一種檢測(cè)免疫原的方法和裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)免疫原的方法和裝置，具體地，本發(fā)明提供的方法包括步驟：將固定化的第一檢測(cè)抗體與樣品中的所述免疫原接觸，形成第一復(fù)合物；將所述第一復(fù)合物與第二檢測(cè)抗體接觸形成第二復(fù)合物；檢測(cè)所述第二復(fù)合物；第一檢測(cè)抗體中包含至少2種針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體；所述第二檢測(cè)抗體帶有檢測(cè)標(biāo)記。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法的檢測(cè)板和試劑盒。本發(fā)明的方法能夠降低傳統(tǒng)ELISA方法中對(duì)單克隆抗體親和力的要求，使得常規(guī)ELISA方法中無(wú)法使用的特異性、親和力較低的單克隆抗體也能夠用于對(duì)抗原的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
一種檢測(cè)免疫原的方法和裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)免疫原的方法和裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是全球女性第二大常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2008年全球新發(fā)病例約為 53萬(wàn)例，其中85%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。臨床試驗(yàn)、分子生物學(xué)研究和病原學(xué)研究表明， 高危型HPVs的持續(xù)感染是宮頸癌的主要因素[zur Hausen H.Papillomaviruses and cancer:from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2002 ；2:342 -50]，而高危型HPV中又以16/18型常見，其中超過(guò)2/3的宮頸癌與其感染有關(guān)。
[0003] HPV病毒持續(xù)感染后，病毒DNA整合進(jìn)入人體基因組，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)致癌蛋白 (HPV癌蛋白、HPV蛋白）。高危型E6，E7蛋白在HPV相關(guān)疾病的誘導(dǎo)，演變和惡性轉(zhuǎn)化中起 重要作用，在宮頸高度病變和癌癥患者的宮頸上皮細(xì)胞中E6, E7蛋白一般呈過(guò)度表達(dá)。因 此，合適的E6或E7抗體能夠成為HPV誘導(dǎo)疾病的有效篩選和檢測(cè)工具。
[0004] 目前市場(chǎng)上常用的HPV的檢測(cè)和診斷方法主要有：（1)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，如仍沿用60 年代制定的宮頸涂片巴氏染色以及新的新柏氏液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)（LBC) ; (2)HPV DNA檢測(cè)， 雜交捕獲Π (HCII)是目前唯一獲得美國(guó)FDA認(rèn)證的HPV-DNA檢測(cè)方法；（3)免疫組化檢測(cè)， 采用HPVL1和替代靶標(biāo)pl6 INK4A，Ki67, hTERT為檢測(cè)對(duì)象。
[0005] 在形態(tài)學(xué)檢查中，產(chǎn)生損害的原因可以是炎癥或腫瘤疾病，不同特性引起的損害 的區(qū)別是困難的。因此，對(duì)與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，細(xì)胞學(xué)者和病理學(xué)者不得不進(jìn)行特殊訓(xùn)練，并且 檢測(cè)結(jié)果基于檢查者對(duì)診斷標(biāo)準(zhǔn)的主觀解釋。作為結(jié)果，假陽(yáng)性和假陰性的比例往往導(dǎo)致 篩選檢測(cè)結(jié)果非常令人不滿意，陽(yáng)性檢出率僅在30%~50%。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中的從LBC樣本中檢測(cè)HPV核酸的方法，使用LBC樣本作為分析的基礎(chǔ)。 在裂解LBC樣本含有的細(xì)胞之后實(shí)施對(duì)HPV核酸的檢測(cè)。在此方法中對(duì)于從相同LBC樣本 制備的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本獲得的信息，使用了將用于生化的非細(xì)胞基礎(chǔ)的HPV核酸檢測(cè)的非標(biāo)準(zhǔn) 化量的LBC樣本。因此該方法僅僅限于定性檢測(cè)，且無(wú)法區(qū)分HPV是瞬時(shí)感染或是持續(xù)感 染，而HPV的持續(xù)感染是腫瘤惡性演變進(jìn)程中所必須的。
[0007] 目前免疫組化（IHC)檢測(cè)HPV感染的蛋白靶標(biāo)有HPVL1和替代靶標(biāo)pl6INK4A，Ki67， hTERT等。Valentina Faoro等研究表明E7和最為常用的替代靶標(biāo)ρ16ΙΝΚ4Α? IHC檢測(cè)低度 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（L-CIN)、高度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（H-CIN)以及宮頸癌（SCC)時(shí)在免 疫學(xué)方面得到的結(jié)果基本一致[Valentina F, Renzo Β,，Serena Β, Davide Β, Sandro S, and Giorgio S.Detection of HPV E70ncoviral Protein in Cervical Lesions by a New Antibody [J] · Appl Immunohistochem Mol Morphol，2013, 21 (4) :341-350] D 雖然研究表 明pl6INK4A與宮頸疾病的嚴(yán)重性相關(guān)，但是pl6INK4A檢測(cè)的可重復(fù)性受限于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化 制定[Martin CM，O'Leary JJ. Histology of cervical intraepithelial neoplasia and the role of biomarkers. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2011 ；25:605 - 615. ]〇 而E7抗體用于IHC時(shí)，即使在少量病變細(xì)胞時(shí)仍能呈現(xiàn)清晰的染色，能夠檢測(cè)出CIN1到 CIN3不同階段的病變細(xì)胞。
[0008] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種能夠?qū)PV感染相關(guān)腫瘤疾病如宮頸癌以及其前 體階段進(jìn)行前期和可靠的診斷的方法。通過(guò)本方法應(yīng)該可以區(qū)分關(guān)于良性炎癥或（組織） 轉(zhuǎn)化的改變不良損害和早期癌等腫瘤疾病之間的差別。另外，現(xiàn)有技術(shù)中的各種檢測(cè)HPV 的方法，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，特異性差，無(wú)法區(qū)分具體的HPV類型。由于HPV18比HPV16具有更 高的致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此在某些情況下本領(lǐng)域需要一種能夠特異性區(qū)分HPV18和HPV16病毒感 染的診斷方法，以對(duì)癌癥的預(yù)防和/或治療提供針對(duì)性更強(qiáng)的醫(yī)療方案。而且本發(fā)明提供 在生化的基礎(chǔ)上用從溶解的樣本中檢測(cè)癌癥的方法。樣本可以是存在于細(xì)胞保存液中的包 括細(xì)胞的任何種類，如用于基于細(xì)胞學(xué)的液體。
[0009] 本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠快速區(qū)分HPV感染及其類型、特異性強(qiáng)、結(jié) 果穩(wěn)定可靠的檢測(cè)HPV的技術(shù)方案。ELISA憑借其高度的靈敏度、良好的特異性、檢測(cè)速度 快及低檢測(cè)成本等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于體外診斷的分析檢測(cè)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)免疫原的方法和裝置。
[0011] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫原（抗原）的檢測(cè)方法，所述方法中包括步 驟：
[0012] (i)將固定化的第一檢測(cè)抗體與樣品中的所述免疫原接觸，形成第一復(fù)合物；
[0013] (ii)將所述第一復(fù)合物與第二檢測(cè)抗體接觸形成第二復(fù)合物；
[0014] (iii)檢測(cè)所述第二復(fù)合物；
