專利名稱：體外擴增造血干細胞和前體細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細胞體外擴增的方法，具體是指一種將從人外周血或骨髓中分
離的造血干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)來擴增造血干細胞和前體細胞。
背景技術(shù)：
成熟血細胞的形成是一個非常復(fù)雜的過程，血細胞成熟的過程主要發(fā)生骨髓之 中。造血干細胞通過增殖和分化，生成不同類型的成熟的血細胞。造血干細胞和前體細胞 具有廣泛和長期的自我更新能力，和分化為所有淋巴細胞的能力。CD34標記的造血細胞表 面抗原是造血干細胞和前體細胞的重要標記。骨髓中l(wèi)-5X的細胞表達CD34抗原，外周血 中0. 1-0. 5X的細胞表達CD34抗原。CD34抗原在人血管內(nèi)皮細胞中也有表達。這提供了 人血管內(nèi)皮細胞和造血干細胞之間相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。體外純化和擴增的CD34陽性干 細胞和前體細胞可以輸回體內(nèi)執(zhí)行造血功能。 骨髓提供了干細胞分化，血細胞生成和干細胞自我更新的微環(huán)境。微環(huán)境中有兩 個主要組成部分，淋巴造血因子和骨髓基質(zhì)。骨髓基質(zhì)由成纖維細胞，內(nèi)皮細胞，脂肪細胞 和巨噬細胞/單核細胞組成，這些細胞為干細胞提供了附著滋養(yǎng)層。這些異質(zhì)細胞層可以 為干細胞提供長期有效的增殖和分化所需要的微環(huán)境。在骨髓基質(zhì)中，造血干細胞和前體 細胞進行自我更新，增殖和分化。干細胞與滋養(yǎng)細胞的相互作用在這一過程中起重要作用。
醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界對在體外建立培養(yǎng)體系培養(yǎng)，擴增和分化造血干細胞和前體細 胞表現(xiàn)出了很大的興趣和熱情。擴增和分化造血干細胞和前體細胞可用于人類疾病的治 療，例如骨髓移植。大多數(shù)骨髓移植用來幫助病人在放射治療和化療之后恢復(fù)造血功能。因 此骨髓移植是一個治療晚期惡性腫瘤治療(包括血液和非血液)，骨髓的內(nèi)在缺陷，以及骨 髓外傷(例如，輻射或毒素)重要的輔助手段。骨髓移植與基因治療技術(shù)的結(jié)合已經(jīng)對許 多疾病的治療帶來革命性的影響。 干細胞體外培養(yǎng)可分為兩類，液體培養(yǎng)和基質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)。在進行液體培養(yǎng)時，干 細胞和前體細胞生長在含有生長因子和細胞因子的液體介質(zhì)中。雖然液體培養(yǎng)易于維護， 在技術(shù)上非常適合用于大規(guī)模擴增干細胞進行干細胞治療，但這種方法生產(chǎn)的干細胞和前 體細胞滿足不了長期移植的需要。因為這樣培養(yǎng)出的干細胞迅速分化成為成熟細胞，不再 具備全能性。這可能是由于液體培養(yǎng)的條件下干細胞和前體細胞得不到生長和增殖分化所 必需的微環(huán)境。為了解決這一問題，本發(fā)明采用基質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)。該基質(zhì)中包含有內(nèi)皮細 胞，干細胞和前體細胞，脂肪細胞，成纖維細胞和巨噬細胞，生長因子和/或細胞因子。
第一代的基質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)(Dexter et al. ，Ann. Rev. Cell Bio. 3 :423， 1987)中基 質(zhì)細胞的異質(zhì)性使得這一培養(yǎng)體系中的微環(huán)境的影響很難分析。這個復(fù)雜的微環(huán)境也極大 地妨礙了對造血干細胞發(fā)育階段影響元素的界定。盡管第一代的基質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠長期 持續(xù)生產(chǎn)干細胞，但這些干細胞目前難以用于的治療目的。首先，該系統(tǒng)中的細胞微環(huán)境非 常復(fù)雜，難以進行大幅改善。二，該系統(tǒng)中需要建立的基質(zhì)往往需要幾個星期，阻礙了大規(guī) 模治療的應(yīng)用。最后，該系統(tǒng)生產(chǎn)的干細胞數(shù)量很少，不能滿足治療的需要。
