一種擬南芥aap1基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，用TRIzol法提取擬南芥幼苗的總RNA，測定OD260/OD280比值，為2.014；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收后的產(chǎn)物與PMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了1600bp的DNA條帶；測序后發(fā)現(xiàn)該基因ORF1458bp，編碼485個(gè)氨基酸的多肽，用限制性內(nèi)切酶EcoR?I和Xba?I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植物表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證；質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了一條為1600bp的DNA條帶；經(jīng)過酶切驗(yàn)證，分別獲得了8300bp的pCAMBIA3300載體與為1600bp的目的片段；說明載體構(gòu)建成功，重新命名為p3300-AAP1。
【專利說明】—種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種擬南芥AAPl基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物種子貯藏蛋白的合成受多重因素的調(diào)節(jié)，蛋白積累很大程度上取決于氨基酸的供應(yīng)。若氨基酸供應(yīng)充足，即可極大地提高植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量。氨基酸透性酶(AAP)基因是擬南芥中重要的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在主根、側(cè)根、根毛及根表皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，Yong等研究表明，過表達(dá)AAPl基因可以顯著提高了擬南芥中中性氨基酸、谷氨酸鹽和組氨酸的吸收能力，使得根部組氨基酸含量明顯上升，繼而使蛋白含量升高。AAP是由完整的膜蛋白與H+耦合催化氨基酸攝取。AAPs由多基因家族編碼，擬南芥中由八個(gè)成員組成，利用基因工程過表達(dá)AAPl基因，能夠顯著改善植物根系氨基酸的利用效率，使得根部組氨酸含量明顯上升；AAP1基因在種子中過量表達(dá)，可增加種子庫的氮含量，提高植物氮等營養(yǎng)元素，并且可以調(diào)節(jié)貯藏蛋白的合成；在酵母中表達(dá)AAP時(shí)，對(duì)氨基酸側(cè)鏈具有低選擇性。在不同細(xì)胞類型的差異表達(dá)，表明AAPs在韌皮部對(duì)氮的吸收和運(yùn)輸具有特異性。
[0003]目前人們已從分子水平上研究氨基酸載體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。擬南芥、蓖麻等植物的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因已被分離和鑒定。Chen和Bush將擬南芥ESTcDNAs克隆至缺失氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)擬南芥細(xì)胞質(zhì)膜存在轉(zhuǎn)運(yùn)賴氨酸和組氨酸的專一'丨生轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LHTl)，擬南芥大約有8個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體AAP1-8。AAPl主要運(yùn)輸帶負(fù)電荷和中性的氨基酸，AAP2和AAP4主要運(yùn)輸苯丙氨酸、纈氨酸以及脯氨酸，AAP3與AAP5主要運(yùn)輸賴氨酸和精氨酸。Boorer和Fisher將在根中表達(dá)量多的擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子AAP5克隆到爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AAP5能轉(zhuǎn)運(yùn)中性、酸性和堿性等多種氨基酸，但轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸以固定的H+:氨基酸=1:1進(jìn)行。由于AAPl基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用，能使得植物中氨基酸含量增加，我們設(shè)想可以將AAPl基因轉(zhuǎn)入普通玉米種，培育出高蛋白玉米，高蛋白玉米具有必需氨基酸含量高、營養(yǎng)富集等特點(diǎn)，是畜牧業(yè)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)飼料；普通玉米的飼用價(jià)值高于其它谷物，高蛋白玉米的飼料價(jià)值更優(yōu)于普通玉米，并且AAPl在玉米中的應(yīng)用和關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新工作，國外未見相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種擬南芥AAPl基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，進(jìn)一步研究擬南芥AAPl基因的功能，本研究從擬南芥中克隆了 AAPl基因，構(gòu)建了擬南芥AAPl基因的植物表達(dá)載P3300-AAP1，以及今后利用AAPl基因進(jìn)行氨基酸、高蛋白植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0005]其具體技術(shù)方案為:
[0006]一種擬南芥AAPl基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0007]I)用TRIzoI法提取到擬南芥幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，根據(jù)Primer5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，上游引物帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Xba I酶切位點(diǎn):
