本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及通過(guò)基因工程方法獲得二萜類化合物合成的關(guān)鍵酶，特別涉及雷公藤二萜合酶及其在松香烷型二萜化合物制備中的用途。

背景技術(shù)：

藥用植物雷公藤(tripterygiumwilfordii.hook.f.)是一味中草藥，

被廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥的治療(raphaelagm，mildredw，royf，etal.comparisonoftripterygiumwilfordiihookfversussulfasalazineinthetreatmentofrheumatoidarthritis：arandomizedtrial[j].annalsofinternalmedicine，2009，151(4)：229-240.taoxl，lipskype.thechineseanti-inflammatoryandimmunosuppressiveherbalremedytripterygiumwilfordiihookf.[j].rheumaticdiseaseclinicsofnorthamerica，2000，26(1)：29-50.)。萜類成分為雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚內(nèi)酯(triptophenolide)和雷公藤紅素(celastrol)等。從中藥中的活性成分開(kāi)發(fā)新藥是一種很有潛力的方式，然而由于植物的生長(zhǎng)緩慢，再加上這些有效成分在植物體中的含量不多，因而大大限制了它的發(fā)展。通過(guò)探尋和闡釋萜類成分在雷公藤中的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，有助于為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來(lái)廣闊的應(yīng)用空間。

二萜類化合物通常以ggpp為底物，在二萜合酶復(fù)合體的催化作用下形成，即ipp通過(guò)一系列的反應(yīng)形成ggpp后，二萜合酶復(fù)合體以ggpp為起始底物，經(jīng)過(guò)最初的離子異構(gòu)化后環(huán)化形成各種陽(yáng)離子中間產(chǎn)物，最終通過(guò)去質(zhì)子或捕獲親核物質(zhì)進(jìn)一步環(huán)化形成一系列的二萜骨架中間體；并通過(guò)細(xì)胞色素p450結(jié)構(gòu)修飾，主要包括羥基化、甲基化、異構(gòu)化、脫甲基化、加成和還原等，最終生成二萜類化合物。

雷公藤中二萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，合成代謝途徑尚不完全清楚。目前基于基因組序列分析和表達(dá)序列標(biāo)簽分析，對(duì)雷公藤二萜合酶復(fù)合體中的部分酶活性蛋白進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足雷公藤二萜化合物生物合成的需求，不能解釋雷公藤二萜化合物種類的多樣性，更不能確定預(yù)測(cè)的酶活性蛋白具體導(dǎo)致了何種二萜類產(chǎn)物，因此迫切需要挖掘雷公藤二萜合酶復(fù)合體中新的酶活蛋白，并確定其具體的催化功能。

雷公藤甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗排異、抗生育等藥理作用，雷公藤甲素與丹參酮類化合物同屬松香烷型二萜。酶催化制備丹參酮的方法已有報(bào)道，但酶催化制備雷公藤甲素尚未獲得成功。針對(duì)雷公藤甲素、丹參酮共同的松香烷型二萜化合物前體進(jìn)行研究能夠?yàn)樽罱K酶催化法合成雷公藤甲素打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在對(duì)雷公藤二萜合酶復(fù)合體中的酶活蛋白進(jìn)行研究過(guò)程中，意外的發(fā)現(xiàn)了一種與twcps1序列相似的柯巴基焦磷酸合酶。最初認(rèn)為其是twcps1的天然突變等效物，隨后進(jìn)一步的研究表明其與twcps1同時(shí)穩(wěn)定存在于同一株雷公藤懸浮細(xì)胞中，并且二者在經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)時(shí)的過(guò)表達(dá)情況也不同。新發(fā)現(xiàn)的柯巴基焦磷酸合酶對(duì)誘導(dǎo)的反應(yīng)更快，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)初期松香烷型二萜化合物的合成和累積，而twcps1對(duì)誘導(dǎo)的反應(yīng)滯后，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)中后期松香烷型二萜化合物的合成和累積，因此將這種新的柯巴基焦磷酸合酶命名為twcps4。

將克隆得到的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因twcps4和丹參中的smksl1基因分別構(gòu)建表達(dá)載體，成功生成了次丹參酮二烯。進(jìn)一步證實(shí)了twcps4在合成雷公藤甲素等松香烷型二萜合成中的作用，且提供了一種合成松香烷型二萜前體的方法，為雷公藤甲素的生物合成奠定基礎(chǔ)。

