本發(fā)明涉及多肽提取的技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種從酒糟中提取多肽的方法。
背景技術(shù)：
酒糟，又名紅糟、酒醅糟、粕等等，是米、麥、高梁等釀酒后剩余的殘?jiān)＞圃阒泻胸S富的蛋白質(zhì)，是一種很高的蛋白質(zhì)的來源。長期以來，大多數(shù)廠家主要是將濕糟作為粗飼料直接低價(jià)出售，其收益甚微；有少數(shù)廠家則是將啤酒糟直接排放，不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，還導(dǎo)致資源的浪費(fèi)。因此開發(fā)綜合利用啤酒糟成為研究人員的重要任務(wù)。
多肽是是氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。人體很多活性物質(zhì)都是以肽的形式存在的。肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長和生殖各領(lǐng)域，其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)和細(xì)胞的生理功能，激活體內(nèi)有關(guān)酶系，促進(jìn)中間代謝膜的通透性，或通過控制DNA轉(zhuǎn)錄或影響特異的蛋白合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。肽是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)。肽可以合成細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能活動(dòng)。肽在人體作為神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞信息。肽可在人體作為運(yùn)輸工具，將人體所食的各種營養(yǎng)物質(zhì)與各種維生素、生物素、鈣及對人體有益的微量元素輸送到人體各細(xì)胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物，它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能，增強(qiáng)和發(fā)揮人體生理活性，它具有重要的生物學(xué)功能。肽對人的細(xì)胞活性、功能活動(dòng)、生命存在太重要了。但現(xiàn)代人因各種因素使人體中的肽流失、損失，合成肽的能力大大減弱，因此現(xiàn)代人體缺乏肽，必須補(bǔ)充人工合成肽，補(bǔ)肽就是補(bǔ)活性，補(bǔ)肽就是補(bǔ)活力，補(bǔ)肽就是補(bǔ)生命。
從粕中提取多肽，在近年來得出現(xiàn)了一些報(bào)道。例如中國專利CN101736065A一種利用啤酒麥糟制備多肽的方法。該方法是將濕啤酒糟進(jìn)行干燥、粉碎和過篩，得到啤酒糟；加入抽提劑，室溫下攪拌，過濾去渣，離心，得到蛋自提取液；調(diào)節(jié)pH4.0～5.0進(jìn)行沉淀，去上清液，真空冷凍干燥，得到粗多肽；在啤酒糟粗蛋白中加入磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.5～8.5；加入Alcalase堿性蛋白酶，加熱至45～65℃，在攪拌條件下水解1～5h；水解完畢之后，于沸水浴滅酶，離心；取離心后的上清液用凝膠柱分離，分別收集各峰后濃縮，冷凍干燥，得到活性多膚。本法未引入有害物質(zhì)，產(chǎn)品取自天然，來源廣泛，使所得天然活性物質(zhì)經(jīng)體外試驗(yàn)表明具有明顯的降血糖活性。
盡管如此，但以上現(xiàn)有技術(shù)中從油粕中制取多肽的得率都較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明在于提供一種從酒糟提取多肽的方法，該方法所提取的多肽具有較高的得率。
一種從酒糟中提取多肽的方法，包括以下步驟：
(1)將酒糟進(jìn)行脫脂；
(2)將經(jīng)步驟(1)處理的酒糟中提取水溶性蛋白；
(3)將經(jīng)步驟(2)處理所殘留的酒糟采用由里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌所組成的混合菌進(jìn)行發(fā)酵；
(4)將經(jīng)步驟(2)所提取的水溶性蛋白和經(jīng)步驟(3)處理殘留的酒糟在在蛋白酶下酶解。
