專利名稱：一種質(zhì)粒dna的提取方法及其提取裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種質(zhì)粒DNA的提取方法及其提取裝置。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)的最基本的步驟之一，分子克隆中的經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法涉及很多的離心，限制了提取質(zhì)粒的規(guī)模，從500mL培養(yǎng)物中只能收獲2～5mg質(zhì)粒，而且純化過(guò)程復(fù)雜，且使用了有毒有害的物質(zhì)。隨著DNA疫苗和基因重組藥物研究和應(yīng)用的快速發(fā)展，對(duì)重組質(zhì)粒的需求量在不斷增加，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室制備及其方法已很難滿足。目前還有一些大規(guī)模提取的方法是用各種類型的親和層析柱，提取效果較好，但費(fèi)用很高，也不易擴(kuò)大規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前現(xiàn)有質(zhì)粒提取技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供了一種質(zhì)粒DNA的提取方法，該方法簡(jiǎn)化了質(zhì)粒提取的過(guò)程，解決了規(guī)?；崛≠|(zhì)粒的問(wèn)題，并且產(chǎn)量高、純度好。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述質(zhì)粒DNA的提取裝置。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種質(zhì)粒DNA的提取方法，包括如下步驟(1)工程菌的培養(yǎng)將工程菌接種于改良TB(Terrific Broth)液體培養(yǎng)基中，37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)約12～14小時(shí)，得到對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物即OD值約為0.6的培養(yǎng)物；接種體積百分比為0.5～1％，所述改良TB液體培養(yǎng)基為將組分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60℃，再加100mL經(jīng)滅菌的170mmol/LKH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液。
(2)工程菌的裂解取步驟(1)中的培養(yǎng)物采用堿裂解法裂解工程菌。
(3)質(zhì)粒的提取純化裂解產(chǎn)物通過(guò)4～6層干酪包布進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，加入RNA酶，使終濃度為20ug/mL，37℃作用20分鐘，然后向?yàn)V液中加入0.6濾液體積的異丙醇，室溫(20～25℃)放置2分鐘，沉淀質(zhì)粒，然后用孔徑為0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，棄去濾液，質(zhì)粒留在膜上，用70％的乙醇沖洗混合纖維素酯微孔濾膜2～3次，風(fēng)干濾膜，最后用50～60℃的雙蒸水或pH8.0的TE(Tris/EDTA)溶解質(zhì)粒DNA，即可得到質(zhì)粒DNA。
所述工程菌包括DH5或TOP10等。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述滅菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/LNa2HPO4的溶液按下述方法制備而成將2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高壓滅菌或用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌。
本發(fā)明還提供了上述質(zhì)粒DNA的提取裝置，該裝置包括堿裂解用容器(1)、質(zhì)粒沉淀用容器(4)、盛質(zhì)粒用容器(8)和濾器，所述堿裂解用容器(1)與質(zhì)粒沉淀用容器(4)通過(guò)裝有干酪包布的濾器(2)相連，質(zhì)粒沉淀用容器(4)與盛質(zhì)粒用容器(8)通過(guò)裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)相連，質(zhì)粒沉淀用容器(4)、盛質(zhì)粒用容器(8)上部均設(shè)有閥門(mén)(6)；質(zhì)粒沉淀用容器(4)通過(guò)連接管(3)外接真空泵，且連接管(3)裝有密封閥門(mén)；盛質(zhì)粒用容器(8)通過(guò)連接管(7)外接真空泵，且連接管(7)裝有密封閥門(mén)。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述堿裂解用容器(1)、質(zhì)粒沉淀用容器(4)和盛質(zhì)粒用容器(8)均采用不銹鋼制成。
該裝置可根據(jù)需要設(shè)計(jì)成不同大小規(guī)格，質(zhì)粒沉淀用容器(4)為堿裂解用容器(1)體積的2～6倍。所述裝有干酪包布的濾器(2)和裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)均可為可換膜濾器。所述裝有干酪包布的濾器(2)的濾膜為4～6層的干酪包布，所述裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)的混合纖維素酯微孔濾膜孔徑為0.22μm。
