本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種聯(lián)合蘋果愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化鑒定蘋果抗病基因的方法。

背景技術(shù)：

蘋果是世界四大水果之一，我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)國，面積和產(chǎn)量均居世界首位。以蘋果輪紋病為代表的真菌病害，是嚴(yán)重制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展的重要病害。以輪紋病為例，該病由致病真菌Botryosphaeria dothidea引起，其危害主要表現(xiàn)兩個方面：(一)侵染枝干，導(dǎo)致樹體衰弱，造成蘋果產(chǎn)量與品質(zhì)下降；嚴(yán)重時導(dǎo)致樹體死亡；(二)在果實成熟期和采后儲藏期，侵染果實，導(dǎo)致果實迅速腐爛，失去食用價值。目前，生產(chǎn)上主要采用刮樹皮、噴施與涂抹石硫合劑、多菌靈與禁用農(nóng)藥福美胂等來防治枝干輪紋病(國立耘等，2009)。對果實則采用套袋技術(shù)。雖然每年為防治輪紋病要耗費(fèi)大量人力物力，但因輪紋病造成的爛果仍占20％左右，損失巨大(張高雷等，2011)。因此，培育、推廣與主栽抗病品種是有效應(yīng)對輪紋病等真菌病害的當(dāng)務(wù)之急，長遠(yuǎn)來看，也是實現(xiàn)蘋果產(chǎn)業(yè)綠色、環(huán)保與高效發(fā)展的必由之路。

而抗病基因的挖掘和鑒定，是充分挖掘與利用抗病基因潛能，進(jìn)行抗病品種培育的理論基礎(chǔ)。近年來，蘋果基因組測序、重測序、深度測序以及相關(guān)組學(xué)等方面的研究取得了很大進(jìn)展，為理解蘋果基因組的基因構(gòu)成與表達(dá)提供了宏大的信息量，但對于蘋果基因功能的研究仍然受制于蘋果生長周期長、轉(zhuǎn)化難、童期長等生物學(xué)特征。與擬南芥、水稻、煙草等模式植物相比，所鑒定的蘋果抗病基因的數(shù)量仍然非常少。這已然成為蘋果抗病分子機(jī)制研究與抗病育種研究的一個巨大障礙和技術(shù)瓶頸。在目前的研究中，研究者普遍借用模式植物轉(zhuǎn)化體系，將蘋果基因作為外源基因?qū)霟煵?、擬南芥等模式植物，這種研究路線在某種程度上可以對蘋果基因的功能進(jìn)行注釋和研究，但這種策略抹殺了物種特異性，對問題的揭示具有很大的局限性。目前，國內(nèi)外的研究科學(xué)家已經(jīng)開始注重創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因蘋果材料，并取得了一定進(jìn)展。但仍然不可避免蘋果生長周期長、轉(zhuǎn)化難這一異于模式植物的主要制約因素。而且，由于蘋果高度雜合，基因功能冗余以及生物學(xué)上的自交不親和，也很難通過突變體篩選來鑒定蘋果的抗病基因。因此，尋找一種高效的進(jìn)行蘋果抗病基因鑒定與篩選的方法，對于目前蘋果抗病功能基因的研究尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定目的基因為蘋果抗病相關(guān)基因的方法。

本發(fā)明提供的方法，為利用蘋果愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，鑒定目的基因是否為蘋果抗病相關(guān)基因。

上述方法中，

所述方法包括如下步驟：

1)提高或沉默所述蘋果愈傷組織中目的基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞或沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞；

2)將所述轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞或所述沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞、和所述蘋果愈傷組織細(xì)胞分別接種引發(fā)蘋果發(fā)病的某種病原菌，得到接種后轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞、接種后沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞和接種后蘋果愈傷組織細(xì)胞；

觀察抗病力，若所述接種后轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞或所述接種后沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞與所述接種后蘋果愈傷組織細(xì)胞的抗病力有顯著差異，則目的基因為或候選為蘋果抗該病原菌引發(fā)病相關(guān)基因；若所述接種后轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞或所述接種后沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞與所述接種后蘋果愈傷組織細(xì)胞的抗病力無顯著差異，則目的基因不為或候選不為蘋果抗該病原菌引發(fā)病相關(guān)基因。