[0015] 其中，所述步驟⑴中，所述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更 優(yōu)選地為2或3種）針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體；所述第二檢測(cè)抗體帶有檢測(cè)標(biāo)記。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中的不同種單克隆抗體分別針對(duì)所述免疫原 的不同抗原表位。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中的不同種單克隆抗體針對(duì)所述免疫原的相 同抗原表位。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述第二檢測(cè)抗體為帶有檢測(cè)標(biāo)記的所述第一檢測(cè)抗體。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫原為疾病標(biāo)志性蛋白。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述疾病包括但不限于：病毒或病菌感染、炎癥、腫瘤、心腦血管 疾病。
[0021 ] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫原為病毒殼體蛋白或其片段。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫原為HPV蛋白。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述HPV選自下組中的一種或多種亞型：HPV16、HPV18、HPV31、 HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述HPV蛋白選自下組：HPV E6蛋白、HPV E7蛋白、HPV L2蛋 白。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體選自申請(qǐng)?zhí)枮?01210033918. 7、 201110384361. 7、201410503512· X 和 201410508253. X 中披露的單克隆抗體。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中包含2種單克隆抗體。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中包含第一單克隆抗體和第二單克隆抗體以 及任選地第三單克隆抗體，所述第一單克隆抗體與所述第二單克隆抗體的重量比為1-3 : 3~1 〇
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述第二檢測(cè)抗體中包含帶檢測(cè)標(biāo)記的所述第一單克隆抗體和 帶檢測(cè)標(biāo)記的所述第二單克隆抗體，所述第一單克隆抗體與所述第二單克隆抗體的重量比 為 1-3 :3-1〇
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（i)中，所述"固定化的第一檢測(cè)抗體"為包被于酶標(biāo) 板的所述第一檢測(cè)抗體。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述"包被于酶標(biāo)板的所述第一檢測(cè)抗體"包被濃度為2-6 μ g/ ml，優(yōu)選地為 3-5 μ g/ml，如 3 μ g/ml、4 μ g/ml、5 μ g/ml。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述第二檢測(cè)抗體的使用濃度為0. 5-3μg/ml，優(yōu)選地為 1-2 μ g/ml〇
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述HPV E7蛋白為HPV18 E7蛋白，其序列如SEQ ID NO. :1所 不。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中的至少一種單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)為SEQ ID NO. : 1中的第44 一 58位氨基酸。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述HPV E7蛋白為HPV16 E7蛋白，其序列如SEQ ID N0. :2所 不。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中的2種單克隆抗體組合選自下組：H11單克 隆抗體和F1單克隆抗體、E8單克隆抗體和H11單克隆抗體、E8單克隆抗體和F1單克隆抗 體。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為能夠特異性區(qū)分HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋 白的單克隆抗體。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記為生物素標(biāo)記、膠體金標(biāo)記、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記、放射性核素標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、或納米粒子標(biāo)記。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述樣品包括：人或動(dòng)物組織樣品、腫瘤切除樣品、宮頸脫落細(xì) 胞、TCT固定細(xì)胞樣本。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述方法用于非診斷性的目的。所述非診斷性的目的包括但不 限于：藥物篩選。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
[0041] (a)提供固定化的單克隆抗體組；
[0042] (b)使待測(cè)樣品與所述固定化的單克隆抗體組接觸；
[0043] (c)提供帶標(biāo)記的單克隆抗體組；
[0044] (d)檢測(cè)是否形成"固定化的單克隆抗體-抗原-帶標(biāo)記的單克隆抗體"復(fù)合物，
[0045] 其中，所述單克隆抗體組中包含至少兩種針對(duì)待測(cè)抗原的單克隆抗體。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述"單克隆抗體"包括H11單克隆抗體、F1單克隆抗體和E8單 克隆抗體中的至少兩種。
[0047] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于免疫原檢測(cè)的檢測(cè)板，所述的檢測(cè)板固定有 第一檢測(cè)抗體，所述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更優(yōu)選地為2或3種） 針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體，所述至少2種單克隆抗體分別針對(duì)所述免疫原的不同抗原 表位。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)板為酶標(biāo)板。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)板為側(cè)流式檢測(cè)板，所述側(cè)流式檢測(cè)板包括基片（支 撐板）和測(cè)試條，所述測(cè)試條上固定有所述第一檢測(cè)抗體。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述測(cè)試條自上游至下游依次分布有抗原加樣區(qū)、所述第二檢 測(cè)抗體、所述第一檢測(cè)抗體，所述第一檢測(cè)抗體固定于所述測(cè)試條，所述第二檢測(cè)抗體可流 動(dòng)的設(shè)置于所述測(cè)試條。所述"固定"是指進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所述第一檢測(cè)抗體不會(huì)隨液體在所 述檢測(cè)板上流動(dòng)。所述"可流動(dòng)"是指，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所述第二檢測(cè)抗體可以隨液體在所述檢 測(cè)板上流動(dòng)。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的測(cè)試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次 搭接組成。
[0052] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括：
[0053] 本發(fā)明第二方面所述的檢測(cè)板，或者
[0054] 用于形成所述檢測(cè)板的酶標(biāo)板和獨(dú)立包裝的所述第一檢測(cè)抗體，以及任選的緩沖 液和細(xì)胞裂解試劑。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括：
