一種國槐子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的成套培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種國槐子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的成套培養(yǎng)基，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 國槐（Sophora japonica Linn)，別名家槐、中國槐，屬蝶形花亞科、槐屬，是理想 的行道樹種和庭院綠化樹種。而且，國槐材質(zhì)優(yōu)良，花、果實、根皮、樹皮可入藥，種子可榨油 制皂，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，應(yīng)用前景十分廣闊。同時，國槐又是嫁接龍爪槐、金枝槐、聊紅 槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種，苗木需求大。國槐主要以種子繁殖為主，但其開花 結(jié)果具有大小年現(xiàn)象，且種子易受病蟲害危害，干癟、空洞現(xiàn)象嚴(yán)重。常規(guī)的育種方法，依靠 種子或扦插繁殖，難以滿足生產(chǎn)的需求。
[0003] 近年來，利用生物技術(shù)培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國槐育種的 新趨勢。到目前為止，對槐樹的形成層培養(yǎng)、莖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、未授粉子房的培養(yǎng) 均已獲得了完整的植株，對原生質(zhì)的培養(yǎng)也取得了一定的進(jìn)展。袁秀云等利用國槐的子葉 和下胚軸產(chǎn)生了不定芽，王喆之等利用花藥培養(yǎng)形成了單倍體植株，Han K. H等（1993， 1997)將直徑為0.5~1.0cm的枝條消毒后，取出形成層接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷，再 將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，獲得了叢生芽，將成苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，可誘導(dǎo)生根。上 述的方法存在的缺點：由于國槐為多年生木本植物，其再生率普遍較低，出芽少，直接影響 了國槐的遺傳轉(zhuǎn)化。利用植物體胚誘導(dǎo)技術(shù)不但能達(dá)到保存母株優(yōu)良基因、快速繁育的目 的，還是提高基因遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種的重要途徑。目前，有關(guān)國槐的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)技術(shù)研 究的較少，可以參考的現(xiàn)有技術(shù)比較少。查閱文獻(xiàn)，可以看到別的樹種也有人在做體胚誘 導(dǎo)，國槐為多年生喬木，基因組龐大，鑒于基因型的限制，沒有參考價值。
[0004] 國槐的離體葉片、根尖等均可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。其前提條件是首先要建立一個穩(wěn) 定的高頻再生系統(tǒng)，只有這樣，才能提供充足的無菌離體材料。在山東地區(qū)，國槐小峰的危 害非常嚴(yán)重，要采集國槐種子，必須在國槐花序剛剛形成開始至授粉形成果莢期間在要采 摘的國槐樹及其周邊均要噴灑農(nóng)藥，防止國槐小蜂寄存在種子中。果莢膨大成熟后，既可采 收種子。專利CN 102499086 A公開了一種刺槐的繁殖方法，由于國槐與刺槐分屬不同的屬， 物種差別較大，不能參考刺槐莢果的體細(xì)胞培養(yǎng)方法得到國槐子葉的體細(xì)胞培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種國槐子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的成套培 養(yǎng)基，以解決國槐再生率低下的問題。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種國槐子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的成套培養(yǎng)基，包括
[0008] 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基:A+3 · 0~5 · Omg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0 · 5~1 · Omg/ L BA+0.5~1.0mg/L NAA(蔡乙酸）+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氛醜胺+0.5~ 1 · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0009]不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：A+0 · 1 ~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1 ~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~I · Omg/L谷氛 酰胺+〇 · 5~I · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0010] 試管苗增殖培養(yǎng)基配方:MS+1 · 0~2 · Omg/L BA(6-芐基腺嘌呤）+ 1 · 0~2 · Omg/LIBA (吲哚丁酸)+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0011]壯苗培養(yǎng)基:MS+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] 生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 ~0.5mg/L ΙΒΑ+0~0.05mg/L NAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗 糖，pH值5.8~6.0，所述1/2MS是MS全量減半；
[0013] 所述:A配方包括MS培養(yǎng)基中的常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和B5培養(yǎng)基的有機(jī)試 劑。
[0014] 優(yōu)選:MS培養(yǎng)基包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機(jī)試劑。
[0015]優(yōu)選:所述MS培養(yǎng)基的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下：硝酸鉀1900mg/ L，硝酸銨1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙 二胺四乙酸二鈉37 · 3mg/L，七水硫酸亞鐵27 · 8mg/L。
[0016] 優(yōu)選：所述MS培養(yǎng)基的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下：四水硫酸錳 22.311^/1^，硫酸鋅8.611^/1^，硼酸6.211^/1^，碘化鉀0.8311^/1，鉬酸鈉0.2511^/1^，硫酸銅 0 · 025mg/L，氯化鈷 0 · 025mg/L。
