本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，更具體而言本發(fā)明涉及人基因突變的檢測，特別是用于同時檢測多種突變類型的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：癌癥是危害公眾健康的一大難題。在中國，癌癥是疾病死亡的第一殺手，并且其發(fā)病率和死亡率仍呈增長的趨勢。僅在2015年，我國共有429.2萬新發(fā)癌癥病例和281.4萬癌癥死亡病例，其中以肺癌的發(fā)病率最高，并且肺癌的死亡率也排在各種癌癥類型之首。另外，胃癌、食管癌和肝癌也是常見診斷的癌癥類型，排在高發(fā)癌癥類型的行列(Chen,W.,etal.,CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin,2016.66(2):p.115-32)。癌癥是基因病，腫瘤基因?qū)W研究揭示了近140個驅(qū)動基因，這些驅(qū)動基因分布于12條信號通路中，分別調(diào)節(jié)細胞命運、細胞生存和基因組穩(wěn)定(Vogelstein,B.,etal.,Cancergenomelandscapes.Science,2013.339(6127):p.1546-58)。驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)推動了靶向藥物的開發(fā)。截至2016年6月，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA，U.S.FoodandDrugAdministration)已經(jīng)批準了72個靶向抗腫瘤藥物。多項研究證實，肺癌的驅(qū)動基因主要包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、BRAF、PI3KCA、AKT1、MEK1、MET、HER2、RET、NRAS、NTRK1等。EGFR是目前肺癌研究中研究最充分的分子靶點。PIONEER研究顯示，肺腺癌患者EGFR基因突變率在亞裔和中國人中分別為51.4％和50.2％(Shi,Y.,etal.,Aprospective,molecularepidemiologystudyofEGFRmutationsinAsianpatientswithadvancednon-small-celllungcancerofadenocarcinomahistology(PIONEER).JThoracOncol,2014.9(2):p.154-62；Shi,Y.,etal.,MolecularEpidemiologyofEGFRMutationsinAsianPatientswithAdvancedNon-Small-CellLungCancerofAdenocarcinomaHistology-MainlandChinaSubsetAnalysisofthePIONEERstudy.PLoSOne,2015.10(11):p.e0143515)。而KRAS和EML4-ALK的驅(qū)動突變率約占肺腺癌患者的15-25％和3-7％(Lovly,C.,L.Horn,W.Pao.2016.MolecularProfilingofLungCancer.MyCancerGenome(UpdatedMarch28))?！睹绹鴩┌Y綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN，NationalComprehensiveCancerNetwork)臨床實踐指南》已經(jīng)明確對于晚期非小細胞肺癌患者，應(yīng)該先實施EGFR和ALK基因檢測。研究表明，對于存在驅(qū)動基因突變且接受對應(yīng)的靶向治療的患者，相對于未根據(jù)基因檢測結(jié)果進行治療的患者，可獲得更好的治療效果和更長的生存期(KrisMG,JohnsonBE,BerryLD,etal.Usingmultiplexedassaysofoncogenicdriversinlungcancerstoselecttargeteddrugs.JAMA2014；311:1998-2006)。對于非小細胞肺癌，除了FDA批準的EGFR抑制劑和ALK抑制劑，NCCN指南還推薦威羅菲尼和達拉非尼，達拉非尼聯(lián)合曲美替尼適用于BRAFV600E突變患者；克唑替尼適用于MET高水平擴增或14號外顯子跳躍突變以及ROS1重排患者；卡博替尼適用于RET重排患者；曲妥珠單抗和阿法替尼適用于HER2突變患者。NCCN指南強烈支持更廣泛的基因檢測，以最大限度的確定現(xiàn)有藥物獲準臨床試驗期藥物相關(guān)的驅(qū)動突變。靶向藥物是精準治療的先鋒，其詮釋了標準化治療為基礎(chǔ)的個體化治療原則。而個體化治療的前提條件是存在個體差異而進行分子靶點檢測，但對于腫瘤分子靶點的檢測卻并非易事。一方面分子靶點涉及的類型復(fù)雜，包括點突變、短片斷插入缺失、拷貝數(shù)變異、融合基因等。另一方面，晚期腫瘤患者的組織樣本往往獲取困難，而ctDNA(Cell-freeCirculatingTumorDNA)檢測雖然無創(chuàng)，但是體液中除了ctDNA，也存在正常組織游離DNA，ctDNA通常占比非常少，屬于超低頻突變。目前對于靶點基因的檢測，現(xiàn)有的ddPCR(微滴式數(shù)字PCR)等技術(shù)雖然可實現(xiàn)絕對定量，且靈敏度高，但是這類技術(shù)只能檢測已知的突變位點，無法檢測基因融合；RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)技術(shù)雖然檢測的突變類型較為全面，但是也只能檢測已知的突變位點，并且存在靈敏度低、通量低等局限性。因此，本領(lǐng)域中需要一種高靈敏度、高特異性的可以同時檢測多個腫瘤基因的多種突變類型的新技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供腫瘤用藥以及療效預(yù)測的指導(dǎo)方案。經(jīng)過反復(fù)試驗，發(fā)明人實現(xiàn)了對與FDA批準靶向藥物或NCCN指南推薦靶向藥物或臨床試驗靶向藥物正在開展的57個腫瘤驅(qū)動基因的敏感突變和耐藥突變的同時檢測。