本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種改進的腺苷酸環(huán)化酶的制備方法。

背景技術：

結構和功能分析需要大量的膜蛋白樣本，但是一個瓶頸是如何大批量高效的獲得膜蛋白。在無細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白復雜性降低帶來了轉錄翻譯流程的高效運轉。采用助表達序列的策略可以基于翻譯起始的優(yōu)化帶來無細胞表達效率的快速提高。高頻使用稀有密碼子以及不利起始翻譯已被確定為蛋白質生物合成的主要限制步驟，在mrna的5'端區(qū)域，如核糖體結合位點涉及高風險的二級結構的形成可以減緩甚至阻止啟動程序，高頻的稀有密碼子可能造成翻譯停頓，錯配的氨基酸，甚至過早終止事件，但這樣的問題可以由合成基因表達的優(yōu)化來解決。

腺苷酸環(huán)化酶，簡稱adcy，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白,是g蛋白的效應物,能催化atp生成camp,引起細胞應答。腺苷酸環(huán)化酶廣泛分布于哺乳動物的細胞膜中，此酶催化atp生成camp并釋放焦磷酸。腺苷酸環(huán)化酶主要分布于細胞質膜、核膜和內質網(wǎng)膜上。腺苷酸環(huán)化酶(adcy)是g蛋白偶聯(lián)受體(gpcrs)下游的關鍵信號分子。基本上標準的無細胞是無法表達出完整的蛋白分子的，所以需要對無細胞表達條件進行改進。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一，為此，本發(fā)明的一個目的在于提供了一種改進的無細胞合成技術，旨在體外合成腺苷酸環(huán)化酶。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

本發(fā)明的具體技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種改進的無細胞合成，包括以下步驟：

(1)待表達基因的密碼子優(yōu)化；

在密碼子優(yōu)化后的待表達基因序列的n段添加助表達序列b-tag，c端添加10×his標簽，三段序列連接成整個序列，作為基因克隆的模板。

(2)目的片段的pcr反應；

設計引入酶切位點的上游引物和引入酶切位點的下游引物，對模板進行pcr擴增。

(3)pcr產(chǎn)物的純化回收；

對pcr產(chǎn)物進行純化和回收，另一方面，將pet28a質粒載體轉化大腸桿菌dh5a，培養(yǎng)過夜后提取質粒，并進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質粒條帶進行純化回收。

(4)重組表達載體的構建；

將上述含酶切位點的待表達基因片段與線性pet28a質粒按2：1比例、在45℃下保溫5min后，置于冰浴中冷卻，冷卻后分別加入1μlt4dna連接酶、2μl10×t4dna連接酶緩沖液，l6℃保溫16h。連接液轉化大腸桿菌dh5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后，挑選3～5個菌落做pcr驗證，進一步進行酶切鑒定，陽性克隆用于dna測序。對經(jīng)測序確證的、含pet28a重組質粒的菌落進行質粒提純。

(5)目的基因的無細胞蛋白合成反應

取300μl標準反應混合物裝于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供應試劑(feedingbuffer)裝于50mlcorning離心管中。將d-tube^tmdialyzermidi放入50ml離心管中。供應試劑沒有模板，沒有t7rna聚合酶，其余與標準反應混合物一致。通過sds-page來檢測adcy2的表達情況。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例一還可以具有如下附加的技術特征：改進的無細胞合成系統(tǒng)可以提高表達效率，延長反應時間。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1構建后pet28a-adcy2載體圖譜

圖2adcy2無細胞表達圖

圖3adcy2蛋白純化電泳圖

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

實施例一

1.對adcy2基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的密碼子，核苷酸序列如seqidno：1所示，在密碼子優(yōu)化后序列的adcy2基因的n段添加助表達序列b-tag，如seqidno：2所示；助表達序列為：(5’-atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctat-3’)；c端添加10×his標簽，如seqidno：3所示；標簽為：(5’-catcatcatcatcatcatcatcatcatcat-3’；hhhhhhhhhh)；基因合成整個序列，作為基因克隆的模板。

2.取上述合成的含b-tag和10×his標簽目的片段作為pcr反應的模板，設計引入ncoⅰ酶切位點的上游引物，如seqidno：4所示；引物序列為：(5’-atgctccatggatccagcgtactccaaagatt-3’)；引入xhoⅰ酶切位點的下游引物如seqidno：5所示；助表達序列為：(5’-gggccctcgagatgatgatgatgatgatgatgatgatgatg-3’)；分別取4.0μl模板、2μl10μmol/l的上游和下游引物、1.0μlpfudnapolymerase(5u/μl)、10μl10×buffer、5.0μldntpmixture作為pcr反應體系。用無菌水將反應液調至50μl，于95℃條件下預變性處理2min，然后分別在94℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最終72℃終延伸5min，整個pcr反應體系共進行35個循環(huán)。

3.pcr產(chǎn)物的純化回收

擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，進行dna純化。純化后的adcy2片段進行雙酶切，反應體系如下：30μl添加了酶切位點的adcy2片段、5μl10×bufer、1μlncoⅰ(20u/μl)、lμlxhoⅰ(20u/μl)，用無菌水將反應液調至50μl后，于37℃下保溫1h，然后在65℃條件下處理20min進行熱失活。經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，dna純化試劑盒純化回收。另一方面，將pet28a質粒載體轉化大腸桿菌dh5a，培養(yǎng)過夜后提取質粒，并進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質粒條帶進行純化回收。

