本發(fā)明涉及一種酶的制備方法，具體涉及一種共固定化酶的制備方法。

背景技術(shù)：

德國生理學(xué)家威廉·屈內(nèi)于1878年首次提出了酶這一概念。酶，俗稱酵素，是植物、動物、微生物和人體細胞合成生產(chǎn)的一類特殊蛋白質(zhì)。由于酶具有提高生物化學(xué)反應(yīng)速度和反應(yīng)質(zhì)量的催化能力，通常被稱為生物催化劑。和傳統(tǒng)催化劑相比，酶具有高效性、專一性、多樣性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。但其在酸、堿、熱及有機溶液等條件下易發(fā)生酶蛋白的變性，使酶活降低或喪失，且酶反應(yīng)多在溶液中進行，反應(yīng)后不易回收，反應(yīng)產(chǎn)物分離提純困難，難以實現(xiàn)工業(yè)上的連續(xù)化、自動化生產(chǎn)，因此酶工程的應(yīng)用發(fā)展受到了很大的限制。

固定化酶是運用化學(xué)或物理方法，對酶進行相應(yīng)處理，使得原本水溶性較強的酶與固態(tài)的不溶于水的載體相互結(jié)合，或者被載體包埋，使兩者形成一個統(tǒng)一的整體。

經(jīng)固定化后，固定化酶具有比游離酶更多的優(yōu)點:

(1)固定化酶與底物、產(chǎn)物較易分離，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心或過濾等簡單的操作就可回收固定化酶，且酶活力降低較少，可重復(fù)多批次使用，減少了生產(chǎn)成本；

(2)經(jīng)固定化處理后，一般穩(wěn)定性會有較大提高，對pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等提高，對抑制劑的敏感性下降。

(3)固定化酶適用于自動化、連續(xù)化生產(chǎn)，易控制催化過程，而且不會將酶蛋白帶進產(chǎn)品中導(dǎo)致酶的殘留，簡化后期提純工藝，提高了酶的利用效率，降低了生產(chǎn)成本。

當(dāng)然，固定化酶存在缺點:

(1)固定化時會損失部分酶活；

(2)酶的固定化需要設(shè)備和載體，增加了生產(chǎn)成本；

(3)只當(dāng)?shù)孜锟扇軙r固定化酶才適用，且不太適用于大分子底物；

(4)微生物分泌的胞內(nèi)酶在分離后才能固定化。

隨著固定化酶研究的不斷深入，固定化方法慢慢過渡到了多種方法的組合。但是發(fā)展至今，幾乎沒有一種固定化技術(shù)適用于任何一種酶，因此要根據(jù)具體酶的特性和應(yīng)用目的，選擇合適的固定化方法。

酶的固定化方法可分為4類:吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法。

吸附法是最早使用的酶的固定化方法之一，吸附法是利用范德華力、離子鍵、氫鍵、物理吸附等作用力,把酶固定在載體上的固定方式。一般可分為物理吸附法和離子吸附法。

魯玉俠利用吸附法將脂肪酶固定在大孔陰離子樹脂D201上，得到的固定化酶有較好的操作穩(wěn)定性。用制備的固定化酶催化天然黃油進行水解反應(yīng)，水解產(chǎn)物香氣柔和、純厚。

共價結(jié)合法是指通過共價鍵結(jié)合的方法把酶上的非必須功能基與載體表面的功能基結(jié)合的固定化方法。

化學(xué)交聯(lián)法是借助雙功能或多功能試劑把酶蛋白分子彼此發(fā)生交聯(lián)，使酶分子和雙功能團試劑或多功能團試劑之間形成共價鍵，得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在此過程中，酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的同時，分子內(nèi)部也存在一定程度的交聯(lián)?；瘜W(xué)交聯(lián)法可分為交聯(lián)酶晶體和交聯(lián)酶聚集體。

包埋法是指酶與載體溶液混合后，借助引發(fā)劑發(fā)生聚合反應(yīng)，通過物理作用把酶限定在載體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，從而實現(xiàn)酶的固定的方法。其優(yōu)點是固定化成本低、固定化酶量大、操作簡單易行、固定化條件溫和、酶分子的穩(wěn)定性高等，但由于酶被固定在載體的內(nèi)部空間中，反應(yīng)底物因為傳質(zhì)阻力的影響需經(jīng)擴散才能到達酶的活性中心發(fā)生催化反應(yīng)。同時，劇烈的酶解反應(yīng)有可能會對聚合物的微囊膜或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成損壞，導(dǎo)致酶泄漏。在載體材料的選擇上，聚丙烯酞胺、明膠、卡拉膠、殼聚糖和海藻酸鈉等是常見的選擇。