進(jìn)一步地，步驟(3)中所述里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌以菌液的形式加入，里氏木霉菌液、解淀粉芽孢桿菌液、枯草芽孢桿菌液、巴氏地衣芽孢桿菌液體積之比為1：0.5～0.8：：2～3：：1～2，所述里氏木霉菌菌液的活菌數(shù)為3×1010～5×1010cfu/ml，解淀粉芽孢桿菌的活菌數(shù)為2×1010～4×1010cfu/ml，枯草芽孢桿菌液的活菌數(shù)為4×1010～6×1010cfu/ml，巴氏地衣芽孢桿菌液的活菌數(shù)為3×1010～5×1010cfu/ml。
進(jìn)一步地，步驟(3)中所述發(fā)酵的溫度為45～55℃，發(fā)酵的時(shí)間為36～72h。
進(jìn)一步地，步驟(3)中所述發(fā)酵的pH為4.5～5.5。
進(jìn)一步地，步驟(3)中所述發(fā)酵在有氧條件下進(jìn)行，氧氣通入量為0.3～0.6vvm。
進(jìn)一步地，步驟(2)中所述提取水溶性蛋白的包括：
將酒糟采用堿液溶解于醇水溶液以沉降出固體，得到濾液；
將所述濾液采用400～600目濾膜進(jìn)行濃縮，再使用400～600目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；
將固體組分溶于水，而后離心。
進(jìn)一步地，所述醇水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50～80wt％。
進(jìn)一步地，所述堿液的加入量為以pH為8～13的用量。
進(jìn)一步地，所述過濾在加入酸液的條件下進(jìn)行，所述酸液的加入量為使pH為2～6的用量。
進(jìn)一步地，所述酶解在堿性條件下進(jìn)行。
本發(fā)明從酒糟提取多肽的方法中，于蛋白酶酶解之前采用里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌的混合菌進(jìn)行發(fā)酵，可將酒糟中的木質(zhì)纖維和半纖維等降解為多糖等小分子，從而避免了纖維素和半纖維對蛋白質(zhì)的束縛，增大蛋白質(zhì)與蛋白酶的充分接觸，提高蛋白質(zhì)的酶解效果，保證了得率。
具體實(shí)施方式
為了便于理解本發(fā)明，下面合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
如本文所用，術(shù)語：
“質(zhì)量份”指表示多個(gè)組分的質(zhì)量比例關(guān)系的基本計(jì)量單位，1份可表示任意的單位質(zhì)量，如可以表示為1g，也可表示2.689g等。假如我們說A組分的質(zhì)量份為a份，B組分的質(zhì)量份為b份，則表示A組分的質(zhì)量和B組分的質(zhì)量之比a：b?；蛘叩?，表示A組分的質(zhì)量為aK，B組分的質(zhì)量為bK(K為任意數(shù)，表示倍數(shù)因子)。不可誤解的是，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的是，所有組分的質(zhì)量份之和并不受限于100份之限制。
“一個(gè)”、“一種”和“所述”可交換使用并指一個(gè)或多個(gè)。
“和/或”用于表示所說明的情況的一者或兩者均可能發(fā)生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
另外，本文中由端點(diǎn)表述的范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)值(例如，1至10包括1.4、1.9、2.33、5.75、9.98等)。
另外，本文中“至少一個(gè)”的表述包括一個(gè)及以上的所有數(shù)目(例如，至少2個(gè)、至少4個(gè)、至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)等)。
本發(fā)明從酒糟中提取多肽的方法，包括以下步驟：
(1)將酒糟進(jìn)行脫脂；
(2)將經(jīng)步驟(1)處理的酒糟中提取水溶性蛋白；
(3)將經(jīng)步驟(2)處理所殘留的酒糟采用由里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌所組成的混合菌進(jìn)行發(fā)酵；
(4)將經(jīng)步驟(2)所提取的水溶性蛋白和經(jīng)步驟(3)處理殘留的酒糟在在蛋白酶下酶解。
