和的水平，且在任何情況下基本上均低于同型中和(圖23，圖a-b)。

dv4-ediii-dv2似乎將主要的denv2型特異性中和表位鑒定為含ediii的四價(jià)表位。該重組病毒獲得對(duì)denv2多克隆免疫血清的中和，而沒(méi)有喪失對(duì)denv4血清的敏感性，表明denv4具有不同的中和表位。該病毒可用作用于denv2或denv4抗體的探針的診斷工具。具體而言，因在異源denv4背景中分離denv2ediii所致，可測(cè)定來(lái)自自然感染或經(jīng)疫苗接種的個(gè)體的ediii特異性ab的相對(duì)豐度。根據(jù)denv2的ediii似乎對(duì)于感染之后的型特異性中和反應(yīng)而言極其關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)，這很重要。該病毒含有來(lái)自denv2和denv4二者的結(jié)構(gòu)域，且對(duì)通過(guò)denv2和denv4抗體二者的中和均敏感，表明該病毒可用作能夠引發(fā)針對(duì)兩種血清型的抗體反應(yīng)的二價(jià)疫苗。此外，如果與denv1/3或denv3/1重組病毒配合使用，四價(jià)疫苗制品為可實(shí)現(xiàn)的，這表明在登革熱疫苗領(lǐng)域的重大進(jìn)步。

病毒構(gòu)建

重組病毒使用四片段克隆策略來(lái)構(gòu)建，其為用于產(chǎn)生野生型denv感染性克隆的相同策略。將denv-4基因組亞克隆成四個(gè)獨(dú)立的dna質(zhì)粒。向a片段的5’端引入t7啟動(dòng)子，并向各片段的5’和3’端引入獨(dú)特的iis型限制位點(diǎn)。這些限制位點(diǎn)確保質(zhì)粒將僅以正確的方向裝配以產(chǎn)生denv基因組序列。

通過(guò)將denv4a片段中的核苷酸替換成編碼denv2氨基酸的核苷酸，向denv4中引入來(lái)自denv2的ediii殘基。合成具有來(lái)自denv2的核苷酸的新a片段并將其插入平puc-57質(zhì)粒(biobasic)中。使除denv4b、c和d質(zhì)粒之外的新a質(zhì)粒在大腸桿菌中生長(zhǎng)、純化、用相應(yīng)的iis型限制酶消化、使用t4dna連接酶連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)cdna登革病毒基因組。使用t7聚合酶轉(zhuǎn)錄cdna。使重組rna電穿孔進(jìn)入bhk-21細(xì)胞中并收集含活病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后在c6/36細(xì)胞上將病毒傳代兩次，離心去除細(xì)胞碎片，并儲(chǔ)存于-80℃。

細(xì)胞

使白紋伊蚊(ae.albopictus)c6/36細(xì)胞于32℃在mem(gibco)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。于37℃將vero-81細(xì)胞維持在dmem中。于37℃將經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)dc-sign的人單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系u937(u937+dc-sign)維持在rpmi-1640(gibco)中并補(bǔ)充50mmβ-巰基乙醇。對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)充fbs(對(duì)于vero-81和u937+dc-sign細(xì)胞為10%，對(duì)于c6/36為5%)，將其降至2%以制備感染培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均額外補(bǔ)充100u/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。u937+dc-sign額外補(bǔ)充0.1mm非必需氨基酸和2mm谷氨酰胺。所有細(xì)胞均在5%co2中培養(yǎng)。

結(jié)合elisa

使用抗e抗體捕獲等量的病毒(如前述通過(guò)elisa滴定)。將第一抗體2d22和2j20稀釋四倍，開(kāi)始生成稀釋系列。使用堿性磷酸酶綴合的第二抗體檢測(cè)第一抗體與磷酸對(duì)硝基苯酯底物的結(jié)合，并使用分光光度計(jì)定量反應(yīng)顏色變化。

denv免疫血清

從證實(shí)先前有自然denv感染的個(gè)體收集人denv免疫血清。從給予denv疫苗的個(gè)體收集另外的人免疫血清。在denv感染之后收集非人靈長(zhǎng)類免疫血清。

病毒滴定和空斑減少中和試驗(yàn)(frnt)

