本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種大量抽提質(zhì)粒的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。目前，質(zhì)粒通常專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體(Vector)。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中最常用的載體之一。質(zhì)粒分子本身是含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒還帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀比如標(biāo)記基因。其自我復(fù)制能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作(如擴(kuò)增、篩選過程)中對基因工程研究及其下游的應(yīng)用都是非常實(shí)用和極具價(jià)值的。在產(chǎn)品研發(fā)過程中，研發(fā)人員對質(zhì)粒量的需求一般不大，μg級別的質(zhì)粒足以滿足大量研發(fā)實(shí)驗(yàn)的需求；但在實(shí)際的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中，質(zhì)粒的使用量往往會比研發(fā)時(shí)的高2-3個(gè)數(shù)量級，達(dá)到100μg乃至1000μg級別。以用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病的抗CD19嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞為例，該治療方案的流程大致如下：首先抽取患者的血液，分離其中的外周血單個(gè)核細(xì)胞，并誘導(dǎo)培養(yǎng)其中的T細(xì)胞；接著將表達(dá)抗CD19單鏈抗體(scFv)基因的通過慢病毒導(dǎo)入到T細(xì)胞中，并繼續(xù)培養(yǎng)這些細(xì)胞；當(dāng)這些細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量達(dá)到臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)后，即可將這些細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)開展治療。這一流程中，最為關(guān)鍵的就是將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)所用的慢病毒?，F(xiàn)有技術(shù)中，用于治療的慢病毒主要是用293T細(xì)胞和慢病毒質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒進(jìn)行并包裝并純化所得到的。這一步驟對質(zhì)粒的量要求較高，一般可達(dá)到數(shù)百μg級別?，F(xiàn)有技術(shù)中，大量提取質(zhì)粒的方法主要包括借助質(zhì)粒吸附柱和借助氯化銫(CsCl)超速離心兩種。借助質(zhì)粒吸附柱的方法，僅需大約2個(gè)小時(shí)即可從400mL左右的菌液中提取出1000μg左右的質(zhì)粒；而借助CsCl超速離心的方法則需要離心過夜，時(shí)間相對較長。但CsCl超速離心法在其他方面遠(yuǎn)優(yōu)于質(zhì)粒吸附柱法：1、基本上不存在細(xì)菌基因組DNA污染。與之相比，質(zhì)粒吸附柱法提取的質(zhì)粒被細(xì)菌基因組DNA污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)要高不少。2、提取的質(zhì)粒中共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子(cccDNA)是質(zhì)粒在后期正常發(fā)揮作用的主要形式，借助CsCl超速離心法提取的質(zhì)粒，cccDNA的比例顯著高于通過質(zhì)粒吸附柱法提取的質(zhì)粒。3、借助超速離心，細(xì)菌內(nèi)毒素可以被更徹底地清除。因此借助超速離心法進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取是一種更好的方法，這已被本領(lǐng)域內(nèi)的實(shí)驗(yàn)人員所接受。CsCl超速離心法大量提取質(zhì)粒的過程中，需要加入核酸染料，以使質(zhì)粒在超速離心后顯色，方便實(shí)驗(yàn)人員借助注射器等器具對其進(jìn)行吸取?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的核酸染料為溴化乙錠(EB)，這是一種靈敏度非常高的核酸染料，能檢測低至10ng的DNA。但是EB是一種強(qiáng)誘變劑，具有較高的致癌性，因此對長期使用該核酸染料的實(shí)驗(yàn)人員來說，如何既保護(hù)好自己的身體健康，又要獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果成為了他們?nèi)粘９ぷ髦胁坏貌幻鎸Φ囊粋€(gè)重要問題。現(xiàn)有技術(shù)中尚未有能很好解決該問題的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種大量提取質(zhì)粒的方法，其特點(diǎn)如下：應(yīng)用新型的GoldenView染料替代高毒性的EB染料進(jìn)行CsCl超速離心提取質(zhì)粒。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：S1、將含有目的質(zhì)粒的大腸桿菌接種至400mLTB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜。然后4℃，6000g離心10min，棄上清，倒置離心管使殘余的液體流出。S2、加入預(yù)冷至4℃的P1緩沖液至終體積到10mL，震蕩重懸使沉淀的細(xì)菌均勻分散。