本發(fā)明涉及一種DNA樹狀分子及其制備方法，和利用該DNA樹狀分子結(jié)構(gòu)控制納米金顆粒自組裝的方法。本發(fā)明屬于納米生物材料領(lǐng)域，在藥物載體，生物檢測(cè)等方面有潛在的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米粒子自組裝成復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)已經(jīng)引起了廣泛的研究興趣。近十幾年，金納米顆粒在納米光電材料方面得到了巨大的應(yīng)用，它們中的很多性質(zhì)，比如表面等離子共振，很大程度上取決于相鄰顆粒之間的相互作用。而“自下而上”的自組裝策略，在精確排列與調(diào)控納米顆粒之間的距離與幾何形狀方面，提供了一個(gè)相當(dāng)合適的方法。

理解納米粒子在納米尺度不同于單分散的組裝行為，如二維層狀結(jié)構(gòu)，三維超晶格納米結(jié)構(gòu)等對(duì)于本發(fā)明認(rèn)識(shí)其宏觀固有的光學(xué)，電學(xué)和化學(xué)特性具有重要意義。這種編程式的DNA獨(dú)有的特性可以使得本發(fā)明更容易的操控這種納米尺度的結(jié)構(gòu)，而這正是傳統(tǒng)方法難以達(dá)成的。

此外，在各種自組裝方法中，DNA由于其獨(dú)特的分子識(shí)別性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，被廣泛應(yīng)用作為納米顆粒的自組裝模板。并且，DNA修飾的納米金常被作為分子尺、基因和蛋白質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域。使用DNA分子的堿基配對(duì)性質(zhì)對(duì)納米顆粒進(jìn)行有規(guī)律的組裝，為納米自組裝材料更好的應(yīng)用于生物檢測(cè)和醫(yī)藥領(lǐng)域開辟了新的途徑，同時(shí)也為本發(fā)明更深入理解納米粒子的自組裝性質(zhì)提供了可靠的基礎(chǔ)。

然而，數(shù)量可控的納米顆?？臻g聚集體的構(gòu)建仍然是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。同時(shí)，樹枝狀分子，一類尺寸均勻的超支化大分子，由于其多價(jià)態(tài)和納米尺寸的結(jié)構(gòu)，在調(diào)控納米顆粒自組裝方法具有巨大的潛力。但是，大多數(shù)樹枝狀分子的獲得需要多步的合成與純化過程，以及復(fù)雜的支鏈引入步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明概述

為了解決上述問題，本申請(qǐng)發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)基于DNA精確的分子識(shí)別能力，完全通過DNA自組裝形成的DNA樹狀分子，可以在不經(jīng)過任何純化步驟的條件下高產(chǎn)率地獲得。

基于此，本發(fā)明公開了一種利用DNA樹狀分子調(diào)控離散金納米自組裝的簡(jiǎn)單而有效的方法。并且，基于DNA樹狀分子球形的結(jié)構(gòu)，其最外層的“粘性末端”可以均勻分布于三維空間中，這也使它們非常適合作為支架結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)納米顆粒精確的空間定位。

DNA樹狀分子具有不同于普通DNA雙鏈或單鏈的性質(zhì)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定、容易修飾，因此是理想的用于納米粒子自組裝的材料，本發(fā)明使用的方法可以有效地控制納米顆?？臻g聚集體的數(shù)量。并且，通過在第一層支鏈與核心之間引入了多個(gè)堿基對(duì)的連接鏈，增加支鏈之間的空間間隔。該設(shè)計(jì)策略不僅能延遲某一層支鏈形成飽和結(jié)構(gòu)的發(fā)生時(shí)間，也能夠改善粘性末端之間的自組裝效率，具有較好的創(chuàng)新性和應(yīng)用潛能。