具體而言，本發(fā)明提供了用于高靈敏度、高特異性同時檢測57個腫瘤驅(qū)動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因的序列組合；針對所述序列組合的探針；用于檢測所述57個腫瘤驅(qū)動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因的方法、基因芯片和試劑盒。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于同時檢測多種突變類型的序列組合，所述序列組合包括：1)如下腫瘤驅(qū)動基因的所有CDS區(qū)域：FGFR1、NTRK1、ALK、FGFR2、APC、PIK3CA、AR、PMS2、ATM、PTCH1、PTEN、BRAF、BRCA1、BRCA2、KIT、RB1、CCND1、KRAS、RET、CDK4、MAP2K1、ROS1、CDK6、SMARCA4、CDKN2A、MET、SMO、MLH1、DDR2、MSH2、STK11、EGFR、MSH6、TP53、ERBB2、TSC1、NF1、TSC2、FBXW7、NRAS；2)以下區(qū)域：AKT1外顯子3；ESR1外顯子4-8；CTNNB1外顯子3；FGFR3外顯子7,9,14-18；FLT3外顯子14,15,20；HRAS外顯子2,3；MAP2K2外顯子2-4,6,7；MTOR外顯子19,30,39,40,43-45,47,48,53,56；IDH1外顯子4；IDH2外顯子4；JAK2外顯子14；PDGFRA外顯子12-18；PTPN11外顯子3,13；RAF1外顯子3,4,6,7,10,14,15,17；SRC外顯子14；VHL外顯子1-3；序列SEQIDNO.8。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第一方面的序列組合還包括其中6個腫瘤驅(qū)動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因斷點以及腫瘤驅(qū)動基因MET外顯子14跳躍突變相關(guān)的區(qū)域，即3)SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第一方面的序列組合還包括EGFR基因19號外顯子缺失突變的序列，即4)SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。在第二方面中，本發(fā)明提供了用于同時檢測多種突變類型的探針，所述探針包括：針對本發(fā)明第一方面的序列組合1)-3)項中序列的探針；SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。優(yōu)選地，所述探針覆蓋所述序列組合1)-3)項中全部序列。在一個實施方案中，所述探針長度為100nt-140nt，優(yōu)選110nt-130n，最優(yōu)選120nt。在一個實施方案中，所述探針包括針對本發(fā)明第一方面的序列組合第1)-3)項中除序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的序列的探針；序列SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。優(yōu)選地，所述探針覆蓋所述序列組合1)-3)項中除序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的全部序列。在優(yōu)選的實施方案中，所述探針還包括：針對如下序列的探針：本發(fā)明的第一方面的序列組合中的1)-3)項中序列在染色體上前后小于150nt，優(yōu)選小于120nt，更優(yōu)選小于80nt的序列。在第三方面中，本發(fā)明提供了用于同時檢測多種突變類型的基因芯片，所述基因芯片上有根據(jù)本發(fā)明第二方面的探針。在第四方面中，本發(fā)明提供了用于同時檢測多種突變類型的試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明第二方面的探針或者根據(jù)本發(fā)明第三方面的基因芯片。在一個實施方案中，所述試劑盒還包括文庫構(gòu)建試劑、探針雜交洗脫試劑、引物和接頭以及核酸純化試劑。在第五方面中，本發(fā)明提供一種用于同時檢測多種突變類型的方法，所述方法包括以下步驟：1)探針設(shè)計，根據(jù)本發(fā)明第一方面涉及的序列組合成探針，例如提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)或羅氏(Roche)合成探針；2)DNA提取，提取待檢測樣本中g(shù)DNA和/或cfDNA，例如石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等體液樣本的DNA；3)文庫構(gòu)建，將提取的DNA構(gòu)建樣本文庫；4)雜交捕獲，將所述樣本文庫采用步驟1)中合成的探針進行雜交捕獲；5)上機測序，將步驟4)得到的捕獲序列測序產(chǎn)生測序數(shù)據(jù)，例如在Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀上機測序；6)信息分析，進行變異檢測和注釋，例如采用發(fā)明人自主開發(fā)的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術(shù)——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)統(tǒng)計質(zhì)控參數(shù)如目標區(qū)域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率等，并進行變異檢測和注釋。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括以下步驟：7)結(jié)果解讀，根據(jù)檢測出來的變異判斷其與靶向藥物療效和預(yù)后的關(guān)系，例如通過與公共數(shù)據(jù)庫(如COSMIC)或建立的數(shù)據(jù)庫比對和文獻檢索，根據(jù)數(shù)據(jù)庫記載和文獻報道，判斷其與靶向藥物療效和預(yù)后的關(guān)系。本發(fā)明的序列組合、探針、基因芯片、試劑盒和方法可以用于同時檢測57個腫瘤驅(qū)動基因的點突變、短片段插入缺失和拷貝數(shù)變異的序列組合。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明可以特異性地一次性檢測出多種腫瘤驅(qū)動基因的不同變異類型。