[0056] 第二檢測(cè)抗體，所述第二檢測(cè)抗體中包含針對(duì)所述免疫原的帶有檢測(cè)標(biāo)記的單克 隆抗體。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更優(yōu)選地 為2或3種）針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體，所述至少2種單克隆抗體分別針對(duì)所述免疫 原的不同抗原表位。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述第二檢測(cè)抗體中包含至少2種單克隆抗體。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述第二檢測(cè)抗體為帶有檢測(cè)標(biāo)記的所述第一檢測(cè)抗體。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括說(shuō)明書，所述說(shuō)明書中記載有本發(fā)明第一 方面所述的檢測(cè)方法。
[0061] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0062] 圖1多抗體包被夾心ELISA中抗體抗原HPV18 E7蛋白結(jié)合特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0063] 圖2多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)抗體配對(duì)結(jié)果。圖2A為單克隆抗體E8包被，H11 和F1分別檢測(cè)結(jié)果。圖2B為單克隆抗體F1包被，E8和H11分別檢測(cè)結(jié)果。圖2C為單克 隆抗體H11包被，E8和F1分別檢測(cè)結(jié)果。
[0064] 圖3多抗體包被夾心ELISA中抗體包被濃度選擇的檢測(cè)結(jié)果。
[0065] 圖4多抗體包被夾心ELISA中抗原HPV18 E7蛋白結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0066] 圖5對(duì)從宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞CH0細(xì)胞獲得溶解標(biāo)本進(jìn)行HPV 癌蛋白特異性檢測(cè)的多抗體包被夾心ELISA分析。
[0067] 圖6對(duì)從宮頸細(xì)胞株Hela細(xì)胞獲得的溶液標(biāo)本中的HPV癌蛋白進(jìn)行定量分析以 確定多抗體包被夾心ELISA分析的最低癌細(xì)胞檢出量。
[0068] 圖7從宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞CH0細(xì)胞獲得溶解標(biāo)本進(jìn)行不同 比例混合后，對(duì)HPV癌蛋白進(jìn)行定量分析以確定多抗體包被夾心ELISA分析的最低癌細(xì)胞 檢出量。
【具體實(shí)施方式】
[0069] 本發(fā)明人通過(guò)HPV癌蛋白廣泛而深入的研究，意外地獲得一種高靈敏度、高特異 性的檢測(cè)免疫原蛋白的方法，將至少兩種單克隆抗體固定化后加入抗原進(jìn)行反應(yīng)，然后再 加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的同樣的兩種單克隆抗體，反應(yīng)后進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢 測(cè)靈敏、特異性高、穩(wěn)定性好。而且，在常規(guī)雙抗體夾心方法中無(wú)法使用的單克隆抗體，能夠 應(yīng)用于本發(fā)明的方法中進(jìn)行檢測(cè)，極大的降低了對(duì)抗體親和力的要求。本發(fā)明還提供了基 于上述方法的試劑盒以及檢測(cè)板。
[0070] 術(shù)語(yǔ)
[0071] 抗體
[0072] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體（單抗）"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即 該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高 特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑（通常是具有針對(duì)不同決定簇 的不同抗體）不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克 隆抗體的好處還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾 語(yǔ)"單克隆"表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用 任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。
[0073] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抗體"或"免疫球蛋白"是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈（L)和兩個(gè)相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過(guò)一 個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重 鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。 每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相 對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形 成界面。
[0074] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可變"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形 成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗 體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段 中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)FR 區(qū)，它們大致上呈β -折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)⑶R相連，在某些情況下可形成部分 β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的⑶R通過(guò)FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R -起形成了抗 體的抗原結(jié)合部位（參見 Kabat 等，NIH Publ. No. 91-3242,卷 1，647-669 頁(yè)（1991))。恒 定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依 賴于抗體的細(xì)胞毒性。
[0075] 脊椎動(dòng)物抗體（免疫球蛋白）的"輕鏈"可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯 不同的兩類（稱為K和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以 分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步 分成亞類（同種型），如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的 重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是 本領(lǐng)域人員所熟知的。
[0076] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab'）2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0077] 本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"還包括該單克隆抗體的活性片段和活性衍生物等變 異形式。
[0078] 這些變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變 體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與本發(fā)明抗體的編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利 用抗本發(fā)明抗體的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0079] 本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人抗體或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的 多肽外，本發(fā)明還包括了本發(fā)明抗體的片段。通常，該片段具有本發(fā)明抗體的至少約50個(gè) 連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少 約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0080] 在本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"還包括與本發(fā)明述及的抗體的氨基酸序列相比，有至 多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨 基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0081] 表 A