發(fā)明的詳細(xì)說明

本發(fā)明通過Y-形DNA（Y-DNA）一步步自組裝的方法，制備得到DNA樹狀分子。由于Y-DNA具有近似平面的結(jié)構(gòu)（如附圖1所示）。

在一個(gè)是實(shí)施例中，通過選擇每一層間DNA雙螺旋的長(zhǎng)度大約為3.75個(gè)螺旋或20-40，優(yōu)選為39個(gè)堿基對(duì)，可以構(gòu)建得到三維的DNA支架結(jié)構(gòu)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，為了盡可能地消除多枝側(cè)鏈所造成的可能的位阻效應(yīng)，本發(fā)明在第一層支鏈與核心之間引入了10-100個(gè)堿基對(duì)的連接鏈，以增加支鏈之間的空間間隔。

優(yōu)選的，使用60個(gè)堿基對(duì)或約5.75個(gè)螺旋。

在本發(fā)明中由于每一個(gè)Y-DNA都具有“三臂”的結(jié)構(gòu)，最外層支鏈的數(shù)目能夠可控地增加到某個(gè)值。進(jìn)一步將修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒，通過與DNA樹狀分子表面的“粘性末端”的互補(bǔ)雜交，從而以DNA樹狀分子作為支架實(shí)現(xiàn)納米顆粒的有序空間排列。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，為了獲得不同代數(shù)的DNA樹狀分子，等量的寡聚核苷酸鏈（比如，Y_na、Y_nb、Y_nc）被混合到一起形成樹狀分子單體（Y_n，第n代的Y-DNA）。Y-DNA臂上的13個(gè)或23個(gè)堿基的“粘性末端”（如附圖1所示）可以在室溫下形成穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)

更優(yōu)選的，本發(fā)明把第n代DNA樹狀分子命名為G_n，通過逐步將Y_n加入到G_n-1（n≥1）中，利用粘性末端之間的雜交互補(bǔ)配對(duì)，可以合成得到不同代數(shù)的DNA樹狀分子（參見附圖2a）。

在本發(fā)明中加入到G_n-1上的所使用的每一層上的Y_n彼此之間都是不同的，本發(fā)明是通過“A-B-C-D-E”的組裝策略、自組裝形成了一系列的DNA樹狀分子。這樣的自組裝策略能夠產(chǎn)生最高質(zhì)量純度的DNA樹狀分子。因此，每一代G_n之間表面的“粘性末端”，無論是13或23個(gè)堿基的序列，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中彼此是不相同的，這樣的設(shè)計(jì)策略可以防止不同層的“粘性末端”之間的非特異性交聯(lián)。

具體而言，本發(fā)明涉及一種DNA樹狀分子的制備方法，包括如下步驟：在磷酸緩沖溶液混合等量的三條DNA序列，得到混合液；將上述混合液加熱，反應(yīng)后冷卻；獲得具有三臂結(jié)構(gòu)的Y型DNA，使用Y’₀表示；在上述Y’₀的三臂每一臂DNA的5’到3’端分別引入m個(gè)堿基連接鏈，獲得核心區(qū)DNA，使用Y₀表示，優(yōu)選的，核心區(qū)DNA 為“”型DNA；使用上述方法，獲得Y’₀，在Y’₀的三臂每一臂DNA的5’到3’端分別引入n個(gè)堿基連接鏈，獲得第一代DNA，使用Y₁表示，優(yōu)選的第一代DNA為“”型DNA；將Y₀與Y₁進(jìn)行混合，利用粘性末端之間的雜交互補(bǔ)配對(duì)，自組裝形成穩(wěn)定的DNA樹狀分子，使用G₀表示。其中，m或n選自10-100之間的正整數(shù)。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中涉及一種DNA樹狀分子的制備方法，步驟包括，使用上述方法，獲得Y’₀，在Y’₀的三臂每一臂DNA的5’到3’端分別引入i個(gè)堿基的連接鏈，獲得第二代“”型DNA，使用Y₂表示；將Y₂與步驟⑥獲得的G₀進(jìn)行混合，利用Y₂與G₀ DNA粘性末端之間的雜交互補(bǔ)配對(duì)，自組裝形成穩(wěn)定的DNA樹狀分子，使用G₁表示。其中，m、n或i選自10-100之間的正整數(shù)。