本發(fā)明對(duì)堿裂解質(zhì)粒提取法進(jìn)行了改進(jìn)，省去了離心的步驟，簡(jiǎn)化了質(zhì)粒提取的過(guò)程，并且解決了規(guī)?；崛≠|(zhì)粒的問(wèn)題，并且產(chǎn)量高，能從達(dá)每升培養(yǎng)液提取大約50mg質(zhì)粒，純度好，OD260/280的平均值為1.89。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明采用了改良的TB(Terrific Broth)培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，提高了細(xì)菌和質(zhì)粒的產(chǎn)量，明顯高于用LB培養(yǎng)基發(fā)酵的工程菌；本發(fā)明利用了價(jià)格便宜、常用的干酪包布和0.22μm的混合纖維素酯微孔濾膜代替了經(jīng)典方法中的過(guò)濾的步驟，節(jié)約了成本和時(shí)間，而且產(chǎn)量和純度比較高，能達(dá)到一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求；本發(fā)明利用了50～60℃的TE或雙蒸水溶解質(zhì)粒，提高了產(chǎn)量及效率；本發(fā)明可用于各種規(guī)模的質(zhì)粒提取，從幾毫升到幾升，甚至更大規(guī)模的質(zhì)粒提取；本發(fā)明可滿足不同規(guī)模的質(zhì)粒提取要求，提取過(guò)程簡(jiǎn)單易行，而且質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量都很好，可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化，還可以滿足核酸疫苗的生產(chǎn)。


圖1為改良Terrific Broth對(duì)工程菌產(chǎn)量的影響圖。
圖2為本發(fā)明提取的質(zhì)粒瓊脂糖電泳圖譜。
圖3為本發(fā)明提取的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。
圖4為本發(fā)明的提取裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1質(zhì)粒的小量制備，從3mL工程菌DH5培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒pMD-18T，可提取質(zhì)粒296μg，OD260/280的值在1.8～2.0之間。
(1)工程菌的培養(yǎng)挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落(工程菌DH5)，接種于2.0ml改良TB(含60μg/mL氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約12～14h)，得到對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物(OD值約為0.6)，接種體積百分比為0.5～1％。改良TB液體培養(yǎng)基將組分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60℃，再加100mL經(jīng)滅菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液(即將2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高壓滅菌或用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌)。所加培養(yǎng)液(改良TB液體培養(yǎng)基)不超過(guò)所用培養(yǎng)容器的四分之一。
(2)工程菌的裂解采用《分子克隆》的堿裂解法裂解工程菌。
取步驟(1)中3ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。將細(xì)菌(培養(yǎng)出的工程菌)沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。加200μl新鮮配制的溶液II，顛倒數(shù)次混勻(不要?jiǎng)×艺袷?，并將離心管放置于冰上2～3min，使細(xì)胞膜裂解(溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清)。加入150μl預(yù)冷的溶液III，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，可在冰上放置3～5min。溶液III為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。
上述試劑按下述方法配制溶液I50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml，在10lbf/in2(6.895×104)高壓滅菌15min，貯存于4℃。
溶液II0.2N NaOH，1％SDS，2N NaOH 1ml，10％SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配制。
溶液III醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8，5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)質(zhì)粒的提取純化裂解產(chǎn)物通過(guò)4～6層干酪包布過(guò)濾，利用針筒式濾器和注射器來(lái)完成，收集濾液，加入RNA酶，終濃度為20ug/mL，37℃作用20分鐘，然后向?yàn)V液中加入0.6濾液體積的異丙醇，室溫放置2分鐘，吸入注射器中，然后用孔徑0.22μm的混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，棄去濾液，質(zhì)粒留在混纖膜上，用70％的乙醇沖洗混合纖維素酯微孔濾膜2～3次，充分風(fēng)干濾膜，最后根據(jù)需要用50～60℃的雙蒸水(或50～60℃的pH8.0的TE)溶解質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖3)。