高尚欣等研究以海藻酸鈉為載體，以CaCl₂-殼聚糖溶液為凝固劑，采用包埋的方法固定化菠蘿莖蛋白酶。試驗表明，此方法制備的固定化酶的熱穩(wěn)定性和最適溫度提高，反應(yīng)pH向堿性偏移，酶學(xué)性質(zhì)得到改善。同時，固定化后的酶還具有良好的可操作性，重復(fù)使用4次后，相對酶活力仍保留80％以上，固定化效果較好。

魯玉俠等海藻酸鈉為載體，CaCl₂溶液為凝固劑，采用包埋法固定脂肪酶。試驗表明，此方法制備的固定化酶的熱穩(wěn)定性較好，60℃下加熱1.5h后，固定化酶的酶活力只下降了30％。而且，其還具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)反復(fù)使用10次，固定化酶的酶活力仍保留95％以上。

共固定化酶始于20世紀80年代，是將兩種或兩種以上的酶固定于同一載體中形成共固定化體系的一種技術(shù)。共固定化酶是以單一酶的固定作為基礎(chǔ)，綜合考慮共固定化的酶的最佳固定化方法，經(jīng)常被研究使用的共固定化方法有交聯(lián)法和包埋法。共固定化酶與普通的固定化酶相比，共固定化酶可充分發(fā)揮不同酶的特點，同時將其催化特性結(jié)合起來，充分體現(xiàn)協(xié)同作用，提高催化效率。同時縮短反應(yīng)時間和減少反應(yīng)步驟，實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，能夠更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

但是目前，在國內(nèi)外有關(guān)于共固定酶的相關(guān)研究報道并不多，且主要集中于糖化酶方面，關(guān)于共固定化蛋白酶和脂肪酶的有關(guān)研究較少。脂肪酶和蛋白酶是工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中最廣泛的兩種酶類，具有廣闊的發(fā)展前景。若把脂肪酶和蛋白酶共固定在同一載體上，將其作為酶反應(yīng)器，可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，簡化工藝，降低成本。

高居易等以脫乙酰殼多糖作為載體，以戊二醛作為交聯(lián)劑，將木瓜蛋白酶和胰蛋白酶共固定在載體上，其活性比單酶固定化提高了25％，該方法被廣泛地應(yīng)用于酒類的抗混濁、澄清等生產(chǎn)中。

劉自琴的研究探討了不同蛋白酶對脂肪酶活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶對脂肪酶Palatase 20000L的活力有提高作用。同時通過研究共固定化的方法，成功將蛋白酶和脂肪酶共固定化在大孔樹脂上，可有效提高蛋白酶的活力且對脂肪酶的活力損失較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種共固定化酶的制備方法，本發(fā)明還提供了采用該方法制備的共固定化酶。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種共固定化酶的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)在海藻酸鈉溶液中加入脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD，攪拌均勻后得到共混液；

(2)將步驟(1)得到的共混液滴入CaCl₂水溶液中，靜置固化后形成凝膠顆粒，制得的凝膠顆粒即為所述共固定化酶。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的總重量為所述海藻酸鈉重量的2.2％-3.52％，所述脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的重量比為脂肪酶A6：脂肪酶MER：蛋白酶MSD＝2:1：0.3。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的總重量為所述海藻酸鈉重量的3.0％，所述脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的重量比為脂肪酶A6：脂肪酶MER：蛋白酶MSD＝2:1：0.3。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中海藻酸鈉溶液是pH為6.0～8.0、質(zhì)量分數(shù)為1.0％～2.0％的海藻酸鈉溶液，所述步驟(2)中CaCl₂水溶液是質(zhì)量分數(shù)為3.0％～6.0％的CaCl₂水溶液。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中海藻酸鈉溶液是pH為6.5、質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液；所述步驟(2)中CaCl₂水溶液是質(zhì)量分數(shù)為4.0％的CaCl₂水溶液。所述海藻酸鈉溶液由以下方法制備而成：將海藻酸鈉固體加入到pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中固化溫度為20～35℃，固化時間為20～40min。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中固化溫度為30℃，固化時間為30min。

本發(fā)明提供了采用上述所述的方法制備而成的共固定化酶。

本發(fā)明提供了上述所述的共固定化酶在制備奶香基料中的用途。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種共固定化酶的制備方法，采用該方法制備的共固定化酶的固定化率較高，共固定化酶的酶活力操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均較好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中牛血清白蛋白標準曲線圖；

圖2為本發(fā)明實施例1中pH值對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖3為本發(fā)明實施例1中海藻酸鈉濃度對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖4為本發(fā)明實施例1中酶量對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖5為本發(fā)明實施例1中CaCl2濃度對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖6為本發(fā)明實施例1中共固定化溫度對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖7為本發(fā)明實施例1中共固定化時間對共固定化酶活力和固定化率的影響的折線圖；