[0084] 雜交瘤細(xì)胞株
[0085] 本發(fā)明的單克隆抗體較佳地由雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，在獲得生產(chǎn)本發(fā)明的HPV蛋白 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地利用該雜交瘤細(xì)胞株制備抗 體。
[0086] 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可很方便地獲知本發(fā)明的抗體的結(jié)構(gòu)（比如抗體的重鏈 可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)），然后可通過(guò)重組方法來(lái)制備適用于本發(fā)明的單克隆抗體。
[0087] 單克隆抗體的制備
[0088] 適用于本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。 例如，本發(fā)明抗原，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利 用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備（見Kohler等人，Nature 256 ;495, 1975 ;Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6:511，1976 ;Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6:292, 1976 ；Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., 1981)或可用重組 DNA 法（美國(guó)專利號(hào)4, 816, 567)制備。
[0089] 代表性的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合、通過(guò)選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞支持抗體的穩(wěn)定高水 平產(chǎn)生、且對(duì)培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基基質(zhì)）敏感的那些骨髓瘤細(xì)胞，包括骨髓瘤細(xì)胞株，例如 鼠類的骨髓瘤細(xì)胞株，包括衍生自M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞株（可購(gòu)自 Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亞哥，加利福尼亞，美國(guó)）以及 SP_2、NZ0 或 X63_Ag8_653 細(xì)胞（可購(gòu)自 American Type Culture Collection，洛克維爾，馬里蘭，美 國(guó)）。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞株也已被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor， J. Immunol.，133 :3001 (1984) ;Brodeur 等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用（Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63 頁(yè)(Marcel Dekker， Inc.，紐約，1987)]。
[0090] 對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以檢測(cè)具有所需特異性的單克隆 抗體的產(chǎn)生，如，通過(guò)體外結(jié)合分析例如，酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析 (RIA)。表達(dá)抗體的細(xì)胞的位置可用FACS進(jìn)行檢測(cè)。然后，可將雜交瘤克隆通過(guò)有限稀 釋步驟形成亞克?。╯ubcloned)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生長(zhǎng)（Goding，單克隆抗體（Monoclonal Antibodies):原則和實(shí)踐（Principles and Practice)，Academic Press (1986) 59-103 頁(yè)）。為了達(dá)到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此 外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水瘤生長(zhǎng)。
[0091] 由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化 工藝適當(dāng)?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法（protein A-Sepharose)、輕 基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
[0092] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，單克隆抗體采用培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞方法制備。取雜 交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱 (Protein G-Sephrose)純化。
[0093] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，單克隆抗體采用Balb/C小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體 的方法制備。將約雜交瘤細(xì)胞接種到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，2-4周內(nèi)可見腹部明顯脹大。抽取 腹水，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法粗提后，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱（Protein G-Sephrose) 純化。
[0094] 適用于本發(fā)明方法的單克隆抗體可以是市售的抗體，也可以是公開文獻(xiàn)中已經(jīng)記 載的抗體。優(yōu)選是抗HPV E7抗體，更優(yōu)選是抗HPV16 E7和/或HPV18 E7單克隆抗體，尤 其優(yōu)選自申請(qǐng)?zhí)枮?201210033918. 7、201110384361· 7、201410503512· X 和 201410508253. X 中公開的單克隆抗體或是與該些單克隆抗體具有同等結(jié)合活性的單克隆抗體，或者是通過(guò) 上述申請(qǐng)文本中記載的單克隆抗體的制備方法所制備的單克隆抗體。
[0095] 標(biāo)記的免疫球蛋白
[0096] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述免疫球蛋白（抗體）帶有可檢測(cè)標(biāo)記物。更佳地， 所述的標(biāo)記物選自下組：膠體金標(biāo)記物、有色標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物。
[0097] 標(biāo)記可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，HPV 蛋白的單克隆抗體用膠體金或生物素標(biāo)記。
[0098] HPV 蛋白