4.pet28a-adcy2重組表達載體的構建

將上述含酶切位點的adcy2片段與線性pet28a質粒按2：1比例、在45℃下保溫5min后，置于冰浴中冷卻，冷卻后分別加入1μlt4dna連接酶、2μl10×t4dna連接酶緩沖液，l6℃保溫16h。連接液轉化大腸桿菌dh5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后，挑選3～5個菌落做pcr驗證，進一步進行酶切鑒定，陽性克隆用于dna測序。對經(jīng)測序確證的、含pet28a-adcy2重組質粒的菌落進行質粒提純。

5.目的基因的無細胞蛋白合成反應

標準的無細胞蛋白合成反應包括如下成分：57mmhepes-koh(ph8.2)，1.2mmatp，0.85mmgtp，0.85mmutp，0.85mmctp，0.64mmcamp，200mm谷氨酸鉀，80mm醋酸銨，15mm醋酸鎂，34μg/mlfolinicacid，6.7μg/ml質粒，33μg/mlt7rna聚合酶，20種氨基酸各500μm，2％pet8000，33mm磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大腸桿菌抽提物。

對于半連續(xù)的表達體系，300μl標準反應混合物裝于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供應試劑(feedingbuffer)裝于50mlcorning離心管中。將d-tube^tmdialyzermidi放入50ml離心管中。供應試劑沒有模板，沒有t7rna聚合酶，其余與標準反應混合物一致。通過sds-page來檢測adcy2的表達情況。

實施例二

1.對adcy2基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的密碼子，核苷酸序列如seqidno：1所示，在密碼子優(yōu)化后序列的adcy2基因的c端添加10×his標簽，如seqidno：3所示；標簽為：(catcatcatcatcatcatcatcatcatcat；hhhhhhhhhh)；基因合成整個序列，作為基因克隆的模板。

2.取上述合成的含10×his標簽目的片段作為pcr反應的模板，設計引入ncoⅰ酶切位點的上游引物，如seqidno：4所示；引物序列為：

(5’-atgctccatggatccagcgtactccaaagatt-3’)；引入xhoⅰ酶切位點的下游引物如seqidno：5所示；助表達序列為：

(5-gggccctcgagatgatgatgatgatgatgatgatgatgatg-3’)；分別取4.0μl模板、2μl10μmol/l的上游和下游引物、1.0μlpfudnapolymerase(5u/μl)、10μl10×buffer、5.0μldntpmixture作為pcr反應體系。用無菌水將反應液調至50μl，于95℃條件下預變性處理2min，然后分別在94℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最終72℃終延伸5min，整個pcr反應體系共進行35個循環(huán)。

3.pcr產(chǎn)物的純化回收

擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，進行dna純化。純化后的adcy2片段進行雙酶切，反應體系如下：30μl添加了酶切位點的adcy2片段、5μl10×bufer、1μlncoⅰ(20u/μl)、lμlxhoⅰ(20u/μl)，用無菌水將反應液調至50μl后，于37℃下保溫1h，然后在65℃條件下處理20min進行熱失活。經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，dna純化試劑盒純化回收。另一方面，將pet28a質粒載體轉化大腸桿菌dh5a，培養(yǎng)過夜后提取質粒，并進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質粒條帶進行純化回收。

4.pet28a-adcy2重組表達載體的構建

將上述含酶切位點的adcy2片段與線性pet28a質粒按2：1比例、在45℃下保溫5min后，置于冰浴中冷卻，冷卻后分別加入1μlt4dna連接酶、2μl10×t4dna連接酶緩沖液，l6℃保溫16h。連接液轉化大腸桿菌dh5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后，挑選3～5個菌落做pcr驗證，進一步進行酶切鑒定，陽性克隆用于dna測序。對經(jīng)測序確證的、含pet28a-adcy2重組質粒的菌落進行質粒提純。

5.目的基因的無細胞蛋白合成反應

標準的無細胞蛋白合成反應包括如下成分：57mmhepes-koh(ph8.2)，1.2mmatp，0.85mmgtp，0.85mmutp，0.85mmctp，0.64mmcamp，200mm谷氨酸鉀，80mm醋酸銨，15mm醋酸鎂，34μg/mlfolinicacid，6.7μg/ml質粒，33μg/mlt7rna聚合酶，20種氨基酸各500μm，2％pet8000，33mm磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大腸桿菌抽提物。對于半連續(xù)的表達體系，300μl標準反應混合物裝于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供應試劑(feedingbuffer)裝于50mlcorning離心管中。將d-tube^tmdialyzermidi放入50ml離心管中。供應試劑沒有模板，沒有t7rna聚合酶，其余與標準反應混合物一致。通過sds-page來檢測adcy2的表達情況。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。

<110>武漢金開瑞生物工程有限公司

<120>一種改進的腺苷酸環(huán)化酶的制備方法

<130>2016

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<213>人工序列

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