圖8為本發(fā)明實施例1中共固定化酶在20℃時的熱穩(wěn)定性的折線圖；

圖9為本發(fā)明實施例1中共固定化酶在60℃時的熱穩(wěn)定性的折線圖；

圖10為本發(fā)明實施例1中共固定化酶的操作穩(wěn)定性的折線圖；

圖11為本發(fā)明實施例1中共固定化酶的貯藏穩(wěn)定性的折線圖；

圖12為本發(fā)明實施例1中共固定化酶添加量對酸價和感官評分的影響的折線圖；

圖13為本發(fā)明實施例1中共固定化酶的酶解時間對酸價和感官評分的影響的折線圖；

圖14為本發(fā)明實施例1中共固定化酶的酶解溫度對酸價和感官評分的影響的折線圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

本發(fā)明以海藻酸鈉作為載體，采用包埋法對蛋白酶MSD、脂肪酶A6和脂肪酶MER進行共固定化，以固定化率和共固定化酶的酶活力為主要指標，對共固定化條件進行了優(yōu)化，將優(yōu)化后得到的共固定化酶用于制備奶香基料，以酸價和感官評價為主要指標，對奶香基料的制備工藝進行了優(yōu)化。

1、材料與方法

1.1試驗材料

(1)黃油為市售上多美鮮無鹽黃油。

(2)乳清粉(乳糖60％，蛋白質(zhì)9％，脂肪15％)購于廣州市日鋒畜牧有限公司。

(3)脂肪酶A“天野”6(Lipase A"Amano"6)，簡寫成脂肪酶A6，由阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)(上海)有限公司贈送。

(4)脂肪酶MER“天野”(Lipase MER"Amano")，簡寫脂肪酶MER，由阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)(上海)有限公司贈送。

(5)蛋白酶M“天野”SD(Protease M“Amano”SD)，簡寫成蛋白酶MSD，由阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)(上海)有限公司贈送。

1.2試驗試劑

乙醚、無水乙醇、KOH、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞指示劑等均為市售分析純。

1.3試驗主要設(shè)備

(1)主要試驗設(shè)備

表1試驗中主要用到的儀器

(2)其它儀器設(shè)備

堿性滴定管、錐形瓶、量筒、燒杯、鐵架臺、藥勺、玻璃棒、移液管、稱量紙等。

1.4試驗方法

1.4.1固定化載體及固定化方法的選擇

1.4.1.1大孔樹脂負載殼聚糖膜交聯(lián)法

稱取0.1g殼聚糖溶于100mL質(zhì)量分數(shù)為1％的醋酸中，配成10mg/mL的殼聚糖-醋酸溶液。稱取10g大孔樹脂和50mL的殼聚糖-醋酸溶液充分混合，在1300Pa狀態(tài)下50℃水浴旋轉(zhuǎn)抽真空10min，用去離子水洗滌至中性。加入30mL的0.125％戊二醛溶液，20℃靜置交聯(lián)2h。用去離子水洗滌除去殘留的戊二醛，直至洗滌液在280nm處的吸收值小于0.01為止。

準確稱取1g經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂于錐形瓶中，加入10mL去離子水潤濕樹脂，準確稱取10mg游離酶與樹脂充分混合，置35℃恒溫搖床150r/min振蕩吸附1h后，過濾并保留濾液。樹脂用去離子水多次洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.4.1.2大孔樹脂吸附法

稱取10g樹脂置于錐形瓶中，往錐形瓶中加入95％的乙醇，浸泡24h后抽濾，并用去離子水沖洗。樹脂用25mL的5％HC1溶液浸泡4h后抽濾，用去離子水洗滌至中性。然后用25mL的5％NaOH溶液浸泡4h后抽濾，用去離子水洗滌至中性。抽濾后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

準確稱取1g經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂于錐形瓶中，加入10mL去離子水潤濕樹脂，準確稱取10mg游離酶與樹脂充分混合，置35℃恒溫搖床150r/min振蕩吸附1h后，過濾并保留濾液。樹脂用去離子水多次洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.4.1.3海藻酸鈉包埋法

準確稱取1g海藻酸鈉固體，加入去離子水，加熱溶解，配成1％的海藻酸鈉溶液。待冷卻到45℃后，加入10mg游離酶，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到100mL質(zhì)量分數(shù)為3％的CaCl₂溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化1h。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.4.1.4殼聚糖包埋法

準確稱取1g殼聚糖固體，加入1％醋酸溶液，攪拌溶解，配成1％的殼聚糖醋酸溶液。待冷卻到45℃后，加入10mg游離酶，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到100mL質(zhì)量分數(shù)為1％的NaOH溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化1h。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.4.2共固定化條件優(yōu)化對酶活力的影響

1.4.2.1 pH值對共固定化酶活力的影響

分別稱取0.50g海藻酸鈉固體加入7個錐形瓶中，加入pH分別是5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成1.0％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，各加入0.0080g脂肪酶A6、0.0040g脂肪酶MER和0.0012g蛋白酶MSD，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)為3.0％的CaCl2溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化20min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入7個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.2.2海藻酸鈉濃度對共固定化酶活力的影響