[0008]上游引物:5’ CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3 ’
[0009]下游引物:5’ GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3 ’
[0010]2)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收后的產(chǎn)物與PMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了大約1600bp的DNA條帶；經(jīng)過雙酶切驗(yàn)證，分別獲得了 2692bp的載體與大約1600bp的目的片段，可初步證明，已經(jīng)成功克隆出擬南芥AAPl基因；
[0011]3)獲得1600bp左右的目的條帶，測序后發(fā)現(xiàn)該基因0RF1458bp，編碼485個(gè)氨基酸的多肽，根據(jù)氨基酸序列推出，該基因編碼一個(gè)氨基酸透性酶；在線對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle (K-D)法計(jì)算氨基酸的親水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸處具有疏水性較強(qiáng)的特性，大約在第37個(gè)氨基酸和360-370氨基酸左右區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性；
[0012]4)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植物表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證；質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了一條約為1600bp的DNA條帶；經(jīng)過酶切驗(yàn)證，分別獲得了約8300bp的pCAMBIA3300載體與約為1600bp的目的片段；說明載體構(gòu)建成功，重新命名為 ρ3300-ΑΑΡ1。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
[0014]由于AAPl基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用，能使得植物中氨基酸含量增加，我們設(shè)想可以將AAPl基因轉(zhuǎn)入普通玉米品種，培育出高氨基酸、高蛋白玉米新材料，高氨基酸、高蛋白玉米具有必需氨基酸含量高、營養(yǎng)富集等特點(diǎn)，是畜牧業(yè)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)飼料；普通玉米的飼用價(jià)值高于其它谷物，氨基酸、高蛋白高蛋白玉米的飼料價(jià)值更優(yōu)于普通玉米，并且AAPl在玉米中的應(yīng)用和關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新工作，國外未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)成功克隆擬南芥AAPl基因并構(gòu)建P3300-AAP1植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究擬南芥AAPl在氨基酸代謝過程中的功能奠定了基礎(chǔ)，而且還為高氨基酸、高蛋白玉米新材料創(chuàng)制提供了載體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為從擬南芥中提取的RNA ；
[0016]圖2為擬南芥AAP1PCR結(jié)果的電泳圖，M, DL2000Marker ；1.PCR產(chǎn)物；
[0017]圖3為擬南芥AAPl基因克隆質(zhì)粒PCR及酶切驗(yàn)證，1、2質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，3、4質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；
[0018]圖4為pCAMBIA3300-AAPl植物表達(dá)載體構(gòu)建流程；
[0019]圖5為擬南芥AAPI基因重組質(zhì)粒PCR及酶切驗(yàn)證，1、2、3、4、5重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，1’、2’、3’、4’、5’重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0021 ] 本發(fā)明遺傳資源擬南芥采集于中國吉林省長春市。
[0022]I材料與方法
[0023]1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0024]實(shí)驗(yàn)材料:野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana), pCAMBIA3300菌種(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生化研究室保藏)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia公司)，Trizol、限制性內(nèi)切酶EcoR 1、Xba 1、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司。
[0025]1.2 方法
[0026]1.2.1擬南芥總RNA提取
[0027]取新鮮的擬南芥幼苗lg，于液氮環(huán)境中迅速研磨成粉，用TRIzoI試劑盒，按照說明書提取擬南芥總RNA，_80°C冰箱中保存總RNA。
[0028]1.2.2 第一鏈 cDNA 的合成
[0029]用試劑盒“ALL-1n-OneFirst-strand cDNA Synthesis Kit”合成第一鏈cDNA。步驟如下:取I μ g的總RNA,加入OligdTl.0 μ LddH2O補(bǔ)充至13 μ 1，65。。1min后迅速置于冰上；再依次加入下列各種成分:5XRT React1n Buffer5.0 μ l,25mM dNTPl.Ομ l,25U/y IRNase Inhibitorl.0 μ 1，200υ/μ I M-MLV RTasel μ 1，ddH204.0 μ 1A2°C 60min，85°C 5min,之后置于_2(TC冰箱保存反轉(zhuǎn)錄后的cDNA。
