本發(fā)明屬于食品健康領域，特別涉及一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測方法。

背景技術：

肉是人類優(yōu)質蛋白質和多種營養(yǎng)素的主要來源，含有豐富的必需氨基酸和多種微量元素。近年來，肉的摻假和欺詐行為越來越受到人們的關注。在“馬肉風波”事件之前，國內早已爆出應用化學藥物處理的“假魚翅”、以及牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件。這不僅涉及到食品摻假欺詐的商業(yè)行為而且涉及到民族和宗教信仰問題。因此，基于經濟和宗教方面的考慮，肉的物種鑒定具有非常重要的意義。另一方面，對加工食品而言，物種的原始可識別形態(tài)特征消失，使得物種的鑒別變得相對困難。目前關于肉的物種鑒定方法有：感官分析，解剖和組織學鑒定，顯微技術，化學方法，電泳法，色譜法以及免疫學技術等方法。但是，因加工后的肉品大多已改變其原始形態(tài)，采用這些方法通常不能做出正確判斷。目前迫切需要一些更靈敏和可靠的檢測方法來鑒定動物食品或動物源性加工食品的物種來源。

正是在這樣的背景下，發(fā)展了各種基于DNA的分子鑒定技術，如PCR,PCR-RFLP,Real-time PCR,DNA條形碼技術等。盡管目前的分子技術已經用于許多肉的物種鑒定，如豬肉，鴨肉，雞肉，鵝肉，牛肉，鹿肉，魚肉等。

黃牛是中國固有的普通牛種。黃牛肉質鮮美，品質優(yōu)良，蛋白質含量高，礦物質豐富，脂肪少，且脂肪中胡蘿卜素含量豐富，是廣受消費者青睞的天然綠色食品。但是，基于黃牛肉需求量大，黃牛肉的價格相對于豬肉、魚肉更高，這樣一來，為了經濟利益，不法商販利用其它肉類加工后充當黃牛肉在市場上進行銷售，嚴重損害了消費者的權益，也帶來了諸多的食品安全隱患。如何進行黃牛肉的真?zhèn)舞b定顯得非常重要。目前，關于黃牛肉真?zhèn)舞b定技術方面的研究報道還不多，國內外報道的文獻也只有寥寥幾篇，因此，還需要不斷開發(fā)新的更加快速的方法。

基于以上的分析和目前迫切的需求，本領域技術人員致力于開發(fā)一種能夠簡單、快速、準確鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚募夹g。為目前市場上售賣的黃牛肉及其制品的監(jiān)督提供急需的技術支持，也為消費者的利益提供技術保障，將具有良好的應用前景和推廣價值。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒用于黃牛肉的鑒定，所述試劑盒中包括引物對：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

進一步地，所述試劑盒還包括DNA提取試劑。

進一步的，所述DNA提取試劑選自下組的一種或多種：

TE緩沖液、約10％(w/v)的SDS溶液、約10mg/mL的蛋白酶K、約5M NaCl、CTAB/NaCl、和體積體積比約為24：1的氯仿/異戊醇溶液。

進一步地，所述試劑盒還包括用于PCR擴增的試劑。

進一步地，所述用于PCR擴增的試劑選自下組的一種或多種：

不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液、約25mM的MgCl₂、約2.5mM的dNTPs、約5U/l的Taq DNA聚合酶、和超純水。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測方法，所述方法包括步驟：

1)DNA提取

提供待測樣品，并自所述待測樣品中提取DNA，作為后續(xù)PCR擴增的模板；

2)PCR擴增

使用如下引物對，對步驟1)獲得的DNA進行擴增：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)；

3)結果鑒定

對步驟2)中獲得的PCR擴增產物進行電泳，觀察電泳結果，黃牛肉的擴增片段大小為534bp，如有534bp大小的片段，則判定結果為陽性，所述待測樣品是黃牛肉；如無534bp大小的片段，則判定結果是陰性，所述待測樣品不是黃牛肉。

進一步地，所述步驟1)將提取的DNA濃度稀釋至約100ng/l作為后續(xù)PCR擴增的模板。

進一步地，所述步驟1)包括步驟：

將待測樣品在液氮中研磨成細粉；取1.0g細粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質測定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為后續(xù)PCR擴增的模板。