為了克服第一代基質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，Schwartz，Roller和Koller等人設(shè)計了灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以保證干細胞和前體細胞生長在一個可以控制的微環(huán)境中。然而，這些灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)只是對液體培養(yǎng)體系做了簡單的修正，還是無法大規(guī)模擴增干細胞和前體細胞。這也限制了干細胞和前體細胞在骨髓移植和基因治療中的應(yīng)用。因此，有必要發(fā)明一個體外培養(yǎng)系統(tǒng)滿足臨床對造血干細胞和前體細胞的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一個體外培養(yǎng)和擴增造血干細胞和前體細胞的方法，為治療疾病提供了足夠數(shù)量的造血干細胞和前體細胞。這種獨特的培養(yǎng)系統(tǒng)使得本行業(yè)內(nèi)具有基本技能的人士能夠在模擬體內(nèi)的環(huán)境中培養(yǎng)和擴增造血干細胞和前體細胞。本發(fā)明提供的在體外環(huán)境中培養(yǎng)和擴增造血干細胞和前體細胞的技術(shù)，可以用來迅速生產(chǎn)造血干細胞和前體細胞滿足骨髓移植及基因療的臨床應(yīng)用中使用。此外，在用細胞因子共同培養(yǎng)的培養(yǎng)條件下，可以分化造血干細胞和前體細胞為特定的血液細胞。本發(fā)明具有的對造血干細胞和前體細胞的分化能力為干細胞的移植和在基因治療方面的使用提供了強有力的物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明的干細胞用于治療的疾病包括但不限于阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥，老年癡呆癥，多發(fā)性硬化癥，與年齡有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，包括時間，日期，位置或身份混亂，和/或最近的記憶喪失，獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的相關(guān)性癡呆，腦損傷，囊腫，自體免疫疾病，細菌感染，膿腫，病毒感染，腦腫瘤，癲癇，神經(jīng)創(chuàng)傷，手術(shù)切口，糖尿病潰瘍，血友病潰瘍，靜脈曲張潰瘍，固體血管源性腫瘤，白血病，血管瘤，聽神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼，化膿性肉芽腫，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜黃斑變性，角膜移植排斥反應(yīng)，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維組織增生，虹彩，毛細血管，韋伯綜合癥，心肌血管盲目性新生，新生血管和毛細血管擴張，血友病，血管纖維瘤，肉芽，上皮細胞新增生，克羅恩病，化學(xué)，熱，感染或自身免疫引起的腸道損傷，化學(xué)品，熱，感染或自身免疫引起的皮膚損傷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，艾滋病，關(guān)節(jié)炎，胰島素依賴型糖尿病，器官特異性自身免疫性疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腸炎病，橋本甲狀腺炎，甲亢病，接觸性皮炎，牛皮癬，排斥反應(yīng)，移植物抗宿主疾病，結(jié)節(jié)病，胃腸道過敏，嗜酸細胞增多，結(jié)膜炎，腎小球腎炎，驅(qū)蟲感染，瘤型麻風(fēng)病，糖尿病，高雪氏病，尼曼匹克癥，寄生感染，癌癥的免疫系統(tǒng)紊亂，化工(包括毒品和酒精)，物理，感染，或自身免疫引起的肝，肝癌，肝損害，癌癥。本發(fā)明的干細胞，干細胞前體細胞，干細胞分化的功能細胞聯(lián)合使用，可用于治療上述疾病或改善與上述疾病有關(guān)的癥狀。
本發(fā)明提供了一個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以篩選出最佳培養(yǎng)條件，生長因子的組合，細胞滋養(yǎng)程序以用來最大限度的實現(xiàn)造血干細胞和前體細胞的增殖并形成細胞克隆。本發(fā)明提供了一個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有選擇的擴增造血干細胞和前體細胞。通過采用放射療法和/或化學(xué)療法對骨髓中造血干細胞抑制的實驗動物模型來發(fā)展出利用各種干細胞和前體細胞擴增產(chǎn)生的細胞實現(xiàn)造血重建的技術(shù)。舉例來說，通過檢測外周血干細胞的活性，可以測試出骨髓干細胞再生的能力。此外，在體內(nèi)檢測造血干細胞和前體細胞在嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中的擴增來確定這些細胞的活性。 本發(fā)明提供了一個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有選擇的擴增白血病患者放療/化療前造血干細胞和前體細胞用于治療后自體骨髓移植。該系統(tǒng)擴增的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染后還可以用于基因療法。
