專利名稱：雪松疫霉的分子檢測(cè)方法及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)雪松疫霉的引物，以及利用所述引物檢測(cè)雪松疫霉的分子檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
雪松疫霉根腐病菌、Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)引起雪松根部腐爛病。該病害1920年在美國(guó)華盛頓西雅圖里首次發(fā)現(xiàn)。目前該病菌廣泛分布于世界各地(Smith I Μ. Phytophthora lateralisEPPO Bulletin, 2009. 39(1) 43-47. )0 該病害于2010年在我國(guó)臺(tái)灣省首次報(bào)道(Brasier C M, Vettraino A M, Chang T T, et al. Phytophthora lateralis discovered in an old growth Chamaecyparis forest in Taiwan [J], Plant Pathology, 2010， 59(4): 595-603)，大陸地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)，是一類危險(xiǎn)性植物檢疫性病害。雪松疫霉根腐病菌不僅危害雪松，還可以侵染美國(guó)扁柏、短葉紅豆杉、美國(guó)尖葉扁柏、獼猴桃、扁柏、杜松、側(cè)柏、杜鵑花屬植物(James W, Claire S. Pest Risk Analysis For Phytophthora lateralis [Z].2006.)。該病害診斷困難，按常規(guī)方法分離會(huì)產(chǎn)生很多雜菌，影響病原菌的準(zhǔn)確分離。 同時(shí)，疫霉形態(tài)特征復(fù)雜，變異快，且A hterahi與其它病原菌如A cinnamomi、P. gonapodyides %%\iX/rf ^(Torgeson D C, Young R A, Milbrath J A. Phytophthora root rot diseases of Lawson cypress and other ornamentals[M]. Agricultural Experiment Station, Oregon State College, 1954)。因此，常規(guī)的病害診斷技術(shù)難以快速準(zhǔn)確鑒定該病原菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)很多疫霉的分子檢測(cè)進(jìn)行了不少研究?，F(xiàn)已證明，由于tRNA序列在真菌(卵菌)種間高度變異、而在種內(nèi)穩(wěn)定，因此該序列為病原菌的分子檢測(cè)提供了理想的靶序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種雪松疫霉的分子檢測(cè)方法及其引物，利用該引物及檢測(cè)方法檢測(cè)雪松疫霉，速度快、準(zhǔn)確、靈敏度高、穩(wěn)定可靠。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種用于檢測(cè)雪松疫霉的引物，其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。
一種檢測(cè)雪松疫霉的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物。一種利用上述引物檢測(cè)雪松疫霉的方法，其過(guò)程是提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，如果存在分子量約為 192bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。上述的檢測(cè)雪松疫霉的方法，進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為10.0 μ L SYBR Premix Ex TaqTM(2Χ) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L) 各0.4 yL，模板2 μ L，用滅菌水補(bǔ)足體積至20 μ L0所述的檢測(cè)雪松疫霉的方法，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4° C預(yù)變性30 s ；94° C 變性 5 s, 46° C 退火 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95° C 15 s，60° C 1 min, 95° C 15 s, 60° C 15 s。進(jìn)一步地，為提高檢測(cè)雪松疫霉的靈敏度，本發(fā)明還提供另一種用于檢測(cè)雪松疫霉的引物，包括兩對(duì)引物，即第一對(duì)引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二對(duì)引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。本發(fā)明還提供另一種檢測(cè)雪松疫霉的試劑盒，其包含上述的第一對(duì)引物和和第二對(duì)引物。本發(fā)明還提供另一種檢測(cè)雪松疫霉的方法，其過(guò)程是提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用所述的兩對(duì)引物進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)的模板為提取待測(cè)樣品的 DNA，引物為所述的第二對(duì)引物，第二輪PCR反應(yīng)的模板為第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，引物為所述的第一對(duì)引物，取第二輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，如果存在分子量約為192bp的 DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。本發(fā)明具有以下有益效果
