一種檢測(cè)單堿基突變的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種檢測(cè)單堿基突變的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸變異（點(diǎn)突變)是指在DNA特定位置發(fā)生一個(gè)核巧酸的改變，廣泛存在于 生物體遺傳信息的編碼中，當(dāng)較少出現(xiàn)的等位基因頻率大于或等于1%時(shí)，則稱為單核巧酸 多態(tài)性(single nucleotide polymo巧hism，SNP)。對(duì)點(diǎn)突變的研究有助于深入認(rèn)識(shí)高等生 物的遺傳特性，解釋個(gè)體的表型差異，掲示基因、信息、蛋白質(zhì)的正常功能，變異的成因 W及 不同個(gè)體對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)功能基因組學(xué)研究和建立分子標(biāo)記都具有重要意義。
[0003] 隨著基因組測(cè)序工作的開(kāi)展，點(diǎn)突變的檢測(cè)和篩選正成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，檢測(cè) 方法也隨之迅速發(fā)展;此外，當(dāng)點(diǎn)突變所造成的基因理化特性改變比較微弱時(shí)，則使得點(diǎn)突 變的檢測(cè)非常困難，運(yùn)也使得人們從多方面探索和建立新的檢測(cè)方法。
[0004] PCR-RFLP是最早用于分析已知點(diǎn)突變的方法。如果點(diǎn)突變正好發(fā)生在某種限制性 內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用PCR特異擴(kuò)增的運(yùn)段DNA經(jīng)某一限制酶 消化后，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，即可確定是否存在點(diǎn)突變。運(yùn)種檢測(cè)具有較 高的特異性，重復(fù)性好，但僅適于設(shè)及到特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變檢測(cè)和突變頻 率大于1 %的多態(tài)性檢測(cè)，不能提供究竟是何種堿基的突變。
[0005] 依賴于DNA變性動(dòng)力學(xué)的PCR技術(shù)和高分辨烙解曲線分析技術(shù)化igh-resolution melting analysis,HRM)也能用于SNP的檢測(cè)。擴(kuò)增片段內(nèi)若存在點(diǎn)突變，則通過(guò)Tm值的差 異或變性過(guò)程中雙鏈DNA飽和染料釋放巧光信號(hào)強(qiáng)度的差異，可將存在錯(cuò)配堿基的雙鏈DNA 與純合的雙鏈DNA相區(qū)分開(kāi)來(lái)。它們可W用于SNP的快速檢測(cè)，但只適合于對(duì)小片段的分析， 且不能確定具體的突變堿基與部位。
[0006] 單鏈DNA由于堿基序列的不同可W引起其構(gòu)象差異，運(yùn)種差異將造成相同或者相 近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率的差別，即單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle S化and conformation polymor地ism,SSCP)。因此，目標(biāo)基因通過(guò)PCR擴(kuò)增、變性及電泳后，突變所引起的DNA構(gòu)象 差異則表現(xiàn)為電泳條帶位置的差異而用于SNP的分析中。但是，單個(gè)堿基突變的檢出率會(huì)隨 著DNA片段的長(zhǎng)度的增加而降低，同時(shí)，SSCP不能夠確定所分析DNA片段中突變的類型及位 置并且耗時(shí)長(zhǎng)。
[0007] 當(dāng)DNA在一定梯度變性劑濃度的凝膠中電泳，即變性梯度凝膠中電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)時(shí)，具有堿基差異的DNA片段會(huì)在不同的地方開(kāi)始 解鏈，從而達(dá)到分離的目的。雖然DGGE檢測(cè)的片段長(zhǎng)度可W達(dá)到化b，但是它耗時(shí)較長(zhǎng)、使用 條件較難優(yōu)化并且不能確定所分析DNA片段中突變的類型和位置。
[000引 變性高效液相色譜（denaturing Μ曲 performance liquid chromatography， DHPLC)是一項(xiàng)在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢巧USNP的突變技術(shù)。帶正電荷的流動(dòng) 相可W吸附帶負(fù)電的DNA分子，同時(shí)，因?yàn)橥措p鏈與異源雙鏈具有不同的退火溫度，因此 通過(guò)控制DHPLC的溫度，使系統(tǒng)維持在異源雙鏈解鏈時(shí)的溫度時(shí)，即可W將其分離，SNP的有 無(wú)最終表現(xiàn)在色譜峰的峰形和數(shù)目上。雖然D冊(cè)LC在尋找未知的SNP上有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是 對(duì)已知SNP不可能實(shí)現(xiàn)100%的檢出，同時(shí)對(duì)每個(gè)DNA片段的分析則都需要優(yōu)化相應(yīng)的運(yùn)行 溫度，不能確定突變的堿基。
