本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種催化丙氨酸脫羧的蛋白質(zhì)及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

茶氨酸（L-Theanine）是茶葉中特有的游離氨基酸，茶氨酸是谷氨酸γ-乙基酰胺，有甜味。茶葉中含有大量的茶氨酸,是形成茶葉風(fēng)味的主要成分。茶氨酸含量通常占茶葉中其他氨基酸總量的50%以上。

研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸合成受到前提物質(zhì)乙胺的調(diào)控。在植物組織培養(yǎng)合成茶氨酸的研究中，有學(xué)者已經(jīng)證實(shí)向培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)-鹽酸乙胺時(shí)，可以大幅度提高愈傷組織中的茶氨酸合成量，而直接添加丙氨酸，則對(duì)茶氨酸累積影響不大。茶氨酸合成中的乙胺系由丙氨酸脫羧（CsAlaDC）而來，催化該反應(yīng)即為丙氨酸脫羧酶。該酶在子葉和根中活性高，在綠色幼苗根中活性高于黃化幼苗，預(yù)示著它積極參與茶氨酸合成中所需乙胺的形成。

目前，有關(guān)CsAlaDC基因的克隆鑒定未見任何報(bào)道。鑒于乙胺的添加可以極大提高茶樹愈傷組織和懸浮細(xì)胞合成茶氨酸，因此CsAlaDC基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究茶樹氮吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種茶樹特有丙氨酸脫羧蛋白CsAlaDC及其編碼基因和應(yīng)用的技術(shù)方案。

所述的一種催化丙氨酸脫羧的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為：

1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列 ；或

2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述編碼所述蛋白質(zhì)的基因,其特征在于該基因的核苷酸序列為：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼 CsAlaDC的核苷酸序列。

所述編碼基因的重組載體。

所述的編碼基因在催化丙氨酸脫羧形成乙胺中的應(yīng)用。

所述的編碼基因在調(diào)控茶樹茶氨酸合成中的應(yīng)用。

所述的一種催化丙氨酸脫羧形成乙胺的方法，其特征在于包括如下步驟：將編碼基因?qū)氪竽c桿菌中，誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，將重組蛋白純化后與丙氨酸溶液混合進(jìn)行催化得到乙胺，所述的編碼基因的核苷酸序列為：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼 CsAlaDC的核苷酸序列。

所述的一種催化丙氨酸脫羧形成乙胺的方法，其特征在于丙氨酸脫羧酶的催化反應(yīng)的條件為10mM 丙氨酸, 100mM的磷酸鉀緩沖液，0.08-0.12 mM 磷酸吡哆醛，5mM二硫蘇糖醇，1mM K₂EDTA，10%的甘油，反應(yīng)溶液pH 為：pH 7.2-pH 7.8反應(yīng)溫度為35℃-45℃。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在茶樹中發(fā)現(xiàn)丙氨酸脫羧酶蛋白CsAlaDC，將該蛋白對(duì)應(yīng)的基因在大腸桿菌中過表達(dá)，純化的重組蛋白同時(shí)具有催化丙氨酸脫羧的活性，驗(yàn)證了該基因具有催化丙氨酸脫羧的功能。

附圖說明

圖1 丙氨酸脫酸酶催化反應(yīng)圖示；

圖2 茶樹CsAlaDC的基因序列；

圖3 不同組織CsAlaDC基因qPCR相對(duì)定量結(jié)果；

圖4 CsAlaDC蛋白原核純化的SDS-PAGE；

圖5 重組CsAlaDC蛋白催化丙氨酸脫羧形成乙胺的高效液相（HPLC）檢測(cè)圖譜；

圖6 催化反應(yīng)2h與24h后，反應(yīng)液中生成乙胺的濃度。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例

（1） 基因克?。阂札埦?3的幼根為材料，用試劑盒法提取總RNA；根據(jù)CsAlaDC的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，用反轉(zhuǎn)錄PCR法獲得該基因的全長，并測(cè)序驗(yàn)證。反轉(zhuǎn)錄基因克隆所采用的引物為SDC-RT-F1: 5′- CTCCTCGGATTCTCAAACCTC AC-3′；SDC-RT-R: 5′- CACACAAACGATAGTAGAACCAACA-3′。

（2）實(shí)時(shí)熒光定量分析： 熒光定量PCR采用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems），以SYBR Green染料進(jìn)行標(biāo)記。內(nèi)參基因選擇茶樹GAPDH基因(GE651107)。采用的引物為SDC-QRT-F: 5′-GGGAAGAACGTGCACACAAC-3′； SDC-QRT-R: 5′-CTAACCAAGACACCGGCCAT-3′； GAPDH-F:5′-TTGGCATCGTTGAGGG TCT-3′及 GAPDH-R:5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。反應(yīng)體系為25ml，包含0.5mL LATaq, 5mL PCR緩沖液, 2 mL dNTP(2.5 mM), 0.5mL引物(10 M), 1mL cDNA(40 ng)和15.5mL ddH₂O。 反應(yīng)條件為: 94℃，3分鐘； 95℃ ，30秒；59℃，30秒；72℃,1分鐘；30個(gè)循環(huán)。72℃,10分鐘；4℃保存。每組樣品3個(gè)重復(fù)。如圖3所示，三個(gè)茶樹品種中根、成熟葉片、一芽二葉等不同組織部位CsAlaDC基因qPCR相對(duì)定量結(jié)果，說明茶樹CsAlaDC基因在茶樹根中特異表達(dá)。茶樹CsAlaDC的基因序列如圖2所示。茶樹CsAlaDC的基因序列如SEQ ID No.1 所示，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。