所述P1緩沖液的成分為50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,100ug/mLRnaseA,pH＝8.0。S3、加入20mg固體溶菌酶(heneggwhitelysozyme)，完全重懸沉淀，室溫放置10min。S4、加入20mL新鮮制備的P2溶液，用移液管輕輕混勻直至溶液均一透明，室溫放置5-10min。所述P2緩沖液的成分為200mmol/LNaOH,1％SDS。S5、加入預(yù)冷至4℃的P3溶液10mL，輕輕但完全地震蕩混勻數(shù)次，直至兩個(gè)液相不再分離，原有的黃色消失，白色絮狀物出現(xiàn)，然后置于冰上10min。所述P3溶液的成分為3mol/LKAc，pH＝4.8。S6、4℃，8000rpm離心10min，棄沉淀，將上清通過四層紗布過濾到量筒中。S7、加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10-15min，然后置于50mL離心管中。S8、8000rpm離心15min后，將上清棄處干凈，回收核酸沉淀。S9、洗滌沉淀。在室溫下，用2mL70％乙醇涮洗管底及管壁。然后將乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常溫離心10min，棄上清。敞開離心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全揮發(fā)掉。S10、加入7mL1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL該溶液沖洗管壁。S11、加入CsCl12.5g，溶解混勻。S12、加入GoldenView核酸染料10微升后混勻。S13、轉(zhuǎn)移上述溶液至超速離心管中，充滿離心管并平衡密封。S14、室溫下55000rpm離心至少12h，或65000rpm離心4h。S15、離心結(jié)束后，將離心管取出，置于錫箔紙包裹的試管架上，在僅有微光的室內(nèi)，可見兩條DNA區(qū)帶，上層區(qū)帶是染色體和線性DNA，下層為所需的cccDNA。S16、用18號針管，小心收集cccDNA，置于50mL離心管中。S17、加入等體積的水飽和異戊醇，蓋緊管蓋，震蕩混合有機(jī)相和水相。S18、室溫下450g離心3min，使水相和有機(jī)相分離，并將上層有機(jī)相(粉紅色)轉(zhuǎn)移至合適的廢液桶中。S19、重復(fù)抽提上述三個(gè)步驟4-6次，直到水相和有機(jī)相均不見綠色。S20、加入2.2倍體積的水，0.6倍體積的異丙醇，混勻。S21、室溫下，8000rpm離心15min，完全棄上清，并回收核酸沉淀。S22、加入8mL超純水重懸沉淀，再加入10mol/L醋酸銨溶液至終濃度2mol/L，充分混勻后加入2.5-3倍體積，預(yù)冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混勻，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。S23、4℃，8000rpm離心10min，棄上清。S24、加入20mL70％乙醇，混合，4℃，12000g離心10min，棄上清。S25、將離心管置于超凈臺中風(fēng)干2min，加入TE溶解質(zhì)粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明對傳統(tǒng)的CsCl超速離心法提取質(zhì)粒進(jìn)行了改造，應(yīng)用新型的GoldenView染料替代了高毒性的EB染料，在降低實(shí)驗(yàn)操作對研究人員的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，還保證了所提取質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量均無明顯下降。附圖說明圖1為應(yīng)用GoldenView和EB進(jìn)行CsCl質(zhì)粒提取，獲得質(zhì)粒總量的結(jié)果圖。圖2為CsCl提取質(zhì)粒的電泳結(jié)果圖。a.應(yīng)用GolenView染料進(jìn)行質(zhì)粒提取的結(jié)果(3次重復(fù))；b.應(yīng)用EB染料進(jìn)行質(zhì)粒提取的結(jié)果(3次重復(fù))。圖3為BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。本發(fā)明所使用的CsCl購自SigmaAldrich，GoldenView染料購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。其它實(shí)驗(yàn)試劑與耗材如無明確說明，均為市售商品。實(shí)施例一大腸桿菌的培養(yǎng)取含有質(zhì)粒的大腸桿菌10μL，置于400mLTB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)14h后，4℃，6000g離心10min收集菌體。實(shí)施例二CsCl超速離心提取質(zhì)粒按照以下步驟應(yīng)用CsCl超速離心法提取質(zhì)粒：1、加入預(yù)冷至4℃的P1緩沖液至10mL，重懸上述菌體，震蕩重懸使沉淀的細(xì)菌均勻分散。2、加入20mg固體溶菌酶(heneggwhitelysozyme)，完全重懸沉淀，室溫放置10min。3、加入20mL新鮮制備的P2溶液，用移液管輕輕混勻直至溶液均一透明，室溫放置5-10min。4、加入預(yù)冷至4℃的P3溶液10mL，輕輕但完全地震蕩混勻數(shù)次，直至兩個(gè)液相不再分離，原有的黃色消失，白色絮狀物出現(xiàn)，然后置于冰上10min。5、4℃，8000rpm離心10min，棄沉淀，將上清通過四層紗布過濾到量筒中。6、加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10-15min，然后置于50mL離心管中。7、8000rpm離心15min后，將上清棄處干凈，回收核酸沉淀。8、洗滌沉淀。在室溫下，用2mL70％乙醇涮洗管底及管壁。然后將乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常溫離心10min，棄上清。