專利名稱：一種靶向性共表達(dá)p53和Mda-7的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明敘述了一種構(gòu)建在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù) 制的、并表達(dá)黑色素細(xì)胞分化相關(guān)基因的、可應(yīng)用于腫瘤基因治療的新型重組 腺病毒的方法。
背景技術(shù)：
黑色素細(xì)胞分化相關(guān)基因(英文名melanoma differentiation associated (mda) genes)，又稱白細(xì)胞介素-24(縮寫IL-24、下同)，屬于白細(xì)胞介素-10家族的一 員。Mda-7/IL-24基因是一個(gè)結(jié)構(gòu)上保守的基因，其表達(dá)產(chǎn)物是由206個(gè)氨基酸 組成的一種糖蛋白。Mda-7/IL-24是在經(jīng)干擾素-6和mezerein (MEZ)處理黑色素細(xì)胞后應(yīng)用差異雜 交法發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有特異性腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。其抗腫瘤機(jī)理被認(rèn)為主要與 激活免疫系統(tǒng)有關(guān)。它的表達(dá)限于黑色素徊細(xì)胞和與免疫糸統(tǒng)相關(guān)的組織，如 脾臟、胸腺和外周血單核細(xì)胞。用多脂糖處理外周血單核細(xì)胞，可誘導(dǎo) Mda-7/IL-24基因表達(dá)。另一方面，用純化的重組Mda-7/IL-24蛋白處理外周血 單核細(xì)胞，可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6、干擾素-Y 、腫瘤壞死因子-a、白細(xì)胞介素-1 P 、 白細(xì)胞介素-12和集落細(xì)胞刺激因子表達(dá)(DevanandSarkar， etal:PNAS, 2005. 105(39) :14034-14039)。多種腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究證明該基因具有區(qū)分正常 細(xì)胞和癌細(xì)胞的能力、能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡功能以及抑制血管形成和腫瘤生長、 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力、并使腫瘤細(xì)胞對化學(xué)藥、生物制劑和放射線治療更為敏感和協(xié)同冶療作用，而更重要的是對正常細(xì)胞沒有明顯毒性作用。目前 在臨床驗(yàn)證療效令人滿意。在晚期腺癌患者的臨床I期和II期驗(yàn)證中表明是安全的和耐受良好的， 一次瘤內(nèi)注射可致大多數(shù)腫瘤細(xì)胞凋亡。認(rèn)為Mda-7是一 個(gè)具有雙重作用的細(xì)胞因子，其正常生理功能可能與免疫系統(tǒng)的特殊方面有關(guān)， 而其過表達(dá)則致特異性腫瘤細(xì)胞凋亡(Fi sher PB, et al:(:驟乂'「 Blol Ther. 2003 Jul-Aug;2(4 Su卯l 1) :S23-37; Fisher PB et al: (:ur「 (kw Tlier. 2006 Feb;6(1) :73-91; Gupta !)， et al: Pharmacol Ther. 2006 S?。?11(3) :596-628. Epub 2006 Feb 7)。因而，Mda-7/IL-24將有望成為一種安全、有效，擁有巨大 市場前景的治療腫瘤的生物藥物(EMML^EE, C證r Res. 2005 Nov 15;65(22):10128-38; Chada S,改al: C肌cer Gene Ther 2005 Nov 11; (Gupta P, et al: Pharnmcol Ther. 2006 Feb 3; I醒e S,改al: C肌Gene Ther. 2006 Feb;6(1 ):73-91;: Mivah織R, et al: Cancer G置Then 2006 Mar 10)。