本發(fā)明屬于瑪咖加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種瑪咖寡糖多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
：植物瑪咖(LepidiummeyeniiWalp，又稱瑪卡)是原產(chǎn)于秘魯安第斯山脈的一種十字花科植物，在安第斯山區(qū)作為藥食兼用的植物已有悠久的歷史。因瑪咖具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用功效，尤其是在抗疲勞、提高生育能力等方面的功效，被人們視為安第斯山神賜予的珍貴禮物，有“秘魯人參”之稱。聯(lián)合國糧農(nóng)組建議人們食用瑪咖，自2003年瑪咖開始被引入中國種植?，F(xiàn)代研究證明，瑪咖富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)化學成分，以及多種次生代謝物質(zhì)，如瑪咖烯(macaene)、生物堿(包括瑪咖酰胺macamide)、芥子油苷及其水解產(chǎn)物(Piacenteetal，2002)、甾醇、多酚等生物活性成分。這些次生代謝物質(zhì)被認為與瑪咖的保健功效有密切關(guān)系。由于人們越來越推崇天然植物藥物和功能食品，具有獨特功效瑪咖產(chǎn)品的開發(fā)受到世界各國研究者的廣泛關(guān)注。但現(xiàn)在市場上銷售的瑪咖產(chǎn)品參差不齊，大多是直接使用瑪咖干粉或水、醇提取物。此類產(chǎn)品中所含瑪咖有效成分低，效果不明顯，不能充分發(fā)揮瑪咖本身含有的潛在價值。目前也有一些關(guān)于瑪咖制備工藝的研究，如公開號CN103864949A的專利公開了一種采用膜分離技術(shù)聯(lián)合蛋白酶和多糖水解酶酶解制備瑪咖多糖及瑪咖生物堿的方法，步驟復雜，而且未得到瑪咖多肽；公開號CN103725741A的專利公開了一種采用由內(nèi)切酶、外切酶和風味酶組成的瑪咖專用酶酶切瑪咖的方法，以提取得到瑪咖肽，但未提到所得瑪咖肽中分子量大小及瑪咖酰胺的含量比例。因此對瑪咖進行工藝條件改進，得到富含功效成分及小分子活性多肽的瑪咖制品，以充分發(fā)揮瑪咖的營養(yǎng)價值。是當今瑪咖產(chǎn)品開發(fā)的當務之急。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種含有富含功效成分及小分子活性多肽的瑪咖寡糖多肽及其制備方法。本發(fā)明瑪咖寡糖多肽：主要成分是寡糖、多肽、黃酮、瑪咖酰胺、芥子油苷等物質(zhì)。本發(fā)明提供了一種瑪咖寡糖多肽，它的重均分子量小于2000；瑪咖酰胺的重量百分含量為0.031～0.136％；氨基酸中精氨酸的重量百分含量不低于10％，脯氨酸的重量百分含量不低于20％；芥子油苷的重量百分含量不低于1％。其中，瑪咖寡糖多肽是由瑪咖制備的；和/或，瑪咖寡糖多肽的重均分子量為500～2000；氨基酸中精氨酸的重量百分含量為10％～20％，脯氨酸的重量百分含量為20～30％；和/或，所述的瑪咖寡糖多肽中，多糖的重量百分含量不低于15％。本發(fā)明還提供了上述瑪咖寡糖多肽的制備方法，它包括如下步驟：(a)取100-300重量份瑪咖，加入800～1200體積份水，在溫度為30～65℃的條件下，加入1～8重量份糖酶反應0.5～12小時；(b)再在30～65℃條件下，調(diào)節(jié)pH值為8～9，加入1～8重量份堿性蛋白酶反應0.5～12小時；(c)再在30～65℃條件下，加入1～8份中性蛋白酶反應0.5～12小時；(d)酶滅活；(e)過濾，將濾液濃縮，即可。重量份與體積份的對應關(guān)系為“1g對應于1mL”。其中，步驟(a)中，所述的瑪咖為瑪咖塊根或瑪咖葉。其中，所述糖酶是淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶的至少一種；所述堿性蛋白酶是alcalase或胰酶中的至少一種；所述中性蛋白酶是A1398、Neutrase酶、Flavourzyme中的至少一種。其中，步驟(a)、(b)和/或(c)中，反應時進行攪拌。其中，步驟(a)中，所述調(diào)整溫度至30～65℃后，加入糖酶前，調(diào)節(jié)pH值為5。其中，步驟(a)中，取100份瑪咖，加入1000份水，調(diào)整溫度至30～65℃，調(diào)pH值為5，加入2份糖酶，反應2小時；或者，取100份的瑪咖，加入800份水，調(diào)整溫度至30℃，加入2份糖酶，反應2小時；或者，取250份的瑪咖，加入1000份水，調(diào)整溫度至30～65℃，調(diào)pH值為5，加入2份糖酶，反應2小時；或者，取300份的瑪咖，加入1200份水，調(diào)整溫度至65℃，加入8份糖酶，反應12小時。