專利名稱：：法呢基焦磷酸合成酶rna干擾重組慢病毒載體構建及用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬分子生物學，生物醫(yī)藥及基因工程
技術領域：
，主要涉及針對法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)基因的RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)的構建及其在心肌肥厚和膽固醇代謝調控中的應用。
背景技術：
：目前研究表明小G蛋白參與心肌肥厚的發(fā)生。RhoA屬于小G蛋白的超家族成員，有GDP結合的非活性態(tài)和GTP結合的活性態(tài)兩種形式。目前很多研究表明RhoA參與心肌肥厚的發(fā)生如血管緊張素II(AngII)誘導的心肌肥厚。有研究發(fā)現過表達Rho-GDI(Rho-GDP分離抑制體)及Rho抑制劑C3exeoeZyme可以明顯抑制AngII誘導的心肌肥厚。法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)是甲羥戊酸途徑中的關鍵酶，甲羥戊酸途徑是哺乳動物體內膽固醇合成的唯一途徑。同時FDS也是異戊二烯途徑中的關鍵酶，分解產生的類異戊二烯中間產物為RhoA活化進而發(fā)揮功能提供了重要的底物。我們前期的實驗表明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞用ΙμΜAngII誘導的心肌肥厚模型及自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心肌(該模型心肌中含有高濃度的AngII)，FDS抑制劑阿倫磷酸鈉可以通過明顯抑制RhoA活性來抑制心肌肥厚。這些充分顯示了FDS在心肌中調節(jié)RhoA活性及在心肌肥厚中的可能重要作用。另外我們的研究也表明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中用ΙμΜAngII孵育12-48h，FDS基因得到上調，尤其在24h最為明顯。同時在18周自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心肌中也發(fā)現了FDS基因的上調。這些前期研究表明了FDS在心肌肥厚中可能的重要作用。FDS在其他領域的研究中也表現出相當的重要性。生物學研究顯示通過抑制FDS的表達，寄生蟲生長速度下降直至最后死亡。另外也有研究表明大鼠前列腺癌細胞中發(fā)現FDS高表達。另研究顯示下調FDS的表達能通過Vγ9Vδ2T細胞介導的免疫監(jiān)視作用來靶向治療腫瘤細胞。所有這些證據表明抑制FDS基因的表達可能阻止AngII相關的心肌細胞/組織肥厚反應。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術是抑制基因表達的常用手段，又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現象。RNA干擾過程主要有兩個步驟一、雙鏈RNA被細胞源性雙鏈RNA特異性的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA,即小干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)二、siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，該復合體具有識別結合與小干擾RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。RNA干擾技術目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應用，同時那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身可以進一步開發(fā)成為RNAi藥物。shRNA即短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA)包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間loop序列分隔組成發(fā)夾結構。在體內shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表達。但是要將該技術應用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達持續(xù)及表達效率等重要問題。目前基因治療的載體主要有非病毒載體及病毒載體，然而非病毒載體無法滿足長時間的表達，這一缺陷無疑被病毒載體填補。近年來慢病毒介導的RNA干擾技術在研究中已經取得了良好的開端。慢病毒載體是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構，但又有不同逆轉錄病毒的組分特性，該病毒既可以轉染分裂細胞又可以轉染非分裂細胞。病毒基因組可以整合宿主中，使得基因長時間穩(wěn)定的表達，并且慢病毒具有較低的免疫源性，這使得慢病毒成為RNA干擾的最佳載體，目前廣泛用于基因表達調控，基因治療等領域。我們選用的是第三代復制缺陷型慢病毒載體是自殺性病毒(SIN)，在體內可以較長期的表達且安全性高。因此慢病毒載體介導的RNA干擾效應在靶細胞內長期存在，可為更好發(fā)揮干擾作用創(chuàng)造條件。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種干擾載體，即法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)。所述載體含有慢病毒骨架質粒重組載體pGCSIL-sh-FDS，所述的重組載體是在p-GCSIL-GFP骨架質粒載體的MCS中連接了針對shRNA的雙鏈DNA片段，針對的靶序列為1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息為1#-1:5，-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3，，1#-2:5，-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3，。