在感染前一天，用5x10⁴個(gè)vero-81或1x10⁵個(gè)c6/36細(xì)胞接種24孔板。感染之前，去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基。通過(guò)以10倍連續(xù)稀釋病毒貯液來(lái)進(jìn)行病毒滴定，然后于37℃孵育1小時(shí)。孵育之后，于37℃向細(xì)胞中添加病毒稀釋物達(dá)1小時(shí)，然后覆蓋以1ml1%含甲基纖維素的optimem(gibco)，補(bǔ)充2%fbs、100u/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。于37℃孵育3-6天之后，去除覆蓋物，用pbs洗滌細(xì)胞并用80%甲醇固定。使用以pbs制備的5%速溶乳粉封閉培養(yǎng)板，然后使用抗emab4g2和抗prmmab2h2孵育，二者均用封閉緩沖液1:500稀釋。然后洗滌培養(yǎng)板，用hrp綴合的羊抗鼠ab(sigma)孵育，用封閉緩沖液1:2500稀釋。然后洗滌培養(yǎng)板，使用truebluehrp底物(kpl)使空斑顯影，并計(jì)數(shù)空斑。

對(duì)于frnt試驗(yàn)，將mab或血清稀釋四倍并與約40ffu病毒混合，然后于37℃孵育1小時(shí)。孵育之后，于37℃向細(xì)胞中加入病毒和mab/血清稀釋物達(dá)1小時(shí)，然后加入覆蓋物并如上處理。

生長(zhǎng)曲線

以0.01的感染復(fù)數(shù)(moi)感染vero或c6/36細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集培養(yǎng)上清液，并離心去除細(xì)胞碎片。將樣品于-80℃冷凍直至使用。每天更換新鮮培養(yǎng)基。如上所述用其增值細(xì)胞類型滴定病毒。

u937+dc-sign中和試驗(yàn)

如在frnt試驗(yàn)中，用u937+dc-sign感染培養(yǎng)基稀釋病毒并與mab的四倍稀釋系列混合。于37℃將病毒和mab混合物孵育1小時(shí)。然后向96孔圓底培養(yǎng)板的每孔5x10⁴個(gè)u937+dc-sign細(xì)胞中加入病毒和mab混合物，并于37℃孵育2小時(shí)。孵育之后，將細(xì)胞離心并用感染培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸浮。感染后一天，將細(xì)胞離心以收集，用pbs洗滌并用4%多聚甲醛固定。然后將細(xì)胞透化處理并用1%標(biāo)準(zhǔn)小鼠血清封閉。使用以alexfluor488直接標(biāo)記的抗e2h2的1:400稀釋物將細(xì)胞染色。用guavaeasycyte流式細(xì)胞儀(millipore)測(cè)定陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

免疫印跡

用pbs稀釋病毒貯液，與4xlaemmli樣品緩沖液(bio-rad)混合并于50℃加熱10分鐘。使樣品在12%proteantgx凝膠(bio-rad)上跑膠，轉(zhuǎn)移至pvdf膜并于4℃用含5%速溶乳粉的pbs+0.05%吐溫封閉過(guò)夜。于37℃用含0.5ug/ml抗e4g2、0.5ug/ml抗prm2h12和5l20的封閉緩沖液將膜探測(cè)2小時(shí)。洗滌之后，用封閉緩沖液1:10,000稀釋hrp綴合的抗鼠和抗人第二抗體，并于室溫孵育1小時(shí)。將膜暴露給化學(xué)發(fā)光底物并在膜上顯影。

實(shí)施例5.使用嵌合重組登革病毒定位血清型2中和性人抗體反應(yīng)