本發(fā)明提供了一個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有選擇的擴增干細胞和前體細胞用于骨髓移植。這種大規(guī)模的擴增干細胞的技術(shù)不僅可以減少發(fā)病率，死亡率，住院和門診費用，而且還可以發(fā)展出更積極的治療方案和壓縮治療日程，增加癌癥患者的存活率。
本發(fā)明提供了一個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以用來尋找到干細胞和前體細胞擴增的分子機制和細胞交互作用。該系統(tǒng)還可以用來優(yōu)化擴增干細胞的基質(zhì)細胞和/或細胞因子。該系統(tǒng)還可以用來分析影響干細胞擴增和分化有關(guān)的基因和/或其他影響因子。
為了達成上述目標，在本發(fā)明的描述中包含有擴增造血干細胞和前體細胞的方法。該方法包括從人骨髓細胞，外周血中分離出造血干細胞，將分離出干細胞與血管內(nèi)皮細胞在多個細胞因子的存在的情況下擴增干細胞和前體細胞。 本發(fā)明包含有移植擴增后干細胞和前體細胞給病人的方法。該方法包括從人骨髓細胞，外周血中分離出干細胞，將分離出干細胞與血管內(nèi)皮細胞在多個細胞因子存在的情況下擴增干細胞。擴增后的干細胞回輸給病人。 本發(fā)明涉及到在體外培養(yǎng)擴增來源于骨髓和血液的造血干細胞。本發(fā)明使用不同的細胞因子處理內(nèi)皮細胞用于骨髓和血液的干細胞和前體細胞的擴增。 全能干細胞可以通過其功能和表現(xiàn)型得以識別。從功能上看，這些干細胞具有自我更新和分化成所有的淋巴造血細胞系的能力。因此，將全能造血干細胞放在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中后，可以完全和持久地制造血液和淋巴細胞。干細胞和前體細胞也可以通過細胞表面抗原來識別。干細胞的特點是為CD34陽性，CD38陰性，HLA-DR陰性，CD15陰性，Lin陰性，c-kit陽性。人干細胞優(yōu)選CD34陽性，CD38陰性的細胞。 本發(fā)明采用的干細胞可以從骨髓，外周血中分離，也可以來自于單核細胞轉(zhuǎn)化的全能細胞。分離的方法為本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所熟悉的方法。干細胞也可以來自于不同物種，例如，人類，非人類靈長類動物或小白鼠。干細胞和前體細胞應(yīng)當(dāng)相當(dāng)?shù)募兌?，至?5 % ，優(yōu)選95 % ，最好99 % 。 在本發(fā)明的培養(yǎng)體系中，純化的干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞直接接觸培養(yǎng)。內(nèi)皮細胞優(yōu)選人內(nèi)皮細胞。包括但不限于其他物種的內(nèi)皮細胞。CD34陽性干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞接觸培養(yǎng)可以最大限度的擴增干細胞。CD34陽性干細胞和前體細胞可以接種到一個長滿70-100%內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)皿中。共同培養(yǎng)7天后，CD34干細胞陽性干細胞和前體細胞數(shù)量顯著增加。而單獨培養(yǎng)的CD34陽性干細胞和前體細胞數(shù)量則沒有變化。
采用內(nèi)皮細胞作為滋養(yǎng)細胞有許多優(yōu)勢。內(nèi)皮細胞是單純一種細胞，而骨髓基質(zhì)細胞層含有內(nèi)皮細胞，成纖維細胞，脂肪細胞，巨噬細胞和破骨細胞。這些不同種類的細胞共同存在于骨髓基質(zhì)層中用作滋養(yǎng)細胞。分析內(nèi)皮細胞滋養(yǎng)層比分析基質(zhì)層要容易很多。內(nèi)皮細胞成長迅速，48小時擴增一倍，可傳54代，可以很容易的在低血清培養(yǎng)條件培養(yǎng)。而基質(zhì)層細胞傳代能力則十分有限。此外，放射性照射和福爾馬林固定的內(nèi)皮細胞層也可以用來滋養(yǎng)CD34陽性干細胞和前體細胞擴增。 與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)相比，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠顯著的擴增/CD34陽性干細胞和前體細胞擴展。例如，培養(yǎng)7天，CD34陽性干細胞和前體細胞擴增了大約IO倍，培養(yǎng)14天，CD34陽性干細胞和前體細胞擴增了大約95倍。相比之下，基質(zhì)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)7天通常只能擴增1到3倍，14天后CD34陽性干細胞和前體細胞的比例迅速減少。