[0099] HPV是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000 個(gè)堿基對(duì)。其中包括8個(gè)早期開放讀碼框架（E1-E8)、2個(gè)晚期讀碼框架和1個(gè)非編碼長(zhǎng)控 區(qū)。在早期開放讀碼框架中，E6和E7基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)刺激最為重要。Ziegent (2003)等研 究已證實(shí)HPV E6、E7基因具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，是潛在的癌基因，編碼HPV E6、E7蛋白為 癌蛋白，在體外能轉(zhuǎn)化小鼠上皮細(xì)胞，也能使人類上皮細(xì)胞發(fā)生永生化，而且HPV E6、E7 蛋白的持續(xù)表達(dá)是維持體外培養(yǎng)細(xì)胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表達(dá)蛋白 E6和E7在宮頸癌的發(fā)生中起著重要作用。癌癥發(fā)生過(guò)程中病毒DNA整合入人體細(xì)胞基因 組內(nèi)，隨著E6和E7蛋白表達(dá)控制的缺失，在高度宮頸非典型增生和宮頸癌病人的上皮細(xì)胞 內(nèi)持續(xù)表達(dá)E6和E7蛋白。E7是腫瘤原性蛋白，且具有較強(qiáng)的抗原性，能夠使腫瘤抑癌基 因pRb失活，最終引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控，導(dǎo)致細(xì)胞永生化而發(fā)生癌變。這使得E7可作為高度 宮頸損傷和宮頸癌檢測(cè)的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物。
[0100] 目前臨床免疫組化檢測(cè)HPV感染主要是采用HPV L1和其他一些輔助生物標(biāo)志，如 P16INK4A，Ki67，hTERT等。臨床HPV檢測(cè)沒有合適的抗體主要有三個(gè)原因：1，HPV蛋白在 臨床組織或細(xì)胞樣本中表達(dá)量較低，需要度高親和力的抗體進(jìn)行檢測(cè)；2, HPV病毒在現(xiàn)有 的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)下不能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)存活；3, E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7 蛋白免疫動(dòng)物不能獲得很好的免疫反應(yīng)，另外使制備得到的抗體往往與其他的HPV蛋白存 在交叉反應(yīng)對(duì)E7蛋白不具有特異性。
[0101] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)通過(guò)HPV癌蛋白廣泛而深入的研究，意外地獲得一種高靈敏度、高 特異性的檢測(cè)免疫原蛋白的方法，將至少兩種單克隆抗體固定化后加入抗原進(jìn)行反應(yīng)，然 后再加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的同樣的兩種單克隆抗體，反應(yīng)后進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方 法檢測(cè)靈敏、特異性高、穩(wěn)定性好。而且，在常規(guī)雙抗體夾心方法中無(wú)法使用的單克隆抗體， 能夠應(yīng)用于本發(fā)明的方法中進(jìn)行檢測(cè)，極大的降低了對(duì)抗體親和力的要求。
[0102] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述HPV18 E7蛋白的氨基酸序列如下：
[0103] MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCE ARIELWESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID N0. :1)。
[0104] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述HPV16 E7蛋白的氨基酸序列如下：
[0105] HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQ STHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID N0. :2)。
[0106] 檢測(cè)板及其材料
[0107] 本發(fā)明的檢測(cè)板可采用本領(lǐng)域常用的檢測(cè)板材料，采用常規(guī)的檢測(cè)板制備方法制 成。
[0108] 本發(fā)明檢測(cè)HPV蛋白的免疫檢測(cè)板，包括測(cè)試條和支撐測(cè)試條的支撐板，如可采 用PVC聚脂膠板等；所述的測(cè)試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組 成，搭接部位可以采用常規(guī)的方法，如膠帶等固定連接；其中：層析材料預(yù)包被膠體金標(biāo)記 或有色標(biāo)記的HPV蛋白單克隆抗體，優(yōu)選被膠體金標(biāo)記的HPV蛋白單克隆抗體，硝酸纖維素 膜上吸附檢測(cè)線和質(zhì)控線；
[0109] 在一個(gè)優(yōu)選的方案中：層析材料上預(yù)包被膠體金標(biāo)記的HPV蛋白單克隆抗體是采 用濃度為〇. 5-1. 5mg/ml膠體金標(biāo)記的HPV蛋白單克隆抗體溶液進(jìn)行預(yù)包被的，包被量為 50 μ Ι/cm2;優(yōu)選的濃度為 0· 5 或 1. 5mg/ml，50 μ Ι/cm 2。
[0110] 檢測(cè)方法與結(jié)果判定
[0111] 平放檢測(cè)板，將試樣滴在濾樣紙上，試樣約120 μ 1，反應(yīng)完成后觀察層析結(jié)果。根 據(jù)出現(xiàn)的條紋位置來(lái)判斷結(jié)果。
[0112] 陰性：質(zhì)控區(qū)、檢測(cè)區(qū)均出現(xiàn)明顯的色帶，示為陰性；
[0113] 陽(yáng)性：只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)明顯色帶，而在檢測(cè)區(qū)無(wú)色帶，示為陽(yáng)性；
[0114] 無(wú)效：質(zhì)控區(qū)、檢測(cè)區(qū)無(wú)任何色帶或在質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)色帶而在檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)色帶，表 明檢測(cè)方法錯(cuò)誤或檢測(cè)板變質(zhì)或失效，應(yīng)重新?lián)Q取檢測(cè)板檢測(cè)。
[0115] 方法和樣本
[0116] 本發(fā)明涉及用于在以細(xì)胞和/或組織溶解的樣本檢測(cè)宮頸癌的方法。該方法步驟 大致如下：獲得細(xì)胞和/或組織樣本；將樣本溶解在介質(zhì)中；檢測(cè)在所述溶解的樣本中HPV 癌蛋白的水平。本發(fā)明方法所使用的樣本可以是存在于細(xì)胞保存液中的包括細(xì)胞的任何樣 本，正如在液基細(xì)胞檢測(cè)法中所使用的。
[0117] 本發(fā)明可以用于HPV感染相關(guān)癌癥中HPV癌蛋白的檢測(cè)，其中HPV感染相關(guān)的癌 癥例如宮頸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、陰莖癌等泌尿生殖系統(tǒng)的腫瘤，小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤 以及頭頸腫瘤以及這些癌癥的前期階段。
[0118] 根據(jù)本發(fā)明，使用HPV癌蛋白分子標(biāo)記可以支持或甚至取代細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué) 檢測(cè)方法。在特殊病例中，蛋白分子標(biāo)記可以被用作診斷工具而不需要進(jìn)一步的基于細(xì)胞 的形態(tài)檢測(cè)的支持。因?yàn)樵跊]有基于細(xì)胞信息支持的情況下，僅僅在蛋白分子水平上對(duì)癌 癥的診斷方法受限于病例，其中標(biāo)記或標(biāo)記的水平應(yīng)該對(duì)將要檢測(cè)的情況有特異性。而如 果生物標(biāo)記是非人源的物質(zhì)，那么這樣的檢測(cè)是完全可區(qū)分的。本發(fā)明所采用的生物標(biāo)記 是HPV癌蛋白，該生物標(biāo)記來(lái)源于病毒，因?yàn)榻M織中病毒存在的標(biāo)記特性不會(huì)發(fā)生在未感 染的人組織中，因此對(duì)HPV感染的檢測(cè)可以在樣本溶液中完成。
[0119] 本發(fā)明中所采用的樣本（樣品）包括細(xì)胞、組織樣本和活檢標(biāo)本。本發(fā)明使用的 術(shù)語(yǔ)"活檢"應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有種類的活檢。因此本發(fā)明中使用的活檢可 以包括例如腫瘤的切除樣本、通過(guò)內(nèi)窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活檢制備的組織樣本。
[0120] 本發(fā)明中使用的樣本可以包括固定的或保存的細(xì)胞或組織樣本。細(xì)胞或組織樣本 可以例如被保存在標(biāo)準(zhǔn)的樣本收集、儲(chǔ)存或運(yùn)輸介質(zhì)中，例如那些本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 商業(yè)可以獲得保存介質(zhì)（福爾馬林、Cytyc "PreservCyt"或Tripath Imaging "Cytorich" 等）。合適的細(xì)胞保存介質(zhì)可以包括一個(gè)或多個(gè)選自醇、醛、酮、酸、金屬離子或汞、醚等的用 于保存細(xì)胞組分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、（正或異）丙醇、（正、異或叔）丁醇或高支 鏈或無(wú)支鏈的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用諸如丙酮的酮類。在標(biāo)準(zhǔn)的樣 本介質(zhì)中使用的酸包括有機(jī)酸（乙酸、三氯乙酸、水楊酸和苦味酸）或諸如鉻酸的無(wú)機(jī)酸。 標(biāo)準(zhǔn)的樣本溶液中可以包括金屬例如銀、銅、鉻、汞、鋨和鈾。諸如乙酸鈾酰、二鉻酸鉀、硫酸 銨等的鹽溶液可以是保存介質(zhì)的組分。