次丹參酮二烯是一種重要的松香烷型二萜化合物前體，由于其發(fā)現(xiàn)于丹參，因此通常將丹參中的smcps1與smks1用于制備次丹參酮二烯。除了丹參以外，其他的植物中盡管也存在二萜合酶ks、cps，理論上也可能產(chǎn)生二萜類化合物，但通常不能催化合成次丹參酮二烯或合成量低于丹參自身smcps1與smksl1的組合。本發(fā)明提供的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4替代丹參smcps1，與smksl1組合使用能夠成功合成次丹參酮二烯，且產(chǎn)量更高。即：本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶twcps4能夠用于生產(chǎn)松香烷型二萜化合物前體，并且代替丹參二萜合酶smcps1能獲得更高的產(chǎn)量，在催化合成松香烷型二萜化合物前體中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種合成雷公藤松香烷型二萜類化合物前體合成的方法：具體將twcps4基因的edna克隆到原核表達(dá)載體pmal-c2x，構(gòu)建帶有twcps4基因的重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)入e.coli表達(dá)宿主菌，通過(guò)誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)初步純化后，加入到以ggpp為底物的體外酶促反應(yīng)體系中，正己烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物，采用gc-ms可檢測(cè)到產(chǎn)物。研究結(jié)果表明，本發(fā)明與雷公藤二萜類化合物合成有關(guān)的基因具有二萜合酶基因的dxdd特征結(jié)構(gòu)域，酶促反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因催化雷公藤二萜類化合物的早期合成步驟，對(duì)于培育高品質(zhì)的藥用植物品種特別是培育具有高雷公藤甲素含量的雷公藤品種具有重要的理論及實(shí)際意義。

本發(fā)明提供一種雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4，其氨基酸序列由seqidno：1所示。

本發(fā)明還提供編碼所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4的基因，其核酸序列由seqidno：2所示。

本發(fā)明還提供雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4或其基因在合成二萜類化合物中的用途。

本發(fā)明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其中雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4或其基因，與丹參貝殼烯合酶smksl1或其基因聯(lián)合使用合成松香烷型二萜類化合物。

本發(fā)明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其中所述二萜類化合物包括雷公藤甲素或其前體、丹參酮或其前體等，優(yōu)選的，所述二萜類化合物是次丹參酮二烯。

本發(fā)明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其中先使用雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4以ggpp為底物催化產(chǎn)生cpp，再使用丹參貝殼烯合酶smksl1催化所產(chǎn)生的cpp合成松香烷型二萜類化合物前體。

本發(fā)明還提供一種合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，其包括：(1)將雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4的編碼基因表達(dá)盒插入原核表達(dá)載體中，制備表達(dá)外源雷公藤柯巴基焦磷酸合酶twcps4的重組大腸桿菌，超聲破碎菌體，取含有重組twcps4蛋白的上清液；

(2)將丹參貝殼烯合酶smksl1的編碼基因表達(dá)盒插入原核表達(dá)載體中，制備表達(dá)外源丹參貝殼烯合酶smksl1的重組大腸桿菌，超聲破碎菌體，取含有重組smksl1蛋白的上清液；

(3)以ggpp為底物，以步驟(1)中獲得的含重組twcps4蛋白的上清液為催化劑，催化ggpp產(chǎn)生cpp；

(4)以步驟(3)獲得的cpp為底物，以步驟(2)獲得的含重組smksl蛋白的上清液為催化劑，催化cpp產(chǎn)生松香烷型二萜類化合物前體。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，步驟(1)所述的原核表達(dá)載體為pmal-c2x，所述twcps4基因插入bamhi和sali之間。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，在步驟(3)的催化反應(yīng)完成后還包括正己烷萃取、脫磷的步驟。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，在步驟(4)完成后還包括對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行g(shù)c-ms分析的步驟，其中在第13.06分出現(xiàn)的峰為次丹參酮二烯。

附圖說(shuō)明

圖1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下twcps4不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量；

圖2宿主菌e.colitransb(de3)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物sds-page蛋白電泳分析。m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶由上往下分別為200、116、97.2、66.4kda；箭頭表示目的重組蛋白約130-140kda；

圖3cps催化底物ggpp形成產(chǎn)物提取離子色譜圖。第13.83分的峰為cpp；

圖4cps催化底物ggpp形成產(chǎn)物質(zhì)譜圖，分子離子峰275(m/z)為cpp，圖4a為twcps4，圖4b為smcps1，圖4c為atcps；