其中，步驟(b)中，溫度30～65℃，調(diào)節(jié)pH值為8，加入2份堿性蛋白酶，反應2小時；步驟(c)中，溫度30～65℃，加入2份中性蛋白酶，反應2小時；步驟(d)中，酶滅活采用：調(diào)整溫度到75～90℃，保溫15～30分鐘；優(yōu)選地，酶滅活采用：調(diào)整溫度到90℃，保溫30分鐘；步驟(e)中，所述濃縮采用真空噴霧干燥或冷凍真空干燥。和/或，步驟(e)后，還包括滅菌步驟。本發(fā)明還提供了上述瑪咖寡糖多肽在制備食品、食品添加劑、保健食品和/或藥品中的用途；其中，所述保健食品、藥品為解酒、提高免疫力、抗疲勞和/或促進生育能力的保健食品、藥品。本發(fā)明還提供了瑪咖寡糖多肽在制備特殊營養(yǎng)食品和藥物中的用途。不同產(chǎn)地的瑪咖中蛋白質(zhì)含量、芥子油苷、瑪咖酰胺等含量有差異，例如芥子油苷在1.05％～1.79％之間，而且與加工方法密切相關(guān)。本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽中所含蛋白質(zhì)含量、芥子油苷、瑪咖烯以及瑪咖酰胺含量與原料瑪咖中初始含量相當。本發(fā)明方法制備的瑪咖寡糖多肽，能夠最大限度的發(fā)揮蛋白質(zhì)和多糖的生物學效能，包括解酒、提高免疫力、抗疲勞、促進生育能力等，在人體中容易消化和吸收，生物利用度高，可用于制備食品、食品添加劑、保健食品和藥品。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為本發(fā)明瑪咖寡糖多肽中瑪咖酰胺的色質(zhì)聯(lián)用檢測圖譜圖2為本發(fā)明瑪咖寡糖多肽(即瑪咖酶解物)的液相圖譜；其中，數(shù)據(jù)1是噴霧干燥產(chǎn)物，數(shù)據(jù)2是冷凍干燥產(chǎn)物(即凍干方式制備的瑪咖寡糖多肽)。具體實施方式下面以實施例作進一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。本發(fā)明工藝流程：瑪咖塊根或瑪咖葉→清洗粉碎→酶解→滅活酶→過濾→噴霧干燥(或凍干)→滅菌；或瑪咖塊根或瑪咖葉→清洗粉碎→酶解→滅活酶→過濾→噴霧干燥(或凍干)，即可。本發(fā)明所用的實驗試劑如下：淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶：均購自德國AB公司；Alcalase、胰酶、Neutrase酶、Flavourzyme：均購自諾維信；A1398：購自北京房縣酶制劑總廠。各檢測方法如下：一、瑪咖芥子油苷含量測定1、材料：島津CBM-10AVPPLUS液相色譜儀(紫外檢測器：SPD-10AVPPLUS，輸液泵：LC-10AVPPLUS)，KQ-300DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A2004N電子天平(上海菁海儀器有限公司，d＝0.1mg)，HH-6恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，10mL頂空進樣瓶，C18色譜柱。2、試劑：乙腈(HPLC純，科試試劑)95％乙醇(科試試劑)，異硫氰酸芐酯BITC(CAS622-78-6，純度＞98％，東京化成工業(yè)株式會社)，葡糖硫苷酶(CAS9025-38-1，酶活力＞100UN/g，東京化成工業(yè)株式會社)3、色譜條件：色譜柱：C18流動相：乙腈(A)-水(B)進樣量：20μL波長：246nm流速：1.0mL/min柱溫：40℃梯度條件：4、葡糖硫苷酶溶液配制：精密稱取33mg葡糖硫苷酶，置于10mL量瓶內(nèi)，蒸餾水溶解，定容成10mL5、對照品溶液配制：精確稱取BITC250mg至25mL量瓶，乙腈溶解定容成25mL.6、標準曲線繪制：分別精密移取0，20，50，100，150，200μL的對照品溶液至10mL量瓶內(nèi)，加入乙腈溶液，并稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20g/L的對照品溶液；以對照品溶液質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(X)，對照品峰面積(Y)為縱坐標，線性回歸，繪制標準曲線。7、供試品制備：1)精密稱取250mg瑪咖粉，置于25mL量瓶內(nèi)。