[0009] 使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)技術(shù)也可W用于檢測(cè) SNP，但是它需要將目的片段轉(zhuǎn)化為DNA/RNA鑲嵌結(jié)構(gòu)，并且在分析之前還需要用四種核酸 酶進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)在費(fèi)用上也不具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。基因忍片技術(shù)將大量探針?lè)肿庸潭ㄔ谥?持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣 品分子的數(shù)量和序列信息，可用于大規(guī)模檢測(cè)基因突變、基因多態(tài)、基因表達(dá)水平W及測(cè)定 DNA序列，具有檢測(cè)信息高通量和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，但費(fèi)用較高，且容易漏檢SNP。
[0010] 相對(duì)而言，酶學(xué)突變檢測(cè)是一種較為簡(jiǎn)便、有效的點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)，它的建立依賴 于特異性核酸酶的發(fā)現(xiàn)和利用，如S1核酸酶、核糖核酸酶、T4內(nèi)切核酸酶、MutY、綠豆核酸 酶、芹菜核酸酶CEL I等都已用于點(diǎn)突變的檢測(cè)，能夠確定突變的位置，但也不能確定具體 突變的堿基。通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)可直接獲取目的片段的堿基序列，通過(guò)序列間的比較，可W 直觀而有效的尋找SNP，是一種最為有效而且可靠的SNP檢測(cè)方法，且可確定SNP的位置及突 變的堿基。雖然隨著測(cè)序的自動(dòng)化程度的提高及測(cè)序成本的降低，直接測(cè)序越來(lái)越多的應(yīng) 用于SNP檢測(cè)中，但需要重復(fù)測(cè)序和確認(rèn)才能將雜合體從序列誤差中區(qū)別出來(lái)，而且測(cè)序的 費(fèi)用仍然很高、費(fèi)時(shí)。
[0011] 由上所述可見(jiàn)，隨著新技術(shù)、新材料和設(shè)備的不斷涌現(xiàn)，點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)得到了迅 速的發(fā)展，但大多數(shù)不能確定具體的突變堿基，而能夠確定突變堿基的方法(如測(cè)序法)貝。 需要?？诘姆治鰞x器，不僅價(jià)格昂貴，而且操作復(fù)雜、專業(yè)性強(qiáng)，在應(yīng)用上受到了一定的限 審IJ。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便和快速確定具體的突變堿基的新檢測(cè)方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)單堿基突變的方法及應(yīng)用，該方法不但可W檢測(cè)是否存在 單堿基突變及突變所在的位置，而且無(wú)需測(cè)序即可快速確定是哪種突變堿基。
[0013] -種檢測(cè)單堿基突變的方法，包括W下步驟：
[0014] (1)針對(duì)待測(cè)樣本與參照的目標(biāo)區(qū)段設(shè)計(jì)引物對(duì)，PCR分別擴(kuò)增；
[0015] (2)將兩組擴(kuò)增產(chǎn)物形成的異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物用CEL I酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)確定 單堿基突變；
[0016] (3)回收CEL I酶所切開(kāi)的兩個(gè)片段，每個(gè)片段分別與帶有A、T、G或C粘性末端的4 種人工接頭連接；
[0017] (4)把基于人工接頭序列設(shè)計(jì)的反向引物與擴(kuò)增目標(biāo)基因或DNA片段的上游引物 W及基于人工接頭序列設(shè)計(jì)的正向引物與擴(kuò)增目標(biāo)基因或DNA片段的下游引物組成兩對(duì)引 物，分別W每個(gè)連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] (5)對(duì)有所PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，所得結(jié)果與單堿基錯(cuò)配類型的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：
[0019]

[0020] 其中表示有擴(kuò)增。
[0021] 步驟(2)中確定單堿基突變樣本的方法為:(EL I酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，如果只有 一條目的基因條帶，說(shuō)明待測(cè)樣本中不存在單堿基突變；除目的基因條帶外還有2條新條 帶，并且兩者的長(zhǎng)度之和與目的基因大小一致，說(shuō)明存在單堿基突變。
[0022] 所述的異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物片段是指一條鏈堿基正常而另一條含有單個(gè)突變堿基鏈。