該載體能有效轉染細胞或組織后特異性降低FDS基因的表達，從而應用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效應，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個制備過程全部使用質粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明中針對的靶基因FDS是甲羥戊酸途徑中的關鍵酶，也是異戊二烯途徑中的關鍵酶，產生的異戊二烯化中間產物為小G蛋白家族包括RhoA活化及功能學提供了重要的底物。甲羥戊酸途徑是哺乳動物體內膽固醇合成的唯一途徑。通過抑制FDS的表達進而降低RhoA的活性，從而有效抑制AngII相關的心肌肥厚。另外通過降低FDS表達，也減少了甲羥戊酸途徑中膽固醇的產生。本發(fā)明通過篩選最有效FDS干擾序列，合成其雙鏈DNA，連接到慢病毒骨架質粒載體中，與輔助質粒共轉染工具細胞(293T細胞)制備出FDS干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS。本發(fā)明的另一個目的是提供所述載體的制備方法，通過以下步驟實現(1)針對FDS基因干擾有效序列的合成、篩選及鑒定；(2)FDS基因干擾慢病毒骨架質粒重組載體pGCSIL-sh-FDS的構建和鑒定；(3)FDS基因干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS的包裝、收集、純化、鑒定和滴度測定。步驟(1)中FDS基因有效干擾序列的篩選，主要分以下幾步(a)、購買FDScDNA(imaGenes,Germany)，通過酶切測序成功克隆GFP-FDS-FLAG融合蛋白質粒；(b)按照RNA干擾序列設計原則，設計四個針對FDS的四個RNA干擾(RNAi)靶點，靶向序列(TargetSeq)分另Ij為1#:5，-GACAGCTTTCTACTCTTTC-3；2#:5，-CACGCTAATGCCCTGAAGA-3，；3#5’-CTGTAGGAGGCAAGTACAA-3；4#:5’-CTGGTGGAACCAAGGAAAC-3’(FDSmRNANM_031840GenBankGI13929205)，并分別合成其雙鏈DNA，序列分別為1#-15'-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3'1#-25'-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3'2#-1:5，-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’2#-25’-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3'3#-1:5’-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3'3#-2:5’-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3'4#-1:5，-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3'4#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’；并合成陰性對照(NC)，DNA片段信息如下NC-I:5，-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3，；NC-2:5，-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3’。然后連接到酶切后的質粒pGC-Ue/Neo/DsRed(質粒載體含有RFP紅色熒光標記，便于觀察)。pGC-U6/Neo/DsRed重組載體構建框架NO.5，STEMPLoopSTEMP1#-1GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT1#-2AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG2#_1GATCCCaaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT2#_2AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG3#_1GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT3#_2AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG4#-lGATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT3#_2AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGGNC-IGATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTNC-2AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG(c)將構建好的FDS融合蛋白和四個不同靶點的RNAi載體質粒或陰性對照質粒(NS，編碼無序序列，無干擾效果)，共同轉染生長狀態(tài)良好的工具細胞293T細胞，36到48小時后分別采用免疫熒光及免疫印跡的方法觀察GFP/RFP表達和檢測FLAG蛋白的表達情況，判斷不同靶點的干擾效果。步驟(2)中，本發(fā)明采用的慢病毒載體構建系統(tǒng)(吉凱，上海)由骨架質粒pGCSIL-GFP，攜帶病毒gag、pol、及rev基因的輔助質粒pHelper1.0及含有NSN-G的輔助質粒pHelper2.0組成。FDS干擾質粒pGCSIL-sh_FDS的構建和鑒定步驟在前(1)外源篩靶結果中獲得最有效序列為1#設計并合成其shRNA的雙鏈DNA。