本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中涉及一種DNA樹狀分子的制備方法，步驟還包括：使用上述方法獲得Y_x和G_x-1，將Y_x與G_x-1進(jìn)行混合，Y_x與G_x-1的DNA粘性末端進(jìn)行雜交互補(bǔ)配對(duì)，獲得DNA樹狀分子G_x；其中，加入到G_x-1上的所使用的Y_x與之前每一層上使用的“”型DNA彼此之間不同；并且，X為大于2的正整數(shù)。

優(yōu)選的，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中涉及一種DNA樹狀分子的制備方法，其中，步驟①中使用的磷酸緩沖溶液的pH為7.5- 8.5，所述三條DNA序列的終濃度均為20 mM；和/或步驟②中使用的加熱溫度為60-100℃，反應(yīng)后冷卻的條件為以每分鐘1℃的速率冷卻到4℃；和/或步驟③中所述的Y-DNA具有近似平面的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的，使得每一層間DNA雙螺旋的長(zhǎng)度大約為30-45個(gè)堿基對(duì)；和/或在Y’₀的三臂每一臂DNA的5’到3’端分別引入堿基的數(shù)量為10-30個(gè)堿基；優(yōu)選的，在每一臂的DNA上添加13個(gè)或23個(gè)堿基的粘性末端。

此外，本發(fā)明還涉及一種利用DNA樹狀分子結(jié)構(gòu)控制納米金顆粒自組裝的方法，包括4個(gè)步驟，具體為，第一步，使用權(quán)利要求1-4所述的方法獲得DNA樹狀分子；第二步，合成修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒；第三步，將上述DNA樹狀分子和修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒進(jìn)行混合，修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒與DNA樹狀分子表面的“粘性末端”的互補(bǔ)雜交，進(jìn)行自組裝；第四步，獲得以DNA樹狀分子作為支架的納米顆粒。

再者，本發(fā)明還涉及一種利用制備獲得的DNA樹狀分子結(jié)構(gòu)控制納米金顆粒自組裝的方法，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明所述方法獲得以DNA樹狀分子作為支架的納米顆粒的數(shù)量為可控；優(yōu)選的，使用權(quán)利要求1-4所述的方法獲得DNA樹狀分子，將獲得的DNA樹狀分子表示為G_a，最終獲得的產(chǎn)物中DNA樹狀分子支架上的納米顆粒個(gè)數(shù)為：3×2^a個(gè)，其中，a為自然數(shù)。

優(yōu)選的，本發(fā)明還涉及另外一種利用DNA樹狀分子結(jié)構(gòu)控制納米金顆粒自組裝的方法，其中，第二步中使用的合成修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒的方法為：將表面由BSPP（二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽）穩(wěn)定的金納米顆粒與硫辛酸修飾的DNA按照1:1的摩爾比例混合；之后通過凝膠電泳的方法純化得到所述的修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒。

更優(yōu)選的，上述方法中所述的單條DNA鏈為較短序列的硫辛酸DNA，該較短序列的硫辛酸DNA單修飾的金納米顆粒制備方法包括以下4個(gè)步驟，i．合成一條較長(zhǎng)的DNA鏈作為輔助鏈，與硫辛酸修飾的DNA鏈進(jìn)行雜交后對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)，獲得金納米顆粒-DNA雜化結(jié)構(gòu)；ii．將上述金納米顆粒-DNA雜化結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過凝膠電泳的方法進(jìn)行分離純化，獲得DNA單修飾的金納米顆粒；iii．將輔助鏈去除；iv．最終獲得具有較短序列的硫辛酸DNA單修飾的金納米顆粒。

同時(shí)，本發(fā)明還公開了使用上述方法制備獲得了相關(guān)產(chǎn)品。并且，上述產(chǎn)品在用于制備藥物載體以及生物檢測(cè)相關(guān)試劑或試劑盒中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

