一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種檢測(cè)黃曲霉毒素 B1的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是主要由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和 飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。它們存在于±壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，特別是容易污 染花生、玉米、稻米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為 突出的一類霉菌毒素。在天然食物中W黃曲霉毒素 B1最為多見，危害性也最強(qiáng)。
[0003] 目前已有的黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有：
[0004] (1)薄層層析法
[0005] 薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990年它被列為A0AC (Association of Official Agricultural Qiemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時(shí)具有定性和 定量分析黃曲霉毒素的功能。
[0006] (2)液相色譜法
[0007] 液相色譜與薄層層析在許多方面具有相似性，二者互相補(bǔ)充。通常用化C進(jìn)行前期 的條件設(shè)定，選擇適宜的分離條件后再用LC進(jìn)行黃曲霉毒素的定量測(cè)定。
[000引（3)免疫化學(xué)分析方法
[0009] 利用具有高度專一性的單克隆抗體或多克隆抗體設(shè)計(jì)的黃曲霉毒素的免疫分析 方法也是常用的黃曲霉毒素檢測(cè)方法。運(yùn)類方法通常包括放射免疫分析方法，酶聯(lián)免疫法 和免疫層析法，它們均可W對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行定量測(cè)定。
[0010] 但是運(yùn)些方法成本高，并且需要使用大型昂貴的儀器，操作繁瑣。
[0011] 核酸適配體是一段DNA(脫氧核糖核酸），RNA(核糖核酸)或者是XNA(核酸類似物） 序列。通常是利用體外篩選技術(shù)一一指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential en;richment，SE；LEX)，從核酸分子文庫(kù)中得到的 寡核巧酸片段。核酸適配體能與目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合，因此被廣泛應(yīng)用于生 物傳感器領(lǐng)域。
[0012] DNA傳感器WDNA為敏感元件，通過(guò)換能器將DNA與其他物質(zhì)之間作用的生物學(xué)信 號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)的光、電、聲波等物理信號(hào)。近年來(lái)，DNA傳感器在基因診斷、環(huán)境監(jiān)控、藥物 研究等領(lǐng)域的應(yīng)用研究受到廣泛重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素 B1的方法， 該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素 B1的方法，該方法包括W下 步驟：
[0015] (1)將含有黃曲霉毒素 B1的待測(cè)樣品與黃曲霉毒素 B1提取液混合，離屯、并抽提上 清液；
[0016] (2)將所述上清液與DM傳感器溶液、DM聚合酶混合并解育；
[0017] (3)加入氯化血紅素溶液、皿PES緩沖溶液，室溫解育后加入ABTS還原態(tài)無(wú)色底物 和雙氧水；
[0018] 其中，所述DNA傳感器溶液包括DNA傳感器、RCA反應(yīng)液和dNTP溶液，
[0019] 所述DNA傳感器由^下；部分組成：
[0020] (l)DM(A):通過(guò)W下DM序列5'端和3'端連接而成的環(huán)狀DM模板：5'-XaACCCAACCCGCCCTACCCXb-3'（SEQ ID N0:2);其中，Xa和Xb分別代表a和b個(gè)任意堿基，且a+ b = 40-80；
[0021] (2)DNA(B):黃曲霉毒素 B1核酸適配體，該核酸適配體具有如下核巧酸序列：
[0022] 5'-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCTGTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGC CCACA-3'（沈Q ID NO: 1);其中，每個(gè)m和η各自獨(dú)立地為A、Τ、C或G且m鏈段和η鏈段互補(bǔ)配對(duì)；