如圖1所示，為改良Terrific Broth對(duì)工程菌產(chǎn)量的影響。A1為1.5mL改良Terrific Broth(改良TB液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)出的工程菌，A2為相同條件下LB培養(yǎng)出的工程菌，經(jīng)測(cè)定其OD值，A1的細(xì)菌含量是A2的5倍。
如圖2所示，為本發(fā)明提取的質(zhì)粒瓊脂糖電泳圖譜。提取的質(zhì)粒為pAdTrack，中間的是2000bp的marker，無(wú)RNA污染。
如圖3所示，為本發(fā)明提取的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。通過(guò)酶切證實(shí)本方法提取的質(zhì)粒能滿足一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。這是提取的含豬圓環(huán)病毒基因ORF2、ORF1+2和ORF1的質(zhì)粒pAdTrack進(jìn)行的酶切，得到了相應(yīng)的片段，證明該法提取的質(zhì)粒能滿足分子生物領(lǐng)域試驗(yàn)的基本要求。
實(shí)施例2質(zhì)粒的大規(guī)模制備同實(shí)施例1中的方法培養(yǎng)工程菌，要求所加培養(yǎng)液不超過(guò)所用培養(yǎng)容器的四分之一，300轉(zhuǎn)/分鐘劇烈震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。利用本發(fā)明的提取質(zhì)粒的裝置進(jìn)行制備。從500mL工程菌可提取50mg質(zhì)粒，OD260/280的值在1.8～1.9之間。其中加溶液I 60mL，溶液II 120mL，溶液III 90mL。
實(shí)施例3根據(jù)需要來(lái)選擇，該裝置可設(shè)計(jì)成不同大小規(guī)格。如圖4所示，本發(fā)明的質(zhì)粒DNA的提取裝置，該裝置包括堿裂解用容器1、質(zhì)粒沉淀用容器4、盛質(zhì)粒用容器8和濾器，所述堿裂解用容器1與質(zhì)粒沉淀用容器4通過(guò)裝有干酪包布的濾器2相連，質(zhì)粒沉淀用容器4與盛質(zhì)粒用容器8通過(guò)裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器5相連，質(zhì)粒沉淀用容器4、盛質(zhì)粒用容器8上部均設(shè)有閥門(mén)6；質(zhì)粒沉淀用容器4通過(guò)連接管3外接真空泵，且裝有密封閥門(mén)6；盛質(zhì)粒用容器8通過(guò)連接管7外接真空泵，且裝有密封閥門(mén)6；所述堿裂解用容器1、質(zhì)粒沉淀用容器4和盛質(zhì)粒用容器8采用不銹鋼制成。該裝置可根據(jù)需要設(shè)計(jì)成不同大小規(guī)格，質(zhì)粒沉淀用容器4是堿裂解用容器1體積的2～6倍，裝有干酪包布的濾器2和裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器5均可為可換膜濾器。所述裝有干酪包布的濾器2的濾膜為4～6層的干酪包布，所述裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器5的混合纖維素酯微孔濾膜孔徑為0.22μm。
堿裂解用容器1與裝有干酪包布的濾器2相連，連接處密封，裂解液在與質(zhì)粒沉淀用容器4相連的真空泵的作用下，經(jīng)裝有干酪包布的濾器2進(jìn)入質(zhì)粒沉淀用容器4，進(jìn)入質(zhì)粒沉淀用容器4后關(guān)閉其上部的閥門(mén)6，通過(guò)連接管3向質(zhì)粒沉淀用容器4中的濾液中加入RNA酶和異丙醇，在與盛質(zhì)粒用容器8連接的真空泵的作用下，經(jīng)過(guò)裝有孔徑0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜的濾器5進(jìn)入盛質(zhì)粒用容器8，質(zhì)粒沉淀用容器4和盛質(zhì)粒用容器8分別通過(guò)連接管3、連接管7外接真空泵，且裝有密封閥門(mén)。
本發(fā)明質(zhì)粒DNA的提取裝置中的工藝流程如下把收集的工程菌放入堿裂解用容器1中，按照前述堿裂解法先后加入溶液I、溶液II、溶液III，堿裂解用容器1中的裂解液在真空泵的作用下通過(guò)裝有干酪包布的濾器2(濾膜為4～6層的干酪包布)進(jìn)入質(zhì)粒沉淀用容器4，通過(guò)連接管3添加異丙醇，質(zhì)粒沉淀后，在與盛質(zhì)粒用容器8相連的真空泵作用下，通過(guò)裝有0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜的濾器5，質(zhì)粒留在膜上，再向質(zhì)粒沉淀用容器4中添加70％的乙醇，沖洗質(zhì)粒兩次，換一個(gè)清潔無(wú)菌的盛質(zhì)粒用容器8，在質(zhì)粒沉淀用容器4中加入雙蒸水溶解質(zhì)粒，通過(guò)真空泵作用，把質(zhì)粒收集到清潔無(wú)菌的盛質(zhì)粒用容器8。
