本發(fā)明涉及一種貓爪草的人工栽培方法，具體涉及一種基于貓爪草花藥離體培育的人工栽培方法。

背景技術(shù)：

貓爪草是毛茛科多年生草本植物小毛茛，以塊根入藥。主要產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽、江西、河南、湖北、貴州、廣西等地區(qū)。貓爪草味微甘、性平，入肺、肝二經(jīng)，有散結(jié)、消腫、清熱、解毒的功能。主治肺結(jié)核、頸上瘰疬、咽喉炎、痔瘡等，還可治療多種癌癥、淋巴瘤等，防癌效果顯著，治愈率高，是中藥中抗腫瘤、解毒、散結(jié)的一種好藥材。

由于貓爪草為野生，采挖方便，具有較廣泛療效，市場(chǎng)需求量大，且價(jià)格比較高，引發(fā)產(chǎn)區(qū)農(nóng)民積極采挖，使貓爪草野生資源日益減少，成為目前緊缺的中藥材，因此，人工栽培貓爪草成為一種必然的趨勢(shì)。

現(xiàn)有技術(shù)人工栽培貓爪草的方法主要是人工移栽、塊根繁殖、種子繁殖。由于野生貓爪草的成本低且部分地區(qū)較為常見，藥農(nóng)大多采用人工移栽的方法栽培貓爪草，但是該方法僅適用于具有大量野生貓爪草的環(huán)境，不適用于大多數(shù)地區(qū)。塊根繁殖是利用貓爪草的塊根旁的小塊根扦插栽種的方法來實(shí)現(xiàn)人工繁殖，塊根繁殖的系數(shù)低，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，而且由于培養(yǎng)環(huán)境如光照、水分、溫度、營(yíng)養(yǎng)等以及激素濃度等因素易造成貓爪草種苗發(fā)生無性變異。毛茛科植物具有很大的變異性，而貓爪草通過異花傳粉也會(huì)導(dǎo)致其基因混雜，通過此方法得到的種子繼續(xù)培育后達(dá)不到預(yù)期藥用效果，易造成貓爪草中棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等有效成分的缺失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種貓爪草的人工栽培方法，具體步驟如下：

(1)花托外植體預(yù)處理：

選取貓爪草的花蕾，在4℃環(huán)境中冷藏3～5天后，將花蕾取出自然恢復(fù)至室溫，剝?nèi)グ托』ǎ眉儍羲疀_洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到貓爪草花托外植體。以上涉及的百分比均為體積百分比。

(2)外植體接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)：

將貓爪草花托外植體移入到滅菌后的第一培養(yǎng)基中，將溫度設(shè)定為23±1℃，以藍(lán)光燈為光源，光照強(qiáng)度控制為400～800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，每十天更換一次培養(yǎng)基，直到誘導(dǎo)出愈傷組織。

所述第一培養(yǎng)基的組成成分為：KNO₃ 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH₂PO₄ 300～450mg/L，CaCl₂·2H₂O 320～350mg/L，MgSO₄·7H₂O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 30～50mg/L，MnSO₄·4H₂O 50～80mg/L，ZnSO₄·7H₂O 15～30mg/L，H₃BO₃ 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 1～5mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，肌醇30～80mg/L，甘氨酸0.5～1.0mg/L，維生素B1 0.5～0.75mg/L，維生素B6 1.0～1.5mg/L，煙酸1.0～1.5mg/L，蔗糖30～50g/L，瓊脂10～15g/L，激動(dòng)素KT 0.5～1.0mg/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L，山梨醇50～70g/L，生物素0.15～0.20mg/L，鹽酸吡哆醇0.5～1.0mg/L，鹽酸硫胺素0.5～1.0mg/L，甲基亞硝基脲1.5～2.0mg/L，吲哚丁酸1.5～2.0mg/L，丙氨酸5～10mg/L，葉酸5～10mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣1.5～2.0mg/L，秋水仙堿1.5～2.0mg/L，水解蛋白2.0～2.5g/L。

(3)轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)培養(yǎng)：

將步驟(2)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到第二培養(yǎng)基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強(qiáng)度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，愈傷組織誘導(dǎo)出嫩芽后，將嫩芽從貓爪草花托外植體上完整地切下，轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)以相同的條件培養(yǎng)至形成貓爪草幼苗。

所述第二培養(yǎng)基的組成成分在步驟(2)所述第一培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。

所述第三培養(yǎng)基的組成成分在所述第二培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了6-芐氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。

(4)幼苗的馴化與煉苗：

將貓爪草幼苗移栽到煉苗基質(zhì)中，并逐步轉(zhuǎn)移到外部環(huán)境中。

所述煉苗基質(zhì)的組成成分為：珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，質(zhì)量比為1:0.5～1.5:0.2～0.8:0.2～0.8:0.1～0.5:0.05～0.15:0.05～0.15:0.005～0.015，優(yōu)選質(zhì)量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。

(5)移栽：

選擇土層深厚、排水良好的山坡或荒地作為待播田，整平耕細(xì)后施加底肥，在步驟(4)所述的幼苗適應(yīng)外部環(huán)境正常生長(zhǎng)后，移栽至所述待播田，行距10～15cm，株距5～8cm。

所述底肥包括貓爪草專用緩釋肥，所述貓爪草專用緩釋肥組成及重量份數(shù)為：尿素100份、多聚糖50～100份、碳酸氫銨20～25份、碳酸氫銨12～14份、硝酸鈣3～6份，磷酸二銨50～60份、鈣鎂磷肥12～14份、硫酸鉀50～60份、磷酸銨鋅3～5份、硅酸鉀4～7份、硼砂1～3份、硫酸錳1～3份。