[0023] (3)DNA(C):RCA引物，所述DNA(C)的長(zhǎng)度為25-50nt且序列具有W下特征：5'端的 15-30個(gè)堿基與DNA(A)固定序列的5 '側(cè)翼互補(bǔ)配對(duì)，3 '端的10-20個(gè)堿基與DNA(B)的5 '端互 補(bǔ)配對(duì)。
[0024] 其中，所述DNA(A)固定序列為位于Xa和Xb之間的序列，由于DNA(A)為環(huán)狀DNA模 板，因此，所述DNA(A)固定序列的5'側(cè)翼不限于Xa中的一部分，也可W包括Xb中的至少一部 分。所述固定序列的互補(bǔ)序列在氯化血紅素的存在下，可W催化ABTS的氧化。
[00巧]本發(fā)明中，所述RCA是指滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)，該術(shù)語(yǔ) 的含義和技術(shù)步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
[00%]優(yōu)選地，所述DNA(A)具有如下核巧酸序列：
[0027] 5 '-ACTGATATTAACCCAACCCGCCCTACCCATTTCTTGTTTCGTATC ATTGCGAATACCGTG-3 ' (沈Q ID N0:3)。
[00%]優(yōu)選地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[0029] 5'-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCCAGCACGGGAAC-3'（SEQ ID N0:4)。
[0030] 或者優(yōu)選地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[0031] 5，-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCACAACAGCACGGGAAC-3，（沈Q ID NO:5)。
[0032] 再或者優(yōu)選地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[0033] 5'-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCAGAGACAACAGCACGGGA AC-3'（SEQ ID N0:6)。
[0034] 本發(fā)明所述DNA傳感器通過(guò)混合上述Ξ種組分進(jìn)行自組裝即可獲得。
[0035] 其中，所述DNA傳感器溶液中DNA(A)、DNA(B)和DNA(C)的濃度均優(yōu)選為lO-lOOOnM， 進(jìn)一步優(yōu)選為20-100nM。
[0036] 其中，所述黃曲霉毒素 B1提取液可W為任何能夠溶解黃曲霉毒素 B1的溶液，優(yōu)選 為甲醇溶液，所述甲醇溶液的濃度可W根據(jù)需要確定，例如，可W為70%甲醇溶液。
[0037] 其中，所述雙氧水可W為常規(guī)的各種濃度，例如為30%的雙氧水。
[0038] 本發(fā)明中，所述RCA反應(yīng)液可W為商購(gòu)DNA聚合酶時(shí)所帶的反應(yīng)液，也可W為根據(jù) 該反應(yīng)原理配置而成的反應(yīng)液。（330mM Tris-醋酸（37°C下抑為7.9)，100mM醋酸儀，660mM 醋酸鐘，l%(v/v)吐溫20，10mM DTT))。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明，所述待測(cè)樣品與黃曲霉毒素 B1提取液的重量比可W為1:1-1000。
[0040] 步驟(2)中解育的條件可W為常規(guī)DM聚合酶反應(yīng)的解育條件，例如為30°C，解育 60min，90°C加熱5min終止反應(yīng)。所述DNA聚合酶可W為本領(lǐng)域常規(guī)的各種DNA聚合酶，優(yōu)選 為化i29DNA聚合酶。所述DNA聚合酶和dNTP的用量可W根據(jù)商購(gòu)該酶時(shí)的使用說(shuō)明確定。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的原理，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W確定步驟(3)中各組分的用量，例如，所 述氯化血紅素的終濃度為0.1-ΙμΜ;所述ABTS還原態(tài)無(wú)色底物的終濃度為所述雙氧 水的終濃度為0.05-0.2mM;所述皿PES緩沖液為2 X皿PES緩沖液。滿足上述終濃度的基礎(chǔ) 上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W根據(jù)需要選擇合適的母液濃度。
[0042] 本發(fā)明采用一步競(jìng)爭(zhēng)法，首先組裝出含有黃曲霉毒素核酸適配體的DNA傳感器，樣 品中游離的黃曲霉毒素 B1與黃曲霉毒素核酸適配體DNA(B)特異性結(jié)合，使其從DNA傳感器 上脫落，從而觸發(fā)DNA傳感器，通過(guò)RCA技術(shù)得到信號(hào)的放大。RCA產(chǎn)物鏈上有η段可W催化底 物ABTS氧化，從無(wú)