分別稱取海藻酸鈉固體0.25g、0.50g、0.75g、1.0g、1.25g，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，各加入0.0080g脂肪酶A6、0.0040g脂肪酶MER和0.0012g蛋白酶MSD，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)為3.0％的CaCl₂溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化20min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入5個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.2.3酶量對共固定化酶活力的影響

在6個錐形瓶中分別稱取0.75g海藻酸鈉固體，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，分別加入脂肪酶A6，加酶量為黃油質(zhì)量的0.080％、0.100％、0.120％、0.140％、0.160％、0.180％；分別加入脂肪酶MER，加酶量為0.040％、0.050％、0.060％、0.070％、0.080％、0.090％；分別加入蛋白酶MSD，加酶量為0.012％、0.015％、0.018％、0.021％、0.027％、0.03％。充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)為3.0％的CaCl₂溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化20min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入6個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.2.4 CaCl₂濃度對共固定化酶活力的影響

在6個錐形瓶中分別稱取0.75g海藻酸鈉固體，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，分別加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)分別為1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％的CaCl₂溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化20min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入6個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.2.5共固定化溫度對共固定化酶活力的影響

在6個錐形瓶中分別稱取0.75g海藻酸鈉固體，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，分別加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分攪拌均勻后，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃水浴的條件下，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)為4.0％的CaCl₂溶液中，形成凝膠顆粒，靜置固化20min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入6個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.2.6共固定化時間對共固定化酶活力的影響

在5個錐形瓶中分別稱取0.75g海藻酸鈉固體，加入pH 6.5的磷酸緩沖溶液，加熱溶解，配成質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉溶液。待冷卻后，分別加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到50mL質(zhì)量分數(shù)為4.0％的CaCl2溶液中，形成凝膠顆粒，30℃下分別靜置固化10min、20min、30min、40min、50min。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后備用。

分別稱取10g固定化酶放入5個錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)1h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.3共固定化酶的穩(wěn)定性

1.4.3.1共固定化酶的熱穩(wěn)定性

將共固定化酶置于20℃的恒溫水浴箱中分別水浴0min、30min、60min、90min、120min、150min。水浴后稱取10g固定化酶放入錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

將共固定化酶置于60℃的恒溫水浴箱中分別水浴0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min。水浴后稱取10g固定化酶放入錐形瓶中，然后分別加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.3.2共固定化酶的操作穩(wěn)定性

稱取10g固定化酶放入錐形瓶中，然后加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。過濾后的固定化酶用去離子水洗滌，抽濾后繼續(xù)重復(fù)上述步驟，考察共固定化酶酶活力隨使用次數(shù)的變化。

1.4.3.3共固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

將共固定化酶置于4℃的冰箱中保藏0、2、4、6、8、10天。每次稱取10g固定化酶放入錐形瓶中，然后加入6g去離子水和10g黃油，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，判斷固定化酶的酶活力。

1.4.4奶香基料的制備

1.4.4.1共固定化酶添加量

分別往6個錐形瓶中加入10g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為0.125g(黃油質(zhì)量的12.5％)，加水量為6g(黃油質(zhì)量的60％)，置于恒溫水浴鍋中(75℃，20min)滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶，添加量與黃油的比例為0、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.4.4.2共固定化酶的酶解時間

分別往6個錐形瓶中加入10g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為0.125g(黃油質(zhì)量的12.5％)，加水量為6g(黃油質(zhì)量的60％)，置于恒溫水浴鍋中(75℃，20min)滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶10g(共固定化酶添加量與黃油質(zhì)量的比例1：1)，置于恒溫搖床中(35℃，150r/min)反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.4.4.3共固定化酶的酶解溫度

分別往6個錐形瓶中加入10g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為0.125g(黃油質(zhì)量的12.5％)，加水量為6g(黃油質(zhì)量的60％)，置于恒溫水浴鍋中(75℃，20min)滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶10g(共固定化酶添加量與黃油質(zhì)量的比例1：1)，分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的恒溫搖床中150r/min反應(yīng)2h。濾出固定化酶后3000r/min離心15min，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.5酸價

1.5.1試劑

(1)中性乙醚乙醇混合液：將乙醚和乙醇按照1：1的比例混合，加入3滴酚酞指示劑，用氫氧化鉀滴定液至指示劑顯中性。

(2)酚酞指示劑：10g/L，10g的酚酞溶解于1L的95％乙醇溶液。

(3)氫氧化鉀乙醇溶液(c(KOH)＝0.050mol/L)：稱取4g氫氧化鉀于聚乙烯容器中，加5ml水溶解，用95％乙醇稀釋至1L，密閉放置24h[17]。

1.5.2氫氧化鉀乙醇溶液的標定

準確稱取0.375g于105℃-110℃干燥至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，溶加入50ml無二氧化碳的水溶解，加入2滴酚酞指示劑，用氫氧化鉀乙醇溶液滴定至呈粉紅色，同時做空白試驗。氫氧化鉀乙醇溶液濃度按下列式子計算。