顯著差異為如下：

若所述接種后轉(zhuǎn)目的基因愈傷組織細(xì)胞的抗病力顯著小于所述接種后蘋果愈傷組織，則所述目的基因為或候選為蘋果抗該病原菌的基因；

若所述接種后沉默目的基因愈傷組織細(xì)胞的抗病力顯著大于所述接種后蘋果愈傷組織，則所述目的基因為或候選為與蘋果抗該病原菌相關(guān)的基因；

上述方法中，

所述提高蘋果愈傷組織中目的基因的表達(dá)為將目的基因?qū)胩O果愈傷組織；

或，所述沉默蘋果愈傷組織中目的基因的表達(dá)為將干擾所述目的基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入蘋果愈傷組織；

或，所述蘋果愈傷組織為蘋果葉片愈傷組織；

或，所述病為蘋果輪紋病；

或，所述病原菌為蘋果輪紋病病菌。

蘋果愈傷組織在鑒定目的基因是否為蘋果抗病相關(guān)基因中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

或蘋果愈傷組織在培育抗病性蘋果愈傷組織或抗病性蘋果中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述中，所述目的基因為序列2所示的蛋白的編碼基因或序列4所示的蛋白的編碼基因或序列6所示的蛋白的編碼基因；

所述干擾序列2所示的蛋白的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為序列7所示的核苷酸或者表達(dá)序列7所示核苷酸的重組載體。

本發(fā)明另一個目的是提供一種蛋白。

本發(fā)明提供的蛋白，是如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列4或序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(3)將序列2或序列4或序列6的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與(1)具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白質(zhì)。

編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第三個目的是提供一種DNA分子。

本發(fā)明提供的DNA分子，為如下1)-4)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列3或序列5所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的由1)或2)衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且具有相同功能的由序列1或序列3或序列5衍生的DNA分子。

含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述DNA分子或權(quán)上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組微生物在培育抗病性植物愈傷組織或抗病性植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述中，

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，

或所述雙子葉植物為蘋果；

或所述病為蘋果輪紋??；

或所述病原菌為蘋果輪紋病病菌。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化進(jìn)行蘋果抗病基因功能鑒定，克服了蘋果植株轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化難等在開展蘋果抗病基因功能研究中的技術(shù)壁壘，大大提高了蘋果抗病基因的篩選效率，為篩選與鑒定蘋果抗病基因提供了一個高效、簡易的方法，使蘋果重要抗病基因的發(fā)掘成為可能。該方法具有高效、易行、耗時短的特點，它為蘋果抗病基因的篩選鑒定與蘋果抗病基因作用機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)和可能。

附圖說明

圖1為MdSYP121基因的克隆。

圖2為MdSYP121基因沉默蘋果細(xì)胞系及MdSYP121超表達(dá)蘋果細(xì)胞系的分子和蛋白水平鑒定。

圖3為MdSYP121基因沉默蘋果細(xì)胞系及MdSYP121超表達(dá)蘋果細(xì)胞系的抗病力表型鑒定。

圖4為MdBAK1基因的克隆。

圖5為MdBAK1超表達(dá)蘋果細(xì)胞系及MdBAK1超表達(dá)蘋果植株的分子和蛋白鑒定。

圖6為MdBAK1超表達(dá)細(xì)胞系抗病力表型鑒定。

圖7為MdBAK1超表達(dá)蘋果植株葉片抗病力表型鑒定。

圖8為輪紋病菌菌絲的PDA板等距離的菌餅示意圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、蘋果愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化鑒定蘋果抗病相關(guān)基因MdSYP121