本文通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，結(jié)合PCR擴(kuò)增的方法可以有效地檢測(cè)植物組織中的A lateralis。本發(fā)明方法具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，可以在病害侵染初期鑒定出病原物，可參考應(yīng)用于出入境植物和植物產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫和田間調(diào)查，對(duì)控制雪松疫霉傳入我國(guó)具有重要意義，同時(shí)，本發(fā)明體系的建立也為其它病原菌的檢測(cè)提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。本發(fā)明對(duì)從GenBank中得到A lateralis和其它疫霉種的tRNA序列進(jìn)行分析， 設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，利用該引物對(duì)其它15種疫霉和其它真菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只能從A lateralis中擴(kuò)增得到一條 192 bp的條帶，其它菌株均無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，表明該對(duì)引物具有種的特異性。以真菌的 rDNA-ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)進(jìn)行病害的診斷和植物病原真菌的分子檢測(cè)，得到廣泛應(yīng)用，曾有學(xué)者利用rDNA-ITS序列的差異設(shè)計(jì)了 A lateralis的特異性引物(Winton L Μ, Hansen E Μ. Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees, water, and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction[J]. Forest Pathology, 2001，31 (5) : 275-283)，但是A lateralis與P.應(yīng)的ITS序列高度相似，無(wú)法將兩者區(qū)分(Martin F N，Tooley P W. Phylogenetic relationships of Phytophthora ramorum, P. nemorosa, and P. pseudosyringae, three species recovered from areas in California with sudden oak death[J]. Mycological Research, 2003， 107(12): 1379-1391)。而本發(fā)明使用這對(duì)引物則可較容易將二者區(qū)分開來(lái)。高靈敏度是病原菌檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)，它關(guān)系到能否把PCR快速檢測(cè)技術(shù)直接應(yīng)用在出入境植物和植物產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫中。在25 μ L反應(yīng)體系中，普通的PCR方法能檢測(cè)到10 pg P. lateralis基因組DNA。曾經(jīng)報(bào)道套式PCR能把檢測(cè)靈敏度提高l(Tl 000倍 (Zhang ZG, Li Y Q, Fan H, et al. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water[J]. Plant Pathology, 2006, 55 (6): 770-775 ；Ippolito A, Schena L, Nigro F. Detection of Phytophthora nicotianae and P. citrophthora in citrus roots and soils by nested PCR[J]. European Journal ofPlant Pathology, 2002. 108(9) 855-868)，而在本發(fā)明建立的體系中采用套式PCR技術(shù)將檢測(cè)A hterWis基因組DNA的靈敏度提高到了 1 fg，效率提高了 10，000倍，這對(duì)于靶標(biāo)病原物的量非常低或存在PCR抑制物時(shí)非常重要。而在其它疫霉的分子檢測(cè)中，靈敏度只能到 Ipg 的 A ca^sici 基因組 DNA、10 pg 的 A uicotianaH P. citrophthora 基因組DNA和2. 5 pg的A flicoiia/^e基因組DNA，這表明本發(fā)明的引物具有很高的靈敏度。游動(dòng)孢子能通過(guò)灌溉水傳播和侵染寄主，因此是分子檢測(cè)的另一個(gè)重要對(duì)象。在本發(fā)明建立的體系中，檢測(cè)A lateralis的靈敏度達(dá)到了 0. 5個(gè)游動(dòng)孢子。該體系的高靈敏度表明，這種方法可以用于發(fā)病植物中病原物的分子檢測(cè)，能達(dá)到檢驗(yàn)檢疫的目的和要求。對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)合簡(jiǎn)單的DNA提取方法使用特異引物T1/T2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 1個(gè)工作日就可以判斷植物是否被A lateralis侵染。使用NaOH裂解法可以在30 min 之內(nèi)即可得到病組織中病原菌的DNA用于PCR擴(kuò)增，而使用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)至少需要2周。致病植物中病原菌的精確定量對(duì)制定防治策略及防治時(shí)機(jī)極為重要，為此本發(fā)明建立了A hterahi的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系，這對(duì)雪松疫霉根腐病的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和制定防治策略有重要的指導(dǎo)意義。優(yōu)化后的PCR體系和程序避免了因?yàn)榉翘禺愋詳U(kuò)增及引物二聚體等因素造成的非特異性擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。


圖1基于雪松疫霉(Phytophthora htera^s) tRNA序列設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物 T1/T2
圖2引物T1/T2的特異性驗(yàn)證，M 2000 bp marker ；泳道1 一 43 表1中的所有菌株 (順序從上至下)；泳道44 陰性對(duì)照。圖3A常規(guī)PCR對(duì)雪松疫霉if. lateralis)的靈敏度檢測(cè)，M 2000 bp marker ； 泳道 1 一 11 模板濃度分別為 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg, 100 ag, 10 ag和1 ag基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道12 陽(yáng)性對(duì)照。圖3B套式PCR對(duì)雪松疫霉iP. lateralis)的靈敏度檢測(cè)，M 2000 bp marker ； 泳道 1 — 11 模板濃度分別為 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg, 100 ag和10 ag基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道12 陰性對(duì)照。圖4雪松疫霉(P. lateralis)接種植株中游動(dòng)孢子DNA的靈敏度檢測(cè)。M 2000 bp marker ；泳道 1 — 11 模板分別為 0. 5，1，2，3，4，5，6，7，8，9 and 10個(gè)游動(dòng)孢子基因組DNA ；泳道12 陰性對(duì)照。圖5發(fā)病植株中雪松疫霉(P. lateralis)的PCR檢測(cè)，M 2000 bp marker ；泳道1 一 6 以發(fā)病植株粗提DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道7 健康植株對(duì)照；泳道8 陽(yáng)性對(duì)照。圖6熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說(shuō)明。實(shí)施例1 設(shè)計(jì)、合成引物并建立雪松疫霉檢測(cè)試盒的PCR反應(yīng)體系一、引物設(shè)計(jì)與合成