式中：m-鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，g；

V1-消耗氫氧化鉀乙醇溶液的體積，mL；

V2-空白試驗消耗氫氧化鉀乙醇溶液的體積，mL；

204.22-鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量

1.5.3酸價的測定

準確稱取奶香基料1.0g放入錐形瓶中，加入10mL中性乙醚乙醇混合液使油樣溶解，滴加2滴酚酞指示劑，用氫氧化鉀乙醇標準溶液滴定至出現(xiàn)微紅色，色澤變化維持30s，記錄消耗的氫氧化鉀乙醇標準溶液的用量[18]。

奶香基料的酸價按以下式子計算：

式中：X-奶香基料的酸價，mg/g；

V-滴定消耗的氫氧化鉀乙醇標準溶液體積，mL；

c-氫氧化鉀乙醇標準溶液的實際濃度，mol/L；

m-奶香基料試樣質(zhì)量，g；

56.11-氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.6相對酶活力

在同一組數(shù)據(jù)中將實驗值最高點的值記作100％，其他實驗點的值與這個點的比值，就是酶的相對活力，用百分數(shù)表示。

1.7蛋白含量測定

共固定化時濾液中的酶蛋白含量用考馬斯亮藍染色法測定。

1.7.1試劑

(1)考馬斯亮藍試劑：稱取考馬斯亮藍G-250 0.1g，溶解于50mL質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇中，再加入85％磷酸100mL，用去離子水稀釋至1L。

(2)標準蛋白溶液：以牛血清白蛋白作為標準蛋白，準確稱取10mg牛血清白蛋白,加水溶解，定容至100mL，配成0.1mg/mL的標準蛋白溶液。

1.7.2繪制牛血清白蛋白標準曲線

取6支干燥的比色管，編號并按表3往比色管中添加試劑。加入試劑后搖勻，靜置5min后，以1號樣作為空白對照，在595nm處測定其余樣的吸光度。實驗結(jié)果以吸光度為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標繪制標準曲線，如表2。

表2牛血清白蛋白標準曲線的繪制

1.7.3樣品測定

取濾液1mL于比色管中，加入考馬斯亮藍試劑5mL，搖勻，靜置5min后在595nm處測定吸光度。按照標準曲線計算濾液中的蛋白含量。

1.8固定化率

載體固定化酶蛋白的能力(固定化率)可用下面式子進行計算。

固定化率＝錯誤！未找到引用源。

式中：m-加入固定化體系初始酶量，mg；

c-固定化后濾液的酶蛋白含量，mg/mL；

V-固定化后濾液的體積，mL。

1.9感官評價

選定若干個人組成感官評價鑒定小組，按表3分別對酶解產(chǎn)物的香氣強度、香氣純度和留香情況進行評分，評分結(jié)果為3者之和，總分為10。評分標準見表3。

表3香氣評分標準

2、結(jié)果與分析

2.1牛血清白蛋白標準曲線

共固定化時濾液中的酶蛋白含量用考馬斯亮藍染色法測定。在合適的條件下，考馬斯亮藍G-250能與蛋白質(zhì)生成藍色化合物，在595nm處有最大的吸收值，蛋白質(zhì)濃度與化合物藍色的深淺程度成正比?？捡R斯亮藍染色法可以穩(wěn)定快速地測出酶液中蛋白質(zhì)的含量，牛血清白蛋白標準曲線如圖1所示。

2.2固定化載體及固定化方法的選擇

固定化載體是影響固定化酶的穩(wěn)定性和酶活力，而選擇合適的固定化載體有利于提高固定化酶的各項性能。固定化酶的性能除取決于固定化所使用的載體外還取決于固定化方法。但是不同種類的酶的等電點、平均直徑、親疏水性等性質(zhì)有顯著差異，因此幾乎沒有一種固定化方法適用于任何一種酶，所以要根據(jù)具體酶的特性，選擇合適的固定化方法。

實驗中選擇四種載體，采用了吸附法、交聯(lián)法和包埋法，分別對脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD進行固定化試驗，測定不同載體和固定化方法對固定化率的影響，結(jié)果如表4所示。

表4不同載體和固定化方法對固定化率的影響(％)

由表4可見，以殼聚糖為載體對三種游離酶采用包埋的方法進行固定化效果并不理想。對于脂肪酶A6，用海藻酸鈉直接包埋的固定化方法效果最好，固定化率為97.8％。對于脂肪酶MER，以大孔樹脂X-5為載體負載殼聚糖膜交聯(lián)法進行固定化和用海藻酸鈉直接包埋效果較好，固定化率分別為99.1％和98.2％。而蛋白酶MSD采用以海藻酸鈉為載體直接包埋的固定化率最高。綜上所述，三種酶采用以海藻酸鈉為載體直接包埋的固定化效果較為理想，固定化率在97％以上，可以考慮采用以海藻酸鈉為載體直接包埋的方法對三種酶進行共固定化。