P53基因是腫瘤抑制基因家族中的主要成員，是目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤發(fā)生的 相關(guān)性最高的基因。研究證明野生型P53基因72位點(diǎn)存在常見的脯氨酸(P72， 下同)/精氨酸(R72，下同)多態(tài)性，這種多態(tài)性對于野生型P53基因的細(xì)胞調(diào)亡 誘導(dǎo)功能上有很大的意義。P53基因?yàn)镽72型的，其細(xì)胞調(diào)亡能力比P72型的 強(qiáng)2-15倍以上(Murphy M， et al: 2003, 3(3):357-65， Nat. Genetics)。我國野生型 P53基因已用于臨床基因治療，取得一定療效。但仍有很大發(fā)展空間。基因治療是應(yīng)用各種載體、尤其是病毒載體，直接進(jìn)入人體細(xì)胞/組織，表達(dá) 治療性目的基因的輸送系統(tǒng)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。目前在治療腫瘤的基因治 療中以腺病毒應(yīng)用最為廣泛，具有安全、有效，治療持續(xù)時(shí)間較長的特點(diǎn)。
同時(shí)由于這種病毒載體自身的原因，如因其感染細(xì)胞須與細(xì)胞上的受體coxsackie-adenovirus rec印tor (CAR,下同)結(jié)合才能起作用，故其感染與細(xì) 胞膜上的受體數(shù)量呈正比。因此，對某些組織細(xì)胞而言，由于受體數(shù)量少，尤 其是腫瘤細(xì)胞表面的CAR受體偏少，對它們的感染有限，故這種病毒難以感染 并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有效發(fā)揮其攜帶基因的治療作用。為了克服這種載體的陷缺，近年研究人員通過基因突變技術(shù)，將腺病毒載 體的，與進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)的纖維突結(jié)基因的數(shù)個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，扦入與integrin 受體相結(jié)合的氨基酸多肽Arg-Gly-Asp(GRB)。以前的研究證明大多數(shù)腫瘤細(xì)胞是a v-integrin陽性,而某些晚期癌癥的CAR表達(dá)是下降的(ChattopadhyayN., et al: J.Exp.Ckin. Cancer Res, 20(2001) :269-275; M.D. Sachs, et al: Urology 60(2002)531-536)。因而，纖維突結(jié)基因突變的腺病毒載體可大大提高感染細(xì)胞的能力，并證明應(yīng)用這種腺病毒載體至少減少腺病毒用量一個(gè)數(shù)量級以上Yuka Okada，et al: BBA 16709(2004) :172-180)。毫無疑問，靶向性基因治療是人類在抗癌斗爭中夢未以求的一種利器。靶向性基因治療是目前和將來癌癥治療研究的一個(gè)非常重要的發(fā)展方向。近年來， 一種腫瘤特異性啟動(dòng)子已被發(fā)現(xiàn)和克隆。更為重要的是，此腫瘤 特異性啟動(dòng)子在正常細(xì)胞內(nèi)沒有活性。新近，應(yīng)用此腫瘤特異性啟動(dòng)子于腺病 毒載體。構(gòu)建成一種僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)行自身復(fù)制的腺病毒載體，形成所謂 條件性復(fù)制能力的腺病毒載體(CRCA)。因此，被確認(rèn)為一種腫瘤特異性啟動(dòng)子 (Haviv, Y. S. ， etal:Curr. Gene Ther. Adv, Drug. Delivery Rev. 53， 135-154; Haviv, Y.S.，et al: Curr. Gene. Ther. (2003)3,357-365; Su， ZZ. et al.
