一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及耐鹽植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫因子。我國的鹽漬土近1億公頃，且鹽漬 化和次生鹽漬化不斷擴(kuò)大，為了確保人類可持續(xù)發(fā)展，必須探索有效治理和利用的方法。傳 統(tǒng)治理辦法耗費(fèi)了大量的資金和水資源，且收效甚微。多年實(shí)踐證明，種植耐鹽植物是鹽堿 地改良的生物學(xué)措施之一，是鹽堿地改良利用技術(shù)中最經(jīng)濟(jì)、有效和可持續(xù)的方法，越來越 受到人們的重視。但耐鹽植物資源、品種短缺，嚴(yán)重制約了生物學(xué)技術(shù)改良利用鹽堿地的有 效性，因此，耐鹽植物育種技術(shù)研宄得到較快發(fā)展。目前，耐鹽植物育種的方法有選擇育種、 雜交育種、基因工程育種、細(xì)胞工程育種、誘變育種等。應(yīng)用較為廣泛的是細(xì)胞工程育種， 通過充分利用離體培養(yǎng)過程中廣泛的體細(xì)胞變異篩選獲得突變體。誘變育種學(xué)是近40年 來興起的一門現(xiàn)代育種技術(shù)，與離體培養(yǎng)相結(jié)合能豐富突變類型，提高突變頻率和育種效 率。在離體條件下，利用誘變技術(shù)獲得耐鹽突變體的方法已經(jīng)在大麥、小麥、水稻、小黑麥、 甘薯、枸杞、甜橙、河北楊、獼猴桃和杜鵑等十幾種植物上得到了應(yīng)用。其中發(fā)明專利《一種 篩選甘薯耐鹽突變體的方法》公開了一種利用 6tlCo Y~射線輻射胚性懸浮細(xì)胞后經(jīng)離體培 養(yǎng)獲得了甘薯耐鹽突變體。
[0003] 蒲公英為菊科蒲公英屬多年草本植物，集食用、藥用、綠化美化環(huán)境為一體的多功 能型植物，由于它是常異花授粉植物，種性不純，而且它的花絲與花柱的周圍連接，形成一 個(gè)管狀體，雜交去雄時(shí)易損傷雌性部分，雜交育種不易成功。中國科學(xué)院植物研宄所開展了 藥蒲公英耐鹽突變體的篩選工作，發(fā)明專利《一種篩選耐鹽藥蒲公英的方法及其專用引物》 公開了耐鹽藥蒲公英體細(xì)胞變異篩選方法和耐鹽檢測專用引物；張新果等在論文《藥蒲公 英耐I. 5% NaCl變異體的篩選及特性分析》報(bào)道了以藥蒲公英葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組 織為材料，采用NaCl溶液作為耐鹽鑒定介質(zhì)（壓力選擇劑），耐鹽經(jīng)3個(gè)月繼代篩選獲得耐 1. 5 % NaCl的愈傷組織，耐鹽愈傷組織經(jīng)4個(gè)月的分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，通過逐步遞升濃度 的方法來完成變異體的耐鹽鑒定，獲得了耐I. 5% NaCl的藥蒲公英再生植株。
[0004] 綜上所述，蒲公英耐鹽突變體的篩選主要采用體細(xì)胞無性變異獲得，變異體的耐 鹽鑒定主要采用NaCl水溶液；目前利用誘變育種技術(shù)和離體培養(yǎng)相結(jié)合篩選耐鹽突變體 的研宄雖然已應(yīng)用于多種植物的耐鹽育種，但在蒲公英耐鹽突變體篩選研宄重中尚未見報(bào) 道。為了選育出更適合濱海鹽堿區(qū)種植的蒲公英品種，本發(fā)明以營養(yǎng)體較大、產(chǎn)量高、耐鹽 性差的一種蒲公英為材料，在建立了該蒲公英葉片離體培養(yǎng)高頻再生技術(shù)體系的基礎(chǔ)上， 利用EMS誘變處理愈傷組織，結(jié)合NaCl脅迫離體篩選方法獲得蒲公英耐鹽突變體，然后通 過鹽堿原土鑒定法對突變體進(jìn)耐鹽鑒定，獲得蒲公英耐鹽突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，通過EMS誘變處理葉 片愈傷組織、NaCl間斷反復(fù)脅迫離體篩選和鹽堿原土鑒定相結(jié)合，篩選獲得蒲公英耐鹽突 變體的方法。
[0006] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)無菌苗培養(yǎng)
[0009] 挑選飽滿種子用75%的乙醇處理30~50s，再用無菌水沖洗3~4次，用0. 1 %升 汞浸泡10~15min，然后用無菌水沖洗3~4次，接種到含有7g/L瓊脂粉、10g/L蔗糖、pH 值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基中，在室溫為21~23°C，暗培養(yǎng)30d后獲得無菌苗；
[0010] 2)愈傷組織誘導(dǎo)
[0011] 取無菌苗的葉片，切成〇. 5 X 0. 5cm大小的方塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，35~40d獲 得胚性愈傷組織；