一、待鑒定目的基因MdSYP121的獲得

1、應(yīng)用CTAB法從富士蘋果果肉提取總RNA

CTAB提取緩沖液配方：0.1M Tris-Cl(pH 8.0)，1.4M NaCl，20mM EDTA，2％CTAB，2％PVP，2％β-巰基乙醇

1)水浴鍋調(diào)至65℃，離心機(jī)4℃預(yù)冷。

2)配CTAB提取液，取4mL加入DEPC處理過的10mL離心管，65℃水浴預(yù)熱。

3)液氮中研磨蘋果果肉0.5-1g，研磨至粉狀。

4)將研磨好的樣品迅速加入預(yù)熱過的離心管，劇烈震蕩、渦旋，65℃水浴5min。

5)在冰架上冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)并渦旋混合，4℃，10000rpm離心15min。

6)上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，重復(fù)步驟5)一次。

7)上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，加入1/3體積的LiCl(8M，4℃預(yù)冷)4℃沉淀過夜(不超過16h)。

8)4℃，10000rpm離心30min，棄上清。

9)用500μL SSTE溶解沉淀，常溫轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，吸打混勻，4℃，10000rpm離心10min(抽提后上層應(yīng)為澄清狀態(tài)，若為乳白色應(yīng)繼續(xù)離心)。

10)取上清至新的1.5mL離心管(冰浴預(yù)冷)，加入兩倍體積無水乙醇，混勻后于-70℃沉淀30min或-20℃沉淀2h。

11)4℃，12000rpm離心20min，沉淀RNA，棄上清。

12)400μL 70％乙醇洗滌沉淀，重復(fù)一次，冰浴晾干，20μL DEPC水溶解RNA。

利用1％濃度的瓊脂糖檢測RNA的完整性，利用Nanodrop2000測定RNA的濃度和純度。

取5μL總RNA，按照RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、MdSYP121超表達(dá)載體構(gòu)建

采用如下引物，以上述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得MdSYP121CDS序列全長，大小為1000bp。

MdSYP121-BamHI-F:5’-GGATCCATGAACGATTTGTTCTCCGGCTCCT-3’

MdSYP121-StuI-R:5’-AGGCCTCTGCGGTTGCGGYGGCGGT-3’

PCR反應(yīng)體系：總體積100μL，包括cDNA模板5μL，8μLdNTP，克隆引物各5μL，5×HF Buffer20μL，ddH₂O 56μL，Phusion高保真酶1μL。

反應(yīng)程序為：

①98℃30s

②98℃15s

③58℃15s

④72℃ 1min30s

⑤go to②③④for 35個循環(huán)

⑥72℃ 5min

⑦4℃保存

PCR產(chǎn)物純化回收，片段大小約為1000bp(圖1)。

將該P(yáng)CR產(chǎn)物用2.5倍體積的95％酒精進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物沉淀；然后，用75％酒精洗沉淀，晾干，用無菌水溶解。

測序該P(yáng)CR產(chǎn)物，其核苷酸序列為序列表中序列1，編碼的蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2，將該核苷酸所示的基因命名為MdSYP121，編碼的蛋白命名為MdSYP121。

二、超表達(dá)MdSYP121的載體和MdSYP121沉默表達(dá)載體構(gòu)建

1、超表達(dá)MdSYP121的載體

將序列表中序列1所示的MdSYP121替換pCB302’質(zhì)粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302’-35S-MdSYP121-2HA，該載體超表達(dá)MdSYP121。

pCB302’質(zhì)粒為將參考文獻(xiàn)：Cui et al.,Plant Physiology,2013,162:1018-1029第1028頁Generation of AXR2and AXR2P87S Transgenic Plants中的pCB302質(zhì)粒中的FLAG標(biāo)簽替換為HA標(biāo)簽。

