本發(fā)明涉及中藥組織栽培技術領域，具體來說是一種誘導重樓未成熟合子胚產(chǎn)生體細胞胚的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
重樓為我國云南、四川地區(qū)地道稀缺名貴藥材，是“云南白藥”、“宮血寧”及“季德勝蛇藥片”等中成藥的主要原料，也可直接入藥用于止血、止痛及治療蛇咬、骨折、腮腺炎、腫瘤和免疫失調(diào)等癥。因為極高的藥用價值，重樓需求量每年增長近20％。且重樓種子休眠期長、發(fā)芽率低，資源再生周期長，同時因為巨大的需求量，重樓野生資源的無節(jié)制掠奪式采集現(xiàn)象極其嚴重，這導致了嚴重的重樓資源危機。目前重樓規(guī)模化栽培的有效措施尚未獲得實質(zhì)性進展，重樓每年單株結(jié)實量波動巨大，這也嚴重阻礙了重樓規(guī)?；耘?。因此大規(guī)模的穩(wěn)定生產(chǎn)重樓種苗以滿足制藥工業(yè)化生產(chǎn)迫在眉睫。植物組織培養(yǎng)快繁可以使植株繁殖系數(shù)成倍數(shù)增加，是解決重樓資源短缺的有效方法。傳統(tǒng)重樓組培多以根莖或芽軸為外植體進行培養(yǎng)，目前已報道的重樓愈傷組織誘導發(fā)生率高達43.52％。但是從誘導形成愈傷組織，分化不定芽，誘導生根及最終移栽至土壤成活整個周期歷時580天。同時重樓根莖內(nèi)生菌較多，組培難度大，目前的組培效果并不顯著，其繁殖系數(shù)低。此外隨著繼代次數(shù)的增加，重樓愈傷組織不定芽誘導率不斷降低。因此目前尚無可行的規(guī)?；貥欠N苗繁育技術推廣，探索短期內(nèi)擴大重樓繁育的組培快繁方法以緩解重樓資源需求壓力勢在必行。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種誘導重樓未成熟合子胚產(chǎn)生體細胞胚的組織培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種誘導重樓未成熟合子胚產(chǎn)生體細胞胚的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟包括：
1)取樣及消毒：每年的8-9月，將帶肉質(zhì)種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織后流水清洗后自來水浸泡24小時，在無菌條件下經(jīng)0.1％濃度HgCl2消毒5min后，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質(zhì)種皮，體式解剖顯微鏡下用組培鑷子固定住剝?nèi)シN皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種于pH為5.8的培養(yǎng)基上，20±1℃下持續(xù)暗光培養(yǎng)；
4)胚性組織培養(yǎng)體系建立：培養(yǎng)6個月后，誘導成功的體細胞胚生長至紡錘形后未成熟胚剝離并置于新的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)使其獲得90％誘導成功率的重樓體細胞胚。
進一步的，所述培養(yǎng)基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L。
本發(fā)明適用于包括華重樓(Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara)及云南重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz)的組織培養(yǎng)快繁。
本發(fā)明的有益技術效果是：目前報道的重樓組培以根莖或芽軸為外植體，這類外植體內(nèi)生菌感染概率極大，在加入高濃度的抗生素培養(yǎng)條件下仍有較高的染菌率。本發(fā)明采用重樓種子中未成熟合子胚進行誘導，該方法可以避免內(nèi)生菌感染問題，染菌率極低。目前重樓組培通過誘導根莖或芽軸等外植體產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織經(jīng)誘導分化產(chǎn)生不定芽，再誘導生根后才能得到可大田栽培的完整植株。本發(fā)明誘導的體細胞胚可以直接誘導生成具有根和芽的完整植株，較愈傷組織具有更好的可塑性。通過重樓幼芽等器官誘導的愈傷組織生長緩慢，且藥效成分低于原植物。本發(fā)明獲得的體細胞胚生長分化速度遠高于營養(yǎng)器官誘導的愈傷組織，且具有更高的遺傳穩(wěn)定性，通過體細胞胚誘導生成的重樓植株重樓皂苷組分及含量與原植物相比差異不顯著。本發(fā)明為重樓規(guī)模化種苗繁育提供了重要的技術支撐。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
1)取樣及消毒：所用外植體適取樣時間為8月，重樓果臨近成熟，但果皮尚未開裂時最佳。將重樓整果剪下后剖開，將帶肉質(zhì)種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織后流水清洗后自來水浸泡24小時，在無菌條件下經(jīng)0.1％濃度HgCl2消毒5分鐘后，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下用鑷子將1)中已消毒的種子剝離掉肉質(zhì)種皮，在體式顯微鏡下利用特細的組培鑷子固定住剝?nèi)シN皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳。因胚顏色與胚乳顏色一致，但組織密度存在差異，因此調(diào)試顯微鏡垂直光照強度，可以發(fā)現(xiàn)位于胚乳中的陰影狀未成熟合子胚。利用手術刀片尖端部位沿胚邊緣斜下壓迫擠出完整未成熟胚。
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，瓊脂粉濃度為7.5g/L，蔗糖濃度為30g/L，PH調(diào)制5.8，培養(yǎng)基中不添加生長激素。培養(yǎng)溫度(20±1)℃，光照設置為持續(xù)暗培養(yǎng)。
4)胚性組織培養(yǎng)體系建立：培養(yǎng)6個月后，約35.01％的未成熟胚會分化生產(chǎn)淡黃色卵圓形胚性組織，該組織即為體細胞胚。卵圓形胚性組織繼續(xù)縱向生長形成紡錘型單體組織，將這類組織剝離，置于新的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2個月后，超過90％的紡錘形胚性組織會繼續(xù)產(chǎn)生淡黃色卵圓形胚性組織。
實施例2
1)取樣及消毒：每年的9月，將帶肉質(zhì)種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織后流水清洗后自來水浸泡24小時，在無菌條件下經(jīng)0.1％濃度HgCl2消毒5min后，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質(zhì)種皮，用組培鑷子固定住剝?nèi)シN皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種于pH為5.8的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L)上，19℃下持續(xù)暗光培養(yǎng)；
4)胚性組織培養(yǎng)體系建立：培養(yǎng)6個月后，培養(yǎng)6個月后，將誘導獲得的體細胞胚剝離置于新的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)使其90％的紡錘形胚性組織產(chǎn)生淡黃色卵圓形胚性組織。
實施例3
1)取樣及消毒：每年的8月，將帶肉質(zhì)種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織后流水清洗后自來水浸泡24小時，在無菌條件下經(jīng)0.1％濃度HgCl2消毒5min后，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質(zhì)種皮，用組培鑷子固定住剝?nèi)シN皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種于pH為5.8的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L)上，21℃下持續(xù)暗光培養(yǎng)；
4)胚性組織培養(yǎng)體系建立：培養(yǎng)6個月后，將誘導獲得的體細胞胚剝離置于新的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)使其90％的紡錘形胚性組織產(chǎn)生淡黃色卵圓形胚性組織。
本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。