本發(fā)明的CD34陽性干細胞和前體細胞加入細胞因子與內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)。為了促進擴增的最大化，加入的細胞因子應(yīng)該與CD34陽性干細胞和前體細胞的物種相匹配。本發(fā)明采用單個合適的細胞因子，但不僅僅限于單個合適的細胞因子。 本發(fā)明也采用下列合適的細胞因子組合IL-l+IL-3+SCF，IH + IL_3+SCF+EP0， IH + IL_3+SCF+EP0+IL_6或IH+IL_3+SCF+EP0+IL_6+sIL6R。優(yōu)選IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R ;GM-CSF ;GM-CSF+SCF ;禾P GM-CSF+IL-3+SCF ;GM-CSF+IL-3+SCF+IL-6 ;GM-CSF+IL-3+SCF+IL-6+sIL6R ;GM-CSF+IL-3+SCF+IL-6+sIL6R。確定細胞因子的用量是本行業(yè)內(nèi)具有基本技能的人士所熟知的常規(guī)方法。IL-1，0.1-20. Ong/ml ; ， IL_3，1. 0-200. Ong/ml ;SCF，5. 0-500. Ong/ml ;IL-6，1.0-100. Ong/ml ;sIL-6R，2. 5-250ng/ml。 純化的CD34陽性干細胞和前體細胞與IL-l+IL-3+SCF， IL-l+IL-3+SCF+EP0，IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6或IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R共同培養(yǎng)7天，雖然非貼壁細胞和CFC分別增加了 10. 2和2. 9倍，但是CD34陽性干細胞和前體細胞的數(shù)量沒有增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，細胞因子單獨作用不能夠擴增CD34陽性干細胞和前體細胞。細胞的擴增可能是CD34陽性干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用，其他可溶性生長因子，膜結(jié)合生長因子，細胞粘附分子或細胞因子活化內(nèi)皮細胞而產(chǎn)生的基質(zhì)蛋白共同作用的結(jié)果。此外，內(nèi)皮細胞衍生的細胞外基質(zhì)結(jié)合這些生長因子也可以激活干細胞的擴增。
本發(fā)明中CD34陽性干細胞和前體細胞擴增的機理并不清楚，正在研究之中。有可能是因為細胞因子激活的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生了一種新的造血生長因子(多個生長因子)，用來支持CD34陽性干細胞和前體細胞的擴增。 純化的CD34陽性干細胞和前體細胞具備長期和多向造血重建能力。在進行骨髓移植時，CD34陽性干細胞中的前體細胞是必須的，例如CFU-GM前體細胞。本發(fā)明提供了一個能夠大規(guī)模擴增CD34陽性干細胞中的前體細胞的方法，利用該方法擴增的細胞中含有大量CD34陽性干細胞中的前體細胞，如CFU-GM。具體來說，培養(yǎng)后14天后，2百萬個CD34陽性干細胞和前體細胞可以產(chǎn)生1千5百萬個CFU-GM。這可以滿足自體骨髓移植的需要。15毫升的骨髓和150毫升的外周血中可以得到所需要的CD34陽性干細胞和前體細胞。本發(fā)明顯著減少骨髓和外周血抽取量，減少了全身麻醉的必要性，促進造血功能快速恢復(fù)，減少住院時間。 本發(fā)明可以用于幫助病人短期內(nèi)產(chǎn)生造血細胞。分離，擴增和分化CD34陽性細胞的方法如前文所述。將分化的細胞回輸給病人前，不需要進一步純化CD34陽性干細胞。將分化的細胞回輸給病人的方法是本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所熟知的方法。