本發(fā)明的探針可以對EGFR、KRAS、BRAF、EML4-ALK等57種驅(qū)動突變實現(xiàn)多重全方位檢測。本發(fā)明可以實現(xiàn)一次性同時檢測57種基因的多種變異類型，包括點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和基因融合。本發(fā)明可以檢測探針覆蓋區(qū)域的已知突變，并同時可以發(fā)現(xiàn)新的未知變異。本發(fā)明檢測突變的靈敏度高，本發(fā)明可以實現(xiàn)0.5％以上變異的準確檢出。本發(fā)明可以精確識別融合基因的斷點。本發(fā)明適用于石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等多種體液樣本。本發(fā)明檢測突變的通量高：能夠在短時間內(nèi)同時進行多例樣本檢測，從而壓縮成本，有利于臨床的推廣。本發(fā)明對于融合基因的檢測可以準確識別斷點(精確到1bp)，并且可以發(fā)現(xiàn)與ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1相關(guān)的新的融合基因。附圖說明通過以下附圖對本發(fā)明進行說明：圖1為本發(fā)明的實施流程圖；圖2為實施例2的ALK基因c.3806G>C讀段圖，序列見SEQIDNO.3；圖3為實施例2的TP53基因c.455C>T(p.P152L)讀段圖，序列見SEQIDNO.4；圖4為實施例3的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO:5；圖5為實施例3的TP53基因的c.578A>C(p.H193P)讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO.6；圖6為實施例4的MET基因的14號外顯子跳躍突變c.3028_3028+17del18讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO.7。具體實施方式本發(fā)明利用發(fā)明人自主開發(fā)的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術(shù)——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利申請公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)，提供了一種高靈敏度、高特異性的可以同時檢測多個基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因的方法及試劑盒。在本發(fā)明中，采用本領(lǐng)域通用表示法表示基因突變和蛋白質(zhì)突變。例如，c.3140A>G(p.H1047R)表示錯義突變，表示編碼區(qū)第3140位的A堿基改變?yōu)镚堿基，從而導(dǎo)致1047位的氨基酸由組氨酸H突變?yōu)榫彼酭；c.464+1G>T表示剪切突變，表示編碼區(qū)第464位所在外顯子3端緊連內(nèi)含子的第一個堿基由G改變?yōu)門；c.2240_2254del15(p.L747_T751del)表示小片段缺失，表示編碼區(qū)第2240位到2254位的15bp堿基缺失，從而導(dǎo)致第747位到751位的5個氨基酸缺失；c.548C>A(p.S183*)表示無義突變，編碼區(qū)第548位的C堿基改變?yōu)锳堿基，從而導(dǎo)致第183位的絲氨酸S變?yōu)榻K止密碼子；c.3028_3028+17del18表示涉及到剪切區(qū)域的小片段缺失，表示表示編碼區(qū)第3028位到其所在外顯子3端緊連內(nèi)含子的第17個堿基(共18個堿基)缺失。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述示例可以解讀本發(fā)明中的其他突變的含義。不希望拘囿于理論，但發(fā)明人考慮，對基因序列進行捕獲進行檢測中使用的探針的效率受到多種因素的影響，例如探針之間的相似度、探針序列的復(fù)雜程度和GC含量差異、探針自身形成二級結(jié)構(gòu)的傾向性、探針之間形成二級結(jié)構(gòu)的可能性。因此，想要對多個基因的多個位點進行同時檢測，存在很大挑戰(zhàn)。需要檢測的基因越多、位點越多越分散，需要設(shè)計的探針越多，有可能遇到的問題越多，檢測的難度就越大。把多個基因的多個位點進行分開檢測，人工費用、儀器費用、試劑費用基本上與試驗份數(shù)成正比，如果不能做到高通量的批量檢測，那么勢必造成資源的巨大浪費，靶向藥物是精準治療的成本會居高不下，限制其在普通患者中的推廣和應(yīng)用。在本發(fā)明中，對57個腫瘤驅(qū)動基因(表1)、突變位點或相關(guān)區(qū)域的選擇經(jīng)過了發(fā)明人的反復(fù)論證，對這些區(qū)域進行探針設(shè)計可以很好地實現(xiàn)相關(guān)突變的高通量檢測，有效地減少探針自身、探針之間的干擾。在本發(fā)明中，突變位點或相關(guān)區(qū)域的選擇考慮了檢測的全面性與檢測的效率、靈敏度和特異性的平衡，既盡可能多地檢測多種類型的突變，又保證了高靈敏度、高效率的精確檢測。本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因的探針，該探針包括57個腫瘤驅(qū)動基因(表1)。#號標記的基因探針設(shè)計區(qū)域除表1中指定的區(qū)域以外，另增加其中6個腫瘤驅(qū)動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因斷點和MET基因外顯子14跳躍突變相關(guān)的區(qū)域如下：chr1:156843751-156844362，chr2:29446394-29448326，chr4:1808661-1808842，chr4:55140698-55141007，chr6:117650609-117658334，chr6:117647577-117650491,chr6:117645578-117647386，chr6:117642557-117645494，chr6:117641193-117642421，chr7:116411702-116411902，chr7:116412043-116412283，chr10:43610184-43612031。