進一步地，所述步驟2)中，PCR擴增體系包括：

不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl2 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，所述上游引物和所述下游引物的10M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，超純水補充至20 l。

進一步地，所述步驟2)中，PCR擴增反應程序為：

95℃預變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

進一步地，所述步驟3)中，電泳條件為：取10 l PCR產物與1 l的6×上樣緩沖液混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進行點樣，120V條件下電泳25min。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明設計的引物僅針對黃牛物種的COI基因序列進行特異性擴增，其他哺乳動物不能擴增出來，并且采用普通PCR即可進行黃牛肉的鑒定，不需要進行酶切和測序。本發(fā)明操作方便，檢測時間短，監(jiān)測結果準確，靈敏度高，具有很好的應用前景，滿足于市場監(jiān)督檢測。

以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是采集的8份不同黃牛肉樣品采用該發(fā)明進行檢測的凝膠電泳圖。

圖中1-8泳道表示是1-8份不同的黃牛肉樣品；M為DNA分子標準；N為陰性對照。8份黃牛鮮肉樣品均能檢測出534bp的陽性條帶，表明所檢樣品屬于黃牛肉。

圖2是采集的8種不同來源和物種的鮮肉樣品采用該發(fā)明進行檢測的凝膠電泳圖。

圖中1-8泳道分別為新鮮雞肉，豬肉，鴨肉，魚肉，黃牛肉，兔肉，冷凍黃牛肉，黃牛肉干樣品；M為DNA分子標準；N為陰性對照；P為陽性對照。5種不同物種的樣品中，只有5號泳道的新鮮黃牛肉樣品，7號冷凍黃牛肉樣品和8號的黃牛肉干樣品能夠擴增出534bp的陽性條帶，其他樣品未出現(xiàn)擴增條帶，表明該發(fā)明具有很好的特異性。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

本發(fā)明中針對黃牛特有的基因，設計了數(shù)十對的引物進行測試，其中有些引物對雖然特異性較好，但是擴增不穩(wěn)定，結果準確率較低，容易造成假陰性的結果。最終獲得了特異性好，擴增穩(wěn)定的黃牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1))和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2))，對黃牛肉樣品進行監(jiān)測，測試了50個批次，結果準確率100％，說明PCR擴增的穩(wěn)定性極好。該引物對針對黃牛物種(Bostaurus)的特異性基因COI基因(NC_006853.1)，擴增片段長度534bp。

實施例1

為了便于直觀理解本發(fā)明的技術方案，在上海市各區(qū)菜場采集新鮮黃牛樣品8份，按照上述方法進行檢測。

1.DNA提?。簩⑿迈r的動物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細粉；取1.0g細粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl為1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50 l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質測定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為模板。

2.PCR:PCR擴增采用20 l的體系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl2 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，黃牛肉特征上游引物和下游引物的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超純水補充至20 l；PCR擴增反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.電泳檢測：取10 L PCR產物(使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物擴增)與1 L L的6×Loading buffer(上樣緩沖液)混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進行點樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

4.結果鑒定：觀察電泳結果，上述9份黃牛肉的擴增片段大小都為534bp，結果為陽性，8份樣品證實都是黃牛肉，結果見附圖1。

實施例2

為了便于直觀理解本發(fā)明的技術方案，在市場上采集新鮮牛肉，雞肉，豬肉，鴨肉，兔肉，羊肉和魚肉，按照上述方法進行檢測。

1.DNA提取：將新鮮的動物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細粉；取1.0g細粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl為1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50 l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質測定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為模板。

2.PCR:PCR擴增采用20 l的體系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl₂ 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，黃牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’)和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’)的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超純水補充至20 l；PCR擴增反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.電泳檢測：取10 L PCR產物與1 L L的6×Loading buffer(上樣緩沖液)混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進行點樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

4.結果鑒定：觀察電泳結果，只有黃牛肉的擴增片段大小都為534bp，其他肉品均未擴增出條帶，結果見附圖2。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。

序列表

<110> 河南省產品質量監(jiān)督檢驗院

<120> 一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測方法

<130> 0001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacctcca aacaacgaag c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacattaccc cttgcgtagg t 21