2、MdSYP121沉默表達(dá)載體

以蘋果果肉的cDNA為模板，用下面的引物擴(kuò)增第一片段和第二片段：

第一片段：

F:5’-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3’；

R:5’-CCATCGAT CTTGCTCCTGTATTGCCTT-3’。

第二片段：

F:5’-CCGCTCGAG GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3’；

R:5’-GGGGTACC CTTGCTCCTGTATTGCCTT-3’。

得到493bp的第一片段，經(jīng)過測序，其為具有序列1第121-613位核苷酸；

得到493bp的第二片段，經(jīng)過測序，其為具有序列1第121-613位核苷酸；與第一片段僅酶切位點不同。

將上述第一片段替換RNAi中間載體pHannibal(參考文獻(xiàn)：Varsha Wesley et al.,Plant Journal,2001,27:581-590Figure 5)的BamH I和Cla I酶切位點間的片段，且將第二片段替換RNAi中間載體pHannibal的Xho I和Kpn I酶切位點間的片段，得到中間載體pHannibal-SYP121；

再用BamH I和Stu I雙酶切中間載體pHannibal-SYP121，得到2600bp的片段(該片段測序結(jié)果見序列7，第317-809位為第一片段，第1671-2163位為第二片段)；

將該該2600bp的片段與經(jīng)過BamH I和Stu I酶切的pCB302’載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pCB302’-RNAi-MdSYP121。

三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因愈傷組織

1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及活化

1)所用農(nóng)桿菌株系為：將100μL農(nóng)桿菌LBA4404(ThermoFisher SCIENTIFIC,18313-015)感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，加入2μL質(zhì)粒DNA(pCB302’-RNAi-MdSYP121或pCB302’-MdSYP121-2HA)，混勻，冰浴30min，液氮速凍1min，37℃熱激5min，冰浴2-3min。

2)加入1mL YEP培養(yǎng)基，28℃，200rpm，震蕩1.5h，離心棄上清，留100μL液體重懸菌體。

3)將重懸好的菌體均勻涂在加有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的固體YEP培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2d。

4)挑取固體YEP培養(yǎng)基上的單克隆農(nóng)桿菌于2ml加有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的液體YEP培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，震蕩20h。

5)取50ml加有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的液體YEP培養(yǎng)基于150ml錐形瓶，加入2ml已搖好的菌液，28℃，200rpm，震蕩6-7h至OD₆₀₀值為0.4-0.6，得到LBA4404/pCB302’-RNAi-MdSYP121菌液和LBA4404/pCB302’-MdSYP121-2HA菌液。

2、蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化

1)分別將LBA4404/pCB302’-RNAi-MdSYP121菌液和LBA4404/pCB302’-MdSYP121-2HA菌液移至50mL離心管，28℃，5000rpm，離心10min，棄上清。

2)用50mLMS液體培養(yǎng)基重懸，將蘋果葉片愈傷組織(品種名稱：王林；以下也稱為野生型細(xì)胞)移入菌液中28℃，200rpm，搖20min。

王林蘋果葉片愈傷組織制備：

以春天剛展開的王林蘋果幼嫩葉片為外植體，帶回實驗室用自來水洗凈。在超凈工作臺上用75％的酒精水溶液浸泡10s進(jìn)行消毒，然后用無菌水沖洗3次，再用濃度為3％的次氯酸鈉水溶液(有效Cl濃度)浸泡10min進(jìn)一步消毒，之后用無菌水沖洗3-6次，放在滅過菌的濾紙上吸干水分，用無菌的剪刀剪幾道傷口，放置到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2周，得到王林蘋果葉片愈傷組織

上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基添加2.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L KT，之后進(jìn)行每天16h的光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000～2500lx。溫度均為24±2℃。

3)紗布過濾蘋果葉片愈傷組織，用無菌濾紙吸去表面菌液，置于MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d。

4)共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至加有羧芐青霉素(300mg/L)和除草劑(glufosinate，8mg/L)的MS愈傷組織選擇培養(yǎng)基中，23-26℃暗培養(yǎng)。

5)培養(yǎng)約1個月后，取在愈傷組織選擇培養(yǎng)基上生長出來的細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行接種繁殖下一代，總共篩選4代，得到能夠在含有除草劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行均一穩(wěn)定生長的細(xì)胞系，得到轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞。