1^'-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3‘；2:5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3，，與pGCSIL-GFP慢病毒骨架質粒載體連接。連接后產物轉化DH5大腸桿菌后PCR及測序鑒定(上海美季公司)。PCR鑒定陽性克隆的引物為Primer:Up:5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3‘；Down:5，-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。慢病毒骨架質粒重組載體構建框架<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>連接產物PCR鑒定循環(huán)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步驟(3)FDS干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS的包裝、收集、純化、鑒定和滴度測定。高純度無內毒素抽提三種質粒pGCSIL-GFP，pHelper1.0和pHelper2.0，制備三種DNA溶液吸取pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper1.0(15μg)和pHelper2.0(10μg)按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明進行共轉染293T細胞，同時設立重組病毒的陽性對照。轉染后8h更換為完全培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液。本發(fā)明的再一目的是提供該基因藥物LV-sh-FDS在心肌肥厚中的應用。在AngII(1μΜ)誘導的心肌細胞肥厚模型中，LV-sh-FDS的應用在有效抑制FDS表達的同時，有效逆轉了心肌細胞對血管緊張素II所致的心肌肥厚反應(具體包括細胞面積減小，β-MHC、BNP等肥厚標記基因的減少等)。在自發(fā)性高血壓大鼠中通過心肌注射LV-sh-FDS，在降低心肌組織FDS表達水平的同時也減輕了i3_MHC、BNP等肥厚標記基因的表達，并部分逆轉心臟指數包括全心/體重(HW/BW)、左室重/體重(LVW/BW)，不同程度改善了心超指標IVSD，EF,FSLV-sh-FDS除了應用于基因治療外，還能夠用于小G蛋白相關的研究，例如通過western及Rho活性試劑盒檢測到，LV-sh-FDS預孵育心肌細胞能有效抑制AngII(IyM)誘導的RhoA活性增加，總RhoA蛋白的表達量沒有改變，進而揭示了在AngII(IyM)誘導的心肌肥厚中，FDS與RhoA之間的關系。LV-sh-FDS也能用于研究甲羥戊酸途徑中的關鍵酶FDS的功能，例如通過商業(yè)化試劑盒發(fā)現自發(fā)性高血壓大鼠血清中的總膽固醇水平(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)得到下降，同時肝臟組織中FDS也得到了抑制。本發(fā)明的載體能有效轉染細胞或組織后特異性降低FDS基因的表達，從而應用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效應，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個制備過程全部使用質粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明中針對的靶基因FDS是甲羥戊酸途徑中的關鍵酶，也是異戊二烯途徑中的關鍵酶，產生的異戊二烯化中間產物為小G蛋白家族包括RhoA活化及功能學提供了重要的底物。甲羥戊酸途徑是哺乳動物體內膽固醇合成的唯一途徑。通過抑制FDS的表達進而降低RhoA的活性，從而有效抑制AngII相關的心肌肥厚。另外通過降低FDS表達，也減少了甲羥戊酸途徑中膽固醇的產生。同時本發(fā)明的LV-sh-FDS帶有熒光標記EGFP便于檢測轉染效率。實驗表明，LV-sh-FDS可以有效的轉染心肌細胞及心肌組織，細胞水平轉染實驗表明MOI為20時，心肌細胞轉染效率可以達到80%以上。同時給藥途徑可采用直接心肌注射也可靜脈給藥冠脈給藥等多種方式。本發(fā)明的藥效實驗表明，LV-sh-FDS能有效抑制心肌細胞及心肌組織中FDS基因的表達。本發(fā)明的有益之處是1本發(fā)明針對FDS靶基因根據在線原則設計出四個有效干擾序列，為克服原代細胞轉染效率低及靶基因無商業(yè)化抗體，構建出四個FDS干擾質粒與FDS融合基因質粒通過共轉染293T細胞，通過檢測標記蛋白篩選出最有效干擾片段，并在靶細胞中得到驗證，為進一步有關FDS基因研究奠定良好實驗基礎。2.本發(fā)明中在構建出最有效的FDS干擾質?；A上進一步通過重組的慢病毒干擾載體構建系統(tǒng)，構建包裝獲得LV-sh-FDS，不僅克服非病毒載體的低轉染效率，也避免了重組腺病毒產生的免疫原性，表達時間較短等缺點，這種重組的慢病毒載體是“自殺性”病毒比較安全能整合到宿主的基因組中，使得干擾作用更加持續(xù)，能廣泛用于體內基因治療及基因功能研究。3.本發(fā)明中的LV-sh-FDS本身帶有EGFP標記在轉染后表達“增強熒光蛋白”便于轉染后的檢測快捷方便。4.本發(fā)明構建的LV-sh-FDS能有效轉染培養(yǎng)的心肌細胞，FDS的mRNA水平得到明顯抑制(78.56%)，心肌細胞對AngII(IyM)誘導的肥厚反應得到了明顯的抑制。在自發(fā)性高血壓大鼠心肌注射LV-sh-FDS11周后，FDS的mRNA水平得到抑制(37.25%)的同時，肥厚基因β-MHC、BNP得到明顯抑制，心臟指數(冊/BW，LVW/BW)部分逆轉，同時心超指標(IVSD,EF,FS%)得到部分改善。預示該載體為心肌肥厚的研究提供了重要的實驗資源。5.本發(fā)明LV-sh-FDS心肌注射有效轉染心肌組織，肥厚反應改善的同時，血清TCLDL-C也有不同程度減輕，肝臟組織FDS水平也能有效抑制，預示LV-sh-FDS可能通過血液循環(huán)影響肝臟FDS的表達，進而調控膽固醇代謝，預示該載體可以通過心肌注射靜脈注射冠脈注射等多種方式實施。