圖5(cps+ks)催化ggpp形成產(chǎn)物提取離子色譜圖。第13.06分的峰為次丹參酮二烯；

圖6(cps+ks)催化ggpp形成產(chǎn)物質(zhì)譜圖，分子離子峰272(m/z)為次丹參酮二烯，圖a為smcps1+smksl1，圖6b為twcps4+smksl1。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)懸浮細(xì)胞在文獻(xiàn)“雷公藤4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶基因的全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析.中國(guó)中藥雜志，2015，40(21)：4165-4170”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都醫(yī)科大學(xué)分子生藥與中藥資源實(shí)驗(yàn)室獲得。

smartertmracecdnaamplificationkit，primestargxldnapolymerase購(gòu)自takara公司；peasy-bluntsimplecloningkit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，ggpp購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為g6025。

實(shí)施例一、雷公藤twcps4誘導(dǎo)表達(dá)分析

根據(jù)雷公藤管家基因β-actin和雷公藤twcps4基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。待目的基因引物及管家基因引物檢測(cè)合格后，在abi7500型實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，配備體系如下：

pcr反應(yīng)條件為：

所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物序列如下：

反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-δδct法分析結(jié)果。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)，采用2-δδct方法進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mj能明顯誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞中twcps1、twcps2、twcps3、twcps4、twks、twges1、twges2基因mrna的表達(dá)。具體表現(xiàn)為mj處理后的twcps2、twcps3、twcps4基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平在12h內(nèi)均迅速達(dá)到最大值；twcps1、twks基因基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平在24h內(nèi)均迅速達(dá)到最大值；twges1、twges2基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平在120h內(nèi)均迅速達(dá)到最大值；mj處理組twcps1基因的表達(dá)量是同期對(duì)照組的23.03倍；mj處理組twcps2基因的表達(dá)量是同期對(duì)照組的30.08倍；mj處理組twcps3基因的表達(dá)量是同期對(duì)照組的6.77倍；mj處理組twcps4基因的表達(dá)量是同期對(duì)照組的6.89倍(圖1)；mj處理組twks基因的表達(dá)量是同期對(duì)照組的35.91倍。

實(shí)施例二、雷公藤twcps4原核表達(dá)載體構(gòu)建

以含有雷公藤twcps4基因全長(zhǎng)cdna的載體pmd-19-t-cps4質(zhì)粒為模板，用含酶切位點(diǎn)引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增基因編碼區(qū)(引物序列見(jiàn)表3-1)。dna聚合酶采用高保真dna聚合酶(primestarhsdnapolymerase)。pcr參數(shù)為98℃3min，1循環(huán)；98℃10s，60℃10s，72℃2min30s，30循環(huán)；72℃7min；4℃維持。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)genejetgelextractionkit膠回收(方法如下)。

genejetgelextractionkit膠回收步驟：

(1)取pcr產(chǎn)物與6×loadingbuffer預(yù)混合，在1.5％瓊脂糖凝膠上以低電壓(約5vcm-1)電泳30-60min；

(2)用解剖刀或剃刀片切割含有dna片段的凝膠，盡可能的靠近dna片段切割，以減小凝膠的含量，將膠片放在事先稱重的1.5ml離心管并稱重。記錄膠片的重量。注意避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下，損害dna而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

(3)加1∶1量的bindingbuffer到膠片中(量以重量計(jì)，如每100毫克瓊脂糖凝膠加100微升的bindingbuffer)；

(4)在50-60℃的條件下溫育凝膠混合物10min，期間顛倒混勻2-3次，促進(jìn)膠融化，保證膠全部溶解，在上柱前將凝膠混合物快速渦旋混勻一次；

(5)轉(zhuǎn)移最多800μl凝膠溶解液到基因回收純化柱，13000g離心1min，棄去流出液，然后將柱放回相同的收集管；

(6)加入700μlwashbuffer(已用乙醇稀釋)到genejet純化柱。13000g離心1min，棄去流出液，然后將柱放回相同的收集管；

(7)離心空genejet純化柱13000g離心1min，徹底去除殘留的washbuffer；

(8)將genejet純化柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml離心管，加30-50μlddh20(可60℃預(yù)熱)于純化柱膜，13000g離心1min；

(9)丟掉genejet純化柱并儲(chǔ)存純化的dna在-20℃。

經(jīng)純化后的pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，采用neb公司t4dna連接酶定向連入經(jīng)相同雙酶切的表達(dá)載體pmal-c2x中(方法如下)，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白菌落篩選及陽(yáng)性克隆的初步篩選，并送樣測(cè)序鑒定，得到經(jīng)測(cè)序核苷酸序列無(wú)突變重組質(zhì)粒pmaltps，并將經(jīng)的重組質(zhì)粒pmaltps轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colitransb(de3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。與此同時(shí)，將擬南芥中功能明確的atcps(催化ggpp形成ent-cpp)、atks(催化ent-cpp形成對(duì)映貝殼杉烯)及丹參中功能明確的smcps1(催化ggpp形成nor-cpp)、smksl1(催化nor-cpp形成次丹參酮二烯)構(gòu)建到pmal-c2x原核表達(dá)載體上(smcps1、smksl1利用實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pet32smcps1及pet32smksl1)，將雷公藤twcps1、twcps2、twcps3、twks與其他植物來(lái)源的cps、ks進(jìn)行對(duì)比。

