本發(fā)明涉及中藥材加工技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法。

背景技術(shù)：

中藥黃芪是我國傳統(tǒng)的常用藥用植物，具有補氣固表、利尿、排膿、斂瘡生肌之功效，而蒙古黃芪又是黃芪中的極品。近年來，隨著保健藥日益暢銷，黃芪的用藥量越來越大，但由于長期大量、無節(jié)制采挖，未注意對自然資源的保護，野生黃芪資源幾近枯竭，大面積成規(guī)模的野生黃芪資源已十分少見。蒙古黃芪中的有效成分可以通過提取獲得，但原料、季節(jié)、地域等條件會限制黃酮的提取量，而用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物則可以不受地區(qū)、季節(jié)限制，節(jié)省土地和植物資源，降低成本，提高生產(chǎn)效率。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃芪次生代謝產(chǎn)物在生物學和醫(yī)藥學領(lǐng)域具有重要的研究和應(yīng)用價值，但采用常規(guī)組培技術(shù)進行黃芪愈傷組織培養(yǎng)過程中極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（褐化是指在外植體誘導(dǎo)和分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象），褐化使外植體、組織細胞、培養(yǎng)基發(fā)生褐變，而且對許多酶有抑制作用，影響培養(yǎng)材料的生長與分化，常常造成大量培養(yǎng)材料褐變死亡，導(dǎo)致科研和生產(chǎn)應(yīng)用的失敗。因此，褐化能否得到有效控制是黃芪組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵所在。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種愈傷組織生長旺盛、增殖速度快、培養(yǎng)周期短、操作簡單、重復(fù)性好的有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：

A、黃芪種子篩選

選取籽粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，使用自來水沖洗30min；

B、黃芪種子浸泡

燒杯內(nèi)加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種，1h之后倒出水，加入質(zhì)量濃度2.5%的NaHCO₃溶液，在35℃條件下浸泡2h；

C、黃芪種子消毒

首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30-50s后倒出乙醇溶液，其次采用質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒10-30min，后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；

D、清洗接種培養(yǎng)

使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗3～5次，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000～2000lux；

E、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15～45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4～10g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8～6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度0.8～2.0mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15～45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4～8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8～6.2。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.6～0.8 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0～6.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度6.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的瓊脂質(zhì)量濃度6.0g/L，pH值調(diào)節(jié)為6.2。

所述步驟A將種子放到燒杯內(nèi)，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下沖洗30min，沖洗種子在燒杯內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)。

所述步驟C中首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸。

所述步驟D中使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗5次每次2min，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000lux；

所述步驟E選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體并接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.3 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.0mg/L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度1.2mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2。

本發(fā)明的有益效果：

1、黃芪種子篩選

選取飽滿、種皮有光澤、無有病蟲斑和損傷的黃芪種子，黃芪種子優(yōu)選蒙古種子，在自來水下沖洗30min，60℃水浴中浸種1h，35℃條件下質(zhì)量濃度2.5%NaHCO3浸泡2h，體積濃度75%的乙醇消毒40s，質(zhì)量濃度2%的NaClO消毒20min，質(zhì)量濃度0.1%的氯化汞消毒3min，無菌水清洗5次，每次2min。消毒完成后用無菌濾紙吸干種子表明水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)到萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)。采用該方法對種子消毒殺菌，有利于快速打破種子休眠時間，發(fā)芽率達到75%以上，真菌和細菌污染率小于2%。

2、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基篩選

以7d苗齡的無菌苗為研究材料，取0.5～1.0 cm的下胚軸建立外植體，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，通過對基本培養(yǎng)基、植物外源激素濃度及配比的多次實驗，篩選出黃芪愈傷組織誘導(dǎo)適宜的培養(yǎng)基為MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂4.5g/L，pH 6.2，下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率為70.6％，但褐化率高達90%以上，多數(shù)外植體隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸褐化死亡。