其中多聚糖為貓爪草生長(zhǎng)提供必需的生物碳能，促進(jìn)甾醇與酸類物質(zhì)的合成。優(yōu)選地，所述多聚糖的重量份數(shù)為65份。

(6)田間管理：

生長(zhǎng)期內(nèi)及時(shí)進(jìn)行松土、澆水、除草等常規(guī)管理；病蟲害管理方面，為保證貓爪草的中藥特性，對(duì)一般危害性小的蟲害不予施加農(nóng)藥，而對(duì)病害則以預(yù)防為主，當(dāng)病害發(fā)生后采用中藥殺菌液對(duì)貓爪草進(jìn)行殺菌處理。

(7)收獲與采種：

當(dāng)貓爪草栽培滿一年后，將其地下部分根部的塊根挖出，地上部分的種子予以采集，同時(shí)完成貓爪草的人工栽培與育種，既獲得經(jīng)濟(jì)效益又獲得穩(wěn)定的貓爪草種質(zhì)資源。

本發(fā)明利用中草藥貓爪草花托外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，對(duì)貓爪草進(jìn)行人工栽培，這在中草藥人工栽培方面尚屬首次。本發(fā)明涉及的一種貓爪草的人工栽培方法，采用貓爪草的花托外植體經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)得到貓爪草幼苗，縮短愈傷組織的愈傷分化時(shí)間，提高愈傷組織的形成數(shù)量與效率。經(jīng)愈傷分化培養(yǎng)得到的貓爪草，既克服人工移栽的區(qū)域限制與成本劣勢(shì)，又克服了通過種子繁殖時(shí)得到種質(zhì)資源的基因的非典型性。本發(fā)明具有在推廣貓爪草人工栽培領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體說明。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例只是作為具體說明，而不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

一種貓爪草離體培育方法，具體步驟如下：

(1)花托外植體預(yù)處理：

選取貓爪草的花蕾，在4℃環(huán)境中冷藏3天后，將花蕾取出自然恢復(fù)至室溫，剝?nèi)グ托』ǎ眉儍羲疀_洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5min，再用70％的酒精消毒30s，之后用無菌水沖洗3次，即得到貓爪草花托外植體；以上涉及的百分比均為體積百分比。

(2)外植體接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)：

將貓爪草花托外植體移入到滅菌后的第一培養(yǎng)基中，將溫度設(shè)定為23±1℃，以藍(lán)光燈為光源，光照強(qiáng)度控制為600Lx，光周期控制為光14h/暗10h，每十天更換一次培養(yǎng)基，直到誘導(dǎo)出愈傷組織。

所述第一培養(yǎng)基的組成成分為：KNO₃ 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH₂PO₄ 360mg/L，CaCl₂·2H₂O 340mg/L，MgSO₄·7H₂O 190mg/L，EDTA 150mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 60mg/L，ZnSO₄·7H₂O 20mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 8mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 3mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，維生素B1 0.65mg/L，維生素B6 1.3mg/L，煙酸1.1mg/L，蔗糖40g/L，瓊脂12g/L，激動(dòng)素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，鹽酸吡哆醇0.8mg/L，鹽酸硫胺素0.8mg/L，甲基亞硝基脲1.6mg/L，吲哚丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，葉酸8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣1.7mg/L，秋水仙堿1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。

(3)轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)培養(yǎng)：

將步驟(2)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到第二培養(yǎng)基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強(qiáng)度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，愈傷組織誘導(dǎo)出嫩芽后，將嫩芽從貓爪草花托外植體上完整地切下，轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)以相同的條件培養(yǎng)至形成貓爪草幼苗；

所述第二培養(yǎng)基的組成成分在步驟(2)所述第一培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。

所述第三培養(yǎng)基的組成成分在所述第二培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了6-芐氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。

(4)幼苗的馴化與煉苗：

將貓爪草幼苗移栽到煉苗基質(zhì)后，從誘導(dǎo)環(huán)境中每天降低溫度1℃，光照強(qiáng)度每天增加300Lx，至與外部環(huán)境相同時(shí)，再培養(yǎng)2～3天即可移栽至待播田。

所述煉苗基質(zhì)的組成成分為：珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，其質(zhì)量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。

(5)移栽：

選擇土層深厚、排水良好的山坡或荒地作為待播田，整平耕細(xì)后施加底肥，在步驟(4)所述的幼苗適應(yīng)外部環(huán)境正常生長(zhǎng)后，移栽至所述待播田，行距10～15cm，株距5～8cm。

所述底肥包括貓爪草專用緩釋肥，所述貓爪草專用緩釋肥組成及重量份數(shù)為：尿素100份、碳酸氫銨20～25份、碳酸氫銨12～14份、硝酸鈣3～6份，磷酸二銨50～60份、鈣鎂磷肥12～14份、硫酸鉀50～60份、磷酸銨鋅3～5份、硅酸鉀4～7份、硼砂1～3份、硫酸錳1～3份。

(6)田間管理：

生長(zhǎng)期內(nèi)及時(shí)進(jìn)行松土、澆水、除草等常規(guī)管理；病蟲害管理方面，為保證貓爪草的中藥特性，對(duì)一般危害性小的蟲害不予施加農(nóng)藥，而對(duì)病害則以預(yù)防為主，當(dāng)病害發(fā)生后采用中藥殺菌液對(duì)貓爪草進(jìn)行殺菌處理。

(7)收獲與采種：

當(dāng)貓爪草栽培滿一年后，將其地下部分根部的塊根挖出，地上部分的種子予以采集，同時(shí)完成貓爪草的人工栽培與育種。