本發(fā)明涉及一種植物再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
野生珍稀花卉大白花杓蘭(Cypripedium macranthum Sw.f.)為杓蘭屬中的一個重要變種，多年生宿根植物，分布于我國東北。株高35～50cm，根狀莖粗壯，莖生葉3～6枚，廣橢圓形?；ù笮?，長3～5cm，有香氣，單生于莖頂?；üＩ詮潱儼咨?。唇瓣似女士的托鞋，故又稱托鞋蘭。大白花杓蘭能散發(fā)香氣，花形奇異，具有極高的觀賞價值。大白花杓蘭生于海拔400～2400米的林下、林緣或草坡上腐殖質(zhì)豐富和排水良好之地。在中國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、臺灣以及日本、朝鮮半島和俄羅斯均有分布。因其為野生花卉，適應(yīng)北方嚴寒氣候，可露地越冬，因此特別適合高緯度城市園林種植，而且與其他園林花卉配置具有畫龍點睛的效果。
但大白花杓蘭一般每隔三年才分株一次，繁殖系數(shù)低，嚴重的制約了大白花杓蘭的廣泛種植。目前采用現(xiàn)有再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基)培養(yǎng)大白花杓蘭存在植株分化率低問題，植株分化率僅為30％～50％。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決大白花杓蘭自然繁殖系數(shù)低，且現(xiàn)有再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)植株分化率低問題，而提供的一種大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括大量元素組分、微量元素組分和有機質(zhì)組分，pH值為5.5～6.0；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中H3BO3的濃度為6.2mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為22.3mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.025mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.25mg/L；
有機質(zhì)組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環(huán)已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環(huán)已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L。
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養(yǎng)基成分包括大量元素組分、微量元素組分、有機質(zhì)組分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，pH值為5.8；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中H3BO3的濃度為3.1mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為11.15mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.012mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.125mg/L；
有機質(zhì)組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環(huán)已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環(huán)已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L；
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養(yǎng)基中吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.05mg/L、蔗糖的濃度為0.5mg/L。
培養(yǎng)基中還包括芐氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；其中，培養(yǎng)基中芐氨基腺嘌呤的濃度為1.0mg/L、激動素的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
培養(yǎng)基中還包括芐氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片繼代培養(yǎng)基；其中，培養(yǎng)基中芐氨基腺嘌呤的濃度為0.05mg/L、激動素的濃度為0.2mg/L、萘乙酸的濃度為0.5mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
本發(fā)明培養(yǎng)基用于大白花杓蘭葉片的再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入特定的激素分別形成誘導(dǎo)分化和繼代培養(yǎng)基。利用野生珍稀花卉大白花杓蘭幼葉作為外植體在本發(fā)明培養(yǎng)基上進行分化誘導(dǎo)、繼代增殖、生根，從而獲得再生植株，具有組織資源豐富，可快速、高效的繁育出大量種苗的特點。
利用本發(fā)明大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基對大白花杓蘭幼葉進行再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)，大白花杓蘭幼葉在本發(fā)明誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上很容易被誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率可達到90％以上；再將誘導(dǎo)出的淡綠色愈傷組織轉(zhuǎn)接至本發(fā)明繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)成植株的幾率高，再生植株誘導(dǎo)率(即植株分化率)可達70％。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)，大白花杓蘭幼葉的植株分化率僅為50％。以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)，大白花杓蘭幼葉的植株分化率僅為30％。
具體實施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。
具體實施方式一：本實施方式獲得大白花杓蘭葉片再生植株：
一、大白花杓蘭葉片的采集與處理
大白花杓蘭采自黑龍江省江山嬌實驗林場，母本為多年生草本，生長健壯；外植體類型為當年生葉片，采集季節(jié)為大白花杓蘭生長季節(jié)5月中上旬，采集時間選在晴朗的上午9～10點進行。將采集的葉片放置冷藏箱中備用。
二、消毒方法
將低溫冷藏的葉片取出，先將葉片用洗滌劑作表面清洗，去除表面塵土，再清水沖洗，然后放在超凈工作臺上用75％的乙醇滅菌10s，再無菌水沖洗3～5次，之后用0.1％的升汞液消毒5min，再無菌水沖洗3～5次，而后放在濾紙上吸干表面水分備用。
三、用解剖刀將經(jīng)過消毒處理的葉片分割成0.5～1cm×0.5～1cm小塊，接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3～5個，每個處理重復(fù)3次。接種后采用光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)相結(jié)合的方法。光照培養(yǎng)光源采用日光燈，培養(yǎng)室內(nèi)白天溫度為24～28℃，照明12～14h，光照強度15μmol·m-2·s-1～20μmol·m-2·s-1，暗培養(yǎng)溫度控制在24～26℃。先暗培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。
大白花杓蘭幼葉先在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上被誘導(dǎo)形成愈傷組織，再將誘導(dǎo)出的淡綠色愈傷組織轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。步驟四分成三組，第一組采用本發(fā)明大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基，第二組采用MS培養(yǎng)基，第三組采用1/2MS培養(yǎng)基，三組培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)采用相同的激素，且激素含量相同。
第一組培養(yǎng)基pH值為5.8。第一組大白花杓蘭葉片再生植株生根培養(yǎng)基成分包括大量元素組分、微量元素組分、有機質(zhì)組分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中H3BO3的濃度為3.1mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為11.15mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.012mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.125mg/L；
有機質(zhì)組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環(huán)已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環(huán)已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L；
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養(yǎng)基中吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.05mg/L、蔗糖的濃度為0.5mg/L。
培養(yǎng)基中還包括芐氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；其中，培養(yǎng)基中芐氨基腺嘌呤的濃度為1.0mg/L、激動素的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
培養(yǎng)基中還包括芐氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片繼代培養(yǎng)基；其中，培養(yǎng)基中芐氨基腺嘌呤的濃度為0.05mg/L、激動素的濃度為0.2mg/L、萘乙酸的濃度為0.5mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
試驗結(jié)果：
第一組愈傷組織誘導(dǎo)率均達到90％以上，再生植株誘導(dǎo)率(即植株分化率)為70％。
第二組愈傷組織誘導(dǎo)率均達到50％以上，再生植株誘導(dǎo)率(即植株分化率)為50％。
第三組愈傷組織誘導(dǎo)率均達到20％以上，再生植株誘導(dǎo)率(即植株分化率)為30％。
本發(fā)明大白花杓蘭葉片再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機鹽的濃度低于現(xiàn)有MS培養(yǎng)基、高于1/2MS培養(yǎng)基無機鹽濃度，符合大白花杓蘭葉片器官分化的需要，大幅提高了大白花杓蘭葉片誘導(dǎo)再生植株的成功率，而且與MS培養(yǎng)基相比可節(jié)省約30％的成本。
實驗對比發(fā)現(xiàn)第一組芽增殖明顯高于第二組和第三組。
第一組獲得的組培苗移栽植株生長與性狀測定，種性純度達98％以上，表現(xiàn)出高度一致性和豐產(chǎn)性，能夠達到快速繁殖優(yōu)良大白花杓蘭種苗的目的。