以上只是概括了本發(fā)明的一些方面，不是也不應(yīng)該認(rèn)為是在任何方面限制本發(fā)明

本說明書提到的所有專利和出版物都是通過參考文獻(xiàn)作為整體而引入本發(fā)明的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)本發(fā)明可作某些改變并不偏離本發(fā)明的構(gòu)思或范圍。下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，不能認(rèn)為是限制本發(fā)明或本發(fā)明所說明的具體方法的范圍。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例，其中：

圖1 以DNA樹狀分子作為支架，實(shí)現(xiàn)金納米顆?？煽乜臻g排布的自組裝策略示意圖；

圖2 （a）構(gòu)建DNA樹狀分子的自組裝策略；（b）G₀-G₄的瓊脂糖凝膠電泳的表征結(jié)果；（c）G₁-G₄動(dòng)態(tài)光散射的粒徑分布表征；（d）G₄的原子力顯微成像的結(jié)果；

圖3 Y-DNA熔點(diǎn)的測(cè)定曲線。熔點(diǎn)測(cè)定過程是通過記錄260 nm的吸光度隨溫度的變化獲得的相應(yīng)曲線，每種Y-DNA的濃度均為1.3 μΜ；

圖4 DNA樹狀分子G₄的熔點(diǎn)測(cè)定曲線；

圖5硫辛酸修飾的DNA單功能化的金納米顆粒的制備過程。（a）利用瓊脂糖凝膠電泳將金納米顆粒-DNA雜化體分離成相應(yīng)的離散條帶結(jié)構(gòu)；（b）獲得短鏈寡聚核苷酸鏈單功能化的金納米顆粒方法的示意圖；

圖6 DNA單功能化的金納米顆粒分別與（a）G₀，（b）G₁，（c）G₂，（d）G₃的組裝結(jié)果的透射電子顯微鏡（TEM）的表征；

圖7 G₃調(diào)控的金納米顆粒組裝體的TEM的表征；

圖8 G₄調(diào)控的金納米顆粒組裝體的TEM的表征。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

在下述每一實(shí)施例中，設(shè)備和材料是從以下所指出的幾家公司購(gòu)得：所有的DNA鏈（PAGE純化）是購(gòu)買自Invitrogen生物科技公司（北京，中國(guó)）。硫辛酸購(gòu)買自Alfa公司。二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽（BSPP）購(gòu)買自Sigma公司。其他化學(xué)藥品均為試劑純或更高純度，購(gòu)買后未經(jīng)純化直接使用。實(shí)驗(yàn)過程中所用水為Millipore Milli-Q純化后的水（電阻率>18 MΩ.cm）。

瓊脂糖凝膠電泳所用的緩沖液位0.5 × TBE，電壓為5 V/cm。純化DNA單功能化的金納米顆粒所用的凝膠濃度為3%；表征DNA樹狀分子所用的凝膠電泳濃度為0.5%。

透射電子顯微鏡為FEI T20型號(hào)，操作電壓為200 kV。制樣方法為：將金納米顆粒樣品滴加到銅網(wǎng)后、空氣中干燥12小時(shí)的方法進(jìn)行制樣。

動(dòng)態(tài)光散射（DLS）使用配備有多角度動(dòng)態(tài)接收器和He-Ne激光光源（λ=632.8 nm）的光散射儀進(jìn)行測(cè)量。

原子力顯微鏡（AFM）使用的是VeecoMultiMode 8掃描探針顯微鏡。將DNA組裝結(jié)構(gòu)滴加到云母表面上以后，在緩沖溶液中通過敲擊模式進(jìn)行成像。