受四種登革病毒(denv)血清型(denv1-4)之一的初次感染得到中和感染血清型但不中和其它血清型的抗體。我們團(tuán)隊(duì)先前已對(duì)從暴露給自然denv感染的人分離血清型特異性強(qiáng)效中和單克隆抗體(hmab)進(jìn)行報(bào)道。我們已證實(shí)的是，這些hmab與僅在完整病毒顆粒上表達(dá)的復(fù)合四價(jià)結(jié)構(gòu)表位結(jié)合。近來(lái)我們報(bào)道的是，有可能產(chǎn)生其中在血清型之間移植這些復(fù)合表位的活性重組denv。通過(guò)使用denv3/4嵌合體，我們觀察到所述包膜(e)蛋白的結(jié)構(gòu)域i/ii之間的鉸鏈區(qū)含有其為中和血清型3和4的型特異性抗體的主要靶標(biāo)的表位。在目前研究中，我們已使用類似的方法定位通過(guò)中和hmab和初次denv2人免疫血清識(shí)別的denv2的位點(diǎn)。我們的研究得到新型四價(jià)結(jié)構(gòu)依賴性denv2表位的鑒定，其與先前對(duì)血清型3和4定義的edi/ii鉸鏈區(qū)表位不同。重要的是，我們使用功能得失研究證實(shí)，denv1-4e糖蛋白中的不同位置編碼獨(dú)特的長(zhǎng)效中和表位，其在血清型之間為可移植的。檢驗(yàn)了denv2表位的位置及其作為暴露給自然感染的人中的中和抗體的靶標(biāo)的相對(duì)重要性。

rdenv4/2病毒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建

將來(lái)自denv2(右)的殘基移入denv4主鏈中，以產(chǎn)生重組denv4/2病毒(rdenv4/2，圖24，圖a)。使用用于處理所述denv基因組的反求遺傳學(xué)系統(tǒng)(圖24，圖b)。上圖=denv2，下圖=denv4。將所述denv基因組分成四個(gè)質(zhì)粒盒，其可獨(dú)立突變、連接在一起并電穿孔進(jìn)入細(xì)胞以產(chǎn)生重組病毒。所述denv4-a盒含有其中進(jìn)行突變的包膜蛋白基因。將denv4殘基替換成來(lái)自denv2的殘基產(chǎn)生rdenv4/2病毒，其完全在denv4基因主鏈上建立。

用于通過(guò)rt-pcr的血清型鑒定和denv4主鏈重組病毒驗(yàn)證的新方法

針對(duì)血清型特異性rt-pcr設(shè)計(jì)rt-pcr引物(圖25，圖a)。所用引物包含靶向高度保守的3’端ns1基因的通用正義寡核苷酸和靶定高度差異的ns2a基因的血清型特異性反義引物。使病毒在c6/36細(xì)胞中生長(zhǎng)，收集培養(yǎng)上清液并離心去除任何細(xì)胞碎片。使用qiagenqiamp病毒rna小量制備試劑盒分離病毒rna。使pcr運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，并在1.5%超純瓊脂糖凝膠上分析pcr產(chǎn)物。使對(duì)照rna(dv1/dv2/dv3/dv4)和水跑膠作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照(圖25，圖b)。預(yù)期產(chǎn)物大小：dv1=205bp，dv2=539bp，dv3=455bp，dv4=401bp。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性區(qū)分rdenv4/2與親代denv4

將限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)分析用于區(qū)分rdenv4/2(下圖)與親代denv4(上圖)。引入denv4e基因組中以產(chǎn)生rdenv4/2的突變(以星號(hào)表示)破壞denv4中存在的xmni限制酶位點(diǎn)(圖26，圖a)。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并用xmni消化。在1.5%超純瓊脂糖凝膠上分析消化產(chǎn)物(圖26，圖b)。預(yù)期產(chǎn)物大?。何聪L(zhǎng)=1031bp，消化產(chǎn)物=931bp和113bp。

具有類似成熟特性的denv4和rdenv4/2病毒體

使病毒在c6/36細(xì)胞中生長(zhǎng)，收集培養(yǎng)上清液并離心去除任何細(xì)胞碎片。使樣品在12%sds-page凝膠上跑膠并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗體探測(cè)印跡(圖27)。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或prm分解。在denv4或rdenv4/2樣品中未檢出prm條帶。

rdenv4/2相對(duì)于親代病毒在vero細(xì)胞中具有2log生長(zhǎng)衰減

使用denv2、denv4和rdenv4/2以moi=0.01感染vero-81細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后用vero-81細(xì)胞滴定(圖28，圖a)。denv在vero-81細(xì)胞中形成感染斑。denv2、denv4和rdenv4/2分別在感染后5天、4天和6天進(jìn)行固定(圖28，圖b)。rdenv4/2顯示小于兩種親代病毒的空斑。

