本發(fā)明涉及細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改良的熒光原位雜交方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2001年WHO對(duì)淋巴造血組織腫瘤進(jìn)行了新的分類，目前在臨床上淋巴細(xì)胞增殖性疾病主要指淋巴細(xì)胞白血病及部分惡性淋巴瘤。淋巴細(xì)胞白血病是一種起源于B或T系淋巴細(xì)胞克隆性惡性增值性疾病，主要包括急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia,ALL）和慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）。前者的特征是不成熟原幼淋巴細(xì)胞在血液、骨髓及淋巴組織中異常增殖和堆積。后者的特征是一種免疫功能不健全的成熟小淋巴細(xì)胞血液、骨髓及淋巴組織中慢性惡性增殖的疾病，最終導(dǎo)致正常造血功能衰竭。惡性淋巴瘤（lymphoma）是發(fā)生于淋巴結(jié)和/或結(jié)外部位淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤，來(lái)源于淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞的惡變，分為非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin Lymphoma, NHL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphoma, HL）兩大類，其中以NHL為主，大約占到85%。常見(jiàn)的如濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等等。近年來(lái)在我國(guó)隨著病毒感染、環(huán)境污染、人口老齡化等因素，淋巴細(xì)胞增殖性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的健康，部分患者總病程僅數(shù)月，部分患者即使不積極治療仍能數(shù)年之久，有些初病時(shí)癥狀類似的患者，即使接收相同的治療，但有完全不同的預(yù)后，因?yàn)榻⒚鞔_的預(yù)后判斷體系對(duì)于個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。
既往評(píng)價(jià)診療及預(yù)后的指標(biāo)主要依靠患者的臨床表現(xiàn)、外周血、骨髓的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓活檢術(shù)、常規(guī)細(xì)胞遺傳（CC）學(xué)、免疫分型等等，這些存在以下問(wèn)題：第一、雖然細(xì)胞改變的質(zhì)與量是形態(tài)學(xué)診斷的重要依據(jù)，但在不典型的原淋細(xì)胞、幼淋細(xì)胞、原粒細(xì)胞之間及同時(shí)表達(dá)髓系、淋系標(biāo)志的細(xì)胞難于清晰區(qū)分；第二、CC技術(shù)只能分析中期細(xì)胞，受細(xì)胞周期及染色體分裂數(shù)量和質(zhì)量的影響，因而可能導(dǎo)致核型分析失敗或漏檢伴有染色體畸變的微小克隆，并且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，主觀人為因素影響太大。如涂片制備的好壞、細(xì)胞計(jì)數(shù)多少、計(jì)數(shù)辨認(rèn)和程度的估計(jì)等等導(dǎo)致CC對(duì)染色體異常的檢出率很低。
二十世紀(jì)八十年代在常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization ,FISH）技術(shù)，是利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo)記或先以生物素或地高辛等半抗原標(biāo)記后與靶DNA進(jìn)行雜交，再通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光素標(biāo)記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)，從而對(duì)標(biāo)本中待測(cè)核酸進(jìn)行定性、定位和定量分析。因此聯(lián)合FISH技術(shù)不僅可明顯提高淋系疾病的染色體異常檢出率和準(zhǔn)確率，而且具有獨(dú)立的預(yù)后判斷價(jià)值，在疾病診斷之初或進(jìn)展時(shí)應(yīng)做FISH染色體檢查，以評(píng)估預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療。