紫外光譜使用的是配置有程序控溫裝置的Varian Cary 100分光光度儀。

實(shí)施例1構(gòu)建DNA樹狀分子所使用的DNA序列

設(shè)計(jì)構(gòu)建DNA樹狀分子所使用的DNA序列（參見表1），通過Invitrogen生物科技公司進(jìn)行購(gòu)買。

表1構(gòu)建DNA樹狀分子所使用的DNA序列

實(shí)施例2 制備DNA單功能化的金納米顆粒所使用的DNA序列

設(shè)計(jì)制備DNA單功能化的金納米顆粒所使用的DNA序列（參見表2），通過Invitrogen生物科技公司進(jìn)行購(gòu)買。

表2制備DNA單功能化的金納米顆粒所使用的DNA序列

實(shí)施例3 Y-形DNA（Y-DNA）的制備方法

將等量的三條DNA序列（Y_na, Y_nb和Y_nc）在磷酸緩沖溶液(100 mMNaCl, 50 mM磷酸鈉, pH 8.0)中混合到一起，使每條DNA鏈的終濃度均為20 mM。然后將混合物加熱到95℃保持5分鐘后，以每分鐘1℃的速率冷卻到4℃，最終獲得Y-DNA組裝結(jié)構(gòu)。

通過紫外光譜對(duì)Y-DNA的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定(如圖3所示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有的Y-DNA的熔點(diǎn)（T_m）都高于60℃，這也意味著這些DNA樹狀分子的單體在室溫下是穩(wěn)定的。

實(shí)施例4 DNA樹狀分子的制備方法

一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)過程是：將3×2^n-1摩爾比例的Y_n與1摩爾比例的G_n-1(n ≥ 1) 在磷酸緩沖溶液中混合均勻后，在室溫下放置1小時(shí)后制備得到G_n。所有制備得到的DNA樹狀分子都通過瓊脂糖凝膠電泳與動(dòng)態(tài)光散射的方法對(duì)其進(jìn)行了表征確認(rèn)。通過紫外光譜對(duì)G₄進(jìn)行的熱穩(wěn)定性的試驗(yàn)表明，G₄的熔點(diǎn)大約為65℃（如圖4所示）。

實(shí)施例5 以DNA樹狀分子作為支架，實(shí)現(xiàn)金納米顆?？煽乜臻g排布的自組裝策略

組裝策略如圖1所示，通過Y-形DNA（Y-DNA）一步步自組裝的方法，制備得到DNA樹狀分子。優(yōu)選的，Y-DNA具有近似平面的結(jié)構(gòu)，通過選擇每一層間DNA雙螺旋的長(zhǎng)度大約為3.75個(gè)螺旋（39個(gè)堿基對(duì)），可以構(gòu)建得到三維的DNA支架結(jié)構(gòu)。

值得注意的是，為了盡可能地消除多枝側(cè)鏈所造成的可能的位阻效應(yīng)，本發(fā)明在第一層支鏈與核心之間引入了60個(gè)堿基對(duì)的連接鏈（約5.75個(gè)螺旋），以增加支鏈之間的空間間隔。該設(shè)計(jì)策略不僅能延遲某一層支鏈形成飽和結(jié)構(gòu)的發(fā)生時(shí)間，也能夠改善粘性末端之間的自組裝效率。由于每一個(gè)Y-DNA都具有“三臂”的結(jié)構(gòu)，最外層支鏈的數(shù)目能夠可控地增加到某個(gè)值。進(jìn)一步將修飾有單條DNA鏈的金納米顆粒，通過與DNA樹狀分子表面的“粘性末端”的互補(bǔ)雜交，從而以DNA樹狀分子作為支架實(shí)現(xiàn)納米顆粒的有序空間排列。

為了獲得不同代數(shù)的DNA樹狀分子，等量的寡聚核苷酸鏈（比如，Y_na、Y_nb、Y_nc）被混合到一起形成樹狀分子單體（Y_n，第n代的Y-DNA）。Y-DNA臂上的13個(gè)或23個(gè)堿基的“粘性末端”（如圖1所示）可以在室溫下形成穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。本發(fā)明把第n代DNA樹狀分子命名為G_n，通過逐步將Y_n加入到G_n-1（n≥1）中，利用粘性末端之間的雜交互補(bǔ)配對(duì)，可以合成得到不同代數(shù)的DNA樹狀分子（如圖2a所示）。