[0121] 另外，在本文公開的方法中可以使用獲得后立即進(jìn)行細(xì)胞裂解的樣本。樣本獲得 后立即進(jìn)行裂解，在此過(guò)程中形態(tài)學(xué)信息已丟失，而樣本的蛋白分子信息被保存。樣本可以 直接從個(gè)體的軀體轉(zhuǎn)移到含有合適的去垢劑和保存劑的溶液中。在裂解介質(zhì)中使用合適的 試劑，可以保存原材料的分子組分，并且不發(fā)生降解。例如通過(guò)使用酶抑制劑而是酶活力降 解最小化。因此，在該裂解介質(zhì)中的檢測(cè)樣本的溶液可以在溶解時(shí)顯示檢測(cè)樣本的蛋白分 子特性。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明，樣本可以溶解在任何合適的裂解介質(zhì)中。該裂解介質(zhì)例如可以是尿 素、甲酰胺，去垢劑的水溶液，例如陰離子去垢劑（如SDS，N-十二烷醇肌酸鈉，去氧膽酸鈉， 烷芳基磺酸鹽，長(zhǎng)鏈（脂肪族）醇硫酸鹽，烯烴硫酸鹽和磺酸鹽，α-烯烴硫酸鹽和磺酸鹽， 硫酸鹽甘油一酸酯，硫酸醚，硫代琥珀酸鹽，鏈烷基磺酸鹽，磷酸酯，烷基異硫代硫酸鹽，蔗 糖酯），陽(yáng)離子去垢劑（如，氯化十六烷基三甲基銨），非離子去垢劑（如，吐溫20，Nonidet P-40, Triton X-100，NP-40，lg印al CA-630，N-辛基-配糖物）或兩性去垢劑（如，CHAPS， 3-十二烷基-二甲基胺-丙烷-1-磺酸，十二烷醇二甲基胺氧化物）和/或氫氧化物堿，例 如氫氧化鈉或氫氧化鉀。通常任何合適的液體可以用作本發(fā)明裂解介質(zhì)的溶劑。液體可以 是有機(jī)或無(wú)機(jī)的，并且可以是純液體，液體混合物或含物質(zhì)溶液的液體并可以含有其他物 質(zhì)以增強(qiáng)溶劑的性質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，裂解介質(zhì)的配方是50mM Tris-HCl，150mM 恥(：1，1%陬-40,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%505。
[0123] 根據(jù)本發(fā)明用于溶解樣本的裂解介質(zhì)可以進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)防止原材料中 組分降解的試劑。該組分例如包括酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中， 樣本直接裂解。蛋白酶抑制劑例如可以包括絲氨酸蛋白酶抑制劑，半胱氨酸蛋白酶抑制劑， 天門冬氨酸蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，酸性蛋白酶抑制劑，堿性蛋白酶抑制劑或中 性蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，蛋白酶抑制劑采用的是Pepstatin (胃蛋白酶抑 制劑），Leupeptin (亮抑制肽），（抑蛋白酶肽）以及100 μ g/ml PMSF(苯甲基磺酰氟）。
[0124] 試劑盒
[0125] 本發(fā)明還提供了一種基于本發(fā)明方法的含有單克隆抗體的或本發(fā)明的檢測(cè)板的 試劑盒，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器、使用說(shuō)明書、緩沖劑等。
[0126] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)用于檢測(cè)HPV癌蛋白水平的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括識(shí)別 HPV癌蛋白的單克隆抗體，用于溶解樣本的裂解介質(zhì)，檢測(cè)所需的通用試劑和緩沖液，如各 種緩沖液、檢測(cè)標(biāo)記、檢測(cè)底物等。所述的抗體優(yōu)選是抗HPV E7抗體，更優(yōu)選是抗HPV16 E7和/或HPV18 E7單克隆抗體，尤其優(yōu)選自申請(qǐng)?zhí)枮?01210033918. 7、201110384361. 7、 201410503512. X和201410508253. X中公開的單克隆抗體或是與該些單克隆抗體具有同等 結(jié)合活性的單克隆抗體。該檢測(cè)試劑盒可以是體外診斷裝置。
[0127] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)開發(fā)用于對(duì)來(lái)自溶液樣本的HPV感染相關(guān)情況評(píng)估的試劑盒， 該試劑盒可以檢測(cè)存在于樣本溶液中的HPV癌蛋白，其中保存樣本的細(xì)胞保存液可以是諸 如液基細(xì)胞檢測(cè)法中的細(xì)胞保存液。將細(xì)胞溶解在合適的裂解介質(zhì)中，并且被用于開發(fā)在 基于非細(xì)胞分析基礎(chǔ)上的對(duì)來(lái)自溶解的樣本的HPV感染相關(guān)腫瘤進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒 和體外診斷裝置。
[0128] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述試劑盒中包括：
[0129] 用于形成所述檢測(cè)板的酶標(biāo)板和獨(dú)立包裝的所述第一檢測(cè)抗體，以及任選的緩沖 液和細(xì)胞裂解試劑，其中，所述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更優(yōu)選地 為2或3種）針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體，所述至少2種單克隆抗體分別針對(duì)所述免疫 原的不同抗原表位。
[0130] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括：
[0131] 第二檢測(cè)抗體，所述第二檢測(cè)抗體中包含針對(duì)所述免疫原的帶有檢測(cè)標(biāo)記的單克 隆抗體。
[0132] 在較佳地實(shí)施方式中，所述第二檢測(cè)抗體中包含至少2種單克隆抗體。
[0133] 在更佳地實(shí)施方式中，所述第二檢測(cè)抗體為帶有檢測(cè)標(biāo)記的所述第一檢測(cè)抗體。
[0134] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0135] (1)本發(fā)明的方法能夠降低傳統(tǒng)ELISA方法中對(duì)單克隆抗體親和力的要求，使得 常規(guī)ELISA方法中無(wú)法使用的特異性、親和力較低的單克隆抗體也能夠用于對(duì)抗原的檢 測(cè) 。
[0136] (2)本發(fā)明提供的方法穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高。
[0137] (3)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法及裝置，適用于相關(guān)癌癥的早期診斷，也可用于非診斷 的目的如大規(guī)模的病人篩查、檢測(cè)樣本是否有被微生物污染、藥物篩選等，并可用于監(jiān)測(cè)復(fù) 發(fā)病人。
[0138] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0139] 材料和方法
[0140] 1、以下實(shí)施例中所涉及的細(xì)胞及主要試劑：人宮頸癌細(xì)胞系Hela、中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢細(xì)胞CH0購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。6-8周齡BALB/c小鼠購(gòu)買于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心。RMPI 1640、DMEM、胎牛血清購(gòu)買自 Hyclone 公司，0.25%胰酶購(gòu)自 Gibco Invitrogen 公司；EZ-Link?Sulf〇-NHS-LC-Biotin and Labeling Kits Product#21327 購(gòu)自 Thermo Scientific 公司；Pierce High sensitivity Streptavidin-HRP Product#21130 貝勾自 Thermo Scientific 公司；脫氧膽酸鈉，BSA，SDS，TMB，Tween-20 購(gòu)自 Amresco,各單克隆抗 體可以購(gòu)自艾托金生物醫(yī)藥（蘇州）有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑 有限公司，其它生物學(xué)試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均可從市售渠道獲得。