rdenv4/2在c6/36細(xì)胞中無(wú)生長(zhǎng)衰減且形成與親代病毒類似的感染斑

使用denv2、denv4和rdenv4/2以moi=0.01感染c6/36細(xì)胞。每24個(gè)小時(shí)收集病毒上清液并隨后用c6/36細(xì)胞滴定(圖29，圖a)。denv在c6/36細(xì)胞上形成感染斑。denv2、denv4和rdenv4/2分別在感染后4天、3天和5天進(jìn)行固定(圖29，圖b)。生長(zhǎng)另外的天數(shù)之后，rdenv4/2空斑達(dá)到與親代病毒相當(dāng)?shù)拇笮　?/p>

圖30.轉(zhuǎn)移通過(guò)型特異性denv2人mab結(jié)合和中和rdenv4/2

在圖30，圖a中顯示與四價(jià)表位結(jié)合的人mab2d22(強(qiáng)效的中和性dv2mab)的結(jié)合的概述。2d22顯示對(duì)中和denv2的極大特異性。elisa試驗(yàn)顯示2d22與rdenv4/2的部分結(jié)合的轉(zhuǎn)移，其高于親代dv4的水平但不及dv2水平(圖30，圖b)。交叉反應(yīng)的對(duì)照抗體2j20的elisa結(jié)合，顯示相當(dāng)水平的病毒存在并維持病毒完整性(圖20，圖c)。使用2d22進(jìn)行基于vero-81的空斑減少中和試驗(yàn)(frnt)并計(jì)算frnt50(中和50%的感染所需的抗體濃度)值(圖30，圖d)。使用2d22進(jìn)行基于u937+dc-sign的中和試驗(yàn)(neut)并計(jì)算neut50值(圖30，圖e)。在兩個(gè)試驗(yàn)中(圖30，圖d-e)，rdenv4/2均獲得水平高于dv2的對(duì)2d22的中和。在任一試驗(yàn)中，dv4均未被最大濃度的2d22中和。

rdenv4/2獲得對(duì)denv2多克隆免疫血清的中和，同時(shí)保留對(duì)denv4多克隆血清的中和

vero-81frnt試驗(yàn)顯示，rdenv4/2獲得水平與親代denv2相當(dāng)?shù)膶?duì)denv2多克隆免疫血清的中和(圖31，圖a)。rdenv4/2未顯示喪失通過(guò)denv4多克隆免疫血清的中和(圖31，圖b)。rdenv4/2未顯示獲得高于親代denv2或denv4中和滴度的對(duì)異型denv1(圖31，圖c)和denv3(圖31，圖d)多克隆免疫血清的中和。如所指示的對(duì)來(lái)自具有自然感染或?qū)嶒?yàn)疫苗接種的個(gè)體的血清進(jìn)行編碼。frnt50<20的樣品以19的血清稀釋因子作圖。

在本研究中，生成由來(lái)自兩種denv血清型(denv2和denv4)的包膜蛋白殘基組成的重組denv病毒，且在表征該病毒時(shí)鑒定了數(shù)個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：可通過(guò)將來(lái)自一種denv血清型的區(qū)域移植到另一種血清型中來(lái)產(chǎn)生活性的重組病毒；rdenv4/2生長(zhǎng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中衰減，但在昆蟲(chóng)細(xì)胞中不衰減；rdenv4/2未檢出prm蛋白存在，表明其為完全加工和高度成熟的；在兩種不同的細(xì)胞類型和中和試驗(yàn)中將結(jié)合和中和轉(zhuǎn)移給人denv2型特異性mab2d22；rdenv4/2獲得對(duì)denv2多克隆免疫血清的中和而不會(huì)喪失對(duì)denv4多克隆免疫血清的中和；rdenv4/2未獲得對(duì)異型多克隆免疫血清的中和；和可將rdenv4/2開(kāi)發(fā)成引發(fā)對(duì)denv2和denv4二者的保護(hù)性抗體反應(yīng)的二價(jià)疫苗。

實(shí)施例6.重組denv與野生型denv序列的氨基酸比對(duì)

dv4-ediii-dv2與野生型denv4和denv2的氨基酸序列比對(duì)顯示于圖32a。denv2-1f4e與野生型denv2和denv1的氨基酸比對(duì)顯示于圖32b。最后，denv4m12、denv4m14和denv4m16與野生型denv4和denv3的氨基酸比對(duì)顯示于圖32b。