在判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療方面：常使用靶向探針GLP P53、GLP RB1、GLP ATM、GLP D13S25、CSP 12、GLP IGH/ GLP BCL2、GLP IGH/ GLP BCL6、GLP IGH/ GLP CCND1、BCR/ABL1、E2A-PBX1、TCR等等常用于診斷與危險(xiǎn)分層治療的指標(biāo)。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤聯(lián)系最為密切的基因，幾乎所有的人類腫瘤中均存在p53信號(hào)通路的異常。p53基因定位于人類染色體17p13.1，在細(xì)胞接受多種應(yīng)激（如DNA損傷、藥物、射線、癌基因等）信號(hào)后，DNA雙鏈斷裂，從而激活共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ATM），進(jìn)一步磷酸化p53，活化的p53可以激活p21WAF1/CIP1等多種基因，參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、老化及凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤。伴有p53突變的淋巴細(xì)胞疾病患者預(yù)后較差。FISH同時(shí)檢測(cè)P53、ATM缺失、 RB1缺失和+12陽(yáng)性，提示CLL總生存期短、預(yù)后差；GLP D13S25陽(yáng)性，則提示CLL病人與預(yù)后好；BCR/ABL1融合基因陽(yáng)性ALL，提示預(yù)后差，但可用靶向藥物格列衛(wèi)治療；E2A-PBX1陽(yáng)性主要見(jiàn)于前B細(xì)胞ALL，提示預(yù)后很差；TCR重排見(jiàn)于T-ALL，陽(yáng)性預(yù)后差。14號(hào)染色體異常是淋巴瘤最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)異常，絕大多數(shù)是由于伙伴染色體與14號(hào)染色體交互易位造成，從而形成部分淋巴瘤特殊的標(biāo)記。如濾泡性淋巴瘤常出現(xiàn)t（14：18）陽(yáng)性、套細(xì)胞淋巴瘤常出現(xiàn)t（11：14）陽(yáng)性、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤常出現(xiàn)GLP BCL6陽(yáng)性，如出現(xiàn)陽(yáng)性則提示預(yù)后均差。因此FISH技術(shù)使得臨床上根據(jù)這些指標(biāo)評(píng)估預(yù)后、制定個(gè)體化治療方案成為可能。
淋巴細(xì)胞增生性疾病的治療失敗一直是臨床難題。雖然經(jīng)過(guò)常規(guī)支持、化療或骨髓移植達(dá)到臨床和血液學(xué)的完全緩解（CR），但體內(nèi)仍然殘留有少量的幼稚細(xì)胞，即微小殘留病灶（minimal residual diease,MRD），是復(fù)發(fā)的根源所在。只有分子水平檢測(cè)、診療才能反映其本質(zhì)。因此分子細(xì)胞遺傳學(xué)的研究在淋系增生性疾病的診斷、病情發(fā)展和預(yù)后判斷、制定個(gè)體化治療方案等方面中有著至關(guān)重要的作用，因此研究臨床上與淋巴細(xì)胞增生性疾病診療、預(yù)后密切相關(guān)的問(wèn)題，開(kāi)辟靶向治療的新途徑，提高診療效果，具有非常重要的臨床價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種改良的熒光原位雜交方法及其應(yīng)用，有助于臨床診療及判斷預(yù)后，同時(shí)對(duì)闡明淋巴細(xì)胞增生性疾病的發(fā)病機(jī)制有重要的臨床價(jià)值，具有廣闊的應(yīng)用前景。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種熒光原位雜交技術(shù)，包括如下步驟：
（1）無(wú)菌抽取患者骨髓2~5ml，在凈化臺(tái)內(nèi)調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞數(shù)1~2×106/ml，注入1640培養(yǎng)液，37℃24h培養(yǎng)；
（2）終止培養(yǎng)前加秋水仙胺應(yīng)用液，然后低滲、預(yù)固定、固定、氣干法制片，其余細(xì)胞懸液置-20℃保存；
（3）取出儲(chǔ)存于-20℃的標(biāo)本，換用新鮮的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30~35min，以體積分?jǐn)?shù)為70%、85%、100%的乙醇中室溫下梯度脫水，每梯度脫水2~4min；
（4）在變性液中72℃變性2~4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脫水，每梯度脫水2~4min，然后晾干；
（5）探針處理：1微升熒光素直接標(biāo)記的著絲粒探針，加雜交液，混均后在75℃水浴中變性8~12min，然后置冰浴2~3min；