PNAS(2005)， 102(4): 1059-1064; Devanand Sarkar, et al. NAS (2005), 102 (39): 14034-14039)。綜上所述，應(yīng)用內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)連接新型p53和Mda-7基因，構(gòu)建以腫 瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)上述雙重基因的表達(dá)盒，結(jié)合腺病毒纖維突結(jié)突變，構(gòu)建成 一種具有更強(qiáng)細(xì)胞感染力、又僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的重但組腺病毒，為臨床 治療惡性腫瘤提供一種全新的、靶向性腫瘤基因治療的腺病毒，將擁有巨大市場 前景的，產(chǎn)生不可估量的的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是構(gòu)建腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)新型p53和Mda-7基因的 表達(dá)盒，并結(jié)合腺病毒纖維突結(jié)突變，形成一種新型靶向性表達(dá)的重組腺病毒。 使其成為臨床上治療惡性腫瘤的新一代腺病毒產(chǎn)品。本發(fā)明的新型重組腺病毒結(jié) 構(gòu)，其主要特點(diǎn)為1) .腺病毒纖維突結(jié)基因扦入氨基酸肽，此氨基酸肽由精氨酸、甘氨酸和天門冬 酰氨酸組成，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2) .腺病毒載體的AlE缺失區(qū)含有由腫瘤特異性啟動(dòng)子PEG-3驅(qū)動(dòng)表達(dá)新型p53 牡Mda-7以及多聚腺嘌呤的表達(dá)盒，3) .新型重組腺病毒具有在腫瘤細(xì)胞中靶向性表達(dá)新型p53和Mda-7功能；4) .腺病毒纖維突結(jié)基因的突變，使其腫瘤感染力更強(qiáng)、腫瘤細(xì)胞感染譜更廣的 特點(diǎn)。


附圖1腫瘤抑制因子p53突變型R72的內(nèi)切酶圖譜R72突變型腫瘤抑制因子 p53在突變位點(diǎn)形成新的核苷酸內(nèi)切酶small位點(diǎn)。用內(nèi)切酶small分別消化 R72突變型和野生型腫瘤抑制因子p53后，R72突變型產(chǎn)生二個(gè)DNA片段；野生 型僅產(chǎn)生一個(gè)DNA片段。圖示電泳第一泳道為landa/Hindlll DNA分子量標(biāo)記 物，第二泳道為IkBDNA分子量標(biāo)記物；第三泳道為野生型腫瘤抑制因子P53; 第四泳道R72突變型腫瘤抑制因子P53。附圖2野生型和突變型p53對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長的影響。用等量野生型和 突變型P53轉(zhuǎn)染徊細(xì)胞后48小時(shí)，觀察與計(jì)數(shù)存活的細(xì)胞數(shù)。此為三次實(shí)驗(yàn)的 細(xì)胞平均計(jì)數(shù)結(jié)果，表明人源抑癌基因R72型p53比野生型p53具有更強(qiáng)的細(xì)胞凋 亡功能。附圖3 Mda-7基因的克隆經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，克隆p53AIPl:于T-Easy載體。 第一、第二泳道為DNA分子量標(biāo)記物，第三泳道為Mda-7的EcoRl酶切結(jié)果，產(chǎn) 生二個(gè)片段。箭頭所指為Mda-7:基因。附圖4腫瘤特異性啟動(dòng)子的克隆此結(jié)果為合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸后的PCR反 應(yīng)產(chǎn)物。第一泳道為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)、第二、第三和第四道均為PCR反應(yīng)產(chǎn)物。 箭頭為PCR反應(yīng)產(chǎn)物。附圖5由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒構(gòu)成圖譜此表達(dá)盒圖譜顯示由位于 N-未端的腫瘤特異性啟動(dòng)子、新型p53、 IRES、 Mda-7和SV40多聚腺嘌呤組成， 并以不同內(nèi)切,點(diǎn)相連接。附圖6表達(dá)由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒的重組腺病毒結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖中