2.3共固定化條件優(yōu)化對酶活力的影響

2.3.1 pH值對共固定化酶活力的影響

在酶的固定化反應(yīng)中，由于固定化載體和酶都存在于緩沖液中，而緩沖液的pH可以改變固定化載體和酶分子的離子化狀態(tài)；此外，酶作為一種蛋白質(zhì)，當(dāng)體系的pH值超出范圍時，其微觀結(jié)構(gòu)將會發(fā)生改變，從而造成酶變性失活。因此緩沖液pH值是影響固定化酶酶活力和固定化率的重要因素之一。

從圖2中可以看出，在pH6.5以下，隨著固定化體系pH的增大，固定化率呈現(xiàn)增大的趨勢。當(dāng)pH值為6.5時，固定化率為98％，達到最高；此時測得酸價為1.16mg/g，共固定化酶酶活力也最高?？赡苁窃谄渌麠l件一致時，固定化酶的固定化率越高，單位質(zhì)量的固定化酶中酶含量越高，酶解產(chǎn)物酸價越大。pH大于6.5時，隨著固定化體系pH的增大，固定化率在97.5％-98％左右，變化不大，共固定化酶的酶活力變化也較為平緩。所以，共固定化的最佳pH為6.5。

2.3.2海藻酸鈉濃度對共固定化酶活力的影響

湯鳴強曾研究過，海藻酸鈉不僅影響溶液的黏度、膠粒的圓整度和機械強度，還影響到固定化酶活力。海藻酸鈉有強烈的吸附性，可與銅、鈣等正二價陽離子形成凝膠。海藻酸鈉濃度太大時，凝膠孔徑較小，影響底物與酶的結(jié)合。海藻酸鈉濃度太小時，凝膠孔徑較大，固定化酶易流失，酶活力較低。所以在共固定化過程中海藻酸鈉應(yīng)有一個最佳的濃度值。

如圖3，在制備固定化酶時，可以明顯地看到當(dāng)海藻酸鈉濃度小于0.5％時，形成的凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，無法形成凝膠顆粒。當(dāng)海藻酸鈉濃度為0.5％時，最終形成不規(guī)則的膠粒，且顆粒較為柔軟，機械強度差，導(dǎo)致制備的海藻酸鈉微球容易破壁，使得大部分的游離酶無法固定。當(dāng)海藻酸鈉濃度為1.0％-1.5％時，固定化酶的固定化率較高，制備的膠粒機械性能好，所測得的酸價較高，固定化酶活力較高?？赡苁沁m當(dāng)?shù)卦黾虞d體海藻酸鈉的濃度會使其可承載酶蛋白分子的能力增強，故固定化率增大。繼續(xù)增加海藻酸鈉的濃度，固定化率及酸價反而下降。原因可能是當(dāng)海藻酸鈉濃度較高時，固定在單位質(zhì)量海藻酸鈉上的酶減少，固定化率下降；形成固定化酶膠粒的薄層太厚，被包埋的酶與底物之間的傳質(zhì)阻力增大，從而使得固定化酶活力下降。當(dāng)海藻酸鈉濃度大于2.5％時，則很快凝固且不易操作，很難將海藻酸鈉溶液從注射器中擠出。故選用質(zhì)量分數(shù)為1.5％的海藻酸鈉進行共固定化較適宜。

2.3.3酶量對共固定化酶活力的影響

在進行固定化酶時，當(dāng)載體含量與給酶量相適宜時才能達到最理想的固定化效果，否則，當(dāng)載體含量相對過低時就會造成部分游離酶無法與載體結(jié)合，造成不必要的浪費，當(dāng)載體含量相對過高時則會造成載體無法充分發(fā)揮其結(jié)合酶蛋白的能力，一定程度上也提高了固定化成本。因此，選擇最適宜的給酶量有利于提高固定化酶的效益。

如圖4，當(dāng)海藻酸鈉濃度不變時，隨著給酶量的增加，固定化率也增大，固定化酶的酶活力呈先上升后下降的趨勢。給酶量小于27mg/g海藻酸鈉時，固定化率增加趨勢比較明顯，說明當(dāng)給酶量較小時，單位載體的固定化并未出現(xiàn)飽和，因此隨著給酶量增加，固定化率增加增大。而當(dāng)給酶量大于27mg/g海藻酸鈉時，固定化率曲線變得平緩，說明此時固定化己經(jīng)接近飽和。當(dāng)給酶量為30mg/g海藻酸鈉時，固定化酶的酶活力達到最大值，此時測得酸價為1.73mg/g。這是因為在載體量不變的條件下，當(dāng)給酶量相對較少時，載體包埋的酶蛋白也較少，使載體沒有被充分利用，因此酶活性也很低。然而當(dāng)給酶量相對較多時，載體所包埋的酶蛋白也較多，從而造成酶蛋白相互聚集成團，酶分子的活性中心可能被遮蓋，影響酶與底物結(jié)合，盡管海藻酸鈉包埋的酶量很多，但酶活性仍很低。所以，共固定化的最佳給酶量是30mg/g海藻酸鈉。