（3）轉(zhuǎn)基因蛋白重組表達(dá)純化：將茶樹CsAlaDC全長cDNA的編碼框克隆到含有T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pET28b上。具體步驟包括：設(shè)計(jì)特異引物：正向引物5’-CGGGATCC(BamH I)ATGGAAGGGACTGTGTCAGTGCTATC and reverse primer 5’-CCCAAGCTT(Hind III)GTTTATGAAGATCACAATCACAATT CTCAC；表達(dá)載體構(gòu)建：PCR 擴(kuò)增的CsAlaDC基因經(jīng)酚、酚/氯仿（1:1）、氯仿/異戊醇（24:1）抽提純化后，用BamH I 和Hind III 雙酶切，低熔點(diǎn)膠電泳分離回收1 500 bp左右的片斷。再將回收片段與經(jīng)相同雙酶切的表達(dá)載體pET-28b 連接，從而將CsAlaDC基因定向克隆到表達(dá)載體pET-28b 中，并將含有插入片斷的重組質(zhì)粒命名為pET-AlaDC，將重組質(zhì)粒pET-AlaDC 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21 中，構(gòu)建工程菌；IPTG誘導(dǎo)大腸表達(dá)及蛋白純化：挑取經(jīng)DNA 測(cè)序驗(yàn)證的工程菌的單菌落，接入5 ml 含氨芐青霉素（50μg/ml）的LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取50μl 接入5 ml 含氨芐青霉素（50μg/ml）的LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2 h 左右，加入IPTG 至終濃度0.05 mmol/L，于16-22℃誘導(dǎo)表達(dá)12-18 h，室溫5 000 r/min 離心5 min收集菌體。菌體破碎后，用鎳柱親和層析純化重組蛋白，洗脫液為160mM 咪唑，透析液為25mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，10%甘油。如圖4所示，CsAlaDC蛋白原核純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）圖。

（4）丙氨酸脫羧活性驗(yàn)證

將10μL純酶液加到90μL反應(yīng)緩沖液A中（10mM 丙氨酸, 100mM pH 7.2-pH 7.8的磷酸鉀緩沖液，0.08-0.12 mM 磷酸吡哆醛，5mM二硫蘇糖醇，1mM K₂EDTA，10%的甘油），混勻后，于35℃-45℃水浴2h和24h，分別取45μL反應(yīng)液于新的離心管中，加5μL 10%的三氯乙酸停止反應(yīng)，靜置5min后，加入400μL超純水稀釋，按照Waters AccQ Tag氨基酸分析包中的方法進(jìn)行衍生，高效液相色譜儀檢測(cè)產(chǎn)物含量。其中丙氨酸脫酸酶催化反應(yīng)如圖1所示。HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，催化反應(yīng)2h時(shí)檢測(cè)到乙胺，催化反應(yīng)24h時(shí)，乙胺大量累積（增加了6倍），說明該重組蛋白具有催化丙氨酸脫羧形成乙胺的能力(圖5；圖6)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所