本發(fā)明中增殖的CD34陽性干細胞和前體細胞在回輸給病人以前也可以通過基因插入的方法進行基因操作來達到基因治療的目的。本發(fā)明的技術(shù)還可以與"凈化骨髓"技術(shù)相結(jié)合，增殖的CD34陽性干細胞和前體細胞在回輸給病人前刪除掉病人不要的細胞。在合適的培養(yǎng)條件可以產(chǎn)生專門的血液的細胞類型回輸給患者。自體輸血可以廣泛的用在癌癥患者，或者傳染病病原體污染的患者。 本發(fā)明還提供了下面的范例用來描述CD34陽性干細胞和前體細胞目前已知最好的應(yīng)用方式。但這些具體的例子不是為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。 有益效果細胞的擴增效果好，對患者顯著減少骨髓和外周血抽取量，減少了全身麻醉的必要性，促進造血功能快速恢復(fù)，減少住院 間。
說明書附圖

圖1造血干細胞生長圖；顯示接觸生長收獲的干細胞比非接觸培養(yǎng)和液體培養(yǎng)收獲的干細胞顯著增長；其中IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R的細胞因子組合作用增長最有效；其次分別為IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6， IL-l+IL-3+SCF+EP0和IL-l+IL-3+SCF。
圖2造血干細胞生長圖；顯示不同細胞因子組合作用下接觸生長收獲的干細胞與生長時間的關(guān)系；細胞處理25天后增長達到峰值，IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R的作用增長最有效，其次分別為IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6， IL-l+IL-3+SCF+EP0和IL-l+IL-3+SCF。 圖3造血干細胞生長分化圖；顯示不同培養(yǎng)條件下造血干細胞分化為CD38+細胞的程度不同。接觸培養(yǎng)分化的程度最低，液體培養(yǎng)分化為CD38+細胞的程度最高。
圖4CFC形成圖；顯示接觸生長培養(yǎng)的干細胞形成CFC數(shù)量比非接觸培養(yǎng)和液體培養(yǎng)培養(yǎng)的干細胞顯著增多。其中IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R的細胞因子組合作用最有效；其次分別為IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6， IL-l+IL-3+SCF+EP0和IL-l+IL-3+SCF。
圖5干細胞移植后小鼠骨髓生成CFU數(shù)量變化圖；顯示移植了接觸生長培養(yǎng)的干細胞后，小鼠骨髓生成CFU的數(shù)量在21天時達到峰值，隨后保持穩(wěn)定；對照組中的CFU的數(shù)量在第5天達到最低后，不再變化。 圖6干細胞移植后小鼠外周血液中淋巴細胞數(shù)量變化圖；顯示移植了接觸生長培養(yǎng)的干細胞后，小鼠外周血液中淋巴細胞的數(shù)量在20天時達到峰值，隨后下降并保持穩(wěn)定；對照組小鼠淋巴細胞的數(shù)量在第5天達到最低后，不再變化。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施作具體說明
實施例1干細胞擴增 人骨髓細胞和人外周血細胞來自健康的捐獻者。提取CD34陽性干細胞和前體細胞的方法是本行業(yè)內(nèi)具有基本技能的人士所熟知的方法。首先采用密度梯度離心的方法分離人骨髓細胞和人外周血細胞中淋巴細胞。CD34陽性骨髓干細胞和前體細胞使用抗體磁珠法進一步純化。 干細胞通過此過程純化后，流式細胞儀的監(jiān)測表明其純度超過99%。分離純化后的CD34陽性干細胞和前體細胞可以冷凍后在液氮中長期保存(100萬-500萬細胞/毫升)。凍存的細胞可以在37t:水浴中迅速解凍，用培養(yǎng)基沖洗兩次，trypan blue染色表明99%細胞依然存活。 甲基纖維素克隆形成實驗可以用來確定干細胞和前體細胞形成CFC的能力。純化的干細胞和前體細胞加入MDM后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)14天。MDM中加入1%甲基纖維素，30%滅活胎牛血清(FBS)， IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R。 5%的二氧化碳，37°C培養(yǎng)。第14天，表達血紅蛋白的細胞為BFU-E ;粒細胞和/或巨噬細胞和/或巨型真核細胞群落為CFU-MIX ;只含粒細胞和巨噬細胞的群落為CFU-GM。 HUVEC細胞加入IMDM后培養(yǎng)7天。MDM中加入10%滅活胎牛血清(FBS) ， 1%盤尼西林。 本發(fā)明比較了接觸生長與懸浮單獨培養(yǎng)的擴增能力。