嗓呤（6~BA)、0?2mg/L二氯本氧乙酸（2, 4~ D)、7g/L瓊脂粉和30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基。
[0033] 液體分化培養(yǎng)基：含lmg/L激動(dòng)素（KT)、0. 3mg/L萘乙酸（NAA)、30g/L蔗糖、pH值 5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基；
[0034] 固體分化培養(yǎng)基：含lmg/L激動(dòng)素（KT)、0. 3mg/L萘乙酸（NAA)、7g/L瓊脂粉、30g/ L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基。
[0035] 生根培養(yǎng)基：含有0.5mg/L萘乙酸（NAA)、7g/L瓊脂粉、30g/L蔗糖、pH值5. 7~ 6.0的MS培養(yǎng)基。
[0036] 具體試驗(yàn)方法：
[0037] 1、無(wú)菌苗培養(yǎng)
[0038] 挑選飽滿(mǎn)種子用75 %的乙醇處理30s，再用無(wú)菌水沖洗3次，用0.1 %升采浸泡 12min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，接種到含有7g/L瓊脂粉、10g/L蔗糖、pH值5. 8的MS培養(yǎng) 基中，室溫21~23°C，暗培養(yǎng)30d后獲得無(wú)菌苗。
[0039] 2、愈傷組織的誘導(dǎo)
[0040] 取無(wú)菌苗的葉片，切成0. 5X0. 5cm大小的方塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度為 21~23°C，每天光照時(shí)間為12~16小時(shí)，光照設(shè)備為白熾燈管，光照強(qiáng)度為20001ux，40d 后獲得胚性愈傷組織。
[0041] 3、EMS誘變處理最佳劑量和時(shí)間的確定
[0042] 將愈傷組織接種在含有0、0. 2%、0. 4%、0. 6% EMS的液體分化培養(yǎng)基中，23°C恒 溫下，轉(zhuǎn)速70r/min，光照強(qiáng)度20001ux，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)lh、2h和3h，轉(zhuǎn)至不含EMS的固體培 養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)，溫度為21~23°C，每天光照時(shí)間為12~16小時(shí)，光照設(shè)備為白熾 燈管，光照強(qiáng)度為20001u X，28d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的存活率和分化率，結(jié)果表明（表1)， 胚性愈傷組織的存活率和分化率都隨著處理時(shí)間的增加和EMS濃度增加而降低。EMS濃度 0. 2%時(shí)，對(duì)胚性愈傷組織的傷害不大，存活率都在75%以上，分化率也在70%以上，EMS濃 度達(dá)到0. 6%時(shí)，對(duì)胚性愈傷組織的殺傷力極強(qiáng)，即使處理lh，愈傷組織的存活率、分化率 也僅有34. 7%和19. 2%，EMS濃度0. 4%時(shí)，處理lh，愈傷組織存活率和分化率均在60% 以上，處理2h，存活率為47. 8%，分化率為57. 5%，處理3h時(shí)，存活率、分化率為36. 2%和 32%，可見(jiàn)0. 4%的EMS濃度可以達(dá)到愈傷組織致死率接近50%，從處理時(shí)間來(lái)看，2h的存 活率接近50%，而分化率卻不低，為了達(dá)到較好的誘變效果，選取0. 4 %處理2h為最佳處理 劑量和處理時(shí)間。
[0043] 4、NaCl脅迫篩選臨界濃度的確定
[0044] 將胚性愈傷組織接種到含有0、50、100、150、200、250、300、350臟〇1/1不同濃度 NaCl的固體分化培養(yǎng)基中，溫度為21~23°C，每天光照時(shí)間為12~16小時(shí)，光照設(shè)備為白 熾燈管，光照強(qiáng)度為20001UX，培養(yǎng)28天，觀察胚性愈傷組織的存活率和分化率。結(jié)果表明 (表2)，胚性愈傷組織的存活率和分化率均隨NaCl濃度的增加而降低，NaCl濃度小于或等 于200mmol/L時(shí)，對(duì)愈傷組織的影響不大，存活率和分化率均達(dá)到50%以上，當(dāng)NaCl濃度達(dá) 到250mmol/L，對(duì)愈傷組織的存活和分化產(chǎn)生較大的抑制作用，存活率、分化率僅為25. 3% 和30%，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到300mmol/L時(shí)，愈傷組織的存活率為6. 3%，成活愈傷組織的分化 率達(dá)到20%，NaCl濃度達(dá)到350mmol/L時(shí)，愈傷組織存活率僅為1. 3%，已全部失去分化能 力。以選擇壓力達(dá)到足以抑制大多數(shù)細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)，又可以保留部分愈傷組織的分化能 力為原則，研宄中選取致死率達(dá)到90%以上的劑量（300mmol/LNaCl)為篩選突變體的臨界 濃度。