[0017] 優(yōu)選:A配方所述的B5有機(jī)試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下：鹽酸硫胺素100mg/L， 煙酸I 〇mg/L，鹽酸吡咳醇10mg/L，肌醇1000mg/L。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 體細(xì)胞胚發(fā)生的因素包括內(nèi)因和外因，內(nèi)因包括物種和基因型，外因主要涉及培 養(yǎng)基中附加成分的種類和濃度。即使是同一屬的植物，由于基因型不同，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率 相差極大，原因如下：一是不同基因型體細(xì)胞胚發(fā)生頻率不同，二是不同基因型的最適誘導(dǎo) 條件不同。外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育程度都直接影響體細(xì)胞胚的發(fā)生，一般生理代謝旺盛 而分化程度較低的組織有利于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。
[0020] 對于培養(yǎng)基中必需的生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸，還原性氮鹽和外源氨 基酸，PH值等其他因素，他們的作用方向、作用程度都不相同。誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚發(fā)生的因 素眾多，但它們的作用程度不盡相同，各種因子通過轉(zhuǎn)錄與翻譯水平復(fù)雜而精確地調(diào)控，使 體細(xì)胞胚發(fā)生的相關(guān)基因在時間上和空間上得以選擇性激活和表達(dá)，只有各種因素配合使 用時才能快速、高效地誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。
[0021] 發(fā)明人綜合考慮影響國槐子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的各種因素，圍繞提高再生率、增加 出芽，提高植株移栽成活率等目的，設(shè)計了本發(fā)明的一套培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基相較于其他的培 養(yǎng)基再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達(dá)到90 %以上，種苗生長健壯，不但可有效解決 優(yōu)良種苗種質(zhì)退化問題，還可為國槐遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種提供一個理想的受體系統(tǒng)
[0022] 使用本發(fā)明的培養(yǎng)基繁殖國槐幼苗，可省去先建立國槐快繁再生體系這一步驟， 大大節(jié)省時間。
【附圖說明】
[0023]圖1子葉劃傷口；
[0024]圖2形成胚性愈傷組織；
[0025] 圖3愈傷組織誘導(dǎo)出叢生芽。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0027] A配方為改良過的MS與B5培養(yǎng)基組合，包括MS培養(yǎng)基中的常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng) 元素和B5培養(yǎng)基的有機(jī)試劑。
[0028] MS培養(yǎng)基包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機(jī)試劑。
[0029]所述MS培養(yǎng)基的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下：硝酸鉀1900mg/L，硝 酸銨1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙二胺 四乙酸二鈉37 · 3mg/L，七水硫酸亞鐵27 · 8mg/L。
[0030] 所述MS培養(yǎng)基的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下：四水硫酸錳22.3mg/ L，硫酸鋅8 · 6mg/L，硼酸6 · 2mg/L，碘化鉀0 · 83mg/L，鉬酸鈉0 · 25mg/L，硫酸銅0 · 025mg/L，氯 化鈷0.025mg/L。
[0031] 優(yōu)選:A配方所述的B5有機(jī)試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下：鹽酸硫胺素100mg/L， 煙酸I 〇mg/L，鹽酸吡咳醇I Omg/L，肌醇1000mg/L。
[0032]優(yōu)選:所述MS培養(yǎng)基的有機(jī)試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下:甘氨酸20mg/L，鹽酸 硫胺素 l〇mg/L，煙酸1 · 0mg/L，鹽酸吡咳醇1 · 0mg/L，肌醇100mg/L
[0033] 實施例一：
[0034] 選取生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生國槐成熟種子，去除果莢，用洗潔精仔細(xì)清洗 后，流水沖洗1小時，濾紙吸凈種子外面多余水分，準(zhǔn)備消毒。
[0035]將試材置于超凈工作臺上，用70%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升 汞滅菌Smin，無菌水沖洗5次，用滅菌濾紙吸干水分，用手術(shù)刀片和鑷子輕輕剝?nèi)シN皮，將子 葉取出。將兩片子葉用鑷子和刀片輕輕分開，保留胚芽，然后將子葉較平的那面朝下，凸面 朝上放置在培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片垂直于子葉凸面面主脈劃3~4個傷口，注意不要劃至子 葉邊緣。
[0036] 將上述子葉接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A+3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+0.5mg/L NAA +0 · lmg/L TDZ+0 · 5mg/L谷氨酰胺+0 · 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5 · 0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值 5.8)中。暗培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)體胚的形成。開始，葉片慢慢變硬變厚，逐漸形成愈傷組織，經(jīng)過 45d的暗培養(yǎng)，外植體變?yōu)闇\黃色黏狀愈傷組織。
[0037] 將上述愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A+0 · 3mg/L ΒΑ+0 · lmg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/L 谷氨酰胺+〇. 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入溫度白天 25± 2°C，夜晚20± 2°C，光照強(qiáng)度1000~15001x，光照時間16h/d的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，愈傷組織 逐漸增殖。在此環(huán)境中培養(yǎng)98d，中間用同種培養(yǎng)基繼代兩次。繼代一次后，愈傷組織出現(xiàn)綠 色的芽點。再繼續(xù)繼代一次，綠色的芽點逐漸長成1~2cm的小苗，形成叢生芽小苗，將叢生 芽小苗切成愈傷快轉(zhuǎn)接到試管苗增殖培養(yǎng)基進(jìn)行快速培養(yǎng)，所述試管苗增殖培養(yǎng)基配方： MS+1 · 0~2 · 0mg/L BA(6-芐基腺嘌呤)+1 ·0~2 · Omg/LIBA(吲哚丁酸)+5 ·0g/L瓊脂+30g/L蔗 糖，pH值5.8 ~6.0。
[0038]將增殖培養(yǎng)的叢生小苗從基部切下，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗 糖，pH值5.8)中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境同上。大約培養(yǎng)25d，小苗長至3~4cm高。
[0039] 將小苗從基