敞開離心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全揮發(fā)掉。9、加入7mL1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL該溶液沖洗管壁。10、加入氯化銫12.5g，溶解混勻。11、加入GoldenView核酸染料10微升后混勻。12、轉(zhuǎn)移上述溶液至超速離心管中，充滿離心管并平衡密封。13、室溫下55000rpm離心至少12h，或65000rpm離心4h。14、離心結(jié)束后，將離心管取出，置于錫箔紙包裹的試管架上，在僅有微光的室內(nèi)，可見兩條DNA區(qū)帶，上層區(qū)帶是染色體和線性DNA，下層為所需的cccDNA。15、用18號針管，小心收集cccDNA，置于50mL離心管中。16、加入等體積的水飽和異戊醇，蓋緊管蓋，震蕩混合有機(jī)相和水相。17、室溫下450g離心3min，使水相和有機(jī)相分離，并將上層有機(jī)相(粉紅色)轉(zhuǎn)移至合適的廢液桶中。18、重復(fù)抽提上述三個(gè)步驟4-6次，直到水相和有機(jī)相均不見綠色。19、加入2.2倍體積的水，0.6倍體積的異丙醇，混勻。20、室溫下，8000rpm離心15min，完全棄上清，并回收核酸沉淀。21、加入8mL超純水重懸沉淀，再加入10mol/L醋酸銨溶液至終濃度2mol/L，充分混勻后加入2.5-3倍體積，預(yù)冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混勻，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。22、4℃，8000rpm離心10min，棄上清。23、加入20mL70％乙醇，混合，4℃，12000g離心10min，棄上清。24、將離心管置于超凈臺中風(fēng)干2min，加入TE溶解質(zhì)粒。實(shí)施例三質(zhì)粒提取量的檢測抬起ThermoNanodrop2000檢測儀的樣品臂，取1μLTE溶液加到檢測基座上，用于儀器調(diào)零，完成后用干凈的擦拭紙將基座擦拭干凈；然后再取1μL溶于TE的質(zhì)粒加到檢測基座上，然后將樣品臂放下，運(yùn)行控制軟件讀取吸光值；再由軟件根據(jù)吸光值估算出質(zhì)粒的濃度。按照以下公式對質(zhì)粒的提取量進(jìn)行計(jì)算：n＝C×V。其中n為質(zhì)粒的提取量，C為質(zhì)粒的濃度，V為溶解質(zhì)粒所用的TE的體積。發(fā)明人用GoldenView和溴化乙錠(EB)各重復(fù)質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)三次，提取情況如下表所示：表1質(zhì)粒提取情況對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖1所示?？梢钥吹?，應(yīng)用GoldenView染料提取所得質(zhì)粒的總量高于應(yīng)用EB染料提取的，但無顯著差異(p>0.05)。實(shí)施例四提取質(zhì)粒內(nèi)毒素的檢測使用湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的凝膠法鱟試劑檢測質(zhì)粒樣品中的內(nèi)毒素殘留。用超純水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10EU/mL、1EU/mL、0.5EU/mL、0.25EU/mL、0.125EU/mL、0.0625EU/mL6個(gè)濃度梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線；再按凝膠法鱟試劑說明書對樣品進(jìn)行稀釋(MVD＝CL/λ)，并進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測。每個(gè)樣品進(jìn)行2次重復(fù)，所得結(jié)果表明，全部質(zhì)粒樣品均呈內(nèi)毒素陰性，表明質(zhì)粒樣品內(nèi)所含內(nèi)毒素均≦5EU/mL，即在要樣品控制內(nèi)毒素限值為5EU/mL范圍，說明質(zhì)粒樣品內(nèi)內(nèi)毒素含量極低。實(shí)施例五提取質(zhì)粒殘留蛋白質(zhì)的檢測使用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BCA檢測試劑盒對提取質(zhì)粒中的殘留蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。用超純水配制濃度分別為0、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL和500ng/μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表2和如圖3所示。可以看到，吸光值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈線性相關(guān)趨勢，r2值大于0.99。表2BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度02550100200300400500吸光值0.1690.1860.2100.2440.3350.4170.4880.551按照相同步驟對實(shí)施例三中獲得的6個(gè)質(zhì)粒提取樣品進(jìn)行殘留蛋白質(zhì)含量的檢測，其吸光值如表3所示。可以看到，6個(gè)樣品檢測所得到的吸光度值均小于標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)對應(yīng)的吸光度值，未檢測出蛋白質(zhì)殘留，說明提取質(zhì)粒的純度很高。表36個(gè)質(zhì)粒樣品殘留蛋白質(zhì)檢測結(jié)果樣品名GoldenView-1GoldenView-2GoldenView-3EB-1EB-2EB-3吸光值0.1640.1650.1660.1630.1650.163以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3