另外，為了很好的捕獲EGFR基因常見的19號外顯子缺失突變，增加基于突變序列的探針：E1:TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGG(SEQIDNO.1)；E2:ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACACTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACC(SEQIDNO.2)。表1本發(fā)明的探針所覆蓋的腫瘤驅(qū)動基因及其范圍注：allCDSs：所有編碼區(qū)；Exon和Exons：外顯子。在本發(fā)明中，基因名稱均采用NCBI-Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)里的官方命名(OfficialSymbol)。染色體序列的參考序列為GRCh37/hg19(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于具體公開的參考染色體序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員簡單地通過對應(yīng)，可以將本發(fā)明涉及的染色體序列在其他類型的基因組數(shù)據(jù)版本上確定。因此，本發(fā)明適用于其他類型的基因組數(shù)據(jù)版本，例如以后發(fā)布的版本。在本發(fā)明中，提及基因序列(包括DNA序列、RNA序列)意味著包括提及的序列本身，以及如果在生物學(xué)的角度理解合理的情況下也包括提及序列的互補序列。這是因為基因序列在染色體上是雙鏈形式存在的，提及一條鏈上的序列，另外一條鏈上的序列也必然存在，突變通常在兩條序列上對應(yīng)出現(xiàn)?；诒?中列出的序列，通過對比待測樣品與基因組數(shù)據(jù)庫中的標準序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定待測樣品是否含有點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異。本發(fā)明檢測的變異類型包括所有57個腫瘤驅(qū)動基因所覆蓋區(qū)域的已知或未知的點突變、短片段插入缺失和拷貝數(shù)變異；6個腫瘤驅(qū)動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)所覆蓋區(qū)域的融合變異。需要說明的是，本發(fā)明也可以檢測MET基因的14號外顯子跳躍突變。以下是本發(fā)明的染色體區(qū)域用于檢測的突變情況：chr1:156843751-156844362(SEQIDNO.9，在NTRK1基因9號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr2:29446394-29448326(SEQIDNO.10，在ALK基因19號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr4:1808661-1808842(SEQIDNO.11，在FGFR3基因17號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr4:55140698-55141007(SEQIDNO.12，在PDGFRA基因11號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr6:117650609-117658334(SEQIDNO.13，在ROS1基因31號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr6:117647577-117650491(SEQIDNO.14，在ROS1基因32號內(nèi)含子發(fā)生的融合),chr6:117645578-117647386(SEQIDNO.15，在ROS1基因33號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr6:117642557-117645494(SEQIDNO.16，在ROS1基因34號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr6:117641193-117642421(SEQIDNO.17，在ROS1基因35號內(nèi)含子發(fā)生的融合)，chr7:116411702-116411902(SEQIDNO.18，MET基因14號外顯子跳躍突變)，chr7:116412043-116412283(SEQIDNO.19，MET基因14號外顯子跳躍突變)，chr10:43610184-43612031(SEQIDNO.20，在RET基因11號內(nèi)含子發(fā)生的融合)。在本發(fā)明中，融合變異是指兩個基因的編碼區(qū)首尾相連置于同一套調(diào)控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結(jié)合序列、終止子等)控制之下，構(gòu)成的嵌合基因。外顯子跳躍，實際上就是涉及到剪切區(qū)域的突變，包括點突變、缺失等，突變后會引起剪切錯誤，導(dǎo)致外顯子丟失。在另一實施方案中，本發(fā)明的用于檢測腫瘤驅(qū)動基因突變的試劑盒包括用于檢測EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK突變的試劑，特別是包括DNA提取試劑、文庫構(gòu)建試劑、探針雜交洗脫試劑、引物和接頭試劑、核酸純化試劑。在一個示例性實施方案中，所述試劑盒包括的試劑的組成如下：表2根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的試劑盒的組成注：上述序號1-22的試劑中，有些未對應(yīng)具體的廠商來源，但本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其中提供的試劑名稱就可以自行獲知很多廠商提供用于實現(xiàn)所述環(huán)節(jié)的試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)有關(guān)手冊配制實現(xiàn)所述環(huán)節(jié)的試劑。對于本發(fā)明中特別選擇的序列組合，可以選擇常規(guī)的方法對其設(shè)計探針。