[0012] 3) EMS誘變處理和NaCl脅迫篩選
[0013] 將胚性愈傷組織接種在含有0.4 %濃度EMS的液體分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng) 2h，用無菌水沖洗干凈，轉(zhuǎn)至含有300mmol/L NaCl的固體分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28d后，轉(zhuǎn)至 不含NaCl的相同培養(yǎng)基中21d，交替進(jìn)行，重復(fù)2次，選擇高3~4cm的小苗，轉(zhuǎn)移到含有 300mmol/LNaCl的MS培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行耐鹽篩選，21d后將生長正常的小苗接種到生根培 養(yǎng)基中，7~10天完成生根，獲得耐鹽試管苗；
[0014] 4)耐鹽植株獲得
[0015] 將耐鹽試管苗先進(jìn)行閉瓶煉苗7-15d，而后開瓶煉苗5-10d，移栽至基質(zhì)為1:1的 蛭石和河沙混合物中，使其成活，20-30d后，再移栽到溫室大棚的土壤中。
[0016]5)耐鹽植株的鑒定
[0017] 利用土壤全鹽含量0. 6%左右的鹽堿原土盆栽法對獲得的耐鹽植株進(jìn)行耐鹽性鑒 定，以未經(jīng)誘變和NaCl篩選的再生植株作對照，篩選出成活好，長勢優(yōu)，各項(xiàng)生長指標(biāo)明顯 優(yōu)于對照的耐鹽植株。
[0018] 本發(fā)明所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含0. 5mg/L 6~節(jié)氨基嗓呤（6~BA)、0. 2mg/L二氯 本氧乙酸（2, 4~D)、7g/L瓊脂粉和30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基。
[0019] 本發(fā)明所述的液體分化培養(yǎng)基為含lmg/L激動(dòng)素（KT)、0. 3mg/L萘乙酸（NAA)、 30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基；固體分化培養(yǎng)基為含lmg/L激動(dòng)素（KT)、0. 3mg/ L萘乙酸（NAA)、7g/L瓊脂粉、30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基。
[0020] 本發(fā)明所述的生根培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L萘乙酸（NAA)、7g/L瓊脂粉、30g/L蔗糖、 pH值5. 7~6.0的MS培養(yǎng)基。
[0021] 步驟⑵培養(yǎng)條件和步驟⑶分化培養(yǎng)條件為：溫度為21~23°C，每天光照時(shí)間 為12~16小時(shí)，光照設(shè)備為白熾燈管，光照強(qiáng)度為20001UX。
[0022] 步驟（3)中所述的震蕩培養(yǎng)的條件為23°C恒溫下，轉(zhuǎn)速70r/min，光照強(qiáng)度 20001ux〇
[0023] 步驟（4)所述的煉苗條件為：自然光照、溫度21-23°C、空氣濕度為80~85%。
[0024] 本發(fā)明通過EMS誘變處理葉片愈傷組織、NaCl間斷反復(fù)脅迫篩選和濱海鹽堿原 土鑒定相結(jié)合，獲得的蒲公英耐鹽突變體，能夠在土壤全鹽含量〇. 6%左右的土壤中正常生 長，且葉長、葉寬比對照增加8~10%和5%~8%。
[0025] 依照以上技術(shù)方案，本發(fā)明只需要260~280d就能篩選出能夠適應(yīng)土壤全鹽含量 0. 6~0. 8%土壤的蒲公英耐鹽突變體，具有操作簡單，效果好，效率高，加速了蒲公英耐鹽 育種的進(jìn)程，應(yīng)用前景非常廣泛。
[0026]與蒲公英耐鹽突變體篩選現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0027] 1)利用EMS誘變處理與NaCl間斷反復(fù)脅迫離體篩選相結(jié)合，篩選耐鹽突變體，變 異率高，經(jīng)歷時(shí)間短，獲得的突變體穩(wěn)定。
[0028] 2)利用鹽堿原土鑒定法對變異植株進(jìn)行耐鹽性鑒定，比水培、沙培等方法更切合 實(shí)際，鑒定結(jié)果也更加準(zhǔn)確，為耐鹽突變體鑒定最直接最有效的鑒定方法。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0030] 實(shí)施例1蒲公英耐鹽突變體的篩選
[0031] 本實(shí)施例培養(yǎng)基配置：
[0032] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含0?5mg/L 6~節(jié)氨基