[0141] 2、以下實(shí)施例中所涉及的主要儀器：MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀（Thermo公司）； WellWASK4MK2洗板機(jī)（購(gòu)自Thermo公司）；酶標(biāo)板（C0STAR公司）。
[0142] 3、HPV18E7單克隆抗體的制備方法請(qǐng)見中國(guó)專利申請(qǐng)"HPV18E7單克隆抗體、相關(guān) 雜交瘤細(xì)胞株和應(yīng)用"（申請(qǐng)?zhí)枺篊N201210033918. 7,申請(qǐng)日2012年2月16日），其它的單克 隆抗體的制備方法可以參考中國(guó)專利申請(qǐng)文件，申請(qǐng)?zhí)枺?01110384361.7、201410503512· X、201410508253. X。
[0143] 實(shí)施例1 HPV18 E7蛋白的特異性鑒定
[0144] 本實(shí)施例中以單克隆抗體H11和F1為例，說(shuō)明本實(shí)施例中的具體實(shí)驗(yàn)方法。
[0145] 檢測(cè)單克隆抗體H11和F1對(duì)His-HPV18 E7和His-HPV16 E7兩種蛋白的反應(yīng)，采 用的多抗體包被夾心ELISA方法進(jìn)行鑒定：
[0146] (1)純化的F1和H11抗體用pH9. 6的碳酸鹽包被緩沖液（取碳酸鈉 (Na2C03) 1. 59g，碳酸氫鈉（NaHC03) 2. 93g 疊氮鈉（NaN3) 0. 2g，10M NaOH 調(diào) pH 值到 9. 6,蒸餾 水加至l〇〇〇ml。）稀釋至各自濃度為2 μ g/ml混合后進(jìn)行包被，100 μ 1/孔，4°C過(guò)夜。
[0147] (2)lx PBST(lxPBS 配方為：氯化鈉（NaCl)5g 氯化鉀（KC1)0. 125g 磷酸二氫鉀 (ΚΗ2Ρ04)0· 125g 磷酸氫二鈉（Na2HP04. 12H20) 1. 81g 蒸餾水加至 1000ml。用 1M HC1 調(diào) pH 至 7. 2,配制成lxPBS。臨用前Tween-201mL，加入到1000ml lxPBS中，攪拌混勻，為lxPBST洗 液。）洗滌一次，拍干。
[0148] (3)加入 5%脫脂奶粉/PBS 封閉，300 μ1/孔，37°C，2h。
[0149] (4) lx PBST洗滌三次，拍干。
[0150] (5)每孔分別加入 100 μ 1 濃度為 2 μ g/ml 的 His-HPV16 E7 和 His-HPV18 E7 蛋白 作為抗原，并設(shè)置空白對(duì)照，37°C孵育lh。
[0151] (6) lx PBST洗滌三次，拍干。
[0152] (7)每孔加入5%83六^^3稀釋的生物素化的!111和？1〇111^〇{1^〇)各148/ 1111，37°(：孵育111。
[0153] (8) lx PBST洗滌三次，拍干。
[0154] (9)加入 Pierce High sensitivity Streptavidin-HRP 進(jìn)行檢測(cè)，米用 5 % BSA/ PBS1:10, 000 進(jìn)行稀釋，100 μ 1/ 孔，37°C孵育 30min。
[0155] (10) lx PBST洗滌三次，拍干。
[0156] (ll)TMB 顯色：TMB A 液（取醋酸鈉（CH3C00Na) 13. 6g，檸檬酸（C6Hs07. H20) 1. 6g，雙 氧水（H20230% ) 0· 3ml，蒸餾水加至500ml)和B液（取乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2) 0· 2g， 檸檬酸（C6Hs07. H20)0. 95g，四甲基聯(lián)苯胺（TMB)0. 2g，蒸餾水加至500ml)等體積混合， 100以1/孔，室溫511^11。
[0157] (12) 2M H2S04, 50 μ 1/ 孔終止，用酶標(biāo)儀 0D450nm 處讀數(shù)。
[0158] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)慰寺】贵wH11和F1僅與His-HPV18E7結(jié)合而與另一個(gè)高危亞型致癌 蛋白HPV16E7無(wú)結(jié)合，具有較強(qiáng)的抗原特異性，結(jié)果如圖1所示。
[0159] 采用上述同樣的方法，驗(yàn)證常規(guī)ELISA檢測(cè)HPV18 E7蛋白的特異性，結(jié)果如圖2 所示，單獨(dú)采用抗HPV18E7的單克隆抗體E8、F1或者H11作為固定化（包被）抗體，包被液 中抗體濃度為4 μ g/ml，然后分別使用H11或者F1、E8或者H11、F1或者E8作為檢測(cè)抗體， 均不能特異性檢出HPV18 E7蛋白。
[0160] 綜上所述，見表1，其中，" + "表示該抗體對(duì)能檢測(cè)出HPV18E7蛋白或HPV16E7蛋 白，"一"表示該抗體對(duì)不能檢測(cè)出HPV18E7蛋白或HPV16E7蛋白。
[0161] 表1 HPV18E7多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)中單抗特異性鑒定結(jié)果
[0162]
[0163] 實(shí)施例2多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)中包被抗體的濃度的選擇
[0164] 混合的HI 1和F1抗體分別稀釋至2. 0 μ g/ml (HI 1和F1濃度分別為1. 0 μ g/ml)， 3· 0 μ g/ml (H11 和 F1 濃度分別為 L 5 μ g/ml)和 4· 0 μ g/ml (H11 和 F1 濃度分別為 2· 0 μ g/ ml)進(jìn)行包被，重組His-HPV16E7, His-HPV18E7蛋白濃度為2 μ g/ml作為抗原，檢測(cè)抗體 H1 Ι-Bio和FI-Bio的濃度各為1 μ g/ml，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，100 μ 1/孔，按照實(shí)施例 1的步驟進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，當(dāng)Η11和F1的包被總濃度為4 μ g/ml時(shí)，即兩者各自的濃 度為2 μ g/ml時(shí)，能夠明顯的區(qū)分陰性和陽(yáng)性蛋白。故選擇HI 1和F1抗體包被總濃度為 4 μ g/ml進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0165] 實(shí)施例3確定多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)重組His-HPV18E7蛋白范圍
[0166] 將純化的重組His-HPV18E7標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行5倍稀釋，從1 μ g/ml開始稀釋，連續(xù)稀 釋 6 個(gè)濃度，1 μ g/ml，0· 2 μ g/ml，0· 04 μ g/ml，0· 008 μ g/ml，0· 0016 μ g/ml，0· 00032 μ g/ ml，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，100 y 1/孔，按照實(shí)施例1的步驟對(duì)單克隆抗體Hll和FI進(jìn)行 檢測(cè)，如圖4所示，重組HPV18E7蛋白與抗體（F1和H11)的反應(yīng)具有良好的濃度依賴關(guān)系， 當(dāng)HPV18E7濃度為0. 2 μ g/ml時(shí)，結(jié)合趨于平緩。將重組His-HPV18E7標(biāo)準(zhǔn)蛋白（200ng/ ml)用lxPBS作2倍稀釋，設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，得出標(biāo)準(zhǔn)蛋白各個(gè)稀釋點(diǎn)的平均值與空白組OD值 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最高稀釋倍數(shù)為64倍，即HPV18E7多抗體包被夾心ELISA結(jié)合的抗原濃度 在3. 125ng/ml時(shí)與空白組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0167] 實(shí)施例4多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞系Hela中的內(nèi)源HPV18E7蛋 白