（6）雜交：變性后的著絲粒探針隨機(jī)加以于玻片雜交區(qū)域內(nèi)，蓋上玻片，封片后放入預(yù)熱的濕盒中，37℃雜交過(guò)夜，雜交后的標(biāo)本在72℃的0.4×SSC溶液中洗滌4~7min，然后用0.1%Triton X-100溶液洗滌2~4min；
（7）復(fù)染：復(fù)染2~4min，用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)。
其中，步驟（3）中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，所述甲醇和冰醋酸的重量比為3：1。
其中，步驟（4）中，所述冰乙酸的溫度為-20℃。
優(yōu)選的，步驟（5）中，所述熒光素為Spectrum green 、 Spectrum red或兩者的混合。
本發(fā)明實(shí)施例還提供一種上述改良的熒光原位雜交方法在制備淋系白血病基因缺失檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：本發(fā)明應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、熱變性姬姆薩顯帶技術(shù)（RHG）、在常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用熒光原位雜交（FISH）等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，擬觀察19例急性淋系白血病（ALL）患者、62例慢性淋系白血?。–LL）患者探討分子細(xì)胞遺傳學(xué)異常與臨床相關(guān)性，研究染色體變化的基因位點(diǎn)，觀察不同的染色體異常在淋系增生性疾病患者中對(duì)診療及預(yù)后的意義，尋找到與患者診斷及預(yù)后的染色體標(biāo)志物，觀察在使用相應(yīng)藥物后生存期、無(wú)病進(jìn)展期等的改變，明確FISH技術(shù)對(duì)于指導(dǎo)患者個(gè)體化治療的臨床價(jià)值。本發(fā)明首次提出從淋巴細(xì)胞增生性疾病的分子染色體異常作為研究窗口尋找預(yù)后的可行性，首次提出借鑒淋巴細(xì)胞增生性疾病的分子染色體異常來(lái)權(quán)衡的治療措施，并且對(duì)闡明淋系增生性疾病的發(fā)病機(jī)制有重要的臨床價(jià)值，同時(shí)為分子靶向治療提供可靠的理論依據(jù)，進(jìn)行分子學(xué)水平診療，因而本發(fā)明的技術(shù)方案具有獨(dú)特的創(chuàng)新之處。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
實(shí)施例1：一種改良的熒光原位雜交技術(shù)，包括如下步驟：
（1-1）無(wú)菌抽取患者骨髓2~5ml，在凈化臺(tái)內(nèi)調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞數(shù)1~2×106/ml，注入1640培養(yǎng)液，37℃24h培養(yǎng)；
（1-2）終止培養(yǎng)前加秋水仙胺應(yīng)用液，然后低滲、預(yù)固定、固定、氣干法制片，其余細(xì)胞懸液置-20℃保存；
（1-3）取出儲(chǔ)存于-20℃的標(biāo)本，換用新鮮的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡30min，以體積分?jǐn)?shù)為70%、85%、100%的乙醇中室溫下梯度脫水，每梯度脫水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比為3：1。
（1-4）在72℃的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺+2×SSC的變性液中72℃變性3min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脫水，每梯度脫水2min，然后晾干；
其中，所述冰乙酸的溫度為-20℃。
（1-5）探針處理：1微升熒光素直接標(biāo)記的著絲粒探針，加雜交液，混均后在75℃水浴中變性10min，然后置冰浴3min；
其中，所述熒光素為Spectrum green 、 Spectrum red或兩者的混合。
所述雜交液的配制如下：8μl體積分?jǐn)?shù)25％DS，20μl 20×SSC混合，取上述混合液50μl，與5μl DF混合即成，其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10％DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50％DF。
（1-6）雜交：變性后的著絲粒探針隨機(jī)加以于玻片雜交區(qū)域內(nèi)，蓋上玻片，封片后放入預(yù)熱的濕盒中，37℃雜交過(guò)夜，雜交后的標(biāo)本在72℃的0.4×SSC溶液中洗滌5min，然后用室溫的0.1%Triton X-100溶液洗滌2min；
