專利名稱：各種癌癥病理演變前期let-7mirna水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與各種癌癥病理演變RNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
根據(jù)國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預防性篩查，然后及時介入預防性調控和預防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性(多態(tài)性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善(動物模型設計不科學)等。同時，該報告中亦提出應重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術)指標來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統(tǒng)臨床觀念認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹?shù)?，從細胞學角度來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時，同時發(fā)現(xiàn)轉移病灶，不在我們表述的內容中)，其實這時已經是晚期診斷和晚期治療，這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術，選擇多組臨床標本(癌癥病人、高危人群、正常對照)，對LET-7MIRNA基因與各種癌癥的早期預警進行檢測分析。研究顯示let_7miRNA在肺癌和其它癌癥中低表達，它是一種抑癌功能的 microRNA。microRNA (miRNA)是一類小分子非編碼RNA，通常為21-25個核苷酸，可與其靶基因的3’ -非翻譯區(qū)互補配對，激活核蛋白復合體miRNAP，對靶mRNA進行切割或翻譯抑制，從而參與調控基因表達。miRNA廣泛存在于動植物細胞中，與腫瘤關系密切。多數(shù)已知的miRNA位于基因組中與腫瘤相關的區(qū)域，某些組織特異性miRNA表達圖譜的改變可見于直腸結腸癌、肺癌、乳腺癌、膠質細胞瘤、垂體瘤等多種腫瘤。到目前為止，已發(fā)現(xiàn) 100多種microRNA，大部分與腫瘤的病理演變有關。肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，Takamizawa等發(fā)現(xiàn)肺癌患者的let-7表達顯著降低，并且let_7表達水平越低，預后越差，術后生存期越短。體外組織培養(yǎng)實驗表明，在人肺癌細胞中瞬時表達let-7可以抑制細胞的增殖。let-7在肺癌的發(fā)生發(fā)展中作為一個抑癌基因在發(fā)揮作用。let_7a2是這個家族的成員之一，其基因定位于染色體llq24. 1。1，25-二羥維生素D3 (1，25-(OH) 2D3) 是維生素D的體內活性形式，能夠調節(jié)細胞的分化增殖，表達量變化影響細胞增殖，易導致癌癥發(fā)生。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)let-7miRNA在各種癌癥患者、癌癥高危人群、正常對照人有明顯的表達量變化，將let-7miRNA作為早期篩查各種癌癥變前期有非常重要的臨床診斷意義。LET-7MIRNA在各種癌癥變前期及癌變過程中低表達。他作于癌變前期篩查、 及各種癌癥治療后的復發(fā)、轉移預警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌癥。目前對LET-7MIRNA的研究都采用高通量基因芯片分析技術，而這些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，而檢測mRNA比基因分析更科學(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性體現(xiàn))，比蛋白分析更可靠(mRNA與蛋白轉錄有時候不同步)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料Let-7miRNA基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設計了(癌癥患者、高危人群、正常對照)不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上癌癥病人LET-7MIRNA低表達，高危人群有不同程度表達16-2896，正常對照都是高表達。表明LET-7MIRNA各種癌癥變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有咕、353、1251和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察及RNA表達譜芯片的對比，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學和生化指標物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫(yī)學手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術，做了創(chuàng)新性的技術突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與各種癌癥變前期篩查及術復發(fā)、轉移早期預警相關的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針具有序列表SEQ ID NO. 1所示，序列號AJ421724，LET-7MIRNA序列。核苷酸序列長度是22bp，位于17號染色體上。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期LET-7MIRNA篩查試劑盒應用價值在于，對各種癌變前期篩查， 及癌變后或術后復發(fā)、轉移、擴散發(fā)生預警，進一步配合臨床治療。本發(fā)明還提供一種LET-7MIRNA原位雜交的檢測方法，包括以下步驟(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自各種癌癥患者、各種癌癥高危人群、健康正常人群。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的癌癥高危人群、癌癥好發(fā)家族、各種癌癥患者。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以LET-7MIRNA 為檢測對象，合成探針是LET-7MIRNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的miRNA。原位雜交技術的顯示方法能提供LET-7MIRNA的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達量，正常人LET-7MIRNA基因高表達，即大量顯色，LET-7MIRNA基因在各種癌癥病人和正常對照人群有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都低。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以LET-7MIRNA合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 LET-7MIRNA表達量，用來確定各種癌癥病理演變前期的RNA變化量，預警各種癌癥變是否發(fā)生及各種癌癥患者術后是否復發(fā)、轉移的預測。