東江白頭翁體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及東江白頭翁體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]東江白頭翁(Pulsatillatongkangensis Y.N.Lee&T.C.Lee)是生長于韓國江原道寧越郡和旌善郡的部分懸崖縫隙的多年生草本植物，屬毛茛科，是白頭翁的一個新物種。相對于朝鮮白頭翁，東江白頭翁具有較大的葉，較短的葉柄和花柄，并且花柄直立生長不彎曲，開花朝天。大部分東江白頭翁花以深紫色為主，但也有淺紫、藕荷、淺粉、紫紅和米白色等多種，因此有巨大的觀賞價值。因東江白頭翁生長限在高山區(qū)域石灰?guī)r地帶，對生長環(huán)境條件的要求較特殊，所以這個物種的自然蔓延受到限制。因此，韓國森林廳將東江白頭翁作為珍稀物種指定為V級保護(hù)植物。
[0003]東江白頭翁主要依靠種子繁殖，但種子成熟后，若不及時播種，很快就會喪失活力，野外生長條件苛刻，自然繁殖和生長緩慢，野生東江白頭翁資源非常稀少，現(xiàn)已瀕臨滅絕。目前，東江白頭翁仍處于野生狀態(tài)，人工播種栽培量極少，而且移栽困難，成活率較低；此外，東江白頭翁是一種珍稀觀賞植物，市場需求量大。利益驅(qū)使人們盲目挖掘，亂挖亂采，以及生存環(huán)境的破壞、盲目開發(fā)、開山鑿石，導(dǎo)致東江白頭翁資源日漸稀少，瀕臨滅絕，遺傳資源面臨枯竭。自2007年，韓國部分地方自治團(tuán)體和民間環(huán)境團(tuán)體擬采用增殖、移栽方法保護(hù)種質(zhì)資源。因此，研宄分析體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的具體過程，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)緩解這一狀況成為迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種東江白頭翁體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，該方法以東江白頭翁的葉片為外植體，篩選出合適的吲哚乙酸(IAA)和玉米素(ZA)的濃度以誘導(dǎo)東江白頭翁體細(xì)胞胚發(fā)生。本發(fā)明技術(shù)方案的原理為:植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內(nèi)使植物繁殖，不僅繁殖速度快，且因?yàn)槭菬o性繁殖可以保持與母株的一致的遺傳性狀。通過組織培養(yǎng)獲得再生植株包括器官分化的再生和體細(xì)胞胚發(fā)生的植株再生途徑。通過體細(xì)胞胚發(fā)生繁殖是指在體外從小部分植物組織或者個體細(xì)胞中產(chǎn)生胚的方法。體細(xì)胞胚在來源上是克隆的，因此用體細(xì)胞胚增殖可以具有非常高的無性增加速率的潛力，并因此有顯著商業(yè)價值。經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生的再生是植物組織培養(yǎng)的有吸引力的選擇。通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的植株再生比器官分化更穩(wěn)定。使用體細(xì)胞胚再生系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是單細(xì)胞來源，因此再生植株的遺傳性狀較穩(wěn)定。該技術(shù)為東江白頭翁大規(guī)模無性繁殖提供重要的技術(shù)支持，是種質(zhì)資源保存和保護(hù)的一條有效途徑。
[0005]一種東江白頭翁體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0006]將東江白頭翁葉片用自來水沖洗2?4h，然后用洗衣粉仔細(xì)洗滌，再用無菌水沖洗；
[0007]在超凈工作臺上，將上述葉片用添加有0.1% Tween-20的1:3的含L 13-1.53%的次氯酸鈉的84消毒液中浸泡15min，后用無菌蒸餾水清洗3?5次，用消毒過的濾紙吸干表面水分；
[0008]經(jīng)消毒處理的葉片切割成塊狀，用解剖刀片均勻割劃3刀，不切斷葉片，接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期為9周；
[0009]將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)過的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，促進(jìn)了體細(xì)胞胚的萌發(fā)、成熟并形成小植株，新培養(yǎng)基成分與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。
[0010]上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基(Murashigi和skoog 1962)中添加0.05mg/L 口引哚乙酸(IAA)和0.5mg/L的玉米素(ZT)，蔗糖30g/L，瓊脂8.0g/L，并用104kPa大氣壓下121°C高壓蒸汽滅菌20min的0.lmol/L的NaOH或HCl調(diào)至pH為5.8。
[0011]上述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:25± 1°C、16h.d 1光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000 μmol.m 2.s下培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:提供一種東江白頭翁體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植物再生的方法，該方法采用植物組織培養(yǎng)方法，不僅繁殖速度快，而且遺傳性狀一致，同時該方法使植株再生比器官分化更加穩(wěn)定，為東江白頭翁大規(guī)模無性繁殖提供了重要技術(shù)支持，是種質(zhì)資源保存和保護(hù)的一條有效途徑。
【附圖說明】
[0013]圖1所示為本發(fā)明體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程的形態(tài)變化；
[0014]圖2所示為本發(fā)明體細(xì)胞胚發(fā)生過程的組織解剖結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下文將結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
[0016]實(shí)施例1
[0017]1、材料準(zhǔn)備
[0018]材料為野生東江白頭翁，外植體為幼嫩的葉片。
[0019]2、植物材料的表面消毒
[0020]將野外采集的東江白頭翁葉片在自來水中沖洗2?4h，然后用洗衣粉仔細(xì)洗滌，清洗葉片上的灰塵或微生物等物質(zhì)，然后用無菌水沖洗，再移到超凈工作臺上進(jìn)行下一步操作。在添加有0.1% Tween-20的1:3的84消毒液(含1.13-1.53%的次氯酸鈉)中浸泡15min，后用無菌蒸餾水洗3?5次，用消毒過的濾紙吸干表面水分到外植體表面沒有水珠為止，備用。
[0021]3、胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)
[0022]經(jīng)消毒處理的葉片切割成面積為0.5cmX0.5cm的塊狀，用解剖刀片勻割劃3刀，不切斷葉片，接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基(Murashigi和skoog 1962)添加0.05mg/L吲哚乙酸(IAA)和0.5mg/L的玉米素(ZT)，蔗糖30g/L，瓊脂8.0g/L，用在104kPa大氣壓強(qiáng)下121 °C高壓蒸汽滅菌20min的0.lmol/L的NaOH或HCl調(diào)至pH為5.8。培養(yǎng)條件為:25± 10C、16h.(Γ1光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000 μ mol.m _2.s下培養(yǎng)。每處理接種10?15個外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。定期觀察，培養(yǎng)期間為9周。
[0023]4、體細(xì)胞胚的萌發(fā)、成苗
[0024]將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)過的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，促進(jìn)了體細(xì)胞胚的萌發(fā)、成熟并形成小植株，新培養(yǎng)基成分與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。
[0025]5、組織解剖學(xué)觀察
[0026]體細(xì)胞胚發(fā)育用組織解剖學(xué)方法檢測。培養(yǎng)2周、4周、5周的體細(xì)胞胚用FAA (福爾馬林:冰醋酸:乙醇，5: 5: 90 ；v/v)在4°C下固定24h，沖洗后，用梯度乙醇(15%，30%,45%,60%,75%,95% )脫水置換各90min，用95 %酒精置換時過夜，純酒精需換液一次，等量純酒精和二甲苯混合液半小時，純二甲苯(換液一次)半小時；65°C石蠟(McCor-mick, USA)