6.本發(fā)明能有效轉染心肌細胞，在MOI為20時，轉染效率可以達到80%以上，活體研究中心肌注射LV-sh-FDS得到高效表達，適用于細胞活體內基因功能研究及基因治療等領域的應用。圖1為pGC_U6/Neo/DsRed載體結構示意圖。圖2為pEGFP-Cl載體結構示意圖。圖3為慢病毒骨架質粒pGCSIL-GFP載體結構示意圖。圖4為外源篩靶有效靶點干擾效果圖片。圖5為pGCSIL-sh-FDS瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖6為pGCSIL-sh-FDS測序鑒定圖。圖7為LV-sh-FDS在心肌細胞及心肌組織中的轉染效率圖片。圖8為LV-sh-FDS有效下調心肌細胞/組織中FDSmRNA圖片。圖9為LV-sh-FDS有效改善血管緊張素II相關的心肌細胞肥厚反應圖片。圖10為LV-sh-FDS改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚反應圖片。圖11為LV-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠心臟超聲圖片。圖12為LV-sh-FDS影響RhoA活性及表達的圖片。圖13為LV-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠肝臟FDSmRNA圖片。具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1:FDS融合基因質粒和干擾質粒共轉染工具細胞篩選FDS干擾最有效靶序列siRNA—、按照設計原則，根據在線RNAi系列設計軟件，設計4個干擾靶點，并合成其雙鏈DNA連接到BamHI和HindIII酶切線性化的pGC-U6/Neo/DsRed載體(購自上海吉凱基因化學技術有限公司，參見圖1)后鑒定正確的克隆進行質粒抽提備用。靶點序列(TargetSeq)如下1#:GACAGCTTTCTACTCTTTC2#:CACGCTAATGCCCTGAAGA3#:CTGTAGGAGGCAAGTACAA4#:CTGGTGGAACCAAGGAAAC同時各自的DNA合成片段信息如下1#-1:5，-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3'1#-25'-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3'2#-1:5，-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’2#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3'3#-1:5，-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3'3#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3'4#-1:5，-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3'4#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’，并合成陰性對照(NC)，DNA片段信息如下NC-15，-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3，；NC-2:5，-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3，。二、FDS融合蛋白質粒載體的制備購買FDScDNA文庫(imaGenes，Germany)，利用PCR方法釣取其目的基因與表達載體pEGFP-ClVector(clonetech，#632465，參見圖2)分別進行雙酶切后定向連接并在表達載體的C端加上FLAG標記蛋白，產物轉化感受態(tài)細胞進行PCR鑒定測序分析比對正確構建成功的融合蛋白表達質粒載體PEGFP-FDS-FLAG，并進行超純去內毒素抽提備用。三、外源共轉染293T細胞篩選FDSRNAi最有效靶序列培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的工具細胞(即293T細胞)，將構建好的FDS過表達融合基因質粒(Iyg)和針對不同靶點的RNAi載體質粒(Iyg)及陰性參照質粒(lyg)，按Invitrogen公司的Iipofectamine2000使用說明共轉染293T細胞，36h后在熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP的表達，初步判斷不同靶點的干擾效果，同時轉染效率大于70%以上的實驗組才可進入后續(xù)檢測，48h后采用Westernblot的方法同時檢測FLAG蛋白的表達情況，進而進一步確認最有效的靶點為1號(參見圖4)。圖4中A免疫熒光觀察293細胞過表達質粒和干擾質粒共轉染GFP/RFP的變化，其中a綠色熒光(GFP)，b紅色熒光(RFP)，c平光顯微鏡；B:ffestern-blot檢測293細胞過表達質粒和干擾質粒蛋白共轉染后FLAG蛋白改變，其中OV過表達質粒轉染組，NC陰性病毒轉染組，α-Tubilin:內參照。實施例2慢病毒重組質粒pGCSIL-sh-FDS的構建和鑒定外源篩靶獲得的最有效靶序列為1號GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成其shRNA的雙鏈DNA，合成片段信息如下1:CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg；2:aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt。連接到經AgeI和EcoRI雙酶切后的線性pGCSIL-GFP載體(購自上海吉凱基因化學技術有限公司，參見圖3)，連接反應體系酶切回收的載體DNAdOOng/μ1)1μ1，退火的雙鏈DNA(100ng/y1)1μ1，10ΧΤ4噬菌體DNA連接酶緩沖液1μ1，Τ4噬菌體DNA連接酶1μ1，(ΜΗ207μ1，于4°C連接12h后，然后37°C培養(yǎng)16h轉化到DH5大腸桿菌，提取陽性克隆菌后行PCR及測序鑒定。