例如對于長度120nt的探針，(1)設(shè)定窗口在所述序列組合中的序列上滑動，得到覆蓋所有序列組合的探針；(2)為了避免探針的GC含量過低(低GC探針會導(dǎo)致覆蓋深度不佳)，在確保目標序列完全覆蓋的情況下，部分探針在GC正常的區(qū)域允許重疊。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在基因探針檢測領(lǐng)域，隨著基因探針數(shù)量增多，在同一個反應(yīng)體系中進行檢測會出現(xiàn)探針的相互影響或干擾。本發(fā)明中突變位點或相關(guān)區(qū)域的選擇考慮了探針覆蓋的全面性與檢測的效率、靈敏度和特異性的平衡，既盡可能多地檢測所需類型的突變，又保證了高靈敏度、高效率的精確檢測。在本發(fā)明中，用于同時檢測多種突變類型的探針符合探針設(shè)計規(guī)范。例如，探針自身不能形成二級結(jié)構(gòu)、探針之間互補序列不宜過長。這樣的探針設(shè)計規(guī)范是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的，探針設(shè)計軟件或者探針設(shè)計提供商也可以提供本領(lǐng)域通常的探針設(shè)計規(guī)范。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于同時檢測57個腫瘤驅(qū)動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因的方法包括以下步驟：1)探針設(shè)計，根據(jù)NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻確定基因集、突變位點或相關(guān)區(qū)域，確定探針的目標區(qū)域，設(shè)計并提交IDT或羅氏(Roche)合成探針；2)DNA提取，提取檢測樣本中g(shù)DNA和cfDNA，包括石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等體液樣本的DNA；3)文庫構(gòu)建，將步驟2)中提取的DNA按文庫構(gòu)建試劑盒說明書構(gòu)建樣本文庫；4)雜交捕獲，將所述樣本文庫采用步驟1)中合成的探針，參照探針制造商(例如IDT或羅氏)提供的說明書進行雜交捕獲；5)上機測序，將步驟4)中捕獲的樣品進入Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀上機測序，產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)；6)信息分析，采用發(fā)明人自主開發(fā)的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術(shù)——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)對所述原始測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計質(zhì)控參數(shù)如目標區(qū)域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率等，并進行變異檢測和注釋；7)結(jié)果解讀，對于檢測出來的變異，進行公共數(shù)據(jù)庫(COSMIC)和已建立的數(shù)據(jù)庫比對和文獻檢索，根據(jù)數(shù)據(jù)庫記載和文獻報道，判斷其與靶向藥物療效和預(yù)后的關(guān)系。本發(fā)明的方法可通過檢測血液、胸水、腹水等體液以及腫瘤冰凍組織或石蠟切片獲得全面的腫瘤驅(qū)動基因突變信息，提高了腫瘤基因檢測的靈敏度和準確率，從而實現(xiàn)輔助臨床醫(yī)生制定個體化用藥方案，使精準治療達到最好效果。實施例下面通過具體的實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本發(fā)明的限制。除非另有定義或說明，本專利所述的科學(xué)技術(shù)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。本發(fā)明實施例中腫瘤基因的探針設(shè)計策略如下：探針設(shè)計的方法概括為根據(jù)NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻確定基因集、突變位點或相關(guān)區(qū)域，確定探針的目標區(qū)域，設(shè)計并提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)合成探針。(1)對于非復(fù)雜區(qū)域發(fā)生的變異，直接按照探針提供商的常規(guī)的設(shè)計方法即可。(2)融合基因檢測的探針設(shè)計：融合基因的斷點通常發(fā)生于內(nèi)含子(intron)區(qū)域，本發(fā)明對于融合基因的檢測是基于DNA水平，并且可以精確到具體的斷點，因此探針需要覆蓋相關(guān)的內(nèi)含子。根據(jù)NCCN指南確定本發(fā)明需要檢測的融合基因為ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1，然后根據(jù)COSMIC、TCGA數(shù)據(jù)庫和文獻記錄的融合變異類型和斷點位置確定本發(fā)明探針需要覆蓋的區(qū)域。將預(yù)定的區(qū)域和全基因組參考序列進行比對，對于存在斷點的重復(fù)區(qū)域，再增加覆蓋配對基因的探針序列；(3)短片段插入缺失的探針設(shè)計：大于15bp堿基的缺失可能會在探針捕獲時存在缺口，因此針對熱點該類型變異(EGFR19號外顯子缺失)，再增加基于突變后的序列設(shè)計探針。經(jīng)過發(fā)明人反復(fù)測試，對于本發(fā)明的用于同時檢測多種突變類型的序列組合1)-3)項中序列除序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，以105-135nt的窗口長度平鋪獲得的探針均可有效用于本發(fā)明的檢測中，序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探針可以是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。