3、鑒定

1)、陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞的鑒定

提取轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，用檢測第一片段引物和檢測第二片段引物分別PCR擴(kuò)增；以野生型細(xì)胞作為對照(WT)。

檢測第一片段引物：

F:5’-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3’；

R:5’-GGTAACATGATAGATCATGTC-3’。

檢測第二片段引物：

F:5’-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3’；

R:5’-CTTCGTCTTACACATCACTTGTC-3’。

結(jié)果如圖2A所示(F1和R1分別為沉默載體的第一片段和第二片段)，可以看出，除野生型細(xì)胞WT無目的條帶外，10個轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞都有目的條帶(圖2A)，說明pCB302’-RNAi-MdSYP121轉(zhuǎn)化愈傷組織成功。

為進(jìn)一步檢測MdSYP121是否被沉默，提取10個轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞RNA(#1-#10)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)實時定量PCR檢測，引物序列為：qRT-RNAi-MLO1-F:5’-TCAAGGTGACCAGTTGGACG-3’；qRT-RNAi-MLO1-R:5’-GAACCTGGCCTTCTGCAACTG-3’；內(nèi)參基因為MdActin、引物序列為:MdActin-F:5’-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3’；MdActin-R:5’-TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3’)，以野生型細(xì)胞作為對照(WT)。

結(jié)果如圖2B所示，在10個轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞中，該基因的表達(dá)均被抑制，且抑制達(dá)90％以上，說明MdSYP121在蘋果細(xì)胞中被有效沉默，10個轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞為陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞。

2)、陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞的鑒定

分別提取6個轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞和野生型細(xì)胞WT的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302’載體上含有HA標(biāo)簽)，應(yīng)用Western Blot技術(shù)，檢測MdSYP121-2HA融合蛋白在蘋果細(xì)胞中的表達(dá)。

結(jié)果如圖2C所示，可以看出，在所得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，在分子量43KD處，全部檢測到了HA標(biāo)簽信號，與根據(jù)MdSYP121氨基酸序列數(shù)目判定的分子量大小完全一致，而在野生型細(xì)胞中無此信號，也說明該信號特異，所檢測細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。另，與Anti-HA抗體的檢測結(jié)果相對照，在野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，均能檢測到MdActin的信號。結(jié)果表明，MdSYP121轉(zhuǎn)化愈傷組織成功并能穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞為陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞。

總之，應(yīng)用該愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法，在以除草劑做選擇壓的條件下，所隨機(jī)選取的10個獨立的MdSYP121基因沉默轉(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)的檢測結(jié)果表明：MdSYP121的表達(dá)均被抑制，轉(zhuǎn)化效率為100％(圖2B)；在所選取的6個MdSYP121超表達(dá)細(xì)胞團(tuán)的檢測結(jié)果表明，均含有MdSYP121蛋白，轉(zhuǎn)化效率為100％(圖2C)。而且，獲得穩(wěn)定生長的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞所需時間均為2個月；具有轉(zhuǎn)化效率高、試驗周期短的特點。

四、轉(zhuǎn)基因愈傷組織的抗輪紋病鑒定

1、待接菌蘋果愈傷組織細(xì)胞的接種培養(yǎng)與準(zhǔn)備

1)準(zhǔn)備

培養(yǎng)基配置：使用無菌玻璃培養(yǎng)皿(上海五一)，培養(yǎng)皿大小為：直徑9cm，深度1.1cm，品牌為，將經(jīng)121℃高壓滅菌20min后的MS培養(yǎng)基，35mL定量傾倒在無菌玻璃培養(yǎng)皿中，備用。

待接菌蘋果愈傷組織細(xì)胞：選取生長12d野生型蘋果愈傷組織(WT)、陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)和陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)，分別準(zhǔn)確稱取2g均勻平鋪于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)和待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)。

野生型蘋果細(xì)胞在不同時期的生長狀態(tài)如圖3A所示，可以看出，細(xì)胞生長12d，此時期蘋果愈傷組織生長狀態(tài)良好均一并且已全部覆蓋在培養(yǎng)基表面。