[0168] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人宮頸癌細(xì)胞系Hela中存在HPV18E7癌蛋白，而CH0細(xì)胞為中 國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞不表達(dá)HPV蛋白。分別收集Hela和CH0細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（細(xì)胞裂 解液配方為 ：50禮1^8-!1(：1，1501111恥(：1，1%陬-40,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%505。臨用 前加入 lug/ml Pepstatin (胃蛋白酶抑制劑），0.5mg/ml Leupeptin (亮抑制肽），lμg/ml 八口1'〇1:;[11；[11(抑蛋白酶肽）以及100以8/1111?107(苯甲基磺酰氟）），置于冰上裂解30111；[11， 離心取裂解液上清作為抗原。將細(xì)胞裂解根據(jù)細(xì)胞數(shù)目做3個(gè)濃度稀釋，分別為2. 5xl05， lxlO5和5x10 4。⑴各取100 μ 1裂解上清加到混合包被有H11和F1的酶標(biāo)板中，4°C孵育 過(guò)夜。⑵lx PBST洗滌三次，拍干。⑶每孔加入5% BSA/PBS稀釋的生物素化的H11和F1 各 lμg/ml，37°C 孵育 lh。（4) lx PBST洗滌三次，拍干。（5)加入Pierce High sensitivity Str印tavidin-HRP 進(jìn)行檢測(cè)，采用 5% BSA/PBS 1:10, 000 進(jìn)行稀釋，100 μ 1/ 孔，37°C孵育 30min。（6)lx PBST洗滌三次，拍干。（7)TMB顯色：TMB A液和B液等體積混合，100μΙ/孔， 室溫5min。（8)2M H2S04,50 yl/孔終止，用酶標(biāo)儀0D450nm處讀數(shù)。結(jié)果如圖5所示，當(dāng) Hela細(xì)胞數(shù)目為5xl04時(shí)得到的0D值基本上趨于平緩，在HPV18E7多抗體包被夾心ELISA 檢測(cè)中呈明顯陽(yáng)性而陰性對(duì)照CH0細(xì)胞即使在最大細(xì)胞數(shù)2. 5x10s時(shí)仍呈陰性。因此，該 多抗體包被夾心ELISA方法能夠特異的識(shí)別人宮頸癌細(xì)胞中HPV18E7蛋白。
[0169] 實(shí)施例5確定多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞數(shù)目的范圍
[0170] 收集人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞進(jìn)行裂解，將細(xì)胞裂解液進(jìn)行一系列稀釋，細(xì)胞數(shù) 目分別為 5xl04, 2. 5xl04, lxlO4, 5xl03, 2. 5xl03, lxlO3,每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，100 μ 1/ 孔， 按照實(shí)施例3的步驟檢測(cè)Η11和F1抗體的檢測(cè)效果，如圖6所示當(dāng)Hela細(xì)胞數(shù)目為lxlO3 時(shí)與空白組的0D值仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明HPV18E7多抗體包被夾心ELISA能夠檢測(cè)的Hela 細(xì)胞數(shù)目的下限在1000以下。
[0171] 實(shí)施例6確定多抗體包被夾心ELISA檢測(cè)細(xì)胞混合裂解液中宮頸癌細(xì)胞系Hela 細(xì)胞數(shù)目的范圍
[0172] 分別收集人宮頸癌細(xì)胞系Hela和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0,將細(xì)胞分別進(jìn)行裂解 后，離心取裂解液上清按不同的比例進(jìn)行混合。細(xì)胞的總數(shù)目為lxl〇 4，Hela和CH0細(xì)胞混 合的比例分別為1 :1，1:9, 1:19, 1:49四個(gè)梯度。其中l(wèi)xlO4個(gè)Hela細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，1x10 4 個(gè)CH0細(xì)胞為陰性對(duì)照，空白為僅加入細(xì)胞裂解液。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，100 μ 1/孔，按 照實(shí)施例3的步驟檢測(cè)Η11和F1抗體的檢測(cè)效果，結(jié)果如圖7所示當(dāng)Hela細(xì)胞與CH0細(xì) 胞的比例為1:9時(shí)，即Hela細(xì)胞數(shù)目為1000, CH0細(xì)胞數(shù)目為9000時(shí)所得的0D值與陰性 對(duì)照和空白對(duì)照均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而當(dāng)Hela細(xì)胞與CH0細(xì)胞的比例為1:19時(shí)，即當(dāng)Hela 細(xì)胞數(shù)目為500, CH0細(xì)胞數(shù)目為9500時(shí)所得的0D值與陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異，即為陰性。因此，當(dāng)HPV18E7多抗體包被夾心用于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混合裂解液檢測(cè) 時(shí)，檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞的最低數(shù)目介于500-1000之間。
[0173] 實(shí)施例7試劑盒
[0174] 本實(shí)施例中試劑盒包括獨(dú)立存放的F1單克隆抗體、H11單克隆抗體；生物素 化的F1抗體；生物素化的H11抗體；細(xì)胞裂解試劑（50mM Tris-HCl，150mM NaCl，l% 即-40,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%505);以其其它緩沖溶液。
[0175] 按照實(shí)施例3所記載的方法使用本試劑盒。
[0176] 另外，該試劑盒還包括說(shuō)明書，在說(shuō)明書中記載該試劑盒的使用方法。
[0177] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種免疫原（抗原）的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法中包括步驟： (i) 將固定化的第一檢測(cè)抗體與樣品中的所述免疫原接觸，形成第一復(fù)合物； (ii) 將所述第一復(fù)合物與第二檢測(cè)抗體接觸形成第二復(fù)合物； (iii) 檢測(cè)所述第二復(fù)合物； 其中，所述步驟（i)中，所述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更優(yōu)選 地為2或3種）針對(duì)所述免疫原的單克隆抗體；所述第二檢測(cè)抗體帶有檢測(cè)標(biāo)記。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一檢測(cè)抗體中的不同種單克隆抗體分別針 對(duì)所述免疫原的不同抗原表位。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二檢測(cè)抗體為帶有檢測(cè)標(biāo)記的所述第一檢 測(cè)抗體。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫原為疾病標(biāo)志性蛋白；優(yōu)選地，所述疾病 包括但不限于：病毒或病菌感染、炎癥、腫瘤、心腦血管疾??；更優(yōu)選地，所述免疫原為病毒 殼體蛋白或其片段；最優(yōu)選地，所述免疫原為HPV蛋白。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一檢測(cè)抗體中包含2種單克隆抗體。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一檢測(cè)抗體中包含第一單克隆抗體和第二 單克隆抗體以及任選地第三單克隆抗體，所述第一單克隆抗體與所述第二單克隆抗體的重 量比為1 _3 :3_1。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述步驟（i)中，所述"固定化的第一檢測(cè)抗體"為 包被于酶標(biāo)板的所述第一檢測(cè)抗體；優(yōu)選地，所述"包被于酶標(biāo)板的所述第一檢測(cè)抗體"包 被濃度為 2-6 μ g/ml，優(yōu)選地為 3-5 μ g/ml，如 3 μ g/ml、4 μ g/ml、5 μ g/ml。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二檢測(cè)抗體的使用濃度為0. 5-3 μ g/ml，優(yōu) 選地為1-2 μ g/ml。9. 一種用于免疫原檢測(cè)的檢測(cè)板，其特征在于，所述的檢測(cè)板固定有第一檢測(cè)抗體，所 述第一檢測(cè)抗體中包含至少2種（優(yōu)選地為2-5種，更優(yōu)選地為2或3種）針對(duì)所述免疫 原的單克隆抗體，所述至少2種單克隆抗體分別針對(duì)所述免疫原的不同抗原表位。10. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括： 權(quán)利要求9所述的檢測(cè)板，或者 用于形成所述檢測(cè)板的酶標(biāo)板和獨(dú)立包裝的所述第一檢測(cè)抗體，以及任選的緩沖液和 細(xì)胞裂解試劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105866420SQ201510032961
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日
【發(fā)明人】常小迦, 施麗君
【申請(qǐng)人】艾托金生物醫(yī)藥（蘇州）有限公司