PCR鑒定陽性克隆的引物為Primer=Up5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，；Down5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3，細菌克隆的PCR產物鑒定結果(圖5)和測序結果(圖6)確證了pGCSIL-sh-FDS插入方向和序列的正確性。測序后進行陽性克隆質粒抽提，獲得的重組質粒pGCSIL-sh-FDS，用于制備慢病毒載體。圖5中泳道1是陰性對照(ddH20)，泳道2是陰性對照(空載體組)306bp，泳道3是MarkerIOkb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb,lkb,750bp,500bp,250bp,泳道4-8是連接入pGCSIL-shFDS載體的陽性克隆343bp。PCR循環(huán)條件(表2):940C30sec94°C30secη60°C30secL30cycle72°C30secJ72°C6min實施例3=FDS基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV_sh_FDS)的制備本慢病毒載體構建系統(tǒng)(購于上海吉凱基因化學技術有限公司)由骨架質粒載體pGCSIL-GFP，攜帶病毒gag、pol、及rev基因的輔助質粒pHelperl.0及含有NSN-G的輔助質粒pHelper2.0組成。制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及輔助質粒即pGCSIL-sh-FDS，pHelperl.0和pHelper2.0質粒，分別進行高純度無內毒素抽提。吸取質粒pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper1·O(15μg)禾口pHelper2·O(10μg),按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明進行共轉染293Τ細胞成功包裝FDS)基因RNA干擾重組慢病毒(LV_sh_FDS)，同時設立陽性對照，即pGCSIL-NS(陰性參照)(20μg)，pHelper1.0(15μg)和pHelper2.O(10μg)共轉染293T細胞構建陰性對照重組慢病毒載體，轉染后8h更換為完全培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液。4°C，4000g離心IOmin除去細胞碎片后并以0.45μM濾器過濾上清液獲得慢病毒備用可滿足一般細胞試驗。若要獲得較高濃度的慢病毒可對其進一步濃縮純化后得到高滴度的慢病毒濃縮液，分裝病毒濃縮液-80度長期保存，取其中一支進行病毒生物學滴度測定。實施例4=FDS基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV_sh_FDS)用于血管緊張素II相關的心肌肥厚模型基因治療研究。一、LV-sh-FDS在體外培養(yǎng)的心肌細胞肥厚的應用取1-3日齡新生WKYs鼠的心室剪成lmm2左右小塊碎，同時用0.125%胰酶與0.05%膠原酶II型混合物重復消化，200目鋼網過濾IOOOg離心6min后收集細胞，5%CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)Ih后，除去貼壁細胞，將細胞密度調整至5X10E5-1X10E6/mL接種于六孔板種培養(yǎng)。按照病毒與細胞比值(MOI)為20加入LV-sh-FDS及陰性病毒顆粒(對照)，感染乳鼠心肌細胞，24h后換完全培養(yǎng)基，感染48h后在熒光顯微鏡下通過觀察GFP表達判斷轉染效率(效率約80%以上)，參見圖7A，感染72h后換無血清培養(yǎng)基24h后加入AngII(1μΜ)孵育24h后結束實驗。結果顯示LV_sh-FDS有效抑制乳鼠心肌細胞中FDS的表達，Ang11(1μΜ)共孵時這種抑制作用更加明顯，陰性病毒顆粒對FDS的表達沒有影響，參見圖8A(i)。同時實驗結果表明LV-sh-FDS能有效抑制心肌細胞對AngII(1μM)的肥厚反應，表現為細胞面積的逆轉及肥厚基因ΒΝΡ、β-MHC表達的下調。參見圖9;另外預孵LV-sh-FDS可以明顯抑制AngII(1μM)(孵育15min)誘導的RhoA活性增加，RhoA蛋白表達量不改變，參見圖12。圖7A免疫熒光鏡觀察轉染后的心肌細胞(IOX)(Μ0Ι=20)；Bjestern-blot檢測心肌組織中GFP蛋白表達，其中a:SHR大鼠未注射病毒液組，b:SHR大鼠陰性病毒轉染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠組。圖8數據以均數士標準誤表示。圖8A細胞水平其中1:未轉染組，2:陰性病毒轉染組，3干擾病毒敲除組，4陰性病毒轉染心肌肥厚模型組(AngII孵育)，5干擾病毒轉染心肌肥厚模型(AngII孵育)，sP<0.05and##P<0.Olvs.2group.**P<0.01vs.4group；圖8B心肌組織，其中b:SHR大鼠陰性病毒轉染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d=WKY大鼠組，*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。圖9的數據以均數士標準誤表示。圖9中A細胞面積，B肥厚標記基因β-MHC，C肥厚標記基因BNP；其中橫坐標的1是陰性病毒感染組，2是干擾病毒敲除組；##Ρ<0.01vs.1group(AngII-)and**P<0.01vs.1group(Ang11+)。圖12的數據以均數士標準誤表示。圖中1陰性病毒轉染組，2陰性病毒轉染心肌肥厚模型組(AngII孵育)，3干擾病毒轉染心肌肥厚模型組(AngII孵育)。sP<0.05vs.1groupand*P<0.05vs.2group。