待接種蘋果輪紋病病菌：生長于PDA培養(yǎng)基上的蘋果輪紋病病菌(Botryosphaeria dothidea(種名：dothidea)，參考文獻(xiàn)：張高雷等，蘋果輪紋病病瘤組織研究,植物病理學(xué)報2011,41(1):98－101)菌絲培養(yǎng)3d，得到待接種蘋果輪紋病病菌。

2)接種

選取大小一致生長狀態(tài)良好的待接種蘋果輪紋病病菌的菌餅分別置于上述待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)和待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)的中央(采用直徑為6mm的實驗室白膠塞打孔器，在生長有輪紋病菌菌絲的PDA板上，以板圓心為核心，等距離打出大小均勻一致的菌餅，各菌餅所含菌絲量一致，如圖8所示)，24℃，黑暗培養(yǎng)3d，觀察不同愈傷組織上蘋果輪紋病病菌的擴(kuò)展情況；陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)的重復(fù)數(shù)為6，陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)的重復(fù)數(shù)為11。

陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)結(jié)果如圖3B左圖和圖3C所示，與野生型細(xì)胞相比，蘋果輪紋病病菌在超表達(dá)MdSYP121轉(zhuǎn)基因愈傷組織上生長較旺盛，相同時間內(nèi)病菌擴(kuò)展面積大，MdSYP121超表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株MdSYP121-OX病斑擴(kuò)展面積在：50.27-73.79cm²之間，而野生型細(xì)胞系病斑擴(kuò)展面積為：20.41-57.93cm²之間，二者具有顯著差異(p<0.05)，說明超表達(dá)MdSYP121顯著降低蘋果對輪紋病的抗性，陽性轉(zhuǎn)pCB302’-MdSYP121-2HA愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-OX)的抗病力低于野生型細(xì)胞。

陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)的結(jié)果如圖3B右圖和圖3C所示，與野生型細(xì)胞相比，蘋果輪紋病病菌在MdSYP121轉(zhuǎn)基沉默細(xì)胞株(MdSYP121-RNAi)中擴(kuò)展與發(fā)病較緩慢，相同時間內(nèi)病菌擴(kuò)展面積??；培養(yǎng)3d之后，RNAi沉默細(xì)胞株中病斑面積在：9.61-22.04cm²之間，野生型細(xì)胞株病斑擴(kuò)展面積為：24.62-48.98cm²之間，二者區(qū)別為極顯著(p<0.01)，說明沉默MdSYP121后可顯著增強(qiáng)蘋果對輪紋病的抗性，表明陽性轉(zhuǎn)pCB302’-RNAi-MdSYP121愈傷組織細(xì)胞(MdSYP121-RNAi)抗病力高于野生型細(xì)胞。

上述實驗證明了，MdSYP121基因為蘋果輪紋病抗性相關(guān)基因，具有調(diào)節(jié)蘋果對輪紋病的抗性，沉默后可以增強(qiáng)蘋果對輪紋病的抗性。

實施例2、蘋果愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化鑒定蘋果抗病相關(guān)基因MdBAK1

一、待鑒定目的基因MdBAK1的獲得

根據(jù)GDR公布的蘋果基因組數(shù)據(jù)，利用引物設(shè)計軟件DNASTAR設(shè)計蘋果中BAK1同源基因的克隆引物：

MdBAK1-1-NcoI-F:5’-CATGCCATGGACCCAACACTGATGAC-3’,

MdBAK1-1-SmaI-R:5’-TCCCCCGGGTCTGGGACCGGACAACTC-3’；

MdBAK1-2-NcoI-F:5’-CATGCCATGGCGTCCTCCGCCTCTGTT-3’,

MdBAK1-2-SmaI-R:5’-TCCCCCGGGTCTGGGACCGGACAACTC-3’。

提取新疆野蘋果紅色愈傷的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別用上述2對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了MdBAK1-1CDS序列，片段長度為1851bp(圖4A，左)和MdBAK1-2CDS序列，片段長度1833bp(圖4A，右)。

