一種分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)機(jī)焦磷酸酶是以焦磷酸為底物的水解酶，該酶廣泛存在于自然界，參與合成糖 類、核酸和蛋白質(zhì)等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解。許多利用ATP的代謝活動(dòng)會(huì) 產(chǎn)生焦磷酸，無(wú)機(jī)焦磷酸酶能將生物體代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的焦磷酸降解掉，防止其過(guò)度積累。 IPPA不僅在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，防止無(wú)機(jī)焦磷酸影響生物體的正常代謝，近年來(lái)隨著生物 催化劑的興起，其體外功能也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。
[0003] 無(wú)機(jī)焦磷酸酶是催化焦磷酸水解為正磷酸的一類酶。焦磷酸是某些代謝過(guò)程如 DNA和RNA聚合、氨基酸活化氨酰tRNA合成、脂肪酸的β -氧化脂酰輔酶A的合成、纖維素 合成UDP-葡萄糖的合成和淀粉合成ADP-葡萄糖的合成過(guò)程的副產(chǎn)物。無(wú)機(jī)焦磷酸酶通過(guò) 分解焦磷酸可使上述反應(yīng)向合成方向進(jìn)行并能為許多生物合成反應(yīng)提供能量，因而無(wú)機(jī)焦 磷酸酶是生命所必需的。
[0004] 基因組測(cè)序是當(dāng)代生命科學(xué)技術(shù)的前沿核心技術(shù)之一，其中的焦磷酸測(cè)序法采用 了熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)，讀長(zhǎng)大，精確度高?，F(xiàn)有的熒光素酶純化技術(shù)中，得到的產(chǎn)物純度較 低，容易影響測(cè)序反應(yīng)的精度，不能滿足基因組測(cè)序的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，包括以下步驟： (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8. 0-9. 0 ; (2) 加入金屬鹽：加入鎂鹽和鈣鹽； (3) 加入穩(wěn)定劑； (4) 有機(jī)溶劑沉淀； (5) 無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化； (7) 采用superdex 200進(jìn)行分子排阻。
[0006] 所述鎂鹽為硫酸鎂、氯化鎂和硝酸鎂中的一種或幾種，所述鈣鹽為硫酸鈣、氯化鈣 和硝酸鉀中的一種或幾種。
[0007] 所述步驟（2)中加入鎂鹽和鈣鹽，使鎂離子的終濃度為20-30_〇1/1，鈣離子的終 濃度為 l〇_20mmol/l。
[0008] 所述穩(wěn)定劑為甘油、乙二醇、大豆多糖和二巰基蘇糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選為大 豆多糖和二巰基蘇糖醇，穩(wěn)定劑的終濃度為5_15g/L。
[0009] 所述有機(jī)溶劑沉淀使用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙腈和丙酮中的一種或幾種。
[0010] 所述無(wú)菌過(guò)濾使用〇· 22 μ m濾膜。
[0011] 所述純化方法的步驟中，保持無(wú)機(jī)焦磷酸酶的環(huán)境溫度為16°C以下。
[0012] 所述無(wú)機(jī)焦磷酸酶帶有His-tag。
[0013] 所述鎳柱純化時(shí)，使用20-500mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫。
[0014] 所述superdex 200為GE分子排阻預(yù)裝柱。
[0015] 在進(jìn)行鎳柱純化和superdex 200分子排阻時(shí)，使用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn) 行柱平衡和洗脫。
[0016] 本發(fā)明中加入的鎂鹽和鈣鹽能夠增加無(wú)機(jī)焦磷酸酶的穩(wěn)定性，同時(shí)保持其在純化 過(guò)程中的高活性。穩(wěn)定劑的加入進(jìn)一步確保了無(wú)機(jī)焦磷酸酶的活性在純化過(guò)程中不受損 失。DEAE Sepharose CL-6B離子交換層析柱、superdex 200分子排阻和有機(jī)溶劑沉淀相結(jié) 合，能夠有效去除酶液中的雜蛋白和其他雜質(zhì)分子。使用本方法純化得到的螢火蟲無(wú)機(jī)焦 磷酸酶活力大，純度高，催化效率高，能夠確保反應(yīng)精度，滿足基因組測(cè)序的需要，適宜廣泛 應(yīng)用于基因組測(cè)序中。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8. 5 ; (2) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化按2mmol、氯化鉀3mmol、氯化鎂lOmmol、硫酸鎂 15mmol 和氣化 1? 1 Bmmol ； (3) 加入大豆多糖6g和二巰基蘇糖醇3g ; (4) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入15ml丙酮和20ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離 心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (5 )使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (7) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH8. 5的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥； 以上步驟均在16 °C環(huán)境下進(jìn)行。
[0018] 實(shí)施例2 (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8. 0 ; (2) 取IL焚光素酶粗酶液，加入硝酸鎂20mmol、硫酸1? 12 mmol和氯化1? 8mmol ; (3) 加入甘油5g ; (4) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入20ml甲醇和12ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離 心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (5 )使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (7) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH8. 