本發(fā)明涉及屬于農(nóng)業(yè)栽培中通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生領(lǐng)域，具體涉及一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系建立方法。

背景技術(shù)：

野大麥又稱短芒大麥，為禾本科大麥屬多年生草本植物，是一種具短根莖的多年生牧草，無(wú)性繁殖力較強(qiáng)，經(jīng)常以株叢形式分布于鹽生植物群落中，在松嫩平原堿化草甸可形成大面積的單優(yōu)群落。野大麥具有草質(zhì)好，營(yíng)養(yǎng)豐富，干草中蛋白質(zhì)及脂肪含量較高，適口性好，抗惡劣環(huán)境，耐踐踏等優(yōu)良特性，是人工栽培草地和草地改良過(guò)程中的優(yōu)選良種。

隨著草場(chǎng)的退化和耕地面積的日益減少，不斷培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的牧草新品種成為國(guó)內(nèi)外牧草研究工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。就育種而言，除了傳統(tǒng)的育種手段，結(jié)合基因工程技術(shù)來(lái)培育新品種能加速育種進(jìn)程，更有效地選育出目標(biāo)品種。而野大麥組織培養(yǎng)是利用基因工程技術(shù)進(jìn)行基因改良的基礎(chǔ)，只有建立了穩(wěn)定、高頻的再生體系，才能構(gòu)建較好的遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率，獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而獲得改良新品種。

目前，國(guó)內(nèi)野大麥離體再生體系研究還不完善，朱進(jìn)等以野大麥的成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，在含 NaCl的MS培養(yǎng)基上篩選到的耐鹽變異體具有一定的耐鹽性且較穩(wěn)定，并分化出了再生植株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系建立方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)野大麥成熟胚為外植體，構(gòu)建愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生獲得再生體系，為探索其細(xì)胞工程育種和遺傳改良研究提供可靠的技術(shù)支持。

本發(fā)明提供一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系建立方法，步驟如下：

（1）選擇野大麥種子并消毒；

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的篩選：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.1-0.5 mg·L^-1 6-BA +1.0-2.0 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5-1.5mg/L 6-BA + 0.2-0.4mg/L NAA，

生根培養(yǎng)基：1/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+蔗糖30g·L^-1+瓊脂10g·L^-1；

（3）成熟胚的處理和誘導(dǎo)分化：取步驟（1）中消毒的野大麥種子，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼代幾次后轉(zhuǎn)入分化和增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，繼代幾次后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待分化苗的根長(zhǎng)4-6cm時(shí)，將瓶苗移出培養(yǎng)室，自然光下閉瓶煉苗，2d后注入自來(lái)水，自然光下開(kāi)瓶煉苗3d，然后洗凈根部，滅菌，用基質(zhì)培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D；

所述分化增殖培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

所述生根培養(yǎng)基為：1/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+蔗糖30g·L^-1+瓊脂10g·L^-1。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：于恒溫25±2℃條件下黑暗培養(yǎng)30d。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述分化增殖培養(yǎng)的條件為：光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：在 25±2℃、光照強(qiáng)度為2000-3000lx、光照時(shí)間16h·d^-1條件下培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明公開(kāi)了一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及再生體系的構(gòu)建方法，以采集臨澤的野大麥成熟胚為外植體，通過(guò)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、生根等步驟的影響，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選，獲得出愈率較高的培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.3mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D,誘導(dǎo)率為50%；分化和植株再生培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，分化率為80%，生根成苗培養(yǎng)基為：1/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基，生根率達(dá)100%；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30g·L^-1和瓊脂10g·L^-1。提供了一種高效效野大麥成熟胚組織培養(yǎng)方法。與已有的野大麥再生體系報(bào)道相比，本發(fā)明的植株再生率顯著提高。

（2）本發(fā)明選用野大麥成熟胚為外植體，進(jìn)行組織再生培養(yǎng)，不受取材材料時(shí)空限制。本發(fā)明為野大麥愈傷組織誘導(dǎo)的組培方法，操作簡(jiǎn)單，成本廉價(jià)；建立的野大麥成熟胚培養(yǎng)植株再生方法體系，為探索其細(xì)胞工程育種和遺傳改良研究提供可靠的技術(shù)支持。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織；

圖2為愈傷組織分化綠苗；

圖3為生根的幼苗；

圖4為移栽后的再生植株。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售。

本發(fā)明的方法具體步驟如下：

（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的野大麥成熟種子，去除外稃后在流水下沖洗30分鐘，然后用75%酒精處理5min，無(wú)菌水沖洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無(wú)菌水沖洗3-5次，將種子置于無(wú)菌濾紙，直至種子水分吸干后待用；所述的野大麥種子指的是：采集于甘肅臨澤野大麥野生種子。

（2）誘導(dǎo)和分化增殖培養(yǎng)基篩選：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1；

誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化增殖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加不同處理激素。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-BA和2,4-D。設(shè)置6-BA濃度為0.1 mg·L^-1、0.3 mg·L^-1、0.5 mg·L^-1；2,4-D的濃度為1. 0 mg·L^-1、1.5 mg·L^-1、2.0 mg·L^-1（表1）；

分化和增殖培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-BA和NAA。設(shè)置6-BA濃度為0.5 mg·L^-1、1.0 mg·L^-1、1.5 mg·L^-1；NAA的濃度為0.2 mg·L^-1、0.4 mg·L^-1（表2）；

生根培養(yǎng)基為1/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基pH均調(diào)至5.8～6.0，在121℃下高壓濕熱滅菌20min。

（3）成熟胚的處理和誘導(dǎo)分化：本步驟對(duì)各部分的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，在以下培養(yǎng)條件時(shí)能夠取得最佳的培養(yǎng)效果。具體培養(yǎng)方法如下：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置于含有不同濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱(25±2)℃條件下黑暗培養(yǎng)30d，期間將意外染菌重復(fù)除去，統(tǒng)計(jì)出愈率和生長(zhǎng)狀況。并將愈傷組織轉(zhuǎn)入最優(yōu)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次后轉(zhuǎn)入含有不同濃度的分化和增殖培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率及出苗率；

（4）待分化苗長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將應(yīng)用最優(yōu)分化和增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的分化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在 (25±2)℃、光照強(qiáng)度為2000～3000lx、光照時(shí)間16 h·d^-1條件下培養(yǎng)。待分化苗的根長(zhǎng)5cm左右，將瓶苗移出培養(yǎng)室，自然光下閉瓶煉苗，2d后注入自來(lái)水，自然光下開(kāi)瓶煉苗3d后統(tǒng)計(jì)生根率。洗凈根部后，移入高壓蒸汽滅菌后基質(zhì)（珍珠巖：蛭石：營(yíng)養(yǎng)土（購(gòu)自杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

表1 不同濃度6-BA 和2,4-D組合對(duì)野大麥愈傷組織形成的影響

由表1可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.1mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)75%，但愈傷組織質(zhì)地較松散，不利于后期的分化組織的形成；添加0.3mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D誘導(dǎo)率為49.72%，愈傷組織為淡黃色，質(zhì)地致密，增殖速度快?？傮w而言，愈傷組織的誘導(dǎo)率在6-BA的濃度為0.1-0.3mg/L之間，隨著2,4-D濃度的增加呈先升高后下降，但是差異性不顯著。因此，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D。

表2不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)野大麥愈傷組織分化能力的影響

由表2可知，在培養(yǎng)基中加入不同激素及其濃度組合，分化率存在明顯差異。當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的分化率呈先升高后下降的趨勢(shì)，激素為1.0mg/L6-BA + 0.4mg/L NAA 和1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA組合，愈傷組織的分化率最高，分別達(dá)到93.33%和86.66%，但是分化苗后期生長(zhǎng)狀況不是很好，死亡率較高。當(dāng)激素濃度為0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA時(shí)，愈傷組織的分化率為80%，分化苗后期成活率高，生長(zhǎng)較旺盛。因此，野大麥愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA。

實(shí)施例1

本發(fā)明的方法具體步驟如下：

（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的野大麥成熟種子，去除外稃后在流水下沖洗30分鐘，然后用75%酒精處理5min，無(wú)菌水沖洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無(wú)菌水沖洗3-5次，將種子置于無(wú)菌濾紙，直至種子水分吸干后待用；所述的野大麥種子指的是：采集于甘肅臨澤的野生野大麥種子。

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的配方如下：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30g×L^-1和瓊脂10 g×L^-1；

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基pH均調(diào)至5.8～6.0，在121℃下高壓濕熱滅菌20min；

（3）成熟胚的處理和誘導(dǎo)分化：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱(25±2)℃條件下黑暗培養(yǎng)30d，期間將意外染菌重復(fù)除去，然后進(jìn)行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次后，測(cè)得誘導(dǎo)率為50%；轉(zhuǎn)入分化增殖培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率及出苗率，增殖率為80%；

（4）待分化苗長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在 (25±2)℃、光照強(qiáng)度為2000～3000lx、光照時(shí)間16 h·d^-1條件下培養(yǎng)，生根率為100%。待分化苗的根長(zhǎng)5cm左右，將瓶苗移出培養(yǎng)室，自然光下閉瓶煉苗2d后注入自來(lái)水，自然光下開(kāi)瓶煉苗3d后統(tǒng)計(jì)生根率。洗凈根部后，移入高壓蒸汽滅菌后基質(zhì)（珍珠巖：蛭石：營(yíng)養(yǎng)土（購(gòu)自杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。