[0045] 表1不同EMS濃度誘變處理對(duì)胚性愈傷組織存活率和分化率的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 無(wú)菌苗培養(yǎng) 挑選飽滿(mǎn)種子用75 %的乙醇處理30~50s，再用無(wú)菌水沖洗3~4次，用0. 1 %升汞 浸泡10~15min，然后用無(wú)菌水沖洗3~4次，接種到含有7g/L瓊脂粉、10g/L蔗糖、pH值 5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基中，在室溫為21~23°C，暗培養(yǎng)30d后獲得無(wú)菌苗； 2) 愈傷組織誘導(dǎo) 取無(wú)菌苗的葉片，切成0. 5X0. 5cm大小的方塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，35~40d獲得胚 性愈傷組織； 3. EMS誘變處理和NaCl脅迫篩選 將胚性愈傷組織接種在含有0. 4%濃度EMS的液體分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)2h， 用無(wú)菌水沖洗干凈，轉(zhuǎn)至含有300mmol/LNaCl的固體分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28d后，轉(zhuǎn)至不 含NaCl的相同培養(yǎng)基中21d，交替進(jìn)行，重復(fù)2次，選擇高3~4cm的小苗，轉(zhuǎn)移到含有 300mmol/LNaCl的MS培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行耐鹽篩選，21d后將生長(zhǎng)正常的小苗接種到生根培 養(yǎng)基中，7~10天完成生根，獲得耐鹽試管苗； 4) 耐鹽植株獲得 將耐鹽試管苗先進(jìn)行閉瓶煉苗7-15d，而后開(kāi)瓶煉苗5-10d，移栽至基質(zhì)為1:1的蛭石 和河沙混合物中，使其成活，20-30d后，再移栽到溫室大棚的土壤中； 5) 耐鹽植株的鑒定 利用土壤全鹽含量0. 6%左右的鹽堿原土盆栽法對(duì)獲得的耐鹽植株進(jìn)行耐鹽性鑒定， 以未經(jīng)誘變和NaCl篩選的再生植株作對(duì)照，篩選出成活好，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)，各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)明顯優(yōu) 于對(duì)照的耐鹽植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，其特征在于： 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含〇.5mg/L6~節(jié)氨基嗓呤、0. 2mg/L二氯本氧乙酸、7g/L瓊脂粉 和30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基； 所述的液體分化培養(yǎng)基為含lmg/L激動(dòng)素、0. 3mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、pH值5. 7~ 6. 0的MS培養(yǎng)基； 所述的固體分化培養(yǎng)基為含lmg/L激動(dòng)素、0. 3mg/L萘乙酸、7g/L瓊脂粉、30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基； 所述的生根培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L萘乙酸、7g/L瓊脂粉、30g/L蔗糖、pH值5. 7~6. 0的MS培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，其特征在于：步驟（2) 培養(yǎng)條件和步驟（3)分化培養(yǎng)條件為：溫度為21~23°C，每天光照時(shí)間為12~16小時(shí)， 光照設(shè)備為白熾燈管，光照強(qiáng)度為20001UX。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，其特征在于：步驟（3) 中所述的震蕩培養(yǎng)的條件為23°C恒溫下，轉(zhuǎn)速70r/min，光照強(qiáng)度20001UX。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，其特征在于：步驟（4) 所述的煉苗條件為：自然光照、溫度21-23°C、空氣濕度為80~85%。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選蒲公英耐鹽突變體的方法，通過(guò)挑選飽滿(mǎn)種子培養(yǎng)獲取無(wú)菌苗，切片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織依次接種至EMS的液體分化培養(yǎng)基和NaCl的固體分化培養(yǎng)基中篩選獲得耐鹽試管苗，煉苗移栽使其成活，再移栽到溫室大棚中，并結(jié)合濱海鹽堿原土盆栽耐鹽堿鑒定方法獲得耐鹽蒲公英植株。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，效果好，效率高，加速了蒲公英耐鹽育種的進(jìn)程，應(yīng)用前景非常廣泛。
【IPC分類(lèi)】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104719162
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510133152
【發(fā)明人】劉雅輝, 王秀萍, 張國(guó)新, 魯雪林, 李強(qiáng), 趙敏, 劉艷芬, 梁偉玲
【申請(qǐng)人】河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月25日