2)加15mL47.5％乙醇液，50℃水浴1h，冷卻至室溫，用47.5％乙醇液定容。3)精密量取上述液4mL，置于10mL頂空瓶，添加1mL葡糖硫苷酶溶液，搖勻，加蓋密封。置于45℃恒溫水浴鍋酶解30min，取出，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶內(nèi)，用47.5％乙醇稀釋至刻度，過0.22微孔濾膜，待測。二、瑪咖總黃酮含量測定方法1、所需試劑試液：蘆丁標準品(中國生物藥品檢定所)，甲醇溶液(科試試劑)，5％亞硫酸鈉溶液(科試試劑)，10％硝酸鋁溶液(科試試劑)，5％氫氧化鈉溶液(科試試劑)2、所需儀器：普析TU-1900雙光束紫外可見分光光度儀，KQ-300DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A2004N電子天平(上海菁海儀器有限公司，d＝0.1mg)3、蘆丁標準液配制：1)準確稱取干燥恒溫蘆丁對照品12mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇完全溶解并稀釋到刻度，此時濃度為0.24mg/mL。2)準確吸取該溶液10mL于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得濃度為0.096mg/mL對照品溶液。4、最大吸收波長確定：1)準確吸取0.096mg/mL蘆丁標準液4.0mL于10mL比色管中，加0.3mL5％亞硫酸鈉溶液，超聲6min。2)加0.3mL10％硝酸鋁溶液，超聲6min。3)加4mL5％氫氧化鈉溶液，超聲15min，室溫下靜置。4)加甲醇至刻度，分光光度計全波長掃描，確定其最大吸收波長。5、標準曲線繪制：1)分別準確吸取0.096mg/mL蘆丁標準液0mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL，10.0mL于20mL容量瓶中。2)加0.3mL5％亞硫酸鈉溶液，超聲6min。3)加0.3mL10％硝酸鋁溶液，超聲6min。4)加4mL5％氫氧化鈉溶液，超聲15min，室溫下靜置。5)加甲醇至刻度，分別測吸光度，回歸方程做出標準曲線。6、瑪咖總黃酮提取測定：1)稱取0.1g瑪咖樣品(包括原料和瑪咖酶解物)，加8mL純凈水潤濕。2)用30mL甲醇超聲提取25min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，殘渣再用甲醇提取2次，合并提取液，甲醇定容至50mL，過0.45濾膜。3)吸取提取液4.0mL于10mL比色管中，加0.3mL5％亞硫酸鈉溶液，超聲6min。4)加0.3mL10％硝酸鋁溶液，超聲6min。5)加4mL5％氫氧化鈉溶液，超聲15min，靜置至溫度降為室溫，加甲醇至刻度。6)測吸光度，換算黃酮含量。三、瑪咖酰胺含量測定1、所需儀器：島津CBM-10AVPPLUS液相色譜儀(紫外檢測器：SPD-10AVPPLUS，輸液泵：LC-10AVPPLUS)，KQ-300DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A2004N電子天平(上海菁海儀器有限公司，d＝0.1mg)2、所需材料：C18色譜柱，瑪咖粉，乙腈(HPLC純，科試試劑，0.05％磷酸水溶液(科試試劑)，無水乙醇(科試試劑)，瑪咖酰胺標樣群(N-芐基十六烷酰胺，N-(間-甲氧基芐基)-亞麻酰胺，N-芐基亞麻酰胺，N-(間-甲氧基芐基)-亞油酰胺，N-芐基亞油酰胺)3、對照品溶液制備：1)取N-芐基十六烷酰胺，N-(間-甲氧基芐基)-亞麻酰胺，N-芐基亞麻酰胺，N-(間-甲氧基芐基)-亞油酰胺，N-芐基亞油酰胺適量，精密稱定，于10mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度。2)各取對照品溶液1mL，各自稀釋為一定濃度梯度的標準液。3)根據(jù)液相數(shù)據(jù)，以峰面積和濃度，做各自對照品標準曲線。4、供試液制備：1)精密稱取瑪咖樣品1g，置于50mL具塞錐形瓶中。2)精密加入10mL無水乙醇，稱定質(zhì)量，超聲45min，再次稱定質(zhì)量，用無水乙醇補足減少質(zhì)量。3)搖勻，過0.45微孔濾膜，待測。