特異性引T1/T2的設(shè)計(jì)對(duì)GeneBank中的P. lateralis和其它疫霉中的tRNA序列進(jìn)行比較分析(圖1)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物T1/T2，序列如下 Tl :5，- GCTTTATATATTTATTAGAT -3，(SEQ ID NO. 1)
禾口 T2:5，- CTCCTTTTTTGATATTAT -3，(SEQ ID NO. 2)。設(shè)計(jì)的引物重新在 GeneBank 中BLAST分析驗(yàn)證其特異性。同時(shí)還設(shè)計(jì)一對(duì)套式PCR外引物T3/T4，根據(jù)A lateralis的tRNA序列，使此引物在特異性引物外側(cè)，設(shè)計(jì)一對(duì)外引物T3/T4，序列如下
T3 :5，- GTTCGAATCCCTTTTTTTGC -3，(SEQ ID NO. 3) T4 :5，- CAACAAATTTACAGTCTGCCGC -3，(SEQ ID NO. 4)。所有引物委托上海英俊(Invitrogen)生物公司合成。二、建立常規(guī)PCR反應(yīng)體系
常規(guī) PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR buffer 2.5 μ L, MgCl2 2 mmol /L，2. 5 mmol/L dNTP 0. 5 μ L，引物(20ymol/L) 0.25 μ L,Taq DNA 酶(5U/μ L) 0. 25 μ L，模板 0· 25 μ L, 擴(kuò)增體系為25 μ L，用滅菌水補(bǔ)足體積。在TaKaRa PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4° C預(yù)變性5min;94° C變性30 s，46° C退火30 s，72° C延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72° C延伸10 min。取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓5 V/cm)，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照，如果存在分子量約為192 bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。三、建立套式PCR反應(yīng)體系
為提高檢測(cè)靈敏度，進(jìn)一步建立了套式PCR反應(yīng)體系。以T3/T4為第一輪反應(yīng)引物，反應(yīng)體系上述常規(guī)PCR體系。反應(yīng)程序中退火溫度為60° C，其他參數(shù)同上述常規(guī)PCR反應(yīng)程序。然后以T1/T2為特異性引物，以第一輪PCR產(chǎn)物(1 μ L)為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。體系同上，退火溫度為46° C，其它參數(shù)不變。所有試劑均購(gòu)于TaKaRa公司。取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓5 V/cm)，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照，如果存在分子量約為192 bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。四、熒光定量PCR反應(yīng)
本發(fā)明進(jìn)一步建立了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為10.0 UL SYBR Premix Ex Taq (2X) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L) 各0.4 yL，模板2 yL，擴(kuò)增體系為20 μ L，用滅菌水補(bǔ)足體積。優(yōu)化后的反應(yīng)程序?yàn)?94° C 預(yù)變性 30 s ；94° C 變性 5 s，46° C 退火 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95° C 15 s，60° C 1 min，95° C 15 s，60° C 15 s。熒光定量 PCR 儀器為 7500 Real-Time PCR System。
實(shí)施例2 制備DNA模板
提取各類樣品的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，具體過(guò)程如下 1.菌絲體的培養(yǎng)、收集及DNA提取 (1)培養(yǎng)基的制備
10% V8培養(yǎng)基100 mL V8汁，CaCO3 0. 2 g,加水定容至1 L。
PDA 培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar)瓊脂粉 20 g, 土豆 200 g,葡萄糖 20 g, 加水定容至1 L。(2)菌絲體培養(yǎng)與收集
將供試疫霉轉(zhuǎn)至V8固體培養(yǎng)基平板上，20° C黑暗培養(yǎng)3 d后從菌落邊緣切取10塊 2 mmX2 mm菌落塊，轉(zhuǎn)至V8液體培養(yǎng)基，25° C振蕩培養(yǎng)5_7天，過(guò)濾收集菌絲，經(jīng)冷凍抽干研磨成粉，-20° C保存?zhèn)溆谩?2)菌絲DNA的提取
取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，于55° C水浴1 h，期間每10 min上下顛倒幾次。12，000 g離心10 min，取上清加等體積酚/氯仿/ 異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻，12，000 g離心10 min，將上清液移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12，000 g離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10 體積的 3 mol/L NaAc (pH 5. 2),-20° C 沉淀(>1 h)。12,000 g 離心 10 min，傾去上清， 沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE (pH8.0)溶解沉淀(含20 μ g /mL RNase)，37° C 處理 Ih 后，-20° C 保存?zhèn)溆谩?.游動(dòng)孢子液DNA的提取