本發(fā)明的上述方法所針對的酒糟可以為一切形式的酒糟，例如啤酒糟和黃酒。
上述發(fā)酵所采用的菌種，系由里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌所組成的混合菌。此處，這些菌種的具體亞種或菌株的類型不作限定。對混合菌的加入形式不加限定，例如可以使用經(jīng)培養(yǎng)后所得菌液添加，也可以將菌株在添加氮源等營養(yǎng)成分的條件下直接接種到該待發(fā)酵的原料中。上述菌液可采用常規(guī)的種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件方法來獲得。可列舉出一種種子培養(yǎng)基的成分，即每升含木糖30～50克，酵母粉5～10克，玉米漿干粉5～15克，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉2～6克，氯化鉀1～2克，硫酸鎂0.2克，余量為水，pH為6～7，于115℃滅菌20分鐘。應(yīng)當(dāng)知道的是，菌液加到待發(fā)酵的原料后，可加入發(fā)酵基，發(fā)酵基的成分可類似于上述培養(yǎng)基，發(fā)酵基所含氮源為酵母粉5～20克、蛋白陳5～20克、玉米漿干粉5～20克、大豆膚5～20克、大豆蛋白陳5～20克五種氮源中的至少一種，還可輔助地含有初糖量不少于500克/升，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉1～6克，氯化鉀2克，硫酸鎂0.2克，其余為水，pH為6～70，于115℃滅菌20分鐘。類推地，對于上述將菌株在添加氮源等營養(yǎng)成分的條件下直接接種到該待發(fā)酵的原料，這里的氮源、營養(yǎng)成分可采用上述相同的，在此不再贅述。
前述菌液中，較好地，里氏木霉菌液、解淀粉芽孢桿菌液、枯草芽孢桿菌液、巴氏地衣芽孢桿菌液體積之比為1：0.5～0.8：2～3：1～2，例如1：0.5：2：1、1：0.55：2.1：1.1、1：0.60：2.3：1.2、1：0.60：2.2：1.5、1：0.65：2.5：1.5、1：0.70：2.8：1.8、1：0.75：2.95：1.95、1：0.80：3.0：2等。這里，里氏木霉菌菌液的活菌數(shù)以3×1010～5×1010cfu/ml為宜，例如3×1010、3.2×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、4.8×1010或6×1010等；解淀粉芽孢桿菌液的活菌數(shù)2×1010～4×1010cfu/ml，例如2×1010、2.2×1010、2.5×1010、3×1010、3.4×1010、3.6×1010、3.8×1010或4×1010等；枯草芽孢桿菌液的活菌數(shù)為4×1010～6×1010cfu/ml，例如4×1010、4.2×1010、4.5×1010、5×1010、5.4×1010、5.6×1010、5.8×1010或6×1010；巴氏地衣芽孢桿菌液的活菌數(shù)為3×1010～5×1010cfu/ml，例如3×1010、3.2×1010、3.5×1010、4×1010、4.4×1010、4.6×1010、4.8×1010或5×1010。當(dāng)然上述四種菌液的活菌數(shù)若過大或過小也可實(shí)施本方案，在影響到發(fā)酵產(chǎn)物及發(fā)酵時(shí)間等。應(yīng)當(dāng)知曉的是，cfu為菌落形成單位(Colony-Forming Units)指單位體積中的細(xì)菌群落總數(shù)，在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，稱為菌落形成單位，以其表達(dá)活菌的數(shù)量。
作為本發(fā)明的發(fā)酵中，其溫度較好地為45～55℃，例如45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54.5℃、55℃。已為本領(lǐng)域所熟知的是，根據(jù)目標(biāo)微生物的繁殖情況，可將發(fā)酵階段分為第一發(fā)酵階段(繁殖增大期)和第二發(fā)酵階段(穩(wěn)定期)兩個(gè)階段。在第一發(fā)酵階段，其溫度可以控制在45～55℃；在第二發(fā)酵階段，其溫度可以控制在48～52℃。本發(fā)明中的混合發(fā)酵菌，具有上述較高的發(fā)酵溫度，高于雜菌通常的繁殖代謝溫度，從而避免了因選用其它可分解木質(zhì)纖維素的微生物所導(dǎo)致的發(fā)酵雜質(zhì)較多難去除等問題。于上述發(fā)酵溫度下，發(fā)酵的時(shí)間以36～72h，例如36h、38h、43h、50h、60h、65h、68h或70h等。