MdBAK1-1CDS序列經(jīng)過測序，其序列3，其編碼的蛋白為序列4，蛋白命名為MdBAK1-1；

MdBAK1-2CDS序列經(jīng)過測序，其序列5，其編碼的蛋白為序列6，蛋白命名為MdBAK1-2；

二、超表達(dá)MdBAK1的載體構(gòu)建

超表達(dá)MdBAK1-1的載體為將序列表中序列3所示的MdBAK1-1替換pCB302’質(zhì)粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302’-35S-MdBAK1-1，該載體超表達(dá)MdBAK1-1(電泳圖如圖4B左)。

超表達(dá)MdBAK1-2的載體為將序列表中序列5所示的MdBAK1-2替換pCB302’質(zhì)粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302’-35S-MdBAK1-2，該載體超表達(dá)MdBAK1-2(電泳圖如圖4B右)。

三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因愈傷組織

1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及活化

與實施例1相同；

2、蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化

與實施例1方法相同，分別將pCB302’-35S-MdBAK1-1和pCB302’-35S-MdBAK1-2分別轉(zhuǎn)入蘋果葉片愈傷組織(王林)中，得到轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞(圖5A)。

3、鑒定

分別提取轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞、轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞和野生型細(xì)胞WT的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302’載體上含有HA標(biāo)簽)，應(yīng)用Western Blot技術(shù)，檢測MdBAK1-1-HA融合蛋白在蘋果細(xì)胞中的表達(dá)。

轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞、轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞的結(jié)果如圖5C所示，在鑒定的5個轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞中，均有MdBAK1-1表達(dá)(圖5C上排，MdBAK1-1OX),2個轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞中，均有MdBAK1-2穩(wěn)定表達(dá)(圖5C上排，MdBAK1-2OX)；可以看出，得到了MdBAK1超表達(dá)的蘋果細(xì)胞系。

總之，在以除草劑做選擇壓的條件下，所隨機(jī)選取的5個獨立發(fā)生的細(xì)胞團(tuán)，全部含有MdBAK1-1蛋白信號，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為100％(圖5C上排，MdBAK1-1OX)；在MdBAK1-2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的檢測中，檢測了3個獨立發(fā)生的細(xì)胞團(tuán)，2個含有MdBAK1-2的蛋白信號，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為66.7％(圖5C上排，MdBAK1-2OX)；而且，得到MdBAK1-1及MdBAK1-2穩(wěn)定表達(dá)和生長的細(xì)胞團(tuán)所需時間為2個月，具有轉(zhuǎn)化效率高、試驗周期短的特點。

四、轉(zhuǎn)基因愈傷組織的抗輪紋病鑒定

方法同實施例1，選取大小一致生長狀態(tài)良好的待接種蘋果輪紋病病菌的菌餅分別置于上述待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞和待接種陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞的中央(采用直徑6mm的實驗室白膠塞打孔器打出大小均勻一致的菌餅，圖8所示)，室溫黑暗培養(yǎng)6天，重復(fù)三次。

結(jié)果如圖6所示，輪紋病菌在陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞和陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞中的生長與擴(kuò)展速度顯著高于對照野生型蘋果愈傷組織；表明，陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1愈傷組織細(xì)胞和陽性轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-2愈傷組織細(xì)胞的抗病力低于野生型蘋果愈傷組織。經(jīng)接種于蘋果愈傷組織細(xì)胞，24℃度培養(yǎng)發(fā)病6天后，在野生型蘋果細(xì)胞中，病菌侵染與擴(kuò)展面積為：15.9-19.63cm²之間，在MdBAK1-1超表達(dá)細(xì)胞中，病菌侵染與擴(kuò)展面積為：63.2-63.6cm²之間，在MdBAK1-2超表達(dá)細(xì)胞中，病菌侵染與擴(kuò)展面積為：62.2-63.6cm²之間。病菌在野生型細(xì)胞與MdBAK1-1或MdBAK1-2超表達(dá)的細(xì)胞中的擴(kuò)展差異為極顯著(p<0.01)(圖6B)。