采用takaraquickcut酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)：

雙酶切反應(yīng)體系

雙酶切反應(yīng)(50μl體系)

內(nèi)切酶1酶切完成后，加入1μl內(nèi)切酶2繼續(xù)酶切。注意：最適酶切溫度較低的內(nèi)切酶應(yīng)先進(jìn)行酶切，若最適酶切溫度相同，可同時(shí)加入同時(shí)酶切。

采用nebt4dna快速連接試劑盒進(jìn)行dna片段連接反應(yīng)：

連接反應(yīng)體系

連接反應(yīng)(20μl體系)

*dna與載體摩爾比約為3∶1-10∶1

25℃連接5min(可適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間)。

構(gòu)建原核表達(dá)載體引物序列

實(shí)施例三、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

誘導(dǎo)表達(dá)

100mmol·l^-1iptg：稱取238.3mg的iptg用10ml的ddh2o溶解，過(guò)濾分裝-20℃保存；lb培養(yǎng)基：trytone1.0％，yeastextract0.5％，nacl1.0％，agar1.5％，ph7.0。

操作步驟：

(1)將酶切鑒定正確且經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的含目的基因的重組質(zhì)粒，取1μl轉(zhuǎn)化至50μltransb(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板lb+amp(氨芐青霉素鈉)固體平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

(2)挑取單克隆菌落經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)到含100μg·ml^-1amp的2mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600到0.6-1.0；

(3)取1ml菌液5000g4℃離心5min收集菌體，用新鮮lb+amp液體培養(yǎng)基混懸菌體，轉(zhuǎn)接到100mllb+amp液體培養(yǎng)基中；

(4)37℃培養(yǎng)至宿主菌密度(od600)達(dá)到0.6-1.0時(shí)，加入適量iptg誘導(dǎo)劑(終濃度約0.4mm)，在低溫下(16℃)誘導(dǎo)培養(yǎng)8h；

(5)4℃3000g離心20min收獲菌體，預(yù)冷的5mlhepes緩沖液(50mmhepes，100mmkcl，7.5mmmgcl2，5mmdtt，1mmpmsf，5％甘油，ph7.2)重懸；

(6)置冰浴中超聲破菌(30％功率，超聲5s，間隔5s，持續(xù)3min)；大腸桿菌破碎液在4℃，15000g離心30min，取上清液；

(7)上清液經(jīng)蛋白超濾管濃縮(4℃5000g40min)至1.5ml。

取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sds-page)凝膠電泳檢測(cè)。

實(shí)施例四、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)(圖2)

試劑配制

30％丙烯酰胺貯存液(神經(jīng)毒性，操作時(shí)配戴口罩及手套)：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺29.2g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加ddh2o溶解后，定容到100ml。針頭濾器過(guò)濾后置棕色瓶中，4℃保存；

ph8.8tris-hcl分離膠緩沖液：配制1.5mtris-hcl，并調(diào)節(jié)ph至8.8，4℃保存；

ph6.8tris-hcl濃縮膠緩沖液：配制1mtris-hcl，并調(diào)節(jié)ph至6.8，4℃保存；

10％sds：稱取sds1.0g，蒸餾水10ml溶解，4℃保存；

10％過(guò)硫酸銨(aps)：取aps1.0g，蒸餾水10ml溶解，4℃保存；

temed(四乙基乙二胺)原液；

5×樣品緩沖液(10ml)：0.6ml1mol·l-1的tris-hcl(ph6.8)，5ml50％甘油，2ml10％的sds，0.5ml巰基乙醇，1ml1％溴酚藍(lán)，0.9ml蒸餾水。可在4℃保存數(shù)周，或在-20℃保存數(shù)月；

10×電泳緩沖液：稱取tris30.38g，甘氨酸144g，sds10.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)ph8.3后，用蒸餾水定容至1000ml，置4℃保存，臨用前稀釋10倍。

實(shí)施例五、樣品制備

將蛋白質(zhì)樣品與5×樣品緩沖液在一個(gè)eppendorf管中混合，放入100℃加熱5-10min，常溫12000g離心3min，取上清點(diǎn)樣。

