本發(fā)明涉及一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參皂苷的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人參皂苷是五加科人參屬植物（人參、西洋參、三七等）的主要藥效成分，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、降血糖等多種藥理作用。目前從人參中分離的人參皂苷超過(guò)150種，它們大體上可分為兩類：常見(jiàn)人參皂苷和稀有人參皂苷，其中常見(jiàn)人參皂苷是指在人參屬植物中含量較高、分離純化相對(duì)容易的人參皂苷，主要有原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和原人參三醇型人參皂苷Re、Rg1、Rg2等。稀有人參皂苷多為常見(jiàn)人參皂苷脫去部分糖基或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改變的次級(jí)人參皂苷，這些皂苷在人參屬植物中含量極低或不存在，主要有人參皂苷Rh1、Rh2、Rh3、Rg3、Rg5、Rg6、Rk1、Rk3、Rh4、F4、CK等。近年來(lái)的多項(xiàng)研究表明，稀有人參皂苷在抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞以及清除自由基等生物活性方面較常見(jiàn)人參皂苷具有更高的藥理活性。如人參皂苷CK是公認(rèn)的一種具有良好的生物學(xué)活性的潛在的多功能藥物，它具有抗過(guò)敏、降血糖、抗腫瘤、抗炎，抗衰老及保肝等效果。人參皂苷Rg3具有一定的抗腫瘤效果，這種抗腫瘤效果不僅僅是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還表現(xiàn)出對(duì)腫瘤組織新生血管的抑制作用，現(xiàn)在臨床上已經(jīng)有一類新藥“人參皂苷”作為肝癌和肺癌的輔助用藥進(jìn)行應(yīng)用。人參皂苷Rh2也具有良好的抗腫瘤效果和增強(qiáng)免疫力等生物學(xué)活性。
隨著稀有人參皂苷新的生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，如何快速、高效的獲得稀有人參皂苷成為目前人參皂苷研究的熱點(diǎn)之一。目前生產(chǎn)稀有人參皂苷方法主要有化學(xué)法（酸、堿水解）、高溫裂解法、微生物轉(zhuǎn)化法以及酶催化法等?；瘜W(xué)法條件比較苛刻，反應(yīng)過(guò)程不易控制，副產(chǎn)物較多，目標(biāo)產(chǎn)物收率很低，后處理比較繁瑣；高溫裂解法耗能，對(duì)設(shè)備等要求高，反應(yīng)過(guò)程中對(duì)母環(huán)的破壞較為嚴(yán)重；微生物轉(zhuǎn)化法和酶催化法反應(yīng)條件溫和，專一性較強(qiáng)，屬于技術(shù)含量較高的兩種方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的能催化轉(zhuǎn)化生成稀有人參皂苷的酶主要有纖維素酶、柚苷酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶等，催化的原料一般為從中藥材中提取的混合皂苷，但催化效率不高，很難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參皂苷的方法，該方法通過(guò)合理選擇離子液體介質(zhì)，使用幾種工業(yè)化酶的混合配比，酶轉(zhuǎn)化條件控制工藝。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：
一種酶催化二醇組人參皂苷大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參皂苷的方法，其將二醇組人參皂苷加至離子液體中，再加入酶制劑進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物經(jīng)洗滌、萃取、再分離純化得到稀有人參皂苷；
所述的酶制劑選自纖維素酶、柚苷酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶中任意兩種或兩種以上組合。
所述稀有人參皂苷為人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh2、人參皂苷CK或原人參二醇。
所述的二醇組人參皂苷含有人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra2、人參皂苷Ra3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc或人參皂苷Rd。
所述的二醇組人參皂苷濃度范圍是50g/L~500g/L，含量≥85%。
所述的離子液體選自1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸鹽、1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸鹽、１-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、１-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽。
所述反應(yīng)器的有效容積為50L~500L；催化轉(zhuǎn)化溫度為25℃~50℃；反應(yīng)時(shí)間為24h~120h。
產(chǎn)物經(jīng)離心洗滌后，用有機(jī)溶劑萃取獲得皂苷，有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、正丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、三氯甲烷。所述的再分離純化工藝為采用工業(yè)化制備色譜柱進(jìn)行梯度洗脫分離。
本發(fā)明利用酶制劑在離子液體介質(zhì)中對(duì)二醇組人參皂苷（人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra2、人參皂苷Ra3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd等）進(jìn)行催化水解，大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參皂苷。發(fā)明人利用離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行稀有人參皂苷的酶促轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化效率得到大幅度提高。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明方法主要包括以下四步：（1）原料準(zhǔn)備：將二醇組人參皂苷（人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra2、人參皂苷Ra3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd等，含量≥85%）溶解于離子液體中，然后投入可控溫反應(yīng)釜（夾套水浴加熱）中，通N2，通氣流量為反應(yīng)釜有效容積量的（50%~200%）/min，持續(xù)1min~5min。
（2）酶制劑的制備：取纖維素酶、柚苷酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶中兩種或兩種以上，以一定的比例組成酶制劑，待反應(yīng)釜內(nèi)溫度降至常溫后投入反應(yīng)釜中，其中酶的總濃度在50g/L~200g/L之間。
（3）轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為25℃~50℃，攪拌速度為100rpm~360rpm，在相應(yīng)的條件下催化反應(yīng)24h~120h。