因此，MdBAK1-1或MdBAK1-2的超表達(dá)可降低蘋果對輪紋病菌的抗性，證明其為輪紋病菌抗病相關(guān)基因。

對比例：轉(zhuǎn)化受體為葉片

1、蘋果葉片轉(zhuǎn)化

將pCB302’-35S-MdBAK1-1分別轉(zhuǎn)入蘋果葉片(以下也稱為野生型細(xì)胞，品種名：嘎啦，葉片取自嘎啦組培苗上具有1個月葉齡的葉片，嘎啦組培苗制備方法如下)中，得到轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1蘋果苗(圖5B)。

上述嘎啦蘋果組培苗的誘導(dǎo)和再生：

收集嘎啦成熟種子，混在含水量50％左右的濕沙中4℃層積三個月，待種子萌發(fā)，挑選下胚軸為紅色的種子，去掉種子外殼，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75％的酒精浸泡10s進(jìn)行消毒，然后用滅菌水沖洗3次，再用濃度3％的次氯酸鈉(有效Cl濃度)浸泡10～15min進(jìn)一步消毒，之后用無菌水沖洗3～6次，放在滅過菌的濾紙上吸干水分，接種到無激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，生長成旺盛的小苗時切掉根部，將莖插到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L)，經(jīng)過1個月的培養(yǎng)，得到多叢芽后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。得到多叢芽后，取多叢芽的葉片切成正方形小塊，放在再生培養(yǎng)基上(MS+0.2mg/L IBA+1.0mg/L TDZ)，暗培養(yǎng)2周后進(jìn)行光培養(yǎng)，4周后再生出不定芽，切下不定芽轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2、鑒定

分別提取轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1蘋果苗和野生型蘋果苗的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302’載體上含有HA標(biāo)簽)，應(yīng)用Western Blot技術(shù)，檢測MdBAK1-1-HA融合蛋白和MdBAK1-2-HA融合蛋白在蘋果植株中的表達(dá)。

結(jié)果在2#、6#兩個系，共5個轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1植株2-1#、2-2#、2-3#、6-1#、6-2#中，均檢測到MdBAK1-1的穩(wěn)定表達(dá)(圖5C，下排，MdBAK1-1OX)，得到了MdBAK1超表達(dá)的蘋果植株。

在應(yīng)用蘋果葉片進(jìn)行MdBAK1-1的基因轉(zhuǎn)化中，從600株生長的組培苗植株中，最終篩選得到了2個超表達(dá)MdBAK1-1的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.3％，耗時長達(dá)1年，而且，篩選工作量巨大，與愈傷組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)化相比，轉(zhuǎn)化效率大為降低，而且，對操作者技術(shù)水平依賴程度高，得到轉(zhuǎn)基因植株較為困難。

2、轉(zhuǎn)基因植株的抗輪紋病鑒定

蘋果植株抗病力鑒定采用離體葉片接種法，具體如下：

在培養(yǎng)皿中加濾紙，倒入無菌水使濾紙保持濕潤，將轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1蘋果苗葉片分別置于濾紙上，正面朝上。葉片扎孔，在扎孔部位，覆蓋于PDA培養(yǎng)基上生長6天的待接種蘋果輪紋病病菌菌塊，培養(yǎng)3d(24℃，暗培養(yǎng))。以野生型蘋果葉片為對照。

結(jié)果如圖7所示，輪紋病菌在轉(zhuǎn)pCB302’-35S-MdBAK1-1蘋果苗的葉片中的擴(kuò)展侵染速度顯著大于野生型對照，所造成的接種部位葉片腐爛的面積顯著大于野生型，證明MdBAK1-1為抗病基因。

因此，表明本發(fā)明用葉片愈傷組織轉(zhuǎn)化的鑒定結(jié)果與用植株葉片的鑒定結(jié)果一致，說明利用蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化進(jìn)行蘋果抗病基因功能鑒定為一種簡易可靠的方法。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。