作為本發(fā)明的發(fā)酵酸堿度環(huán)境，其pH較佳地為4.5～5.5，例如4.5、4.6、4.8、5、5.2或5.5?？梢岳斫獾氖牵{(diào)節(jié)pH的試劑有很多，譬如硫酸、磷酸等常見酸，以及氫氧化鈉、強(qiáng)氧化鉀等常見堿。
由于上述里氏木霉菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏地衣芽孢桿菌可以在有氧及無氧的環(huán)境下都可生長。因而，本發(fā)明不對發(fā)酵的有氧或無氧做特別限定，不過為了將木質(zhì)纖維素降解為更小的分子，其采用有氧條件下進(jìn)行。氧氣通入量可參考為0.3～0.6vvm，例如0.3vvm、0.35vvm、0.4vvm、0.45vvm、0.5vvm、0.55vvm、0.58vvm或0.6vvm。作為發(fā)酵領(lǐng)域較為常見的術(shù)語，vvm為通氣比，指每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值(air volume/culture volume/min)，通氣比＝通氣速率(單位：立方米/分鐘)/發(fā)酵液體積(單位：立方米)。
值得補(bǔ)充的是，前述“經(jīng)發(fā)酵處理的酒糟”指發(fā)酵產(chǎn)物，既包括發(fā)酵后的固體殘?jiān)舶òl(fā)酵液，而不是單純地指固體殘?jiān)．?dāng)然，這里發(fā)酵產(chǎn)物可以經(jīng)過固液相分離，分別對液相采用公知的方法對水溶性蛋白提取，對固相可以直接進(jìn)行酶解。除此，也可不對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行固液相分離，直接進(jìn)行酶解。
為了提高混合菌對其中的木質(zhì)纖維素的發(fā)酵，可較好地將待發(fā)酵原料進(jìn)行預(yù)處理。例如，稀酸或稀堿處理。具體地，可在pH為4～5的酸下浸漬4～10h。采用酸或堿處理，可以使得降低木質(zhì)纖維素的交聯(lián)化，打斷其分子的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有助于微生物的更好分解。除此，預(yù)處理還可以通過高溫蒸汽蒸的處理。
作為本發(fā)明的脫脂，其可采用本領(lǐng)域通用的用溶劑溶取的方式。這些有機(jī)溶劑可列舉出丙酮、石油醚、正已烷烴、乙醇、乙酸乙酯等一種或任意組合等。以石油醚和乙醇為例，可先采用石油醚進(jìn)行溶取，再采用乙醇溶取。石油醚溶取可采用索氏提取器在常溫下進(jìn)行為0.5～1.5h，石油醚的用量為8～12ml，以待脫脂的固體質(zhì)量為1g計(jì)；乙醇溶取可采用索氏提取器在常溫下進(jìn)行為0.5～1h，乙醇的用量為6～10ml(其為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70～90％的乙醇水溶液)，以待脫脂的固體質(zhì)量為1g計(jì)。上述有機(jī)溶劑溶取后，再烘干有機(jī)溶劑。
本發(fā)明中脫脂優(yōu)選為采用磷脂酶和脂肪酶進(jìn)行酶解。酶解避免了采用上述有機(jī)溶劑溶取方式的脫脂所導(dǎo)致的對環(huán)境的污染，以及后期對有機(jī)溶劑回收的麻煩，更重要的是，酶解的轉(zhuǎn)化率較高。本發(fā)明不對脂肪酶和磷脂酶的具體種類做特別限定，例如可采用天津諾奧酶制劑有限公司所生產(chǎn)的。
磷脂酶和脂肪酶的用量不做特別嚴(yán)苛的規(guī)定，但較好地，磷脂酶可為占待脫脂的油牡丹粕質(zhì)量的0.3～3‰，例如0.3‰、0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、2.8‰或3‰。脂肪酶可占待脫脂的油牡丹粕質(zhì)量的0.2～2‰，例如0.2‰、0.5‰、1‰、1.5‰、1.8‰、1.9‰或0.2‰。該兩種酶過多，不會(huì)帶來轉(zhuǎn)化率的顯著提高；過少則會(huì)影響脂類的轉(zhuǎn)化率。
脫脂的酶解的較好的溫度為30～40℃，例如30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃。于上述酶用量及酶解的溫度前提下，酶解的時(shí)間為較佳為0.5～5h，例如0.5h、0.75h、1h、2h、3h、4h、4.5h、5h或5h等。