（1-7）復(fù)染：用復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade）復(fù)染2min，然后用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)，作出精確的染色體分析，判斷患者基因的缺失及分子遺傳學(xué)異常。
實(shí)施例2：一種改良的熒光原位雜交技術(shù)，包括如下步驟：
（2-1）無(wú)菌抽取患者骨髓2~5ml，在凈化臺(tái)內(nèi)調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞數(shù)1~2×106/ml，注入1640培養(yǎng)液，37℃24h培養(yǎng)；
（2-2）終止培養(yǎng)前加秋水仙胺應(yīng)用液，然后低滲、預(yù)固定、固定、氣干法制片，其余細(xì)胞懸液置-20℃保存；
（2-3）取出儲(chǔ)存于-20℃的標(biāo)本，換用新鮮的固定液，滴片，37℃2×SSC中浸泡31.5min，以體積分?jǐn)?shù)為70%、85%、100%的乙醇中室溫下梯度脫水，每梯度脫水2min；
其中，所述固定液包括甲醇和冰醋酸，而甲醇和冰醋酸的重量比為3：1。
（2-4）在72℃的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺+2×SSC的變性液中72℃變性4min，在70%、85%、100%的冰乙酸中梯度脫水，每梯度脫水2min，然后晾干；
其中，所述冰乙酸的溫度為-20℃。
（2-5）探針處理：1微升熒光素直接標(biāo)記的著絲粒探針，加雜交液，混均后在75℃水浴中變性10min，然后置冰浴3min；
其中，所述熒光素為Spectrum green 、 Spectrum red或兩者的混合。
所述雜交液為8μl體積分?jǐn)?shù)25%DS、20μl 20×SSC混合。
所述雜交液的配制如下：40μl體積分?jǐn)?shù)50％DS，20μl 20×SSC，40μl ddH2O混合，取上述混合液50μl，與5μl DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10％DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50％DF。
（2-6）雜交：變性后的著絲粒探針隨機(jī)加以于玻片雜交區(qū)域內(nèi)，蓋上玻片，封片后放入預(yù)熱的濕盒中，37℃雜交過(guò)夜，雜交后的標(biāo)本在72℃的0.4×SSC溶液中洗滌7min，然后用室溫的0.1%Triton X-100溶液洗滌4min；
（2-7）復(fù)染：用10μl復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade）復(fù)染2min，然后用熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)，作出精確的染色體分析，判斷患者基因的缺失及分子遺傳學(xué)異常。
實(shí)施例3：一種改良的熒光原位雜交方法在制備淋系白血病基因缺失檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，比如用于檢測(cè)淋系白血病患者p53基因的缺失。
對(duì)接診的19例急性淋系白血?。ˋLL）患者、62例慢性淋系白血?。–LL）患者應(yīng)用本發(fā)明的熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in Situ hybridization， FISH）檢測(cè)分析。前者應(yīng)用特異性探針BCR/ABL、MLL、IHG、C-MYC、TEL/AML1，后者應(yīng)用D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)、p53(17p13)、CSP12 檢測(cè)分析。
在81例淋系白血病中：49例檢出分子遺傳學(xué)異常，占58.02%（47/81）。其中19例ALL患者，7例存在1種及1種以上分子遺傳學(xué)異常，占36.84%（7/19）；3例存在2種及2種以上分子遺傳學(xué)異常，占15.79%（3/19），其中最為常見(jiàn)的BCR/ABL陽(yáng)性4例，占21.05%（4/19），其它依次為MLL、IHG、C-MYC、TEL/AML1。
62例CLL患者，42例存在1種及1種以上分子遺傳學(xué)異常，占67.74%（42/62）；10例存在2種及2種以上分子遺傳學(xué)異常，占16.13%（10/62），其中最常見(jiàn)為13q14.3占41.94%（26/62），其它依次為13q14、+12 、11q22.3、17p13。
由上述數(shù)據(jù)可知：分子遺傳學(xué)分析不但有助于淋系白血病的診斷和鑒別診斷，而且還是臨床監(jiān)測(cè)病情緩解和復(fù)發(fā)、判斷療效的重要指標(biāo)。在染色體核型分析基礎(chǔ)上選用合適的熒光原位雜交探針和方法，可對(duì)大多數(shù)淋系白血病患者作出精確的染色體分析，各分子遺傳學(xué)異常與患者預(yù)后相關(guān)。
以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。