在本發(fā)明實施例中，在序列組合1)-3)項中序列除以下表中的序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，使用的是以120nt的窗口長度平鋪獲得的探針；序列區(qū)間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探針是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40；短片段插入缺失的探針是SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。實施例1：本實施例以涵蓋點突變、短片斷插入缺失、拷貝數(shù)變異和融合基因變異類型的3個Horizon標準品(HD-C755、HD200和HD664)、1個細胞系RT112和8個已知變異的臨床樣本為例來闡述本發(fā)明。本實施例的實施流程如圖1。1.DNA提取：本發(fā)明的樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病例組織、石蠟切片、全血、血漿、胸腔積液標本等。本實施例采用血細胞的gDNA的測序結(jié)果作為對照用于排除胚系突變。對于全血需要首先進行血漿/血細胞分離：采集10mL外周血，及時進行血漿/血細胞分離(EDTA抗凝管，4h內(nèi)；Streck管72h內(nèi))。分離步驟如下：第1步：在4℃條件下1600g離心10min，離心后將上層血漿分裝到多個1.5mL或者2.0mL的離心管中，在吸取血漿過程中注意不要吸到中間層的白細胞。注意：在分離血漿后，中間層+底層血細胞留取備用，作為正常對照。第2步：在4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細胞，將上清轉(zhuǎn)入新的1.5mL或者2.0mL離心管中(注意不要吸到管底的白細胞)，即得到所需的血漿。DNA提?。貉獫{、胸腔積液等體液按照QIAampCirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取試劑說明書，進行血漿cfDNA的提取。血細胞和組織等樣本按照QIAampDNAMiniKit提取試劑說明書，進行g(shù)DNA的提取。然后采用Qubit定量，要求血漿cfDNA大于30ng；血細胞gDNA大于300ng；組織DNA大于100ng。2.文庫構(gòu)建：體液中提取的cfDNA按照NEBNextUltraII文庫構(gòu)建試劑盒說明書構(gòu)建樣本文庫，引物和接頭來自于Invitrogen。對于組織或者用于對照的血細胞提取的基因組DNA，應(yīng)先打斷成200-250bp的片段，然后按照文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建樣本文庫。2.1末端修復(fù)及加“A”：按照下表配置末端修復(fù)以及加“A”反應(yīng)：組分單反應(yīng)體積(μl)EndPrepReactionBuffer7EndPrepEnzymeMix3cfDNA或片段化的DNA50μl總體積60μl將以上混合物充分振蕩混勻并離心，然后按照以下步驟在恒溫混勻儀上孵育：首先20℃，孵育30min；然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室溫，高速離心機短暫離心。2.2接頭連接：按照下表配置接頭連接反應(yīng)Premix：組分單反應(yīng)體積(μl)LigationMasterMix30LigationEnhancer1總體積31接頭加入量隨DNA起始量變化而變化，對應(yīng)關(guān)系見下表：依次向反應(yīng)管中加入31μl接頭連接反應(yīng)Premix及對應(yīng)體積的接頭，并用ddH2O補充體積至95μl，充分振蕩混勻后離心。恒溫混勻儀20℃孵育15min。孵育完成后，微量高速離心機短暫離心。連接反應(yīng)結(jié)束后，使用磁珠對接頭連接產(chǎn)物進行純化，最后回溶至25μLTE(pH8.0)中。2.3捕獲前PCR(Non-C-PCR)引入標簽(index)按照下表順序在PCR管中加入反應(yīng)組分，振蕩混勻并離心，并設(shè)置陰/陽性對照：2.3.1PCR上機樣本循環(huán)數(shù)對應(yīng)關(guān)系見下表：2.3.2PCR上機程序見下表：對Non-C-PCR產(chǎn)物進行純化，最終溶解在31μlTE(pH8.0)中。純化產(chǎn)物進行Qubit-BR定量和2100質(zhì)控。3.靶序列富集與上機測序3.1擴增后文庫質(zhì)控合格后并采用本發(fā)明實施例設(shè)計的探針，參照芯片制造商(IDT)提供的說明書進行雜交捕獲。最后洗脫回溶21μLddH2O帶雜交洗脫磁珠。3.2雜交捕獲產(chǎn)物的擴增。3.3先除去上一步磁珠，然后進行磁珠純化，最后回溶25μLddH2O，進行QC及上機。3.4采用Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀進行上機測序，測序?qū)嶒灢僮靼凑罩圃焐烫峁┑牟僮髡f明書進行上機測序操作。4.信息分析正反雙鏈糾錯低頻信息分析(RealSeqPipeline)具體方法為：4.1基于插入片段兩端的序列堿基作為標簽，所述插入片段是文庫中與接頭引物相連接的DNA片段，經(jīng)雙末端測序，每個片段形成一對成對測序序列；將成對測序序列的測序序列1的前12bp堿基和測序序列2的前12bp堿基作為標簽，字母序排列以較小的標簽在前連接成24bp的一條索引，并且以這24bp作為成對測序序列的索引，測序序列1的標簽在前就標記成正鏈；測序序列2的標簽在前就標記為反鏈；4.2對索引進行外部排序，以達到將同一個DNA模板的所有測序重復(fù)測序序列聚集到一起的目的；4.3對聚集起來的擁有相同索引的測序序列進行中心聚類，根據(jù)其序列之間的漢明距離(Hammingdistance)，將每個有相同索引的大簇聚集成若干個小簇，每個小簇中任意兩對成對測序序列的漢明距離不超過10，以達到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；4.4對步驟4.3中獲得的同一個DNA模板的重復(fù)簇進行篩選，若正鏈和反鏈的測序序列數(shù)都達到2對以上，則進行后續(xù)分析；4.5對滿足4.4中條件的簇進行糾錯，并產(chǎn)生一對無錯的新測序序列。