[0030]1.2.3AAP1基因的克隆
[0031]根據(jù)Primer5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，上游引物帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Xba I酶切位點(diǎn):
[0032]上游引物:5’ CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3 ’
[0033]下游引物:5’ GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3 ’
[0034]以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μ I擴(kuò)增體系，含1XEx Taqbuffer2.5 μ I ;2.5mM dNTP mix2.5 μ I ;10 μ mol.L-1 正、反向引物各 I μ I ；cDNAl μ I ；Ex Taq0.5 μ I ；ddH2017.5μ I。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min ；94°C 30s ；58°C 30s ；72°C lm30s ；72°C 1min ;4°C保溫，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收目的片段并與PMD-18T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 α，提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定后，選擇陽性克隆送至上海生物工程有限公司測序。
[0035]1.2.4ρ3300-ΑΑΡ1植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0036]對(duì)AAPl基因和植物表達(dá)載體PCAMBIA3300分別用EcoR I和Xba I進(jìn)行雙酶切。20 μ I 酶切體系中，質(zhì)粒 10 μ IjEcoR I 和 Xba I 各 I μ 1，10XMBuffer2y l,ddH206 y 1，37°C反應(yīng)4h，電泳回收目的條帶。將擬南芥AAPl基因與pCAM BIA3300植物表達(dá)載體用T4連接酶16°C過夜連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 α，篩選陽性重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證。
[0037]2結(jié)果與分析:
[0038]2.1擬南芥總RNA的提取
[0039]用TRIzol法提取到擬南芥幼苗的總RNA，并用NANO DR0P2000測定總RNA含量，OD26tZOD28tl為2.014。用I %的瓊脂糖變性膠電泳，三條帶清晰，證明總RNA完整性較好，純度較高，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR實(shí)驗(yàn)(圖1)。
[0040]2.2擬南芥AAPl基因的克隆及序列分析
[0041]將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA做模板，對(duì)擬南芥AAPl基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條約為1615bp的DNA條帶，與預(yù)測的目的片段大小一致。
[0042]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收后的產(chǎn)物與PMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證(圖2)，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，我們獲得了大約1615bp的DNA條帶。經(jīng)過雙酶切驗(yàn)證，我們分別獲得了 2692bp的載體與1615bp的目的片段，可初步證明，我們已經(jīng)成功克隆出擬南芥AAPl基因。
[0043]將克隆后的基因送與測序公司進(jìn)彳丁測序，測序結(jié)果與Genebank(ΝΜ_104616.4)中公布的已知序列進(jìn)行比對(duì)，由比對(duì)結(jié)果可知，從擬南芥中克隆的AAPl基因序列與GenBank中發(fā)表的序列比對(duì)，只有817bp處有一個(gè)堿基的差別，同源性達(dá)到了 99.93%，進(jìn)一步證明成功克隆出擬南芥AAPl基因。
[0044]測序成功后將測序所得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過在線軟件ProtParam(http://us.expasy.0rg/tools/protparam.html)對(duì) AAPl 目的基因進(jìn)行分析，對(duì)所預(yù)測的氨基酸序列理化性質(zhì)進(jìn)行細(xì)致的分析，由圖中我們可知:擬南芥AAPl基因編碼的氨基酸序列氨基酸數(shù)(number of amino acids)是485個(gè),分子質(zhì)量(molecular weight)為 52865.4Da,理論等電點(diǎn)(theoretical pi)8.99,正、負(fù)電荷殘基總數(shù)(total numberof positively/negatively charged residues)分別是:37 和 27,氨基酸成分(atomiccomposit1n)由 C、Η、N、0、S 元素組成，分子式(formula) C2434H3736N6060667S22，在組成擬南芥AAPl蛋白的20種氨基酸中丙氨酸(Ala)所占比例最高，達(dá)到9.9%，而色氨酸(Trp)所占比例最低,僅為1.6% ο原子總數(shù)(total number of atoms)為7465,不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為32.56,表明是一種比較穩(wěn)定的蛋白。脂肪系數(shù)(aliphatic index)為 95.15?？偲骄H水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)為 0.423。