兩瑞分別為腺病毒的左臂和右臂，表達(dá)盒由腫瘤特異性啟動(dòng)子、R72型腫瘤抑制 因子p53、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES，下同)、Mda-7基因和SV40多聚腺苷酸組成。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明的內(nèi)容，而不是^任何方式限制本發(fā)明的 范圍。本發(fā)明所用的腺病毒載體為Stratagene公司產(chǎn)品，包括腺病毒穿載體 PaDeasy-1 。穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttie-IRES。實(shí)施例一、R72型腫瘤抑制因子p53的形成其方法是以克隆的人p53基因?yàn)?模板，采用基因突變技術(shù)，使野生型第72位脯氨酸的密碼子ccc(P72)突變成 精氨酸的密碼子cgg(R72)，在突變區(qū)形成新的核苷酸內(nèi)切酶small位點(diǎn)。1).人野生型腫瘤抑制因子p53基因5'-端Ncol至笫72位密碼子片段擴(kuò)以人野生型P72腫瘤抑制因子p53基因cDNA中N'-端-Ncol-突變區(qū)片段作為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)如下引物l:N端- 5， -gccttccgggtcact咖catg^aggagccg-3' 30加er Ncol 引物2: ccg為精氨酸密碼子N端..5， -gaatgccagaggctgctccc[cg^gt碟cccctgca-3， 35 merPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后， 擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。2) .人野生型腫瘤抑制因子p53基因笫72密碼子區(qū)至C -端Ncol片段擴(kuò)增以上述的片段區(qū)cDNA為模板，用人工合成的下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)如下引物3: ccg為精氨酸密碼子N端 5- aggggccac^^gggagcagcctctggcattc -332班er 引物4:N端 5，-gtagatgg^^^cgcggacgcgggtg-3， 28 aer Ncol將PCR擴(kuò)增的二個(gè)產(chǎn)物按1)的方法聯(lián)接至T-easy載體，經(jīng)DNA測序正確無誤。3) .上述二個(gè)PCR片段產(chǎn)物的拼接，形成Ncol Nco1片段將l)和2)中含上述DNA片段的T-easy載體質(zhì)粒DNA分別用Ncol和Small 完全酶切，純化后，再與經(jīng)Ncol酶切的野生型p53基因cDNA進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化 細(xì)菌、質(zhì)粒抽提和經(jīng)酶切檢測拼接方向正確后，構(gòu)建成R72型的野生型P53基 因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53 。實(shí)施例二、 Mda-7DNA片段的人工合成及其克隆根椐巳知基因序列，按常規(guī)技 術(shù)人工合成Mda-7的編碼DNA片段，并以下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 引物1(43證)5， - agc[gggccc[tatg肪ttttcaacagaggctgcaa8gcctgtgg -3， S坦all引物2(37 mer):5， - cgacagatctatcagagcttgtagaatttctgcatcc -3， XbalPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后， 擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。實(shí)施例三、腫瘤特異性啟動(dòng)子DNA片段的人工合成及其克隆根椐已知基因序 列，按常規(guī)技術(shù)人工合成腫瘤特異性啟動(dòng)子的DNA片段，并以下述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物l:(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Nrul、 Kpnl和Xbal) 5'- tgtcgcgaggtacctctagaatttcagtgttgttttcct -3'弓!物2:(在C-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRl和Stul) 5'- gcgatatcaggcctgtccggttcggtttgccaaaagcg - 3'PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。實(shí)施例四、由腫瘤特異性啟動(dòng)子、新型p53、內(nèi)部核糖體結(jié)合點(diǎn)(IRES)和Mda-7 組成的表達(dá)盒的構(gòu)建。本實(shí)施例所用的Stratagene公司產(chǎn)品為pShuttle-IRES， 以此載體為骨架構(gòu)建表達(dá)盒。通過多次不同的內(nèi)切酶消化、連接反應(yīng)、感受態(tài) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化和測序證實(shí)，完成此表達(dá)盒構(gòu)建。即以5'-末端為Smal內(nèi)切酶位點(diǎn) 和3'-末端為Xbal內(nèi)切酶位點(diǎn)的Mda-7基因片段拼接于SV40多聚腺嘌呤的上 游，而位于IRES的下游；以5'-末端為EcoR V和3'-末端為Notl內(nèi)切酶位 點(diǎn)的新型P53片段，拼接于IRES的上游；以5，-末端為Nrul和3'-末端為 EcoRl內(nèi)切酶位點(diǎn)的腫瘤特異性啟動(dòng)子PEG-3片段，拼接于新型P53片段的上游，至此，此表達(dá)盒構(gòu)建才告完成。實(shí)施例五腺病毒纖維基因HI環(huán)扦入精氨酸、甘氨酸和天門冬酰氨酸多肽的實(shí) 施，參見"一種在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制的新型腺病毒載體"專利申請。