5、色譜條件：流動相：乙腈(A)～0.05％磷酸水溶液(B)梯度洗脫條件：0～15min，70％～90％A15～35min，90％A檢測波長：208nm體積流量：1.0mL/min柱溫：30℃四、瑪咖多肽分子量測定：茚三酮法測水解度及分子量1、儀器&試劑北京普析TU-1900型紫外可見分光光度計或同類儀器移液管(2ml)移液槍容量瓶(100ml、50mL)具塞比色管(10ml)茚三酮、甘氨酸、果糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(分析純)乙醇2、實驗步驟1)、20μg/mL甘氨酸標準溶液：2mg甘氨酸定容到100mL容量瓶中。2)、茚三酮顯示劑配制：水合茚三酮0.5g，果糖0.3g，磷酸氫二鈉11.2g，磷酸二氫鉀6g，定容到100mL，稍熱溶解，低溫可保存1周。3)、標準曲線的繪制：取9支具塞試管，按下表精密吸取標準溶液至10mL具塞試管中，各加純水至2.0mL，加入茚三酮顯色劑1.0mL，混勻后用沸水浴中加熱15min，然后迅速用冷水冷卻至室溫，加入40％乙醇5mL搖勻，并放置15min后在570nm波長下測吸光度(A)為縱坐標，含量為橫坐標制作標準曲線。4)、樣品測定4.1樣品溶液：取水解液0.50mL定容至50mL。4.2樣品測定：吸取樣品溶液0.5mL，放入具塞比色管(每個樣品重復2次)，加純水至2.0mL，加入茚三酮顯色劑1.0mL，混勻后用沸水浴中加熱15min，然后迅速用冷水冷卻至室溫，加入40％乙醇5mL搖勻，并放置15min后在570nm下比色，用“0”號試管作參比，測定吸光度，并通過標準曲線查得含量?？傠逆I毫摩爾數(shù)＝各肽鍵毫摩爾數(shù)之和4.3結(jié)果計算：水解液-NH2含量(μmol/mL)＝[C/(75*V)]*100式中，N—水解液蛋白含量(凱氏定氮)htot—每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)C—標準曲線查得的含量(μg)75—甘氨酸分子量V—樣品溶液所測體積100—樣品稀釋倍數(shù)4.4平均肽鏈長(PCL)與平均分子量(Mw)的測定：PCL＝1/DHMw＝110*PCL+18實施例1本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的制備1、原料：干燥瑪咖塊根。2、制備方法：將100克干凈的瑪咖干燥塊根粉碎，加入無離子水1000毫升，調(diào)整溫度為30～65℃，調(diào)pH值為5，加入2克淀粉酶反應2小時；之后同樣溫度下，調(diào)pH值至8，攪拌加入2克alcalase酶反應2小時；再之后同樣溫度條件下加入2克A1398酶反應2小時；之后升溫至90℃，恒溫反應半小時，使酶失活，過濾。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，溫度40～65℃減壓濃縮，最后凍干，即得本發(fā)明瑪咖寡糖多肽。3、檢測結(jié)果：本發(fā)明方法制備的瑪咖寡糖多肽收率為58.2％。其中：粗蛋白含量20.12％，氨基酸總含量：17.61％；芥子油苷1.35克/100克；瑪咖酰胺136毫克/100克瑪咖寡糖多肽，重均分子量為547Da?，斂Ч烟嵌嚯闹鞋斂０返纳|(zhì)聯(lián)用檢測圖譜見圖1。本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽與瑪咖原料的氨基酸含量對比見表1。表1本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽與瑪咖原料的氨基酸含量對比實施例2本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的制備1、原料：干燥瑪咖塊根(西藏產(chǎn))。2、制備方法：將100克干凈的瑪咖干燥塊根粉碎，加入無離子水800毫升恒溫30℃，加入2克纖維素酶，反應2小時；之后同樣溫度下，調(diào)pH值至8，恒溫下加入2克胰酶反應2小時；再之后同樣溫度條件下加入2克Neutrase酶反應2小時；之后升溫至90℃，恒溫反應半小時，使酶失活，過濾。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，溫度40～65℃減壓濃縮，最后凍干，即得本發(fā)明瑪咖寡糖多肽。3、檢測結(jié)果：本發(fā)明方法制備的瑪咖寡糖多肽收率為51.6％。其中：粗蛋白含量17.53％，氨基酸總含量：15.17％；芥子油苷0.85克/100克；瑪咖酰胺31毫克/100克瑪咖寡糖多肽，重均分子量為623Da。瑪咖寡糖多肽的液相圖譜見圖2(本發(fā)明制備方法中最后干燥時也可以不凍干，而采用噴霧干燥方法，二者的結(jié)果對比見圖2)。本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量見表2。