對于DNA模板的每一個測序堿基，若某種堿基型在正鏈的測序序列中的一致率達到80％，且在反鏈測序序列中的一致率也達到80％，則記新測序序列的這個堿基為此堿基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測序序列；4.6將新測序序列用bwamem算法重新比對到基因組上，篩除比對質(zhì)量小于30的測序序列；4.7根據(jù)4.6中得到的測序序列進行統(tǒng)計，得到捕獲區(qū)域內(nèi)每個位點的堿基型分布，統(tǒng)計目標區(qū)域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率；4.8CallSNV/InDel/SV/CNV：根據(jù)患者樣品與對照樣品信息的比對，用mutect流程callsomaticSNV變異；用gatk流程callsomaticInDel變異；用contra.py流程callCNV；用somVar流程callSV；所使用的篩選參數(shù)為：對照位點變異率≤2％；糾錯后變異測序序列條數(shù)≥2；突變預(yù)測p值≤0.05；4.9變異注釋：注釋變異的功能、變異測序序列支持數(shù)、變異頻率、氨基酸變異及已有變異數(shù)據(jù)庫中的該變異的情況。5.檢測結(jié)果：5.1探針性能：以下將結(jié)合覆蓋度和目標區(qū)域序列占比說明本發(fā)明的探針的性能。A.覆蓋度：在樣本的平均測序深度為～1000X(去除重復(fù)讀段(reads))的情況下；目標區(qū)域覆蓋深度大于500X的比例大于90％，表明覆蓋情況很好。B.目標區(qū)域序列占比：本發(fā)明目標區(qū)域序列占比均值是53％，說明本發(fā)明捕獲效率較高(表3)。表3本發(fā)明的探針的測試樣本覆蓋度和目標區(qū)域占比分布5.2變異檢測結(jié)果本發(fā)明的方法檢測結(jié)果與已知的變異類型和頻率結(jié)果完全一致。對于點突變，本發(fā)明的方法可以準確識別0.5％以上的突變(表4)。表4實施例1變異檢測結(jié)果5.3融合基因靈敏度分析：將含有融合基因變異FGFR3-TACC3的細胞系DNA按照2％、1％、0.5％進行稀釋，并設(shè)置一個平行重復(fù)，然后進行檢測。結(jié)果表明本發(fā)明的靈敏度高，0.5％的融合基因變異即可檢出，檢測頻率與理論頻率相比，具有高度的一致性和重復(fù)性(表5)。表5融合基因靈敏度分析檢測結(jié)果實施例2：取待檢測的臨床肺癌血液樣本1例。受檢者既往接受克唑替尼治療，治療10個月后，效果不明顯，疾病繼續(xù)發(fā)展。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法對血液樣本進行血漿/血細胞分析，DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構(gòu)建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結(jié)果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。EML4-ALK融合基因的斷點分別為chr2:42503274和chr2:29447354；前者位于EML4基因6號內(nèi)含子(NM_019063)，后者位于ALK基因19號內(nèi)含子(NM_004304)。圖2為ALK基因c.3806G>C讀段圖；圖3為TP53基因c.455C>T(p.P152L)讀段圖。在圖2中，參考序列的C堿基突變成了G堿基(由于ALK基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變?yōu)镚突變?yōu)镃)。在圖3中，參考序列的G堿基突變成了A堿基(由于TP53基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變?yōu)镃突變?yōu)門)。檢測結(jié)果解讀：盡管受檢者依然存在ALK基因融合，但是ALK基因激酶區(qū)的G1269A突變會導(dǎo)致克唑替尼發(fā)生耐藥。目前FDA批準的ALK抑制色瑞替尼和艾樂替尼均能解決G1269A突變導(dǎo)致的耐藥問題。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，目前尚無相關(guān)的靶向藥物。基于上述基因突變的檢測結(jié)果，該肺癌患者選擇第二代ALK抑制劑色瑞替尼或艾樂替尼為宜。實施例3：取待檢測的臨床肺癌石蠟切片組織樣本1例。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構(gòu)建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結(jié)果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。圖4為的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)讀段圖的部分截圖；圖5為TP53基因的c.578A>C(p.H193P)讀段圖的部分截圖。在圖4中，參考序列的15個堿基GGAATTAAGAGAAGC存在缺失。在圖5中參考序列的T堿基突變成了G堿基(由于TP53基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變?yōu)锳突變?yōu)镃)。檢測結(jié)果解讀：受檢者存在EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)突變，宜采用EGFR抑制劑，如易瑞沙或特羅凱進行治療為宜。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，目前尚無相關(guān)的靶向藥物。實施例4：取待檢測的臨床肺癌胸水1例，同步采集外周血，以血細胞提取的基因組DNA作為對照。受檢者為肺腺癌IV期患者，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法對胸水樣本進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構(gòu)建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結(jié)果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。