因為LET-7MIRNA在正常人中高表達，如果LET-7MIRNA基因表達量降低，說明有患癌的風險，說明癌變已發(fā)生，或癌癥病人術后已經復發(fā)、轉移，從而獲得癌癥的診斷信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測各種癌癥變發(fā)生和病理演變過程中LET-7MIRNA 表達量的變化，預警各種癌癥發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標志物，以及影像醫(yī)學檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在RNA水平檢測LET-7MIRNA異常表達，在影像醫(yī)學檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復發(fā)之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌病患者一個真正的早期預警以及治療后轉移復發(fā)及早預測。這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治各種癌癥惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖1是本發(fā)明LET-7MIRNA原位雜交技術流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中癌癥病人LET-7MIRNA表達降低圖片。圖3是本發(fā)明實施例中高危人群LET-7MIRNA表達降低圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人LET-7MIRNA表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例1
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以LET-7MIRNA設計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
消化液100 μ L/管1管/盒無色透明液體保護液100 μ L/管1管/盒無色透明液體預雜交液1300 μ L/ 管2管/盒無色透明液體正義雜交液IOuL/t1管/盒無色透明液體反義雜交液IOuL/t1管/盒無色透明液體封閉液1000 μ L/ 管1管/盒無色透明液體堿性磷酸酶抗體1μ!7 管1管/盒無色透明液體顯色劑A175 μ L/ 管1管/盒黃色液體顯色劑B320 μ L/ 管1管/盒無色透明液體緩沖液I90mL/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液II80mL/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液III2OmL/ 瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液IV90mL/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體固定液90mL/ 瓶1瓶/盒無色透明液體陽性對照標本6片/盒
配制試劑使用濃度
1).將IOX緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液I；
2).將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2 X緩沖液II ；
按1:100稀釋成0.2X緩沖液II ；按1:200稀釋成0. IX緩沖液II ；3).將10X緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1X緩沖液III ；
4).IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10!^，加水至IOOmL既可)。實施例2
應用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本LET-7MIRNA表達量的實施過程
1).取待測標本兩張；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μ L加IX緩沖液I 99. 9ml，即為使用濃度)50 ml，37°C水浴預熱lOmin，放進16張玻片，37°C處理12 min,再用IX緩沖液I洗5min ；
3)·用O. 2%的保護液(保護液Iml加1X緩沖澍，99ml即為使用濃度)洗lOmin，三蒸水
洗5min (以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片，讓其自然干燥；
4).將玻片放入保濕盒內，加預雜交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中汕以上；
5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%、90%、95%的乙醇各洗aiiin， 取出，自然干燥；
6).將玻片放入保濕盒內，一張加正義雜交液25μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內
在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ； 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ； 在42°C恒溫水浴箱中用0. IX緩沖液II洗兩次，每次15min ；
8).用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·將玻片放入保濕盒內，加0. 5%封閉液(Iml封閉液加5ml 1 X緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；
10).取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11).將玻片放入保濕盒內，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1.8ml 1 χ緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產生假陽性(此步驟不需加蓋玻片)；
12).取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;
13).用IX緩沖液IV洗anin，加顯色劑(顯色劑A73.3yL，顯色劑B157. 5yL加到 30mL IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。 肝癌病人20名，高危人群(乙肝肝硬化)20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌癥患者LET-7MIRNA表達量低，細胞染色淺；高危人群表達稍降低，小數(shù)染色；正常對照組LET-7MIRNA基因表達量高， 細胞大多數(shù)染色，具體結果見圖2、圖3、圖4。
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示的序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種LET-7MIRNA基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細胞標本選自癌癥、高危人群、正常人標本。
10.LET-7MIRNA基因在制備檢測各種癌癥病變原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與各種癌癥早期病理演變有密切相關let-7miRNA的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測let-7miRNA表達量，比影像醫(yī)學和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的癌變前期RNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102559884SQ20111044299
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權日2011年12月27日
發(fā)明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司