申請 號為200620063702.5。實(shí)施例六、構(gòu)建含此表達(dá)盒的腺病毒穿梭質(zhì)粒1) .以內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化上述含表達(dá)盒的pIRES質(zhì)粒DNA，將產(chǎn)生 Kpnl-Kpnl片段和Kpnl-Sail 二個(gè)DNA片段，由此，該表達(dá)盒將包含SV40的多 聚腺嘌呤DNA序列。消化后，經(jīng)1. 2%瓊脂糖電泳分離、純化所需DNA片段備用。2) .以內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化pShuttle穿梭載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)1. 2%瓊脂 糖電泳分離、純化線性化的pShuttle載體DNA備用。3) .將上述線性化的pShuttle載體DNA片段和消化表達(dá)盒產(chǎn)生的Kpnl-Kpnl 片段和Kpnl-Sail 二個(gè)DNA片段，在連接酶作用下進(jìn)行拼接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受 態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)擴(kuò)增。4) .篩選細(xì)菌轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)擴(kuò)增，抽取重組質(zhì)粒DNA，最后再經(jīng)酶切消化和 DNA測序證實(shí)。實(shí)施例七、靶向性共表達(dá)新型p53和Mda-7基因的重組腺病毒1).制備線性化含新型p53和Mda-7基因表達(dá)盒的重組穿梭質(zhì)粒 pShuttle-p53-Mda-7:取適量上述重組穿梭質(zhì)粒DNA，經(jīng)核苷酸內(nèi)切酶Pmel消 化、電泳分離、純化Pmel酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒DNA,備用。2) .將上述線性化重組穿梭質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化已預(yù)轉(zhuǎn)化腺病毒載體pAdEasy-1 的BJ5183-AIM細(xì)菌，進(jìn)行同源重組，并以抗生素卡拉霉素進(jìn)行篩選。含腺病 毒載體pAdEasy-1重組體的細(xì)菌將為耐卡拉霉素細(xì)株。3) .擴(kuò)增含腺病毒載體pAdEasy-1重組體的、耐卡拉霉素的細(xì)株，即擴(kuò)增重 組腺病毒載體pAdEasy-1 DNA。抽提腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，用內(nèi)切 酶Pacl消化，線性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，并分離純化備用。4).按Stratagene公司關(guān)于AdE呵XL Adenoviral Vector System說明手 冊介紹的方法，將上述純化備用的線性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA轉(zhuǎn) 染AD"胚胎腎293細(xì)胞。5) .轉(zhuǎn)染AD-胚胎腎293細(xì)胞7-10后，備制原代重組腺病毒母液，并優(yōu)化原 代重組腺病毒母液的感染AD-胚胎腎293細(xì)胞的條件，擴(kuò)增重組腺病毒。6) .擴(kuò)增足量的高滴定度的重組腺病毒，用于研究和動(dòng)物試驗(yàn)。<formula>formula see original document page 15</formula>cccgcgtccgcgccatggccatctBcaagcagtcacagca catgBCggag gttgtgaggc660gctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtct ggcccctcct cagcatctta720tccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatga c卿肌cact tttcgacata780gtgtggtggtgccctBtgagccgcctgaggttggctctga ctgtaccacc atccactaca840actacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccg gaggcccatc ctcaccatca,tcacactggaagactccagtggt肪tctactgggscggaa cagctttgag gtgcatgttt960gtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagagga卿gaa tctccgcaag肌3gggg3gc1020ctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcact gccc肌caac accagctcct1080ctccccagcca肌gaagaaaccactggatggagaatattt cacccttcag atccgtgggc1140gtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggcctt ggaactcaag gatgcccagg1200ctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagcca cctgaagtcc aaaaagggtc1260agtctacctcccgccataaaaaactcatgttc肌gacaga agggcctgsc tcagEictgac1320attctccacttcttgttccccEictgscagcctcccacccc catctctccc tcccctgcca1380ttttgggttttgggtctttgaacccttgcttgcaataggt gtgcgtc卿agcacccagg1440acttccatttgctttgtcccggggctccactgaacaagtt ggcctgcact ggtgttttgt1500tgtggggaggaggatggggagtaggacBtaccagcttaga ttttaaggtt tttactgtga1560gggatgtttggg卿tgt肌g肌atgttcttgcagttaag ggttagttta caatcagcca1620cattctaggtagggatccceicttcaccgtactaaccaggga agctgtccct cactgttgac1680tagtaattcgcggccgcgtcg1701〈212〉 Type : DNA <211> Length : 1701SequenceN腿e : p53(72R)SequenceDescription :MetGluGluProGlnSerAspProSerValGluProProLeuSerGlnGluThrPheSer 15 10 15 20AspLeuTrpLysLeuLeuProGluAsnAsnValLeuSerProLeuProSerGlpAlaMet 25 30 35 40AspAspLeuMetLeuSerProAspAspIleGluGlnTrpPheThrGluAspProGlyPro 45 50 55 60AspGluAlaProArgMetProGluAlaAlaProArgValAlaProAlaProAlaAlaPro 65 70 75 8085 90 95 100LysThrTyrGlnGlySerTyrGlyPheArgLeuGlyPheLeuHisSerGlyThrAlaLys105 110 115 120SerValThrCysThrTyrSerProAlaLeuAsnLysMetPheCysGlnLeuAlaLysThr125 130 135 140CysProValGlnLeuTrpValAspSerThrProProProGlyThrArgValArgAlaMet145 150 155 160165 170 175 180ArgCysSerAspSerAspGlyLeuAlaProProGlnHisLeuIleArgValGluGlyAsn185 190 195 200LeuArgValGluTyrLeuAspAspArgAsnThrPheArgHisSerValValValProTyr205 210 215 220GluProProGluValGlySerAspCysThrThrlleHisTyrAsnTyrMetCysAsnSer225 230 235 240245 250 255 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1，一種靶向性共表達(dá)新型p53和Mda-7的重組腺病毒。本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品AdEasy-1載體，為E1和E3區(qū)缺失的腺病毒載體。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)盒由腫瘤特異性動(dòng)子、新型p53、IRES、Mda-7和SV40多聚腺嘌呤組成，其主要特征為a).人野生型p53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；b).P53抑癌基因在其N-末端以內(nèi)切酶EcoR V和C-末端以內(nèi)切酶Not1片段拼接于pIRES質(zhì)粒上游；c).Mda-7基因在其N-末端以內(nèi)切酶Sma1和C-末端以內(nèi)切酶Xba1片段拼接于pIRES質(zhì)粒下游；d).腫瘤特異性啟動(dòng)子在其N-末端以內(nèi)切酶Nru1和C-末端以內(nèi)切酶EcoRV片段拼接于新型p53基因的上游；經(jīng)重組后，該表達(dá)盒位于腺病毒載體的E1缺失區(qū)。該重組腺病毒具有靶向性共表達(dá)p53和Mda-7的作用，因而具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡功能、抗癌譜更廣的生物功能。
2.根椐權(quán)利要求l， 一種腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)二種有協(xié)同抗癌作用 基因的表達(dá)盒，其含有下列氨基酸序列和具有轉(zhuǎn)錄功能的脫氧核苷酸序列a) .與人腫瘤抑制基因p53的親本多肽的氨基酸序列基本一致，僅有一個(gè) 氨基酸的取代，即此腫瘤抑制基因P53的第72異氨基酸由精氨酸(R72)代替野 生型P53同一位置的脯氨酸(P72)。所述腫瘤抑制基因p53親本來源于人；b) —種親本源于人的p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(p53AIPl)基因； c) 腫瘤特異性啟動(dòng)子為鼠源PEG-3基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包含的區(qū)域?yàn)?-118到+ 194脫氧核苷酸組成；d) 內(nèi)部校核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)源于腦心肌炎病毒；
