一種通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于非洲菊組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過誘導體細胞胚獲得非洲 菊再生植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非洲菊（Gerbera jamesonii)又稱扶郎花，原產(chǎn)南非，系菊科大丁草屬多年生草本 植物，具有花色豐富、花型獨特、產(chǎn)花量高、觀賞期長等優(yōu)點，是世界五大切花之一。由于非 洲菊自花不孕，種子苗變異大，分株繁殖可以保持原有的種性特征，不發(fā)生變異，但存在繁 殖過程中種苗易被病蟲害侵染，受季節(jié)限制，增殖速度慢等問題，難以適應規(guī)模化、工廠化 生產(chǎn)的需求，且長期無性繁殖還存在病毒積累，種性退化等問題。
[0003]非洲菊在國際、國內(nèi)花丼市場上發(fā)展迅速，良種種苗需求大，成本高，目前產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)中使用的非洲菊種苗多為組培苗。一般非洲菊的培養(yǎng)程序是：利用非洲菊花托、花瓣、 嫩葉、莖尖、葉莖等為起始外殖體，脫分化誘導形成愈傷組織，再將愈傷組織培養(yǎng)于分化培 養(yǎng)基獲得不定芽，從而利用不定芽增殖培養(yǎng)，最后將不定芽分割后誘導生根。此操作過程復 雜，周期長，還存在外植體經(jīng)過愈傷組織途徑形成的種苗容易發(fā)生變異等問題。
[0004]何俊平等開展了非洲菊品種玲瓏再生體系建立的研宄，以非洲菊花托為外植體， 研宄了不同消毒濃度、消毒時間的消毒效果以及激素種類對外植體不定芽分化、增殖及生 根的影響。結(jié)果表明，用2%次氯酸鈉滅菌IOmin對玲瓏外植體有良好的消毒效果?；ㄍ?誘導不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+10.0 mg/L 6-BA+O. 5mg/L IAA，芽體分化率達60. 5%。 增殖培養(yǎng)基以MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA最為適宜，增殖系數(shù)為3. 70。生根培養(yǎng)基以 1/2MS+0. lmg/L NAA最為適宜，生根率達100%【何俊平，涂小云，周艷寶等，非洲菊品種玲 瓏再生體系的建立，江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012,40(7) :56 - 58】。
[0005] 馮新等以非洲菊無菌苗的帶節(jié)莖段為外植體開展組織培養(yǎng)研宄，結(jié)果表明，以 0. 8-1. 2cm的非洲菊帶節(jié)莖段為外植體，可以不通過愈傷組織途徑，直接誘導出芽。非洲菊 帶節(jié)莖段誘導芽苗的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0. lmg/L。較高濃度的6-BA有利 于增殖系數(shù)的提高，但容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，高濃度的NAA會使芽苗葉色退綠，故最適合的 增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. 3mg/L。非洲菊芽苗生根的濃度范圍較寬，最佳生根 培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0. 2mg/L【馮新，賴呈純，賴鐘雄，非洲菊離體快繁條件的優(yōu)化，亞熱帶 農(nóng)業(yè)研宄，2009,5(4):222-228】。
[0006] 王春彥等為探尋非洲菊離體葉片培養(yǎng)的不定芽再生條件，完善非洲菊離體葉片的 不定芽再生體系，以不同解離方式的離體葉為外植體，進行不同激素濃度配比的試驗。結(jié)果 表明，除葉柄剪半的外植體無不定芽再生外，另外2種離體葉在葉柄基部均有器官型再生 不定芽和器官發(fā)生型再生不定芽。自株叢基部撕脫的離體葉于l/2MS+KT5mg/L+NAA0.1 mg/ L+蔗糖30g/L的培養(yǎng)基中，器官型不定芽的再生率最高達60%~70%。再生比例為1~ 2,器官發(fā)生型再生率20%~30%，再生比例1~2。器官型不定芽再生主要集中在接種后 4~12天的時間段內(nèi)，而器官發(fā)生型不定芽形成主要集中在接種后12~24天的時間段內(nèi)。 若將KT換成不同濃度的6-BA，則以自株叢基部撕脫離體葉的器官型再生率最高達60%~ 70%，再生比例4~5,器官發(fā)生型再生率為50%~60%，再生比例為2~3。試驗表明： 6-BA和KT二者同屬細胞分裂素類物質(zhì)，二者濃度上的變化對不定芽再生影響不大，而二者 種類不同對不定芽再生差異很大【王春彥，羅鳳霞。非洲菊離體葉培養(yǎng)誘導不定芽研宄，中 國農(nóng)學通報 2011，27(13) :144-148】。
[0007] 利用體細胞胚途徑培養(yǎng)非洲菊再生植株，可簡化培養(yǎng)程序、縮短培養(yǎng)周期，降低種 苗培育成本，提高種苗質(zhì)量，降低或避免種苗發(fā)生變異。