在這里，加入到G_n-1上的所使用的每一層上的Y_n彼此之間都是不同的，每一代G_n之間表面的“粘性末端”，無論是13或23個(gè)堿基的序列，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中彼此是不相同的，這樣的設(shè)計(jì)策略可以防止不同層的“粘性末端”之間的非特異性交聯(lián)。自組裝得到的DNA樹狀分子本發(fā)明進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）等技術(shù)對(duì)它們的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了表征。如圖2b所示，不同代數(shù)的DNA樹狀分子即使在不經(jīng)任何純化的條件下也能獲得高純度的產(chǎn)品，并且在瓊脂糖凝膠電泳中表現(xiàn)出了單一的條帶。由于越大的結(jié)構(gòu)在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率越低，因此高代數(shù)的DNA樹狀分子表現(xiàn)出較小的遷移率。在這里尺寸效應(yīng)（而非電荷效應(yīng)）在瓊脂糖凝膠電泳中占了主導(dǎo)效應(yīng)。因此在凝膠電泳的表征結(jié)果中，G_n+1的遷移率表現(xiàn)出比G_n的較小的遷移率。動(dòng)態(tài)光散射的測(cè)量結(jié)果（如圖2c所示）表明，樹狀分子的水合半徑從G₁時(shí)的約12 nm增加到G₄時(shí)的約28 nm，這一結(jié)果與凝膠電泳的結(jié)果相一致。本發(fā)明進(jìn)一步通過原子力顯微鏡（AFM）對(duì)第四代DNA樹狀分子（G₄）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)。首先將G₄樣品滴加到云母表面上，然后在緩沖溶液中通過原子力顯微鏡的敲擊模式進(jìn)行成像。成像的結(jié)果顯示出G₄具有超支化的樹狀納米結(jié)構(gòu)（如圖2d所示）。

實(shí)施例6硫辛酸修飾的DNA的合成方法

3’端-硫辛酸修飾的單鏈DNA是通過文獻(xiàn)的方法進(jìn)行合成與純化的。簡(jiǎn)言之，3’-氨基修飾的DNA(cY_n)與硫辛酸酯在醋酸-三乙胺緩沖溶液（TEAA）中以大于200:1的摩爾比例混合后，將其在室溫下放置10小時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物（硫辛酸修飾的DNA，LA-cY_n）通過反相-HPLC的方法純化得到。（洗脫流動(dòng)相：ACN/TEAA, 20:1→ACN/TEAA, 4:1）

實(shí)施例7硫辛酸修飾的DNA單功能化的金納米顆粒的制備過程

如上所述的納米尺度的與大小可控的多枝DNA樹枝分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用其表面的已知序列的“粘性末端”，可以將其作為支架用來調(diào)控金納米顆粒的空間排列。這里本發(fā)明所采用的金納米顆粒，表面僅負(fù)載有單條DNA鏈（標(biāo)記為“DNA單功能化的金納米顆粒”）。因?yàn)檫@種單功能化的金納米顆?？梢员苊庠谧越M裝過程中的非特異性的交聯(lián)，從而有效地提高自組裝的精確度。本發(fā)明通過將表面由BSPP（二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽）穩(wěn)定的金納米顆粒與硫辛酸修飾的DNA按照1:1的摩爾比例混合后，再通過凝膠電泳的方法純化得到DNA單功能化的金納米顆粒（如圖5所示）。利用瓊脂糖凝膠電泳的方法分離得到DNA單功能化的金納米顆粒，一般需要足夠長(zhǎng)的單鏈DNA（對(duì)于5 nm金顆粒通常需要大于50個(gè)堿基）才能達(dá)到理想的分離效果。這里本發(fā)明所用的與DNA樹狀分子表面進(jìn)行雜交所需的硫辛酸修飾的DNA為13個(gè)或23個(gè)堿基，相對(duì)于上述要求來說明顯是太短了。為了解決這一問題，本發(fā)明利用一條較長(zhǎng)的DNA鏈（EXT-Y_n）作為輔助鏈，與硫辛酸修飾的DNA鏈（LA-cY_n）進(jìn)行雜交后對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)。如圖5a所示，將所獲得的金納米顆粒-DNA雜化結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過凝膠電泳的方法對(duì)其進(jìn)行分離純化。再將DNA單修飾的金納米顆粒從相應(yīng)條帶中分離出來以后，輔助鏈（EXT-Y_n）是通過與其完全互補(bǔ)的序列鏈（cEXT-Y_n）進(jìn)行雜交后加以去除的（如圖5b所示）。最終獲得具有較短序列的硫辛酸DNA單修飾的金納米顆粒。