2.3.4 CaCl₂濃度對共固定化酶活力的影響

Ca²⁺與海藻酸鈉形成海藻酸鈣凝膠是固定化酶的重要過程。CaCl₂作為凝固劑即決定固定化酶的機械強度，也決定了固定化酶的固定化“牢固”程度。

結(jié)果如圖5所示，共固定化酶的固定化率及酶活力隨CaCl₂濃度的增大而增大，當(dāng)CaCl₂濃度達到4.0％時，共固定化酶的固定化率及酶活力達到最高，而且大部分凝膠顆粒成有規(guī)則的球形。CaCl₂濃度繼續(xù)增加時，固定化率變化不大，共固定化酶的酶活力隨CaCl₂濃度的增大而下降。可能的原因是當(dāng)CaCl₂濃度過低，共固定時包埋不完全，部分酶無法固定到凝膠顆粒中，固定化率較低；固定化所得的凝膠顆粒較柔軟，機械強度弱，洗滌時損失較多的酶活，固定化酶的酶活力較低。當(dāng)CaCl₂濃度過高時，凝膠顆粒表面會形成一層致密的海藻酸鈣層，不利于底物的擴散，使固定化酶的酶活力下降。因此，共固定化的最佳CaCl₂濃度是4.0％。

2.3.5溫度對共固定化酶活力的影響

適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾用阜肿拥膭幽埽岣呙概c載體間的接觸率，從而增大固定化效率。但是酶作為一種蛋白質(zhì)，高溫容易造成其變性失活。

從圖6可以看出，溫度不超過30℃時，固定化的溫度對共固定化酶酶活力影響并不是很大。溫度超過30℃時，固定化酶酶活力呈下降趨勢。20℃-35℃范圍內(nèi)，固定化率呈上升趨勢。35℃時固定化率達最高，固定化率為99.2％。溫度繼續(xù)增大時，固定化率下降。原因可能是當(dāng)固定化溫度較低時，海藻酸鈉在低溫下會凝固，從而加大了操作的難度，固定化率較低；由于溫度較低，溫度對固定化酶酶活力影響并不大。所以，共固定化的最佳溫度時30℃。

2.3.6時間對共固定化酶活力的影響

固定化時間指的是酶與海藻酸鈉的混合液滴落到CaCl₂后靜置反應(yīng)的時間。

由圖7可知，固定化時間對固定化率的影響不明顯，隨著固定化時間的增加，固定化率始終維持在98％左右，固定化率較高。而固定化酶酶活力隨著固定化時間的增大呈先上升后下降的趨勢。這是因為海藻酸鈉與CaCl₂反應(yīng)并形成凝膠顆粒的過程是需要時間的。共固定化初期，包埋漸漸緊密，流失減少，固定化酶酶活力呈上升趨勢；30min后固定化酶酶活力達到最大，此時測得酸價為1.69mgKOH/g；但是時間繼續(xù)增加會使Ca²⁺與酶作用，并且凝膠過于緊密，影響底物與酶結(jié)合，影響共固定化酶酶活力。故選擇最適的固定化時間為30min。

2.4共固定化酶的穩(wěn)定性

2.4.1共固定化酶的熱穩(wěn)定性

溫度對酶的影響十分復(fù)雜，溫度影響酶蛋白分子的構(gòu)象、參與酶促反應(yīng)功能團的解離狀態(tài)，還影響到底物與酶的親和力。

從圖8可得，共固定化酶在20℃下水浴150min后仍然保留81.4％的酶活力，熱穩(wěn)定性較好?？赡苁且驗檩d體提供了一種環(huán)境，對酶起了保護作用。

從圖9可知，共固定化酶在60℃下水浴時，酶活力下降幅度較大。0-20min時，酶活力下降較快；20min后，酶活力變化不大，相對酶活力保持在70％-75％左右。共固定化酶在60℃時酶活力迅速下降的原因可能是由于高溫時酶容易失活以及在較高溫度下共固定化酶外層的海藻酸鈣會因為溫度的升高而軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來，因此酶活力下降較快。

2.4.2共固定化酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶的操作穩(wěn)定性是有別于游離酶的一項重要特征，是反映固定化效果的重要指標。固定化酶的重復(fù)利用不但有利于酶解后產(chǎn)物的回收和純化，而且有利于節(jié)約成本。