實(shí)施例六、電泳

操作步驟

(1)將玻璃板、樣品梳用洗滌劑洗凈，用ddh2o沖洗數(shù)次，晾干；

(2)安裝玻璃板；

(3)按如下體積配制10％分離膠15ml(配制兩塊膠)，混勻；

(4)向玻璃板間灌制分離膠，立即加入1mlddh20壓平膠面，大約20min后膠即可聚合；

(5)按如下體積配制5％濃縮膠5ml(配制兩塊膠)，混勻；

(6)將上層ddh2o傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；

(7)裝好電泳系統(tǒng)，加入電泳緩沖液，上樣5-10μl；

(8)恒流40ma，溴酚藍(lán)跑出分離膠30min后，停止電泳；

(9)卸下膠板，剝離膠，染色，照膠。

實(shí)施例七、考馬斯亮藍(lán)染色

試劑配制

考馬斯亮藍(lán)r250染色液：0.25％考馬斯亮藍(lán)r250(w/v)，45％甲醇(v/v)，10％冰乙酸；

脫色液(1000ml)：100m冰乙酸，250ml乙醇，蒸餾水補(bǔ)足至1000ml。

染色步驟

室溫染色45min-60min(或微波爐快染，高火20s，兩次)；用蒸餾水清洗3-5遍；加入脫色液，置于100rpm搖床上脫色，每20min更換一次脫色液至膠透明，脫色完成后，用umaxpowerlook2100xl掃描儀進(jìn)行照膠。

實(shí)施例八、酶促反應(yīng)

以ggpp為底物的酶促反應(yīng)，取實(shí)施例三、步驟(7)獲得的濃縮重組cps蛋白上清進(jìn)行酶促反應(yīng)。并以pmal-c2x空載體、pmal-c2x-atcps、pet32a(+)-smcps1轉(zhuǎn)化大腸桿菌transb(de3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，所破碎濃縮得到的重組蛋白上清進(jìn)行酶促反應(yīng)作為對(duì)照。

酶促反應(yīng)體系如下：

濃縮重組蛋白上清182μl

底物ggpp(200μm)18μl

反應(yīng)產(chǎn)物充分混合(槍頭吹打)，在室溫(25℃)、黑暗的環(huán)境下反應(yīng)2h；反應(yīng)結(jié)束后用正己烷抽提3次，每次加入0.5ml，棄有機(jī)相，留水相(留一層正己烷覆蓋水相，防止產(chǎn)物氧化)；然后用n2將水相中的正己烷徹底吹干，以免影響下一步的脫磷反應(yīng)。

脫磷反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)產(chǎn)物充分混合(槍頭吹打)，在37℃下反應(yīng)4h；脫磷后的產(chǎn)物再用正己烷抽提3次，每次加入0.5ml，將抽提所得有機(jī)相匯合在一起；用n2將提取液吹干，并加入60μl正己烷溶解，用于gc-ms分析(圖3、圖4)。

以cpp為底物的酶促反應(yīng)

對(duì)twks進(jìn)行功能分析的酶促反應(yīng)是以經(jīng)cps酶催化ggpp所產(chǎn)生的產(chǎn)物(cpp)作為反應(yīng)底物，分析twks酶催化所得產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而鑒定twks功能。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

(1)配制如下酶促反應(yīng)體系，在室溫(25℃)黑暗條件下反應(yīng)2小時(shí)，使ggpp充分轉(zhuǎn)化成cpp；

濃縮重組ks蛋白上清182μl

底物ggpp(200μm)18μl

(2)向上述反應(yīng)混合液中加入等體積的twks酶，并補(bǔ)充mgcl2至10mm，在室溫(25℃)黑暗條件下，反應(yīng)過(guò)夜(12-16h)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，體系用正己烷抽提3次(每次0.5ml)，所得正己烷相用n2吹干，然后加入60μl正己烷溶解進(jìn)行g(shù)c-ms分析(圖5、6)。實(shí)施例九、反應(yīng)產(chǎn)物gc-ms檢測(cè)

gc-ms分析條件為：取1μl的進(jìn)樣，無(wú)分流的模式下，50℃保持2min，20℃·min-1升至300℃，保持20min；進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度250℃，電子能量70ev，對(duì)樣品進(jìn)行20-650m/z范圍掃描。gc-ms儀器為thermoscientific公司thermotrace1310/tsq8000gaschromatograph，色譜柱為db-5ms(30m×0.25mm)。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>首都醫(yī)科大學(xué)

<120>雷公藤焦磷酸合酶twcps4及其制備松香烷型二萜化合物中的應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<213>雷公藤

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<213>雷公藤

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