二、LV-sh-FDS用于自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)心肌肥厚的研究7周齡SHR大鼠共12只及7周齡WKYs大鼠6只入組，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰臥位，氣管切開，連接動物呼吸機，打開胸腔，暴露心臟，吸取LV-sh-FDS或者陰性病毒顆粒SOuL(約5XIO7TU)于心尖及左心室壁取3-4點注射重組病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同劑量生理鹽水以正常對照。關閉胸腔，撤除呼吸機。大鼠清醒后于清潔級環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)11周后予以心臟超聲檢查，大鼠稱重后取心臟稱重留取左心室予以逆轉錄和實時定量PCR檢測FDS、BNP、β-MHC的基因檢測。結果顯示LV_sh-FDS能明顯下調FDS的轉錄(圖8B)，同時肥厚基因ΒΝΡ、β-MHC降低，心臟指數(HW/BW和LVW/BW)部分減輕，參見圖10。另外心超結果也有不同程度的改善，參見圖11。圖10數據以均數士標準誤表示。圖10的A:HW/BW(心臟重/體重)，B:LVW/Bff(左室重/體重)，C肥厚標記基因β-MHC,D肥厚標記基因BNP。各圖中b:SHR大鼠陰性病毒轉染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠組；#P<0.05vs.dgroup。*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。圖11數據以均數士標準誤表示。圖11的A:IVSD(舒張末期室間隔壁厚度)，BLVPWD(舒張末期心室后壁厚度)，C:FS(短軸縮短率)，D:EF(射血分數)。各圖中b:SHR大鼠陰性病毒轉染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠陰性對照組。sP<0.05and##P<0.01vs.dgroup；*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。實施例5LV-sh-FDS在膽固醇代謝調控中的研究7周齡SHR大鼠共12只及7周齡WKYs大鼠6只入組，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰臥位，氣管切開，連接動物呼吸機，打開胸腔，暴露心臟，吸取LV-sh-FDS或者陰性病毒顆粒SOuL(約5XIO7TU)于心尖及左心室壁取3-4點注射重組病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同劑量生理鹽水以正常對照。關閉胸腔，撤除呼吸機。大鼠清醒后于清潔級環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)11周后取大鼠全血，3000g離心15min后取血清分裝后置-80度保存。取500uL血清檢測大鼠血清膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)。結果顯示LV-sh-FDS心肌注射有效轉染心肌組織，肥厚反應改善的同時，血清TCLDL-C有不同程度減輕，同時肝臟組織FDSmRNA水平也得到有效抑制，分別參見表1和圖13，預示LV-sh-FDS可能通過血液循環(huán)影響肝臟FDS的表達，進而影響膽固醇代謝，血清膽固醇濃度下降，也預示該載體可能可以通過心肌注射靜脈注射冠脈注射等多種方式實施。表1:LV-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠血清膽固醇數據<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注數據以均數士標準誤表示；b:SHR大鼠陰性病毒轉染組；c:SHR大鼠干擾病毒敲除組；d=WKY大鼠陰性對照組。；#P<0.05and##P<0.01vs.dgroupand*P<0.05vs.bgroup。圖13中b:SHR大鼠陰性病毒轉染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠陰性對照組。sP<0.01vs.dgroupand*P<0.05vs.bgroup。本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學<120>法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾慢病毒載體構建及用途<160>14<210>1<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設計的正義鏈<400>1gatcccaagacagctttctactctttcttcaagagagaaagagtagaaagctgtctttttttggat66<210>2<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>16-34<223>人工設計的反義鏈<400>2Agctatccaaaaaaagacagctttctactctttctctcttgaagaaagagtagaaagctgtcttgg66<210>3<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設計的正義鏈<400>3Gatcccaacacgctaatgccctgaagattcaagagatcttcagggcattagcgtgtttttttggat66<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>16-34<223>人工設計的反義鏈<400>4Agatatccaaaaaaacacgctaatgccctgaagatctcttgaatcttcagggcattagcgtgttgg66<210>5<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223〉人工設計的正義鏈<400>5Gatcccactgtaggaggcaagtacaattcaagagattgtacttgcctcctacagttttttggat64<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>15-33<223>人工設計的反義鏈<400>6Agctatccaaaaaactgtaggaggcaagtacaatctcttgaattgtacttgcctcctacagtgg64<210>7<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設計的正義鏈<400>7Gatcccaactggtggaaccaaggaaacttcaagagagtttccttggttccaccagtttttttggat66<210>8<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq.<222>16-34<223>人工設計的反義鏈<400>8Agctatccaaaaaaactggtggaaccaaggaaactctcttgaagtttccttggttccaccagttgg66<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223>人工設計的正義鏈<400>9Gatccccttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaatttttt60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223>人工設計的反義鏈<400>10Agctaaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaaggg60<210>11<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>7-25<223>人工設計的正義鏈<400>11Ccggaagacagctttctactctttcttcaagagagaaagagtagaaagctgtctttttttg61<210>12<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>13-31<223>人工設計的反義鏈<400>12Aattcaaaaaaagacagctttctactctttctctcttgaagaaagagtagaaagctgtctt61<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>用于PCR反應的上游引物<400>13Cctatttcccatgattccttcata24<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>用于PCR反應的下游引物<400>14Gtaatacggttatccacgcg20權利要求一種針對法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體，其特征在于，所述載體含有慢病毒骨架質粒重組載體pGCSIL-sh-FDS，所述的重組載體是在p-GCSIL-GFP骨架質粒載體的MCS中連接了針對shRNA的雙鏈DNA片段，針對的靶序列為1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息為1#-15’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3’，1#-25’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3’。2.一種針對法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體制備方法，其特征在于，根據FDSmRNA序列，設計合成了針對shRNA的雙鏈DNA片段如下正義鏈5，-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3，反義鏈5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3'然后將上述DNA片段連接到慢病毒骨架質粒載體pGCSIL-GFP中MCS中建成pGCSIL-sh-FDS重組載體，再將pGCSIL-sh-FDS重組載體、pHelper1.OpHelper2.0共轉染293T細胞，獲得所述的重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)。3.根據權利要求2所述的針對FDS基因的RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，在合成的DNA片段末端引入AgeI和EcoRI酶切位點。4.根據權利要求2所述的針對FDS基因的RNA干擾重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，用AgeI和EcoRI酶將pGCSIL-GFP酶切消化，回收大片段后將其與DNA片段連接后轉化感受態(tài)菌，獲得重組陽性克隆。5.根據權利要求1所述的針對法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體在制備治療心肌肥厚藥物中的應用。6.根據權利要求1所述的針對法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體在制備膽固醇代謝調控藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種針對法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體的構建，在工具細胞293T細胞中篩選出FDS基因RNAi最有效靶序列，合成最有效靶序列的雙鏈DNA連接到pGCSIL-GFP載體，通過酶切測序鑒定成功構建該重組載體。研究表明所構建的RNA干擾載體LV-sh-FDS在新生乳鼠心肌細胞中可下調FDSmRNA水平的表達，同時也能下調心肌肥厚標記如細胞面積和標記基因beta-MHC及BNP的表達，另外在下調FDS的同時也能有效抑制RhoA的活性，可在制備治療心肌肥厚疾病的藥物中應用。也可在制備膽固醇代謝調控藥物中的應用。文檔編號C12N15/113GK101805750SQ200910156609公開日2010年8月18日申請日期2009年12月29日優(yōu)先權日2009年12月29日發(fā)明者葉煬,胡申江申請人:浙江大學