步驟(2)中水溶性蛋白的提取方法很多，可采用公知的植物蛋白提取方法，例如水溶法和/或溶劑法。提取蛋白的次數(shù)可根據(jù)提取效果選擇。水溶法指以水為溶劑，主要包括預(yù)處理、水溶、離心處理等?？闪信e出一種水溶法提取蛋白的實(shí)例：首先將待提取原料在50℃下浸泡3～6h，可按照1g/5ml加入水，再加3mol/L氫氧化鈉堿溶液調(diào)pH至8.5左右，在3500rpm下離心15min，再將上層清液用3mol/L檸檬酸，調(diào)pH至4.5，在3500rpm下離心15min，對得到的沉淀進(jìn)行冷凍干燥。
為了提高水性形蛋白的提取率，本發(fā)明中提取水溶性蛋白可以包括：將酒糟采用堿液溶解于醇水溶液以沉降出固體，得到濾液；將該濾液采用400～600目濾膜進(jìn)行濃縮，再使用400～600目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；最后將固體組分溶于水，而后離心。
此處，醇水溶液中醇可以為乙醇、甲醇、異丙醇等。醇水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50～80wt％，例如50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、78wt％、79wt％或80wt％等。
此處，堿液的用量以pH為8～13的用量為佳，如pH為8、8.5、9、10、11、12、12.5或13等。
上述過濾在加入酸液的條件下進(jìn)行。其中，酸液的加入量可以為使pH為2～6的用量，如pH為2、2.3、2.5、3、4、4.5、5、5.5或6等。
此處，濃縮的體積不做限定，例如可以濃縮至原體積的5～10％。
上述步驟(4)中，酶解可以在堿性條件下進(jìn)行。例如其堿性的pH可為7～8。堿性酶解的蛋白酶可采用常規(guī)的蛋白酶，如堿性蛋白酶，即絲氨酸蛋白酶，可以為Novo蛋白酶或Carsberg蛋白酶，當(dāng)然還可以為Alcalase堿性蛋白酶等。至于酶解的溫度以及時(shí)間可以根據(jù)蛋白酶的種類作常規(guī)調(diào)整，于此不詳述。
步驟(1)之前還包括對酒糟進(jìn)行粉碎。粉粹可以至20～30目粒度，所述粉碎采用超微粉粉碎或超聲波粉碎。
以上未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。
實(shí)施例1
步驟一、將濕酒糟進(jìn)行真空冷凍干燥并粉碎。
步驟二、脫脂。用有機(jī)溶劑清洗(如丙酮)對上述粉碎的渣進(jìn)行清洗2-3次即可，風(fēng)干。
步驟三、水溶性蛋白提取。將酒糟采用堿液溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80wt％的乙醇醇水溶液，堿液的加入保持pH為13，以離心分離沉降出固體，得到濾液。再將該濾液采用600目濾膜進(jìn)行濃縮至原體積的10％，再加入酸液調(diào)節(jié)其pH為6，使用600目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；將固體組分溶于水，而后離心，將固相干燥。
步驟四、上述固體加入發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入體積之比為1：0.5：3：1的里氏木霉菌液(活菌數(shù)為3×1010fu/ml)、解淀粉芽孢桿菌液(活菌數(shù)為4×1010cfu/ml)、枯草芽孢桿菌液(活菌數(shù)為6×1010)、巴氏地衣芽孢桿菌液(活菌數(shù)為3×1010cfu/ml)。向發(fā)酵罐中通入0.3vvm的氧氣，控制pH為4.5，在45℃下發(fā)酵72h，分離出發(fā)酵殘?jiān)桶l(fā)酵液。發(fā)酵液中可能的蛋白進(jìn)行采用公知的方法進(jìn)行提取，固體保留以備用。
步驟五、所得固體中加入緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至堿性。
步驟六、加入公知的堿性蛋白酶，水解得到水解液。
步驟八、將所得多肽液用Sephadex G15凝膠柱分離并脫鹽，分離條件為：上樣量5ml，洗脫液為蒸餾水，流速3.0mL/min，收集洗脫時(shí)間33min～53min內(nèi)組分，濃縮，冷凍真空干燥，得到活性多肽。
實(shí)施例2
步驟一、將濕酒糟進(jìn)行真空冷凍干燥并粉碎。
步驟二、脫脂。用有機(jī)溶劑清洗(如丙酮)對上述粉碎的渣進(jìn)行清洗2-3次即可，風(fēng)干。