5的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，蒸發(fā)干燥； 以上步驟（6)和（7)在4°C下進(jìn)行，其他步驟均在16°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0019] 實(shí)施例3 (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至9. O ; (2) 取IL熒光素酶粗酶液，加入氯化銨lmmol、氯化鉀2mmol、氯化鎂30mmol、硫酸鈣2 mmol、氯化 1? 4mmol 和硝酸1? 4mmol ; (3) 加入甘油8g、乙二醇2g和大豆多糖5g ; (4) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入30ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離心，棄去上清， 加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (5 )使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (7) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH8. 5的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，蒸發(fā)干燥； 以上步驟（6)和（7)在4°C下進(jìn)行，其他步驟均在16°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0020] 實(shí)施例4 (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8. 3 ; (2) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化鎂llmmol、硫酸鎂6 mmol、硝酸鎂5mmol和硫酸媽 17mmol ； (3) 加入乙二醇5g和大豆多糖4g ; (4) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入36ml甲醇，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離心，棄去上清， 加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (5 )使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (7) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH8. 5的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，蒸發(fā)干燥； 以上步驟均在16 °C環(huán)境下進(jìn)行。
[0021] 對(duì)比例1 (1) 取IL熒光素酶粗酶液，加入硫酸鎂3mmol和氯化鈣5mmol ; (2) 加入甘油Ig ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入6ml甲醇，攪拌，13000rpm離心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH7. 4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫，干燥； 以上步驟均在26°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0022] 對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1進(jìn)行產(chǎn)物酶純度的測(cè)定，結(jié)果如下：
由表1可知，本發(fā)明中得到的產(chǎn)物純度顯著高于對(duì)比例1，達(dá)到了 98. 73%，而由不同條 件得到的對(duì)比例1產(chǎn)物純度僅為95. 19%。高純度的無(wú)機(jī)焦磷酸酶能夠確保測(cè)序反應(yīng)的順利 進(jìn)行。
[0023] 上述詳細(xì)說(shuō)明是針對(duì)本發(fā)明其中之一可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，該實(shí)施例并非用以 限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明技術(shù) 方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 調(diào)整pH值：調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8. 0-9. O ; (2) 加入金屬鹽：加入鎂鹽和鈣鹽； (3) 加入穩(wěn)定劑； (4) 有機(jī)溶劑沉淀； (5) 無(wú)菌過(guò)濾； (6) 進(jìn)行鎳柱純化； (7) 采用superdex 200進(jìn)行分子排阻。2. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述鎂鹽為硫酸 鎂、氯化鎂和硝酸鎂中的一種或幾種，所述鈣鹽為硫酸鈣、氯化鈣和硝酸鉀中的一種或幾 種。3. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述步驟（2)中加 入鎂鹽和媽鹽，使鎂離子的終濃度為20-30_〇1/1，媽離子的終濃度為10-20_〇1/1。4. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為甘 油、乙二醇、大豆多糖和二巰基蘇糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選為大豆多糖和二巰基蘇糖醇。5. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑沉 淀使用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙腈和丙酮中的一種或幾種。6. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述無(wú)菌過(guò)濾使 用0. 22 ym濾膜。7. 如權(quán)利要求1所述的分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法，其特征在于，所述純化方法的 步驟中，保持無(wú)機(jī)焦磷酸酶的環(huán)境溫度為16°C以下。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶的方法。包括以下步驟：（1）調(diào)節(jié)粗酶液的pH值至8.0-9.0；（2）加入鎂鹽和鈣鹽；（3）加入穩(wěn)定劑；（4）沉淀（5）過(guò)濾；（6）過(guò)鎳柱；（7）進(jìn)行分子排阻。使用本方法得到的無(wú)機(jī)焦磷酸酶應(yīng)用于基因組測(cè)序中，能夠確保反應(yīng)精度，滿足基因組測(cè)序的需要。
【IPC分類】C12N9/14
【公開號(hào)】CN104946612
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510414396
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月15日