表2本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量實施例3本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的制備1、原料：干燥瑪咖塊根(云南產(chǎn))。2、制備方法：將300克干凈的瑪咖干燥塊根粉碎，加入無離子水1200毫升恒溫65℃，攪拌加入8克果膠酶，反應12小時；之后同樣溫度下，調(diào)pH值至9，恒溫下攪拌加入8克alcalase酶反應12小時；再之后同樣溫度條件下攪拌下加入8克Flavourzyme酶反應12小時；之后升溫至90℃，恒溫反應半小時，使酶失活，過濾。上清液真空凍干，滅菌，即得本發(fā)明瑪咖寡糖多肽。3、檢測結(jié)果：本發(fā)明方法制備的瑪咖寡糖多肽收率為48.6％。其中：粗蛋白含量18.25％，氨基酸總含量：14.31％；芥子油苷1.02克/100克；瑪咖酰胺120毫克/100克瑪咖寡糖多肽，重均分子量為613Da。本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量見表3。表3本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量氨基酸瑪咖寡糖多肽(％)按照100％計算天門冬氨酸0.855.94蘇氨酸0.42.80絲氨酸0.382.66谷氨酸1.047.27甘氨酸0.473.28丙氨酸0.463.21胱氨酸0.171.19纈氨酸0.543.77蛋氨酸0.191.33異亮氨酸0.42.80亮氨酸0.624.33酪氨酸0.130.91苯丙氨酸0.352.45賴氨酸0.53.49組氨酸0.281.96精氨酸2.6918.80脯氨酸4.732.84氨基酸總量14.31100.00實施例4本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的制備1、原料：新鮮瑪咖塊根(四川阿壩產(chǎn))。2、制備方法：將250克干凈的新鮮瑪咖塊根(含水量65％)粉碎，加入無離子水1000毫升，調(diào)整溫度為30～65℃，調(diào)pH值為5，加入2克糖化酶反應2小時；之后同樣溫度下，調(diào)pH值至8，攪拌下加入2克胰酶反應2小時；再之后同樣溫度條件下加入2克A1398酶反應2小時；之后升溫至90℃，恒溫反應半小時，使酶失活，過濾。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，溫度40～65℃減壓濃縮，最后凍干，即得本發(fā)明瑪咖寡糖多肽。3、檢測結(jié)果：本發(fā)明方法制備的瑪咖寡糖多肽收率為51.6％。其中：粗蛋白含量13.62％，氨基酸總含量：11.13％；芥子油苷0.89克/100克；瑪咖酰胺106毫克/100克瑪咖寡糖多肽，重均分子量為753Da。本發(fā)明的瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量見表4。表4本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的氨基酸含量氨基酸瑪咖寡糖多肽(％)按照100％計算天門冬氨酸0.706.29蘇氨酸0.322.88絲氨酸0.292.61谷氨酸0.827.37甘氨酸0.312.79丙氨酸0.363.23胱氨酸0.161.44纈氨酸0.494.40蛋氨酸0.151.35異亮氨酸0.262.34亮氨酸0.393.50酪氨酸0.110.99苯丙氨酸0.262.34賴氨酸0.312.79組氨酸0.151.35精氨酸2.4622.10脯氨酸3.4831.27氨基酸總量11.13100.00以下用試驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果：試驗例1本發(fā)明瑪咖寡糖多肽的效果實驗取實施例1制備的瑪咖寡糖多肽，進行解酒功效實驗，結(jié)果見表5：表5本發(fā)明瑪咖寡糖多肽用于解酒的效果由表5可見，本發(fā)明瑪咖寡糖多肽可快速治療酒精中毒，具有良好的解酒效果。綜上，本發(fā)明提供的瑪咖寡糖多肽，能夠最大限度的發(fā)揮蛋白質(zhì)和多糖的生物學效能，包括解酒、提高免疫力、抗疲勞、促進生育能力等，在人體中容易消化和吸收，生物利用度高，可用于制備食品、食品添加劑、保健食品和藥品。本發(fā)明制備瑪咖寡糖多肽的工藝簡便，生產(chǎn)成本低廉，所制備的產(chǎn)品性能比現(xiàn)有產(chǎn)品有顯著區(qū)別特性和顯著的優(yōu)越性，有極好的工業(yè)應用前景。當前第1頁1 2 3