實(shí)施例8DNA單功能化的金納米顆粒的制備方法

首先，硫辛酸修飾的DNA(cY_n-LA)通過與輔助鏈(EXT-Y_n)雜交后對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行延長(zhǎng)。然后將這些部分互補(bǔ)的DNA加入到BSPP穩(wěn)定的5 nm金顆粒中，將該混合物在室溫下放置2小時(shí)后，從瓊脂糖凝膠電泳中分離得到DNA-金顆粒偶合的目標(biāo)產(chǎn)物。最后，其中的輔助鏈(EXT-Y_n)通過與其完全互補(bǔ)的序列鏈（cEXT-Y_n）雜交后將其置換下來。

實(shí)施例9DNA樹狀分子調(diào)控金納米顆?？煽乜臻g排列的表征

在成功獲得樹狀DNA支架結(jié)構(gòu)與DNA單功能化的金納米顆粒以后，接下來本發(fā)明開始測(cè)試?yán)眠@些支架結(jié)構(gòu)調(diào)控產(chǎn)生空間可控的納米顆粒聚集體。將具有“三臂”結(jié)構(gòu)的、每條臂上均含有“粘性末端”的G₀與具有相應(yīng)互補(bǔ)序列DNA單功能化的金納米顆粒按照一定比例混合以后，通過透射電子顯微鏡（TEM）的表征結(jié)果表明（如圖6a所示），形成了金納米顆粒三聚體的結(jié)構(gòu)。由于Y-DNA構(gòu)象的自由度，金納米顆粒形成的三角形結(jié)構(gòu)具有角度可變性，從而使其沒有表現(xiàn)出完美的等邊三角形的排列結(jié)構(gòu)。與之相似，通過G₁與相應(yīng)互補(bǔ)DNA單功能化的金納米顆粒混合后，可以獲得金納米顆粒六聚體的結(jié)構(gòu)（如圖6b所示）；將G₂與DNA單功能化的金顆粒雜交后，能夠生成含有12個(gè)納米顆粒的復(fù)合體（如圖6c所示）。據(jù)本發(fā)明人所知，利用如此簡(jiǎn)單直接的方法精確調(diào)控12個(gè)納米顆粒的空間排布的研究還未曾被報(bào)道過。雖然隨著DNA樹狀分子代數(shù)的增加，該組裝策略可行性變得有所降低。比如本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將G₃和G₄分別與相應(yīng)DNA單功能化的金納米顆粒雜化后，預(yù)期的自組裝結(jié)果沒形成。TEM的表征結(jié)果表明，產(chǎn)生了22個(gè)或更少的納米顆粒的聚集結(jié)構(gòu)（圖6d，圖7和圖8）。對(duì)這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因可能是，隨著樹狀分子代數(shù)的增加，DNA結(jié)構(gòu)變得更加松軟，樹狀分子表面的粘性末端也變得更加擁擠，這種立體位阻效應(yīng)和電子排斥效應(yīng)同時(shí)阻礙了位點(diǎn)特異性的組裝過程的發(fā)生，但是并不妨礙本發(fā)明的前述調(diào)控金納米顆粒組裝過程的進(jìn)行。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。