上文為本發(fā)明的闡述，且并非理解為其限制。本發(fā)明通過(guò)下列權(quán)利要求限定，所述權(quán)利要求的等同物包含在本文中。

本文引用的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)，通過(guò)引用以其整體結(jié)合，用于與其中顯示所述引用的語(yǔ)句和/或段落相關(guān)的教導(dǎo)。

序列

>親代wt_denv3:115-773e[登革病毒3，seqidno:12]

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgnetq--gvtaeitpqastteailpeygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklelkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa

>denv4_m12:115-775e(seqidno:2)

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>denv4_m14:115-775e(seqidno:3)

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>denv4_m16:115-775e(seqidno:4)

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>親代wt_denv4:115-775e[登革病毒4，seqidno:1]

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>親代wt_denv2:115-775[登革病毒2，seqidno:13]

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>dv4-ediii-dv2:115-775[登革病毒4/2，seqidno:5]

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>親代wt_denv1:115-775e[登革病毒1，seqidno:14]

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>denv2-1f4e:115-775(seqidno:6)

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denv1/4(5h2)

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denv2/4(5h2)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelikteakqpatlrkycieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfickhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckknmegkvvqpenleytivitphsgeehavgndagkhgvtamitpqsssvevklpdygevtmecsprtgldfnemvllqmedkawlvhrqwfldlplpwlpgadtqesnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqmssgnllftghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:16)

denv2-1f4e(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtnpavlrkycieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckknmegkvvqpenlkysvivtvhsgeehavgndttehgttatvtpqaptseiqltdygaltlecsprtgldfnemvllqmenkawlvhrqwfldlplpwlpgadtqgsnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttlftghlkcrlrmdklqlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:17)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更小的移植到denv2中的denv1區(qū)域的2種病毒：

1.n52q、v55t、s138t、v139i

2.a168s、p169s、a180t、l181v、l183m(除在1中列舉的變化之外)

denv4-1f4e

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtnpavlrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienlkysvivtvhngdthavgndttehgttatitpraptseiqltdygaltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdtggtttmfaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:18)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更小的移植到denv2中的denv1區(qū)域的2種病毒：

1.n52e、p53v、v55l、s138t

2.a168s、a180e(除在1中列舉的變化之外)

denv1-3m14

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkclepiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgtiatitpqaptseiqltdygaltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdkltlkgmsyvmctgsfklekevaetqhgtvlvqvkyegtdapckipfssqdekgvtqngrlitanpivtdkekpvnieaeppfgesyivvgagekalklswfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:19)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv3區(qū)域的病毒(稱為denv1-3m16)：

1.s225t、e229p、e307k

denv2/3m12(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelikteatqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckepiegkvvqpenleytivvtphsgeehavgndtgkhgkeikvtpqssiteaeltgygtvtmecsprtgldfnemvlltmknkawmvhrqwffdlplpwtstadtqgpnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlrmdklqlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgivtlylgvmvqa(seqidno:20)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv2中的denv3區(qū)域的2種病毒(稱為denv2-m14(#1)anddenv2-m16(#2))：

1.k122l、k123e、p132y

2.e71d、e148q、d225t、s229p、v307k(除在1中列舉的變化之外)

denv3/4(5h2)

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgneasnqgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:21)

dv4-ediii-dv2)

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:22)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv4中的denv2區(qū)域的2種病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列舉的變化之外)

dv1-ediii-dv2

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellktevtnpavlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtklegkivqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqaptseiqltdygaltldcsprtgldfnemvlltmekkswlvhkqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdkltlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:23)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv2區(qū)域的2種病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列舉的變化之外)

dv3-ediii-dv2

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgnetqgvtaeitpqastteailpeygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklelkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:24)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv3中的denv2區(qū)域的2種病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列舉的變化之外)

denv2/1/3(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckkpiegkvvqpenlkytiivtvhsgeehavgndttehgttatvtpqsstseiqltdygtvtmecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgadtqgsnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsstttifaghlkcrlrmdklqlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:25)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv2中的denv1和/或denv3區(qū)域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列舉的變化之外)