<120> 一種催化丙氨酸脫羧的蛋白質(zhì)及其基因和應(yīng)用

<130> 11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 茶樹

<400> 1

atggaaggga ctgtgtcagt gctatcgaat gtgagcaagg tggagctgtt gtcgaagtgc 60

tttgatctca ttaccatccc tgtggaaccc ttgcctccgg ttgtggcttc caacggagtt 120

gctggcggag agacgaagaa gatgaaggag aaggatattg ttctggggaa gaacgtgcac 180

acaacaagcc tcaccatcac ggagcctgat gtggacgatg actccaccag cgatatggag 240

gccttcatgg ccggtgtctt ggttaggtat cgcaaaactc tcattgagaa gaccaagtat 300

catttaggct atccatttaa tctggacttg gattatggtc ctctagcgga attgcagcat 360

ttcgccataa acaaccttgg cgatccattt attgaaagca actatggtgt tcattcaaga 420

caatttgaag tgggtgtttt ggattggttt gcccgtctat gggaaataga gcagaaagaa 480

tactggggat acattacaaa tggtggcaca gaaggcaatc ttcatggaat cctggttgga 540

agagaagtgt ttccagatgg aattttttat acgtcgcaag aatcacatta ctctatcttc 600

aaagcagcac ggatgtacag aatggaatgc gttaaggtcg gcactttaat caatggggag 660

attgattgtg cagatttcaa agcaaagcta ctttctaaca aggacaaacc agccataatt 720

aatttgaaca taggtactac tgtcaaagga gcggttgatg atattgatct tgttatacaa 780

acccttgaag aatgtggatt ctcgcatgat cgattctaca tccactgtga tggggctctg 840

tttggattca tgatgccatt tctcaaccgt ggaccgaaaa taaccttcaa gaagcccatt 900

ggaagtgtga gtgtttctgg ccacaagttt atgggatgtc caacgccgtg cggtgtccag 960

ataacaaggc ttgagcacat taatgcctta tcaaggaatg tcgaatacct tgcttcaagg 1020

gatgccacaa tcacaggaag ccggaacggc cactctccaa tcattctgtg gtacgcgctg 1080

aacagaaaag gtttcaaggg gttccagaaa gaagtccaaa agtgcctcag aaatgctcac 1140

tatttgaaag accgccttag ggaagcaggt attagtgcca tgctaaatga gcttagtagc 1200

acggttgtgt ttgagcgacc tctagatgag gagtttgttc ggcgttggca acttgcatgc 1260

gagggaaata tggcacatgt tattgtgatg cctaatgtca ccattgagaa gctggatgaa 1320

ttcttgaatg aattagttca aaagcgcgcg aattggtaca acgatgggaa agctggacct 1380

ccttgtcttg caccagatat aggaagtgag aattgtgatt gtgatcttca taaatga 1437

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> 茶樹

<400> 2

Met Glu Gly Thr Val Ser Val Leu Ser Asn Val Ser Lys Val Glu Leu Leu Ser Lys Cys

1 5 10 15 20

Phe Asp Leu Ile Thr Ile Pro Val Glu Pro Leu Pro Pro Val Val Ala Ser Asn Gly Val

25 30 35 40

Ala Gly Gly Glu Thr Lys Lys Met Lys Glu Lys Asp Ile Val Leu Gly Lys Asn Val His

45 50 55 60

Thr Thr Ser Leu Thr Ile Thr Glu Pro Asp Val Asp Asp Asp Ser Thr Ser Asp Met Glu

65 70 75 80

Ala Phe Met Ala Gly Val Leu Val Arg Tyr Arg Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Lys Tyr

85 90 95 100

His Leu Gly Tyr Pro Phe Asn Leu Asp Leu Asp Tyr Gly Pro Leu Ala Glu Leu Gln His

105 110 115 120

Phe Ala Ile Asn Asn Leu Gly Asp Pro Phe Ile Glu Ser Asn Tyr Gly Val His Ser Arg

125 130 135 140

Gln Phe Glu Val Gly Val Leu Asp Trp Phe Ala Arg Leu Trp Glu Ile Glu Gln Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Trp Gly Tyr Ile Thr Asn Gly Gly Thr Glu Gly Asn Leu His Gly Ile Leu Val Gly

165 170 175 180

Arg Glu Val Phe Pro Asp Gly Ile Phe Tyr Thr Ser Gln Glu Ser His Tyr Ser Ile Phe

185 190 195 200

Lys Ala Ala Arg Met Tyr Arg Met Glu Cys Val Lys Val Gly Thr Leu Ile Asn Gly Glu

205 210 215 220

Ile Asp Cys Ala Asp Phe Lys Ala Lys Leu Leu Ser Asn Lys Asp Lys Pro Ala Ile Ile

225 230 235 240

Asn Leu Asn Ile Gly Thr Thr Val Lys Gly Ala Val Asp Asp Ile Asp Leu Val Ile Gln

245 250 255 260

Thr Leu Glu Glu Cys Gly Phe Ser His Asp Arg Phe Tyr Ile His Cys Asp Gly Ala Leu

265 270 275 280

Phe Gly Phe Met Met Pro Phe Leu Asn Arg Gly Pro Lys Ile Thr Phe Lys Lys Pro Ile

285 290 295 300

Gly Ser Val Ser Val Ser Gly His Lys Phe Met Gly Cys Pro Thr Pro Cys Gly Val Gln

305 310 315 320

Ile Thr Arg Leu Glu His Ile Asn Ala Leu Ser Arg Asn Val Glu Tyr Leu Ala Ser Arg

325 330 335 340

Asp Ala Thr Ile Thr Gly Ser Arg Asn Gly His Ser Pro Ile Ile Leu Trp Tyr Ala Leu

345 350 355 360

Asn Arg Lys Gly Phe Lys Gly Phe Gln Lys Glu Val Gln Lys Cys Leu Arg Asn Ala His

365 370 375 380

Tyr Leu Lys Asp Arg Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Ala Met Leu Asn Glu Leu Ser Ser

385 390 395 400

Thr Val Val Phe Glu Arg Pro Leu Asp Glu Glu Phe Val Arg Arg Trp Gln Leu Ala Cys

405 410 415 420

Glu Gly Asn Met Ala His Val Ile Val Met Pro Asn Val Thr Ile Glu Lys Leu Asp Glu

425 430 435 440

Phe Leu Asn Glu Leu Val Gln Lys Arg Ala Asn Trp Tyr Asn Asp Gly Lys Ala Gly Pro

445 450 455 460

Pro Cys Leu Ala Pro Asp Ile Gly Ser Glu Asn Cys Asp Cys Asp Leu His Lys

465 470 475