步驟三、水溶性蛋白提取。將酒糟采用堿液溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50wt％的乙醇醇水溶液，堿液的加入保持pH為8，以離心分離沉降出固體，得到濾液。再將該濾液采用400目濾膜進(jìn)行濃縮至原體積的5％，再加入酸液調(diào)節(jié)其pH為2，使用40000目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；將固體組分溶于水，而后離心，將固相干燥。
步驟四、上述固體加入發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入體積之比為1：0.8：3：1的里氏木霉菌液(活菌數(shù)為5×1010fu/ml)、解淀粉芽孢桿菌液(活菌數(shù)為2×1010cfu/ml)、枯草芽孢桿菌液(活菌數(shù)為6×1010)、巴氏地衣芽孢桿菌液(活菌數(shù)為3×1010cfu/ml)。向發(fā)酵罐中通入0.3vvm的氧氣，控制pH為4.5，在55℃下發(fā)酵36h，分離出發(fā)酵殘?jiān)桶l(fā)酵液。發(fā)酵液中可能的蛋白進(jìn)行采用公知的方法進(jìn)行提取，固體保留以備用。
步驟五、所得固體中加入緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至堿性。
步驟六、加入公知的堿性蛋白酶，水解得到水解液。
步驟八、將所得多肽液用Sephadex G15凝膠柱分離并脫鹽，分離條件為：上樣量5ml，洗脫液為蒸餾水，流速3.0mL/min，收集洗脫時(shí)間33min～53min內(nèi)組分，濃縮，冷凍真空干燥，得到活性多肽。
實(shí)施例3
步驟一、將濕酒糟進(jìn)行真空冷凍干燥并粉碎。
步驟二、脫脂。用有機(jī)溶劑清洗(如丙酮)對上述粉碎的渣進(jìn)行清洗2-3次即可，風(fēng)干。
步驟三、水溶性蛋白提取。將酒糟采用堿液溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60wt％的乙醇醇水溶液，堿液的加入保持pH為10，以離心分離沉降出固體，得到濾液。再將該濾液采用400目濾膜進(jìn)行濃縮至原體積的10％，再加入酸液調(diào)節(jié)其pH為2，使用400目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；將固體組分溶于水，而后離心，將固相干燥。
步驟四、上述固體加入發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入體積之比為1：0.8：3：2的里氏木霉菌液(活菌數(shù)為5×1010fu/ml)、解淀粉芽孢桿菌液(活菌數(shù)為3×1010cfu/ml)、枯草芽孢桿菌液(活菌數(shù)為6×1010)、巴氏地衣芽孢桿菌液(活菌數(shù)為5×1010cfu/ml)。向發(fā)酵罐中通入0.3vvm的氧氣，控制pH為5，在50℃下發(fā)酵48h，分離出發(fā)酵殘?jiān)桶l(fā)酵液。發(fā)酵液中可能的蛋白進(jìn)行采用公知的方法進(jìn)行提取，固體保留以備用。
步驟五、所得固體中加入緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至堿性。
步驟六、加入公知的堿性蛋白酶，水解得到水解液。
步驟八、將所得多肽液用Sephadex G15凝膠柱分離并脫鹽，分離條件為：上樣量5ml，洗脫液為蒸餾水，流速3.0mL/min，收集洗脫時(shí)間33min～53min內(nèi)組分，濃縮，冷凍真空干燥，得到活性多肽。
實(shí)施例4
步驟一、將濕酒糟進(jìn)行真空冷凍干燥并粉碎。
步驟二、脫脂。用有機(jī)溶劑清洗(如丙酮)對上述粉碎的渣進(jìn)行清洗2-3次即可，風(fēng)干。
步驟三、水溶性蛋白提取。將酒糟采用堿液溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60wt％的乙醇醇水溶液，堿液的加入保持pH為10，以離心分離沉降出固體，得到濾液。再將該濾液采用500目濾膜進(jìn)行濃縮至原體積的8％，再加入酸液調(diào)節(jié)其pH為3，使用500目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；將固體組分溶于水，而后離心，將固相干燥。