圖6為MET基因的14號外顯子跳躍突變c.3028_3028+17del18讀段圖的部分截圖。在圖6中，參考序列的18個堿基GGTATATTTCAGTTTATT存在缺失。檢測結(jié)果解讀：受檢者同時存在MET基因擴增和14號外顯子跳躍突變。因此該肺癌患者宜選擇MET抑制劑，如克唑替尼和卡博替尼，進行治療為宜。序列表<110>北京吉因加科技有限公司蘇州吉因加生物醫(yī)學(xué)工程有限公司<120>用于同時檢測多種突變類型的序列組合和探針<130>CP20160435<160>40<170>PatentInversion3.3<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>1tgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaagg60cgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatgg120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>2atcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaaca60ctcgatgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccacc120<210>3<211>79<212>DNA<213>Homosapiens<400>3ctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatcttggccactcttccagggcctgga60caggtcaagaggcagtttc79<210>4<211>79<212>DNA<213>homosapiens<400>4gatggccatggcgcggacgcgggtgccgggcgggggtgtggaatcaacccacagctgcac60agggcaggtcttggccagt79<210>5<211>80<212>DNA<213>homosapiens<400>5gtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaag60ccaacaaggaaatcctcgat80<210>6<211>81<212>DNA<213>homosapiens<400>6cacacgcaaatttccttccactcggataagatggctgaggaggggccagacctaagagca60atcagtgaggaatcagaggcc81<210>7<211>80<212>DNA<213>homosapiens<400>7atctgtagactaccgagctacttttccagaaggtatatttcagtttattgttctgagaaa60tacctatacatatacctcag80<210>8<211>5177<212>DNA<213>homosapiens<400>8ggccttcaaccactatctcagtgcaatgggtaagcaatgcctgggtaagaggcagttgac60gtgtggatggttgaatctgcttgaaggctgtgtgtggcatttaaaatccccttttaaaac120cccgtaactgatttattccatctttagatgggaatggaggatgtgtcaaactatcaaacc180aacttttttttttttttttgagatgagtcttgctctgtcgcccaggctggagtgcagtgg240tgcaatctcagctcaccgcaagctccacctcccgggttcaagcaattctcctacctcagc300ctccagagtagctgggactacaggcgcgtgccaccacgcccagctaattttttctatttt360tggtagagatggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcaatctcctgaccttgtaat420ctgcctgtctcagcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcgcatggccc480acatcaacatttttacaaagttactaacttttgtggcagtgatgagttgaggtccaaaca540ttagctttcaggtctgtcttcattaagctaaagtgtgttttaaccaccaggctttacata600gtaatgacattttgcttgaaagggaactgatcatttacagaaaatagcttaataatcaaa660agtgtaaagaaagatgacaatcatttttgaaaataacacttttaaaaaaatgaactagtt720catgaaagcagtaccaacatagaaccatgaaaatggtttgttttctgcctaaattcctct780ttgtgcttattgctcagagggtttggacatagtactaatcagattaggttgtaggttttt840atttcagggattaaaggcagtagtagggtttgaaccaagagtggctaacataaataccac900agaggcccacagcaaaatcatggaaggaactgacctggtggagactggtaaattggagag960tatttgccccttctatgtttgggccacacctaattgtggctgtgagggcatgtggtctca1020gggtgggttttcctatattgcaagataacctaggaatgcaaaattgatgccagataccct1080gtttcaacattgacagctgattcagattttgaaaacattgtacaagctgaaaagaaacat1140ctgcagacttgatttggcccttgaacctacagcatgtgactttgggtacatactttgggt1200aaccttggtgaggggctgagtctgtgttgatcgacttgctgttccccaccaatggaaaag1260gttcatgtcttgatcagtagtcaatcacattgaccatttgtccagattagcttgccatac1320atgaacaagatagaagtaa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