干細胞分別與HUVEC細胞接觸共同培養(yǎng)，非接觸共同培養(yǎng)，和單獨培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加入IL-l+IL-3+SCF，IL-l+IL-3+SCF+EP0， IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6或IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R. 37°C，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中生長。 7天后，從內(nèi)皮細胞單層中輕輕的移走非貼壁細胞，用手動血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。圖1顯示出接觸生長所收獲的非貼壁細胞比非接觸生長所收獲的非貼壁細胞顯著增加，單獨培養(yǎng)的干細胞增長最少。 接觸生長所收獲的非貼壁細胞在IL-l+IL-3+SCF， IL-l+IL-3+SCF+EP0，IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6和IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R的作用下分別增長了 10. 9，18. 9和39. 6倍。最有效的細胞因子組合為IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R。任何細胞因子組合對內(nèi)皮細胞的生長和組織形態(tài)沒有任何影響。如圖2顯示了造血干細胞在不同細胞因子組合作用下，干細胞生長與時間的關(guān)系。 本發(fā)明比較了在各種細胞因子組合和培養(yǎng)條件下擴增的干細胞中CD34和CD38的表達情況。圖3顯示培養(yǎng)了 7天后的細胞。在IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R的作用下，接觸培養(yǎng)的CD34陽性細胞只有7%為CD38陽性。非接觸培養(yǎng)的CD34陽性細胞有61%為CD38陽性，而單獨培養(yǎng)的干細胞中有超過82%為CD38陽性。 本發(fā)明還比較了單獨培養(yǎng)，非接觸培養(yǎng)和接觸培養(yǎng)7天后擴增的非貼壁細胞中的CFC。單獨培養(yǎng)時IL-l+IL-3+SCF， IL-l+IL-3+SCF+EP0， IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6和IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R細胞因子組合分別激活干細胞CFC增長了 1. 1， 1. 5和3. 2倍。非接觸培養(yǎng)時IL-l+IL-3+SCF， IL-l+IL-3+SCF+EP0， IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6和IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R細胞因子組合分別激活干細胞CFC增長了 3. 5， 4. 5和8. 2倍。接觸培養(yǎng)時IL-l+IL-3+SCF， IL-l+IL-3+SCF+EP0， IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6和IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R細胞因子組合分別激活干細胞CFC增長了 7. 5， 15. 5和23. 2倍。 實施例2小鼠移植 雌性小鼠12-14周齡(C57BL/6)購自美國杰克遜實驗室。動物都維持在12小時光/暗周期。HUVEC細胞加入MDM后培養(yǎng)7天。MDM中加入10%滅活胎牛血清(FBS)，1%盤尼西林。 骨髓細胞體外擴增 小鼠干細胞從股骨骨髓細胞中分離。分離的干細胞接種到長滿HUVEC的培養(yǎng)皿
中。加入GM-CSF(5ng/ml) ， IL-3 (5ng/ml) 37°C ， 5%的二氧化碳培養(yǎng)7天后，從HUVEC層中
輕輕的移走非貼壁細胞。用含有1% FBS和1X盤尼西林的PBS清洗，濃縮。 用頸椎脫位的方法處死小鼠，取出股骨和脾臟。股骨中的細胞用5毫升含10%熱
滅活胎牛血清的PBS沖洗。用25號針頭打散脾臟組織，直到細胞呈現(xiàn)單細胞狀態(tài)。用手動