^ M 7Jn Tj (Zheng X B. Phytophthora and methods in phytophthora^Xn Chinese) [M]· Beijing: China Agriculture Press (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué))，1997.)誘導(dǎo) A lateralis釋放游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子DNA粗提方法在60 μ L無(wú)菌水中加入60個(gè)游動(dòng)孢子(顯微鏡下直接計(jì)數(shù))，加0.05 g石英砂，在渦旋器上劇烈振蕩3 min，稍離心，上清液即為游動(dòng)孢子DNA粗提液，分別取0.5-10 μ L上清液直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.發(fā)病植物組織DNA的提取
將供試疫霉轉(zhuǎn)至V8固體平板上，20° C黑暗培養(yǎng)3 d后從菌落邊緣切取3塊2 mmX 2 mm菌落塊，創(chuàng)傷接種于美國(guó)扁柏上。20° C黑暗保濕培養(yǎng)，一段時(shí)間后切取發(fā)病組織提取基因組DNA。具體操作取一段發(fā)病的植株組織，每毫克組織加入10 μ L 0.5 mol /L NaOH, 在研缽中充分研磨后轉(zhuǎn)移至1. 5 !1^的印 611(10什管中，12，000 g離心5 min，取5 μ L上清液加入495 μ L 0. 1 mmol /L Tris ( pH 8.0)，混勻后取1 μ L直接用于PCR反應(yīng)。下面用上述實(shí)施例1檢測(cè)引物及方法和實(shí)施例2制備的模板進(jìn)行雪松疫霉的檢測(cè)。實(shí)施例3 檢測(cè)引物的特異性和靈敏度一、特異性檢測(cè)
本發(fā)明所用菌株及相關(guān)信息見表1。采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物Τ1/Τ2對(duì)表1中所有供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅能從2個(gè)供試的A lateralis菌株中特異地?cái)U(kuò)增出一條192 bp的條帶，而其它供試菌株及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增條帶(表1，圖2)。表明該引物具有種的特異性，可以將A lateralis與其它近似種及其它相關(guān)種區(qū)分開。表1本實(shí)施例中用于篩選引物特異性的菌株
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)雪松疫霉的引物，其特征在于其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述， 下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。
2.一種檢測(cè)雪松疫霉的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物。
3.一種雪松疫霉的分子檢測(cè)方法，其特征在于提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，如果存在分子量約為 192 bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為 10. 0 μ L SYBR Premix Ex TaqTM(2Χ) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L)各0. 4 μ L，模板2 μ L，用滅菌水補(bǔ)足體積至20 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?94° C 預(yù)變性 30 s ；94° C 變性 5 s，46° C 退火 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95° C 15 s，60° C 1 min, 95° C 15 s,60° C 15 s。
6.一種用于檢測(cè)雪松疫霉的引物，其特征在于包括兩對(duì)引物，第一對(duì)引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二對(duì)引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。
7.—種檢測(cè)雪松疫霉的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含權(quán)利要求6所述的引物。
8.一種利用權(quán)利要求6所述的引物檢測(cè)雪松疫霉的方法，其特征在于提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用權(quán)利要求6所述的引物進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)的模板為提取待測(cè)樣品的DNA，引物為所述的第二對(duì)引物，第二輪PCR反應(yīng)的模板為第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，引物為所述的第一對(duì)引物，取第二輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，如果存在分子量約為192 bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雪松疫霉的分子檢測(cè)方法及其引物，建立了一套快速、高靈敏度、穩(wěn)定可靠的檢測(cè)雪松疫霉的分子檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明方法具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，可以在病害侵染初期鑒定出病原物，可參考應(yīng)用于出入境植物和植物產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫和田間調(diào)查，對(duì)控制雪松疫霉傳入我國(guó)具有重要意義，同時(shí)，本發(fā)明體系的建立也為其它病原菌的檢測(cè)提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424851SQ201110443100
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者廖太林, 張正光, 李百勝, 王健生, 紀(jì)睿 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)昆山出入境檢驗(yàn)檢疫局