步驟四、上述固體加入發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入體積之比為1：0.8：2.5：1.5的里氏木霉菌液(活菌數(shù)為4×1010fu/ml)、解淀粉芽孢桿菌液(活菌數(shù)為2×1010cfu/ml)、枯草芽孢桿菌液(活菌數(shù)為4×1010cfu/ml)、巴氏地衣芽孢桿菌液(活菌數(shù)為4×1010cfu/ml)。向發(fā)酵罐中通入0.3vvm的氧氣，控制pH為5，在50℃下發(fā)酵48h，分離出發(fā)酵殘?jiān)桶l(fā)酵液。發(fā)酵液中可能的蛋白進(jìn)行采用公知的方法進(jìn)行提取，固體保留以備用。
步驟五、所得固體中加入緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至堿性。
步驟六、加入公知的堿性蛋白酶，水解得到水解液。
步驟八、將所得多肽液用Sephadex G15凝膠柱分離并脫鹽，分離條件為：上樣量5ml，洗脫液為蒸餾水，流速3.0mL/min，收集洗脫時(shí)間33min～53min內(nèi)組分，濃縮，冷凍真空干燥，得到活性多肽。
實(shí)施例5
步驟一、將濕酒糟進(jìn)行真空冷凍干燥并粉碎。
步驟二、脫脂。用有機(jī)溶劑清洗(如丙酮)對上述粉碎的渣進(jìn)行清洗2-3次即可，風(fēng)干。
步驟三、水溶性蛋白提取。將酒糟采用堿液溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60wt％的乙醇醇水溶液，堿液的加入保持pH為10，以離心分離沉降出固體，得到濾液。再將該濾液采用500目濾膜進(jìn)行濃縮至原體積的8％，再加入酸液調(diào)節(jié)其pH為3，使用500目濾膜進(jìn)行過濾，得到固體組分；將固體組分溶于水，而后離心，將固相干燥。
步驟四、上述固體加入發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入體積之比為1：0.60：2.5：1.5的里氏木霉菌液(活菌數(shù)為4×1010fu/ml)、解淀粉芽孢桿菌液(活菌數(shù)為3×1010cfu/ml)、枯草芽孢桿菌液(活菌數(shù)為5×1010)、巴氏地衣芽孢桿菌液(活菌數(shù)為4×1010cfu/ml)。向發(fā)酵罐中通入0.3vvm的氧氣，控制pH為5，在50℃下發(fā)酵48h，分離出發(fā)酵殘?jiān)桶l(fā)酵液。發(fā)酵液中可能的蛋白進(jìn)行采用公知的方法進(jìn)行提取，固體保留以備用。
步驟五、所得固體中加入緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至堿性。
步驟六、加入公知的堿性蛋白酶，水解得到水解液。
步驟八、將所得多肽液用Sephadex G15凝膠柱分離并脫鹽，分離條件為：上樣量5ml，洗脫液為蒸餾水，流速3.0mL/min，收集洗脫時(shí)間33min～53min內(nèi)組分，濃縮，冷凍真空干燥，得到活性多肽。
對比例1
除了不包括發(fā)酵的步驟，其它同實(shí)施例3。
按照以下方法測量實(shí)施例以對比例所得的多肽得率。
多肽得率＝(酶解后過濾液的固含量×過濾液總重量)/(原料使用量×原料粗蛋白含量)。測試結(jié)果如下表所示：
由于本發(fā)明中所涉及的各工藝參數(shù)的數(shù)值范圍在上述實(shí)施例中不可能全部體現(xiàn)，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以想象到只要落入上述該數(shù)值范圍內(nèi)的任何數(shù)值均可實(shí)施本發(fā)明，當(dāng)然也包括若干項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)具體值的任意組合。此處，出于篇幅的考慮，省略了給出某一項(xiàng)或多項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)具體值的實(shí)施例，此不應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的技術(shù)方案的公開不充分。
申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式選擇等，落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。