[0023] 所述異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物的制備方法為:將等質(zhì)量的參照和待測(cè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物混合，再 進(jìn)行高溫變性和降溫復(fù)性。
[0024] 所述異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物的制備方法也可W為:在PCR擴(kuò)增時(shí)用參照與待測(cè)樣品等質(zhì)量 混合的DNA作為模板，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高溫變性和降溫復(fù)性。
[0025] 所述高溫變性條件為:94°C變性5min;所述降溫復(fù)性條件為:先按2°C/s降溫至85 DC，再 W〇.rc/s降溫至 25°C。
[0026] 芹菜核酸酶CEL I是一種單鏈特異性核酸酶，能從3'端切割異源雙鏈DM分子中錯(cuò) 配的單核巧酸堿基對(duì)。當(dāng)參照與待測(cè)樣本在檢測(cè)區(qū)段內(nèi)具有單堿基突變時(shí)，形成的異質(zhì)雙 鏈產(chǎn)物中將含有錯(cuò)配堿基，CEL I能特異性識(shí)別和切割錯(cuò)配堿基。當(dāng)電泳圖譜中只有一條目 的基因擴(kuò)增條帶時(shí)，表明待測(cè)樣本中不存在單堿基突變或變異；當(dāng)電泳結(jié)果顯示除了目的 基因擴(kuò)增條帶外還出現(xiàn)2條新條帶時(shí)，說(shuō)明具有單堿基突變或變異，且運(yùn)2個(gè)片段的長(zhǎng)度之 和與目標(biāo)擴(kuò)增片段大小一致。
[0027] 證明了待測(cè)樣本具有單堿基突變后，對(duì)存在突變的樣本再進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)，用于 測(cè)定具體的突變類型。
[0028] 所述的連接產(chǎn)物的擴(kuò)增是指利對(duì)異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物的CEL I消化產(chǎn)物與4種不同DNA接 頭連接后的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所用的引物是特異性的，其中之一 就是用來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)片段的上游或下游引物，另一條則是基于人工接頭序列設(shè)計(jì)的正反向引 物AF或AR，AF和AR序列在4個(gè)接頭中是相同的，AF用于突變點(diǎn)下游的擴(kuò)增，AR用于突變點(diǎn)上 游的擴(kuò)增。
[0029] 利用T4連接酶將CEL I酶切割產(chǎn)物分別與帶有A、T、G或C粘性末端的4種不同DNA接 頭連接。
[0030] 所述帶有A、T、G或C粘性末端的4種人工接頭分別為：
[0031] 接頭 A:
[0032] 5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 圖-3 '
[0033] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0034] 接頭 T:
[0035] 5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 固-3 '
[0036] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0037] 接頭 G:
[00；3 引 5 ' -ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 圖-3 '
[0039] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0040] 接頭 C:
[0041 ] 5 ' -ACCTCGCTCAGCATCCTCCAc|-3 '
[0042] 3，-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5，。
[0043] 所述基于人工接頭序列設(shè)計(jì)的正反向引物為：
[0044] AF:5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC-3 '
[0045] AR:3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '。
[0046] 所述的突變堿基類型的確定是根據(jù)不同接頭連接后擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)和擴(kuò)增產(chǎn)物 的大小來(lái)判斷的。若待測(cè)樣本在目標(biāo)區(qū)段內(nèi)具有單堿基突變，則異質(zhì)雙鏈產(chǎn)物中含有8種可 能的錯(cuò)配形式，I消化的產(chǎn)物只能與特定的接頭連接。若有擴(kuò)增產(chǎn)物，而且擴(kuò)增產(chǎn)物大 小是切割片段長(zhǎng)度與接頭長(zhǎng)度的之和，則突變的堿基必定是與相應(yīng)接頭粘性末端堿基互補(bǔ) 的堿基。
[0047] 基于所述的檢測(cè)單堿基