[0008] 王麗花等以非洲菊的未受精胚珠為試材，研宄胚珠發(fā)育時期培養(yǎng)基及供體基因型 對非洲菊的未受精胚珠離體誘導效果的影響，并以根尖染色體計數(shù)為基礎(chǔ)對獲得的33株 再生植株的倍性進行了流式細胞術(shù)鑒定。結(jié)果表明，胚珠發(fā)育時期培養(yǎng)基及供體基因型均 極顯著影響愈傷組織和胚狀體的誘導頻率，且外輪舌狀花完全水平展開內(nèi)輪管狀花開放前 ld，剝?nèi)〉呐咧檎T導頻率較高；MS中的大量元素和有機物+Heller中的微量元素+1/2鐵鹽 +0. 5mg/L2,4-D預培養(yǎng)7~IOd有利于啟動雌核發(fā)育誘導胚狀體形成；經(jīng)胚狀體或愈傷組 織2種途徑可再生植株【王麗花，瞿素萍，吳學尉等。非洲菊未受精胚珠離體培養(yǎng)影響因素 研宄，西南農(nóng)業(yè)學報，2013, 26 (4) : 1639-1644】。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，以非 洲菊的幼小花托為外植體，不經(jīng)過愈傷組織階段，通過體細胞胚途徑獲得再生植株，可避免 外植體經(jīng)脫分化誘導愈傷組織再生植株途徑而發(fā)生突變，為非洲菊的大量離體繁殖優(yōu)質(zhì)種 苗及轉(zhuǎn)基因研宄提供基礎(chǔ)材料，取材方便，操作簡單，又不傷害母株。
[0010] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0011] 一種通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，包括如下步驟：
[0012] 1)選取非洲菊花蕾，清洗，70%酒精消毒30-60s，0. 1%取(：12消毒8-14min，用無 菌水沖洗，吸干表面水分待用；
[0013] 2)剝?nèi)シ侵蘧栈ɡ偕系幕ㄝ嗪托』ㄐ?，得到花托，并切去花托的外表層，作為外?體；
[0014] 3)將步驟2)的外植體整體接種到權(quán)利要求1所述的誘導培養(yǎng)基中，弱光照培養(yǎng) 5~8天；
[0015] 所述的用于非洲菊體細胞胚的誘導培養(yǎng)基，包含如下表1所示物質(zhì)：
[0016]表1
[0017]
【主權(quán)項】
1. 一種用于誘導非洲菊體細胞胚的誘導培養(yǎng)基，包括以下組分：
其中，每升誘導培養(yǎng)基添加蔗糖30-40克，瓊脂粉6. 5-8. O克；所述誘導培養(yǎng)基pH = 5. 5~6. 5〇
2. -種通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 選取非洲菊花蕾，清洗，70%酒精消毒30-60s，0. 1% HgCl2消毒8-14min，用無菌水 沖洗，吸干表面水分待用； 2) 剝?nèi)シ侵蘧栈ɡ偕系幕ㄝ嗪托』ㄐ?，得到花托，并切去花托的外表層，作為外植體； 3) 將步驟2)的外植體整體接種到權(quán)利要求1所述的誘導培養(yǎng)基中，弱光照培養(yǎng)5~8 天； 4) 將步驟3)培養(yǎng)的外植體置于強光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)45-50天，獲得非洲菊體細胞胚，繼 續(xù)培養(yǎng)10-15天，體細胞胚逐漸萌發(fā)，形成小芽； 5) 將萌發(fā)2-3片葉的非洲菊體胚小芽轉(zhuǎn)接于新鮮的分化培養(yǎng)基上，小芽不斷生長發(fā) 育，葉片數(shù)逐漸增多，基部形成根系，獲得再生植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步驟1)中，所述非洲菊花蕾直徑為4-7mm，清洗前于4-6°C冷藏處理24-48h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步驟3)中，所述弱光照培養(yǎng)的光照強度為300-5001x，培養(yǎng)溫度23-26°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步驟4)中，所述強光照培養(yǎng)的光照強度為2400-28001x，培養(yǎng)溫度23-26°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法， 其特征在于，步驟5)所述的分化培養(yǎng)基組分如下：
其中，每升分化培養(yǎng)基添加蔗糖25-35克，瓊脂粉6. 5-7. O克；所述誘導培養(yǎng)基pH = 5. 5~6. 5〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過誘導體細胞胚獲得非洲菊再生植株的方法，以非洲菊花托為外植體材料，培養(yǎng)于含6-芐氨基嘌呤、激動素、苯基噻二唑基脲、萘乙酸、毒莠定、水解酪蛋白的體細胞胚誘導培養(yǎng)基中，誘導體細胞胚，體細胞胚萌發(fā)后，將其繼代培養(yǎng)于分化培養(yǎng)基中，獲得再生植株。本發(fā)明以非洲菊的花托做外植體，不經(jīng)過愈傷組織階段，通過體細胞胚途徑獲得再生植株，可避免外植體經(jīng)脫分化誘導愈傷組織再生植株途徑而發(fā)生突變。利用本發(fā)明進行非洲菊組織培養(yǎng)培育種苗，使培養(yǎng)程序簡化、培養(yǎng)周期縮短、種苗質(zhì)量提高，為非洲菊的大量離體繁殖優(yōu)質(zhì)種苗及轉(zhuǎn)基因研究提供基礎(chǔ)材料。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104719161
【申請?zhí)枴緾N201510127620
【發(fā)明人】殷麗青, 孫翊, 李水根, 陸錦明, 張永春, 周音, 范曉芬
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學院, 上海景香農(nóng)業(yè)科技有限公司, 上海閔行區(qū)苗圃
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月23日