專利名稱：馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒別診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種含有不明結(jié)構(gòu)抗原或抗體的醫(yī)用配制品，用于馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體的鑒別診斷試劑。
馬傳染性貧血病(簡(jiǎn)稱馬傳貧)是各國(guó)養(yǎng)馬業(yè)的大敵之一，為世界廣泛存在的馬的傳染病。為了預(yù)防本病，我國(guó)首創(chuàng)馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗，用于馬匹免疫預(yù)防。但是患本病馬匹與接種過(guò)弱毒疫苗的馬匹均可出現(xiàn)血清學(xué)反應(yīng)。如依各國(guó)現(xiàn)行的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)法、中和試驗(yàn)法、補(bǔ)體結(jié)合法檢查，則兩者無(wú)法區(qū)分，使診斷工作無(wú)法進(jìn)行。
本發(fā)明的目的是采用現(xiàn)代高技術(shù)中的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出僅對(duì)馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)，并制成酶聯(lián)McAb試劑，以免疫斑點(diǎn)(DB)試驗(yàn)法鑒別診斷馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬匹。
下面詳細(xì)說(shuō)明馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒別診斷試劑的制造方法。
一、雜交瘤細(xì)胞株的建立用馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒免疫BALB/C鼠，以免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，采用雜交瘤細(xì)胞融合法進(jìn)行細(xì)胞融合。對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔上清液，用ELISA和IF法進(jìn)行分泌McAb的檢測(cè)，對(duì)培養(yǎng)上清液抗體檢測(cè)陽(yáng)性孔的細(xì)胞，再用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以有限稀釋法作三次克隆化培養(yǎng)和增殖，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，并連續(xù)培養(yǎng)60代，以此獲得了分泌抗馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒株系特異McAb的雜交瘤細(xì)胞株。
二、McAb的制備和純化1、McAb的制備取雜交瘤細(xì)胞(1×107/ml)0.5ml接種到預(yù)先腹腔注射0.5ml降值烷的BALB/C鼠的腹腔內(nèi)，經(jīng)10-14天，BALB/C鼠的腹部膨大后，無(wú)菌抽取腹水，再接種到第二代BALB/C鼠的腹腔，如此在BALB/C鼠腹腔傳三代后，大批接種第四代小鼠，無(wú)菌收集腹水，經(jīng)200g離心力離心，10分鐘后，收集上清液備用。
2、McAb的純化(1)硫酸銨沉淀法將所獲得腹水以50%的飽和硫酸銨反復(fù)沉淀3次，用PH7.2、0.02M的PBS透析，至無(wú)銨離子為止。
(2)柱層析用SephadexG200凝膠過(guò)濾，收集第一個(gè)峰，用蔗糖濃縮，凍干后置-20℃條件下存用。
三、酶聯(lián)McAb試劑的制備采用過(guò)碘酸氧化法1、稱取辣根過(guò)氧化物酶5mg溶于1ml、0.3M碳酸氫鈉溶液中，電磁攪拌下加入0.1ml、1%的二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液，室溫避光攪拌1小時(shí)。
2、加入1ml、0.06M過(guò)碘酸鈉溶液，室溫避光電磁攪拌30分鐘。
3、加入1ml、0.16M乙二醇溶液，室溫避光電磁攪拌1小時(shí)。
4、對(duì)1000ml、0.01MPH9.5碳酸鹽緩沖液透析，4℃過(guò)夜，中間換液三次。
5、加入5mgMcAb(以0.1MPH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至1ml)室溫避光攪拌3小時(shí)。
6、加5mg硼氫化鈉4℃作用3小時(shí)。
7、裝透析袋，以0.02MPH7.4的PBS透析，4℃下放置24小時(shí)，中間換液2-3次。
8、電磁攪拌下逐滴加入等體積100%飽和硫酸銨4℃靜置1小時(shí)，400G離心力離心15分鐘，棄上清液，沉淀物用50%飽和硫酸銨洗二次，按前方法離心，沉淀溶于少量滅菌的0.02MPH7.4PBS中，4℃下對(duì)0.02MPH7.4PBS透析過(guò)夜，換液數(shù)次至無(wú)銨離子為止。用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD403nm和OD280nm。
9、計(jì)算酶標(biāo)記抗體的McAb量、酶量、克分子比值。
10、酶標(biāo)記抗體，以滅菌的0.02MPH7.4PBS稀釋成一定濃度(200μg/ml)分裝安瓶，-20℃低溫保存。
四、使用方法采用免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)法。
應(yīng)用硝酸纖維素膜或混合纖維素脂膜作固相載體。
操作步驟(1)點(diǎn)樣將陽(yáng)性、陰性對(duì)照及受檢血清用微量進(jìn)樣器或玻璃棒沾約2.5ml，點(diǎn)在膜的指定位置上，室溫干燥15分鐘。
(2)用含0.05%Tween-20的0.02MPBS(PH7.2)漂洗三次，每次3-5分鐘。
(3)將膜浸入抗原-酶聯(lián)McAb試劑溶液中，室溫下1小時(shí)，抗原-酶聯(lián)McAb試劑用(2)項(xiàng)溶液稀釋。
(4)重復(fù)(2)項(xiàng)(5)將膜浸入底物溶液(PH7.6的0.05M Tris-HCl 20ml;DAB 3mg;30%H2O260ml)30分鐘。
(6)用蒸餾水漂洗。終止反應(yīng)，判讀結(jié)果，顯紅棕色為陽(yáng)性，即馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗免疫馬。這樣就區(qū)分開(kāi)了馬傳貧病馬與接種過(guò)馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗馬。
用本發(fā)明的試劑鑒別診斷馬傳貧病馬與接種過(guò)弱毒疫苗的馬，結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單。
權(quán)利要求
1.一種馬傳貧病馬與接種過(guò)弱毒疫苗馬的鑒別診斷試劑，其特征在于，采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出的僅對(duì)馬傳貧驢馬白細(xì)胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)并制成酶聯(lián)單克隆抗體(McAb)試劑，以免疫斑點(diǎn)(DB)試驗(yàn)法鑒別診斷馬傳貧病馬與接種過(guò)驢白細(xì)胞弱毒疫苗馬。
全文摘要
本發(fā)明是一種馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒識(shí)診斷試劑，這種試劑是利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得了分泌抗馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株，再對(duì)單克隆抗體(McAb)進(jìn)行制備和純化。采用過(guò)碘酸鈉氧化法，制備出了酶聯(lián)單克隆抗體(McAb)試劑，以免疫斑點(diǎn)(DB)試驗(yàn)法來(lái)鑒別診斷馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1042940SQ8810808
公開(kāi)日1990年6月13日 申請(qǐng)日期1988年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1988年12月1日
發(fā)明者蘆景良, 孔憲剛, 寧希德, 張日闊, 褚桂芳, 相文華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所