如上所述，可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒DNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)工程菌的培養(yǎng)將工程菌接種于改良TB液體培養(yǎng)基中，37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12～14小時(shí)，得到對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物即OD值為0.6的培養(yǎng)物；所述接種體積百分比為0.5～1％；所述改良TB液體培養(yǎng)基為將組分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，上述各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60℃，再加100mL經(jīng)滅菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/LNa2HPO4的溶液；(2)工程菌的裂解取步驟(1)中的培養(yǎng)物采用堿裂解法裂解工程菌；(3)質(zhì)粒的提取純化裂解產(chǎn)物通過(guò)4～6層干酪包布進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，加入RNA酶，使終濃度為20ug/mL，37℃作用20分鐘，然后向?yàn)V液中加入0.6濾液體積的異丙醇，室溫放置2分鐘，沉淀質(zhì)粒，然后用混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，棄去濾液，質(zhì)粒留在膜上，用70％的乙醇沖洗混合纖維素酯微孔濾膜2～3次，風(fēng)干濾膜，最后用50～60℃的雙蒸水或pH8.0的TE溶解質(zhì)粒DNA，即可得到質(zhì)粒DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA的提取方法，其特征在于，所述工程菌包括DH5或TOP10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA的提取方法，其特征在于，所述滅菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液按下述方法制備而成將2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高壓滅菌或用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌。
4.一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，該裝置包括堿裂解用容器(1)、質(zhì)粒沉淀用容器(4)、盛質(zhì)粒用容器(8)和濾器，其特征在于，所述堿裂解用容器(1)與質(zhì)粒沉淀用容器(4)通過(guò)裝有干酪包布的濾器(2)相連，質(zhì)粒沉淀用容器(4)與盛質(zhì)粒用容器(8)通過(guò)裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)相連，質(zhì)粒沉淀用容器(4)、盛質(zhì)粒用容器(8)上部均設(shè)有閥門(mén)(6)；質(zhì)粒沉淀用容器(4)通過(guò)連接管(3)外接真空泵，且連接管(3)裝有密封閥門(mén)；盛質(zhì)粒用容器(8)通過(guò)連接管(7)外接真空泵，且連接管(7)裝有密封閥門(mén)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，其特征在于，所述堿裂解用容器(1)、質(zhì)粒沉淀用容器(4)和盛質(zhì)粒用容器(8)均采用不銹鋼制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，其特征在于，質(zhì)粒沉淀用容器(4)為堿裂解用容器(1)體積的2～6倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，其特征在于，所述裝有干酪包布的濾器(2)和裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)均為可換膜濾器。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，其特征在于，所述裝有干酪包布的濾器(2)的濾膜為4～6層的干酪包布，
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種質(zhì)粒DNA的提取裝置，其特征在于，所述裝有混合纖維素酯微孔濾膜的濾器(5)的混合纖維素酯微孔濾膜孔徑為0.22μm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種質(zhì)粒DNA的提取方法及其提取裝置，該方法包括如下步驟工程菌的培養(yǎng)；工程菌的裂解；質(zhì)粒的提取純化。本發(fā)明采用了改良的TB培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，提高了細(xì)菌和質(zhì)粒的產(chǎn)量；本發(fā)明利用了價(jià)格便宜、常用的干酪包布和混合纖維素酯微孔濾膜代替了經(jīng)典方法中的過(guò)濾的步驟，節(jié)約了成本和時(shí)間，而且產(chǎn)量和純度比較高；本發(fā)明利用了50～60℃的雙蒸水或TE溶解質(zhì)粒，提高了產(chǎn)量及效率；本發(fā)明可滿足不同規(guī)模的質(zhì)粒提取要求，提取過(guò)程簡(jiǎn)單易行，而且質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量都很好，可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化，還可以滿足核酸疫苗的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1958800SQ20061012371
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
發(fā)明者宋長(zhǎng)緒, 王建龍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所