（4）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化：由于產(chǎn)物稀有人參皂苷不易溶于水，溶于乙酸乙酯、正丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，并且產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率較高。可以先將轉(zhuǎn)化液離心過(guò)濾后收集沉淀，將沉淀用磷酸緩沖液清洗數(shù)次，再加入水與有機(jī)溶液不同比例的混合液進(jìn)行萃取，萃取2~3次后合并收集有機(jī)相，減壓濃縮至原體積的1/10~1/20，用制備型的色譜柱進(jìn)行分離純化?？梢缘玫郊兌?5%以上的人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh2、人參皂苷CK和原人參二醇四種稀有人參皂苷。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，需要指出的是，以下所有實(shí)施例并不以任何方式限定本發(fā)明的權(quán)利要求和核心內(nèi)容。
實(shí)施例1
將有效容積為50L的反應(yīng)釜中加入體積為30L離子液體1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸鹽，再加入1.5kg含量為86.1%的二醇組人參皂苷（雜質(zhì)主要為多糖），通N2，通氣流量為25L/min，持續(xù)5min。降溫至室溫以下后，加入纖維素酶/果膠酶為1:1的酶制劑3kg。保持反應(yīng)釜溫度為25℃，攪拌速度為100rpm，催化反應(yīng)120h。反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水：乙酸乙酯為2:5的溶液進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取2次，收集有機(jī)相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/20。用制備柱進(jìn)行分離純化。分離得到四種稀有人參皂苷：人參皂苷Rg3，純度95.2%；人參皂苷Rh2，純度95.7%；人參皂苷CK，純度96.3%；原人參二醇，純度95.7%，總皂苷轉(zhuǎn)化率為70%。
對(duì)比實(shí)例：與實(shí)施例1類似，不同的是離子液體1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸鹽用等體積水代替，總皂苷轉(zhuǎn)化率僅為42%。
實(shí)施例2
將有效容積為100L的反應(yīng)釜中加入體積為60L離子液體1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸鹽，再加入30kg含量為85.3%的二醇組人參皂苷（雜質(zhì)主要為多糖），通N2，通氣流量為200L/min，持續(xù)1min。降溫至室溫以下后，加入纖維素酶/糖化酶為1:1的酶制劑12kg。保持反應(yīng)釜溫度為30℃，攪拌速度為360rpm，催化反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水：丁酸乙酯為2:5的溶液進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取3次，收集有機(jī)相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/12。用制備柱進(jìn)行分離純化。分離得到四種稀有人參皂苷：人參皂苷Rg3，純度95.5%；人參皂苷Rh2，純度96.1%；人參皂苷CK，純度95.9%；原人參二醇，純度96.0%，總皂苷轉(zhuǎn)化率為70%。
對(duì)比實(shí)例：與實(shí)施例2類似，不同的是離子液體1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸鹽用等體積水代替，總皂苷轉(zhuǎn)化率僅為45%。
實(shí)施例3
將有效容積為200L的反應(yīng)釜中加入體積為120L離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，再加入24kg含量為88.1%的二醇組人參皂苷（雜質(zhì)主要為多糖），通N2，通氣流量為160L/min，持續(xù)4min。降溫至室溫以下后，加入柚苷酶/果膠酶酶為1:1的酶制劑36kg。保持反應(yīng)釜溫度為37℃，攪拌速度為180rpm，催化反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水：乳酸乙酯為2:5的溶液進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取2次，收集有機(jī)相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/15。用制備柱進(jìn)行分離純化。分離得到四種稀有人參皂苷：人參皂苷Rg3，純度95.7%；人參皂苷Rh2，純度95.4%；人參皂苷CK，純度96.2%；原人參二醇，純度95.3%，總皂苷轉(zhuǎn)化率為75%。
對(duì)比實(shí)例：與實(shí)施例3類似，不同的是離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽用等體積水代替，總皂苷轉(zhuǎn)化率僅為46%。
實(shí)施例4
將有效容積為300L的反應(yīng)釜中加入體積為180L離子液體１１-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，再加入54kg含量為89.0%的二醇組人參皂苷（雜質(zhì)主要為多糖），通N2，通氣流量為300L/min，持續(xù)3min。降溫至室溫以下后，加入纖維素酶/淀粉酶為1:1的酶制劑54kg。保持反應(yīng)釜溫度為42℃，攪拌速度為200rpm，催化反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水：正丁醇為2:5的溶液進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取3次，收集有機(jī)相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/18。用制備柱進(jìn)行分離純化。分離得到四種稀有人參皂苷：人參皂苷Rg3，純度95.1%；人參皂苷Rh2，純度96.4%；人參皂苷CK，純度96.1%；原人參二醇，純度95.4%，總皂苷轉(zhuǎn)化率為75%。
實(shí)施例5
將有效容積為500L的反應(yīng)釜中加入體積為300L離子液體１-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，再加入120kg含量為89.6%的二醇組人參皂苷（雜質(zhì)主要為多糖），通N2，通氣流量為750L/min，持續(xù)2min。降溫至室溫以下后，加入果膠酶/纖維素酶為1:2的酶制劑60kg。保持反應(yīng)釜溫度為50℃，攪拌速度為300rpm，催化反應(yīng)60h。反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，加入磷酸緩沖液洗滌數(shù)次，再向沉淀中加入水：三氯甲烷為2:5的溶液進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取3次，收集有機(jī)相萃取液，減壓濃縮至原體積的1/10。用制備柱進(jìn)行分離純化。分離得到四種稀有人參皂苷：人參皂苷Rg3，純度95.6%；人參皂苷Rh2，純度95.1%；人參皂苷CK，純度95.5%；原人參二醇，純度96.0%，總皂苷轉(zhuǎn)化率為75%。