3、 根椐權(quán)利要求1和要求2所述重組腺病毒，其特征在于表達(dá)盒中驅(qū)動(dòng)共 表達(dá)新型人腫瘤抑制基因p53和Mda-7基因的啟動(dòng)子序列不僅限于鼠源腫瘤特 異性PEG-3基因啟動(dòng)子，也包括其他腫瘤特異性啟動(dòng)子，如人端粒酶啟動(dòng)子、雌 激素和低氧反應(yīng)啟動(dòng)子、人前列腺癌特異因子啟動(dòng)和肝胎兒甲型球蛋白啟動(dòng)子 (AFP，胎甲球蛋白啟動(dòng)子)；。
4、 根椐權(quán)利要求1，表達(dá)盒中共表達(dá)的p53基因既可位于IRES的上游，也 可位于其下游；Mda-7亦如此。
5、 根椐權(quán)利要求1和要求3，由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)的、位于IRES 上游的基因既可是本發(fā)明的新型P53(72R)，也可以是p53(46F);位于IRES下 游的基因既可是Mda-7基因，也可以是其他促細(xì)胞凋亡基因，如Noxa、 p53RFP和 P27(Kipl);免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-2、 IL-6、 IFN-y ,粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激 因子(GMCSF)和TNF-a等；
6、 根椐權(quán)利要求l，本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品 AdEasy-1載體，為El和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。但本發(fā)明使用的腺病 毒載體不限于此復(fù)制缺陷型Ad5型腺病毒，也包括條件性復(fù)制的腺病毒載體，如 本人申請的另一專利"一種用于臨床腫瘤基因治療的新型腺病毒載體"所敘述 的腺病毒載體。該專利敘述的條件性復(fù)制腺病毒載體為一種由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)腺病毒復(fù)制因子E1A基因僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因而具有僅能在腫瘤細(xì) 胞內(nèi)復(fù)制的能力。而且，其纖維蛋白AB環(huán)、Hl環(huán)和/或Shaft進(jìn)行了突變，具 有感染力更強(qiáng)、感染細(xì)胞譜更廣的特點(diǎn)。此新型重組腺病毒也可僅表達(dá)Mda-7基因。
7、 根椐權(quán)利要求1，此靶向性共表達(dá)新型p53和Mda-7的重組腺病毒為一 種用于治療多種惡性癌癥疾病的基因治療藥物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦 形劑。
8、 如權(quán)利要求7所述的基因治療藥物，其特征在于，權(quán)利要求1所述的 由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)R72型人p53基因和Mda-7基因共表達(dá)的重組腺病毒， 所述的有效抗癌成份為細(xì)胞凋亡功能更強(qiáng)的R72型人p53基因和Mda-7基因的 表達(dá)蛋白質(zhì)。
9、 如權(quán)利要求l、 5、 6、 7和8的基因治療表達(dá)組合藥物，其特征除權(quán)利 要求1所述的靶向性共表達(dá)R72型人p53基因和Mda-7基因的重組腺病毒之外，還包括由此腫瘤特異性啟動(dòng)子靶向性共表達(dá)含有其他具有抗癌治療效果的促細(xì) 胞凋亡因子、細(xì)胞因子和/或免疫調(diào)節(jié)因子通過內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)與R72型人p53基因或p53AIPl基因相連接的表達(dá)盒的重組腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明敘述了一種構(gòu)建靶向性共表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53和Mda-7的表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的重組腺病毒的方法及其用途和意義，其主要特征為1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2)通過內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)將新型腫瘤抑制基因p53和Mda-7基因連接；3)該表達(dá)盒的啟動(dòng)子由腫瘤特異性啟動(dòng)子PEG-3來驅(qū)動(dòng)；4)該重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的血清A5型腺病毒。該新型腺病毒具有靶向性共表達(dá)二種抗癌基因，即新型腫瘤抑制基因p53和Mda-7基因，其產(chǎn)物具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能，但對正常細(xì)胞不會(huì)造成損傷。因此，在腫瘤，尤其是惡性腫瘤的基因治療中將具有重要意義。
文檔編號C12N15/861GK101148681SQ20061012301
公開日2008年3月26日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者王尚武 申請人:王尚武