3.k122l、k123e、p132y

4.e71d、e148q、d225t、s227p、v307k(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何或全部組合(即1+3、1+4、2+3、2+4)

denv2/1/4

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtqpatlrkycieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckknmegkvvqpenlkytiivtvhsgeehavgndatehgvtamvtpqsstvevklpdygevtmecsprtgldfnemvllqmenkawlvhrqwfldlplpwlpgadtqgsnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttlftghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:26)

注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv2中的denv1區(qū)域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列舉的變化之外)

denv2/3/4(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelikteatqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckepiegkvvqpenleytivvtphsgeehavgndagkhgvtamvtpqsssvevklpdygevtmecsprtgldfnemvlltmknkawmvhrqwffdlplpwtstadtqgpnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgivtlylgvmvqa(seqidno:27)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv2中的denv3區(qū)域的2種病毒：

1.k122l、k123e、p132y

2.e71d、e148q、d225t、s229p、v307k(除在1中列舉的變化之外)

denv2/1/3/4(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckkpiegkvvqpenlkytiivtvhsgeehavgndatehgvtamvtpqassvevklpdygevtmecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgadtqgsnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsstttifaghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:28)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv2中的denv1和/或denv3區(qū)域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列舉的變化之外)

3.k122l、k123e、p132y

4.e71d、e148q、d225t、s227p、v307k(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv1/3/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsyvmctgsfklekevaetqhgtvlvqvkyegtdapckipfssqdekgvtqngrlitanpivtdkekpvnieaeppfgesyivvgagekalklswfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:29)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv3區(qū)域的病毒：

1.v122l、t123e、k124p、l214f

2.s225t、e229p、e307k(除在1中列舉的變化之外)

denv1/2/3

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqaptseiqltdygaltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdkltlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:30)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv2和/或denv3區(qū)域的病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列舉的變化之外)

3.v122l、t123e、k124p、l214f

4.s225t、e229p、e307k(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv1/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellktevtnpavlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtklegkivqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemvlltmekkswlvhkqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:31)

注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv2區(qū)域的2種病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列舉的變化之外)

denv1/2/3/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:32)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv1中的denv2和/或denv3區(qū)域的2種病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列舉的變化之外)

3.v122l、t123e、k124p、l214f

4.s225t、e229p、e307k(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv3/1/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkysviitvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsgttsifaghlkcrlkmdklrlkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:33)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv3中的denv1區(qū)域的病毒：

1.s169p、t180a

2.q52n、l53p、t55v(除在1中列舉的變化之外)

denv3/1/2

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqastseiqltdygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklelkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:34)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv3中的denv2和/或denv1區(qū)域的2種病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列舉的變化之外)

3.s169p、t180a

4.q52n、l53p、t55v(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv3/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgneaqgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:35)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv3中的denv2區(qū)域的2種病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列舉的變化之外)

denv3/1/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:36)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv3中的denv2和/或denv1區(qū)域的2種病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列舉的變化之外)

3.s169p、t180a

4.q52n、l53p、t55v(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv4/1/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprsptseiqltdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:37)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv4中的denv1和/或denv3區(qū)域的病毒：

1.t49e、s122l、g123e、i132y

2.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在1中列舉的變化之外)

3.s168a、e180a

4.e52n、v53p、l55v、t138s(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv4/1/2

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprsptseiqltdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsggtttmfaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:38)

注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv4中的denv1和/或denv2區(qū)域的2種病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列舉的變化之外)

3.s168a、e180a

4.e52n、v53p、l55v、t138s(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv4/2/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmirili

gflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:39)

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv4中的denv2和/或denv3區(qū)域的2種病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列舉的變化之外)

3.t49e、s122l、g123e、i132y

4.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在3中列舉的變化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部組合

denv4/1/2/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprspsvevkltdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:40)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可進(jìn)行下列變化以產(chǎn)生具有更大的移植到denv4中的denv1、denv2和/或denv3區(qū)域的2種病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列舉的變化之外)

3.t49e、s122l、g123e、i132y

4.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在3中列舉的變化之外)

5.s168a、e180a

6.e52n、v53p、l55v、t138s

7.1、2、3、4、5、6和原始序列的任何和全部組合。