[0045]ProtPar am分析擬南芥AAPl蛋白氨基酸序列。
[0046]本研究根據(jù)SignalP4.1server對(duì)所預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析,驗(yàn)證其是否具有信號(hào)肽及其位置，C score表示剪切位點(diǎn)分值(C值)，S score表示信號(hào)肽分值(S值)，Yscore表示綜合剪切點(diǎn)分值(Y值)。經(jīng)過分析得知,分析值中的mean S-score = 0.5,所以無信號(hào)肽。
[0047]擬南芥AAPl蛋白氨基酸序列SignalP4.1server分析。
[0048]利用TMHMM Server V.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)擬南芥AAPl氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬南芥AAPl的氨基酸序列中除3個(gè)的跨膜區(qū)域外，但對(duì)于整個(gè)擬南芥AAPl氨基酸序列來說均不在跨膜區(qū)。
[0049]擬南芥AAPl蛋白氨基酸序列TMHMM分析。
[0050]米用PortScale (http//www.expasy.0rg/cg1-bin/portscale.pi)程序?qū)︻A(yù)測的擬南芥AAPl蛋白氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析,此程序采用的是Kyte&Doolittle (K-D)法計(jì)算氨基酸的親水性或疏水性。程序中分析得知，第460氨基酸處具有疏水性較強(qiáng)的特性，大約在第37個(gè)氨基酸和360-370氨基酸左右區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性。
[0051]2.3擬南芥AAPl植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0052]為了能將AAPl轉(zhuǎn)入到擬南芥中，我們需要將AAPl基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植物表達(dá)載體上，將改造后的載體命名為P3300-AAP1。
[0053]將目的片段連接到pCAMBIA3300上，經(jīng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，我們獲得了一條約為1600bp的DNA條帶。經(jīng)過酶切驗(yàn)證，
[0054]我們分別獲得了約8300bp的pCAMBIA3300載體與約為1600bp的目的片段。用特異引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果與擬南芥AAPl測序結(jié)果完全相同。證明，我們已經(jīng)成功構(gòu)建P3300- AAP1載體。
【權(quán)利要求】
1.一種擬南芥AAPl基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用TRIzol法提取到擬南芥幼苗的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,根據(jù)Primer5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，上游引物帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Xba I酶切位點(diǎn): 上游引物:5’ CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’ 下游引物:5’ GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’ 2)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收后的產(chǎn)物與PMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了 1600bp的DNA條帶；經(jīng)過雙酶切驗(yàn)證，分別獲得了 2692bp的載體與1600bp的目的片段，可初步證明，已經(jīng)成功克隆出擬南芥AAPl基因； 3)獲得1600bp左右的目的條帶，測序后發(fā)現(xiàn)該基因0RF1458bp，編碼485個(gè)氨基酸的多肽，根據(jù)氨基酸序列推出，該基因編碼一個(gè)氨基酸透性酶；在線對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&D00little(K-D)法計(jì)算氨基酸的親水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸處具有疏水性較強(qiáng)的特性，在第37個(gè)氨基酸和360-370氨基酸左右區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性； 4)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xba I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植 物表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證；質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，獲得了一條為1600bp的DNA條帶；經(jīng)過酶切驗(yàn)證，分別獲得了8300bp的pCAMBIA3300載體與為1600bp的目的片段；重新命名為ρ3300_ΑΑΡ1。
【文檔編號(hào)】C12N15/52GK104046638SQ201410202095
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】崔喜艷, 張治安, 陳展宇, 劉相國, 佟珊珊, 王闊, 范貝, 鹿丹, 劉明曉 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)