增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中決定繁殖速度快慢、繁殖系數(shù)高低的關(guān)鍵階段，是由植物激素的的種類和濃度決定的，本方法中優(yōu)化篩選出黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基為MS、6-BA2.0mg/ L、 NAA1.2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂4.5g/L，pH 6.2，愈傷組織增殖速度較快，增殖倍數(shù)1.84，褐化率較高，70%以上的愈傷組織隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸褐化死亡。

3、不同褐變抑制劑和吸附劑對黃芪愈傷組織褐化的抑制效果

在篩選的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加一定量的抗氧化劑和吸附劑都能不同程度的降低外植體褐化率，單獨添加抗氧化劑檸檬酸0.8 g/L、抗壞血酸Vc0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP6.0g/L，褐化率較對照分別降低20%、30%和22.9%。配合使用不同種類和濃度的抗氧化劑和吸附劑進行實驗，結(jié)果顯示以0.2 g/L抗壞血酸Vc和4.0g/L聚乙烯吡咯烷酮 PVP配合使用效果最好，褐化率較對照降低58.6%。

4、固體支持物和培養(yǎng)條件對愈傷組織褐化的影響

培養(yǎng)基中的固體支持物瓊脂用量的多少和培養(yǎng)條件對黃芪愈傷組織褐化的影響較大。本研究通過適當提高瓊脂用量和pH值能顯著降低褐化現(xiàn)象，瓊脂用量為6.0g/L，pH 6.2，弱光照條件下1000lux，愈傷組織褐化率較對照降低33.5%，有利于細胞的分裂和生長。

5、有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法

在培養(yǎng)基中添加一定量的抗氧化劑和吸附劑都能不同程度的降低外植體褐化率，但卻不能完全抑制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，但將多種方法和措施綜合運用，可使黃芪愈傷組織褐化現(xiàn)象得到有效抑制，取得了黃芪組織細胞離體培養(yǎng)的成功。

黃芪下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)，最佳培養(yǎng)基配方為MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、Vc 0.2 g/L、4.0g/L PVP＋蔗糖30g/L＋瓊脂6.0g/L，pH 6.2，培養(yǎng)條件光照1000lux，溫度22±3℃，相對濕度70%-80%。在此條件下培養(yǎng)10-20d，下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率達到100%，呈淡綠色或白色雪花狀，結(jié)構(gòu)疏松，無褐化現(xiàn)象發(fā)生。

在黃芪愈傷組織增殖階段，最佳培養(yǎng)基配方為 MS、6-BA2.0mg/L、 NAA1.2mg/L、白砂糖30g/L、瓊脂6.0g/L，pH 6.2，培養(yǎng)條件同上。因在誘導(dǎo)階段愈傷組織褐化現(xiàn)象得到了有效抑制，在增殖階段去除Vc和PVP不會引起褐化發(fā)生，且去除非培養(yǎng)基成分有利于細胞的分裂和快速生長。采用白砂糖代替蔗糖，對黃芪愈傷組織增殖效率不會造成影響，且降低了生產(chǎn)成本。在此條件下愈傷組織細胞生長旺盛，增殖快，繼代周期10-15d，增值倍數(shù)3.27，愈傷組織顏色呈乳白色或淡黃綠色，有光澤，結(jié)構(gòu)疏松易分散，無褐化現(xiàn)象出現(xiàn)。

綜上所述本發(fā)明成果是在大量實驗研究和不斷探索優(yōu)化的基礎(chǔ)上取得的，理想的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基，黃芪愈傷誘導(dǎo)率達100%，愈傷組織生長旺盛，增殖速度快，經(jīng)15d的培養(yǎng)，愈傷組織的鮮重增加至培養(yǎng)前的3.27倍左右。細胞增殖速度快，培養(yǎng)周期短，1個月內(nèi)可輕松培養(yǎng)2代，產(chǎn)出比高，且操作簡單，重復(fù)性好，具有工廠化生產(chǎn)和自動化控制等優(yōu)點，便于生物學和醫(yī)藥學領(lǐng)域?qū)S芪次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)和利用研究。