血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。 骨髓和脾臟細生成CFU-GM的實驗采用前文描述的方法。每毫MEM培養(yǎng)基中含有50萬-100萬細胞，培養(yǎng)基中加入1 %甲基纖維素，30 % FBS，IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R，37。C，5X的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后計算CFU-GM形成數(shù)量。 用1. 0照射劑量率/分鐘Y射線照射小鼠雙邊。對照組第二天沿尾靜脈注入生理鹽水，治療組第二天或者注入懸浮培養(yǎng)擴增的干細胞，或者注入HUVEC共同培養(yǎng)擴增的干細胞。對照組和注入懸浮培養(yǎng)擴增的干細胞組的小鼠平均存活了 14+/-3天。注入huvec 共同培養(yǎng)擴增的干細胞的小鼠平均存活了 60+/-11天。 從小鼠眼底取小鼠外周血。白細胞，紅細胞和血小板用貝克計數(shù)儀快速計數(shù)。白 血細胞(wbc)的數(shù)量和血小板達到了照射4天后到達低谷，在小鼠死亡之前沒有恢復(fù)正常 水平。注入huvec共同培養(yǎng)擴增的干細胞的小鼠平均存活了 60+/-11天。
骨髓和脾臟中造血細胞的恢復(fù) y射線照射小鼠雙邊后，0，4，8，12，15，19，24，28和60天檢測骨髓和脾臟中的 gm-cfc干細胞。注入huvec共同培養(yǎng)擴增的干細胞的小鼠，骨髓干細胞質(zhì)減少到正常骨髓 細胞的10%，照射4天后的前體細胞數(shù)目降到最低。12天后逐漸增加。然而移植后60后 也沒有恢復(fù)到正常水平。脾臟中造血細胞照射4天后的血細胞數(shù)目降到最低，2周后恢復(fù)到 移植前正常水平。
權(quán)利要求
體外擴增骨髓CD34陽性干細胞和前體細胞的方法，其特征在于分離CD34陽性骨髓干細胞和前體細胞；將干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞直接接觸培養(yǎng)；加入至少一種細胞因子擴增干細胞和前體細胞；通過細胞表面抗原進行識別，選取的干細胞和前體細胞為CD34陽性，CD38陰性，HLA-DR陰性，CD15陰性，Lin陰性，c-kit陽性，純度不小于85％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擴增方法，其特征在于所述的細胞因子為IL-1， IL-3， SCF， EP0， IL-6或sIL6R中的一種或幾種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴增方法，其特征在于所述的細胞因子為IL-l+IL-3+SCF、 IL-l+IL-3+SCF+EP0、IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6或IL-l+IL-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R中的一 種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴增方法，其特征在于所述的細胞因子為 IL-1+1L-3+SCF+EP0+IL-6+sIL6R 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，其特征在于所述的干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞 層的體積比為l : 1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，其特征在于所述的干細胞和前體細胞的純度不小 于95%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴增方法，其特征在于所述的干細胞和前體細胞的純度不小 于99%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種干細胞體外擴增的方法，具體是指一種將從人外周血或骨髓中分離的造血干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)來擴增造血干細胞和前體細胞。本發(fā)明通過分離CD34陽性骨髓干細胞和前體細胞；將干細胞和前體細胞與內(nèi)皮細胞直接接觸培養(yǎng)；加入至少一種細胞因子擴增干細胞和前體細胞；通過細胞表面抗原進行識別，選取的干細胞和前體細胞為CD34陽性，CD38陰性，HLA-DR陰性，CD15陰性，Lin陰性，c-kit陽性，純度不小于85％。本發(fā)明的優(yōu)點是細胞的擴增效果好，對患者顯著減少骨髓和外周血抽取量，減少了全身麻醉的必要性，促進造血功能快速恢復(fù)，減少住院時間。本發(fā)明疾病治療有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/0789GK101735979SQ200910155910
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者吳忠福, 徐以兵, 董升炬 申請人:浙江中贏控股集團有限公司