本方法以蒙古黃芪無菌苗為研究材料，在優(yōu)化篩選基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，重點研究了不同種類和濃度的褐變抑制劑、吸附劑、固體支持物和培養(yǎng)條件對黃芪愈傷組織褐化的影響，優(yōu)化建立了一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，取得了黃芪組織細胞離體培養(yǎng)的圓滿成功，為今后開展黃芪次生代謝產(chǎn)物研究和利用開辟了新途徑。

具體實施方式

一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：

A、黃芪種子篩選

選取籽粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，使用自來水沖洗30min；

B、黃芪種子浸泡

燒杯內(nèi)加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種，1h之后倒出水，加入質(zhì)量濃度2.5%的NaHCO₃溶液，在35℃條件下浸泡2h；

C、黃芪種子消毒

首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30-50s后倒出乙醇溶液，其次采用質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒10-30min，后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；

D、清洗接種培養(yǎng)

使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗3～5次，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000～2000lux；

E、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15～45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4～10g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8～6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度0.8～2.0mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15～45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4～8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8～6.2。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.6～0.8 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0～6.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度6.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0g/L。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的瓊脂質(zhì)量濃度6.0g/L，pH值調(diào)節(jié)為6.2。

所述步驟A將種子放到燒杯內(nèi)，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下沖洗30min，沖洗種子在燒杯內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)。

所述步驟C中首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸。

所述步驟D中使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗5次每次2min，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000lux；

所述步驟E選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體并接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.3 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6-芐胺基嘌呤6-BA質(zhì)量濃度2.0mg/L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度1.2mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2。

實施例1

一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：

A、黃芪種子篩選

選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下沖洗30min，沖洗種子在燒杯內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)。

B、黃芪種子浸泡

燒杯內(nèi)加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之后倒出水，加入質(zhì)量濃度2.5%的NaHCO₃溶液，在35℃條件下浸泡2h；

C、黃芪種子消毒

首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30s后倒出乙醇溶液，其次加入質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒10min后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；

D、清洗接種培養(yǎng)

使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗3次每次2min，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度2000lux；

E、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體并接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度2.0 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.1mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度1.5mg/ L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度0.8mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度15g/L、瓊脂質(zhì)量濃度4g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 5.8。所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.6 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.1 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0g/L。

實施例2

一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：

A、黃芪種子篩選

選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下沖洗30min，沖洗種子在燒杯內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)。

B、黃芪種子浸泡

燒杯內(nèi)加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之后倒出水，加入質(zhì)量濃度2.5%的NaHCO₃溶液，在35℃條件下浸泡2h；

C、黃芪種子消毒

首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒50s后倒出乙醇溶液，其次加入質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒30min后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒5min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；

D、清洗接種培養(yǎng)

使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗5次2min，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000lux；

E、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體并接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.5 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度10g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度2.0mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度45g/L、瓊脂質(zhì)量濃度8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質(zhì)量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度6.0g/L。

實施例3

一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：

A、黃芪種子篩選

選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下沖洗30min，沖洗種子在燒杯內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)；

B、黃芪種子浸泡

燒杯內(nèi)加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之后倒出水，加入質(zhì)量濃度2.5%的NaHCO₃溶液，在35℃條件下浸泡2h；

C、黃芪種子消毒

首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入質(zhì)量濃度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入質(zhì)量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；

D、清洗接種培養(yǎng)

使用無菌水沖洗種子表面去除消毒液，反復(fù)沖洗5次每次2min，沖洗完成后用濾紙吸干種子表面水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基中并放入紙箱內(nèi)，紙箱外套黑色塑料袋放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度23±2℃，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，光照強度1000lux；

E、黃芪愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

所述步驟E選取步驟D中培養(yǎng)苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體并接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～20d，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質(zhì)量濃度0.3 mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；接著進行愈傷組織快速增殖培養(yǎng)10～15d，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、6 芐基嘌呤6BA質(zhì)量濃度2.0mg/ L、萘乙酸 NAA質(zhì)量濃度1.2mg/L、蔗糖質(zhì)量濃度30g/L、瓊脂質(zhì)量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為 6.2。

所述步驟E中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質(zhì)量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質(zhì)量濃度4.0g/L。