從圖10可以看出，隨著使用次數(shù)的增加，相對酶活力降低，可能是由于不斷攪拌，海藻酸鈉載體持水性發(fā)生變化，共固定化酶凝膠結(jié)構(gòu)改變，酶從海藻酸鈉載體上脫落并與底物接觸不斷水解。共固定化酶使用4次后，酶活力仍保持原來的92.4％，穩(wěn)定性較好。與此同時，共固定化酶使用4次后制得的奶香基料與第一次的奶香基料的香氣在感官上沒有太大差別。

2.4.3共固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

由圖11可見，共固定化酶貯藏0-4天時，酶活力保持在91.8％以上。說明酶與海藻酸鈉載體結(jié)合后，載體的存在阻止了酶蛋白之間的相互作用，抑制了酶蛋白的變性和降解，使共固定化酶具有一定的貯藏穩(wěn)定性。共固定化酶貯藏4天以后，其酶活力迅速下降，第10天時固定化酶酶活力是66.8％。酶活力下降的原因可能是海藻酸鈉凝膠中的蛋白酶水解脂肪酶，影響脂肪酶的酶活力。

實驗結(jié)果表明，共固定化的最佳條件是：磷酸緩沖液的pH為6.5，海藻酸鈉的濃度為1.5％，總加酶量為30mg/g海藻酸鈉(MSD:A6:MER＝0.3：2：1)，CaCl₂濃度為4.0％，共固定化的溫度為30℃，共固定化的時間是30min。此時共固定化酶的固定化率為98.0％，第4次使用后酶活力仍保持原來的92.4％，貯藏10天后酶活力仍保持原來的66.8％，穩(wěn)定性較好。

2.5奶香基料的制備

2.5.1共固定化酶添加量

酶催化生成奶香基料時，酶的添加量對奶香基料的風(fēng)味影響較大。酶的添加量較少時，生成的風(fēng)味物質(zhì)的量少，奶香味較淡；酶添加量過多時，雖可產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，卻會產(chǎn)生某些不良氣味，同時也會增加生產(chǎn)成本。因此，應(yīng)選擇合適的共固定化酶添加量。

表5共固定化酶添加量對奶香基料的感官影響

由圖12和表5可知，當(dāng)共固定化酶添加量小于黃油質(zhì)量時，隨著共固定化酶的增加，產(chǎn)香效果越好，香氣越濃郁。共固定化酶等于黃油質(zhì)量時，所得到的奶香基料為甜香型奶味，香氣濃郁、圓潤且回味悠長，此時測得酸價為1.86mg/g。當(dāng)共固定化酶添加量大于黃油質(zhì)量時，開始產(chǎn)生酸臊味，且隨著加酶量的增加，奶香基料的酸價增加較快，酸臊味越來越嚴重。綜合考慮，最適宜的共固定化酶的添加量與黃油的質(zhì)量相等。

2.5.2共固定化酶的酶解時間

為了得到最好的效果和提高生產(chǎn)效率，選擇合適的酶解時間也是很重要的。就理論而言，酶解時間越長，酶解反應(yīng)越徹底。事實上，過長的酶解時間會生成較多的不良風(fēng)味物質(zhì)，影響香基的整體風(fēng)味。但是當(dāng)酶解時間過短時，酶解反應(yīng)不完全，風(fēng)味物質(zhì)生成過少，風(fēng)味沒有充分形成。要奶香基料達到理想的風(fēng)味，酶解反應(yīng)時間應(yīng)控制好。

表6酶解時間對奶香基料的感官影響

從圖13和表6可以看出，酶解產(chǎn)物的酸價隨著酶解時間的增加而增大。當(dāng)酶解時間是2h時，產(chǎn)香效果最好，所得奶香基料香氣濃郁、圓潤，并與奶甜味協(xié)調(diào)，留香時間長，此時酸價為1.70mg/g。當(dāng)酶解時間超過2h后，酸價繼續(xù)上升，開始出現(xiàn)酸敗味，感官評分下降，可能是黃油的酶解程度過高導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中不良風(fēng)味物質(zhì)生成。綜合考慮，選擇酶解最適宜的時間為2h。

2.5.3共固定化酶的酶解溫度

酶對溫度較為敏感,溫度的不同會影響到酶活性中心的分子構(gòu)象分布及底物黃油的乳化狀態(tài)，從而影響到整個酶解反應(yīng)的進程。當(dāng)酶解溫度低于最適溫度時，溫度會抑制酶的活性，使酶活力較低，同時也會影響底物的粘度，進而影響傳質(zhì)速度，酶解反應(yīng)的速度變慢。當(dāng)酶解溫度高于最適溫度時，由于高溫會導(dǎo)致酶變性而減弱甚至失去催化活性，而且在較高溫度下共固定化酶外層的海藻酸鈣會軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來，酶活力下降。

表7酶解溫度對奶香基料的感官影響

由圖14和表7可以看見，當(dāng)酶解溫度低于40℃時，隨著溫度的升高，奶香基料的香氣越來越強烈，香氣純度越來越協(xié)調(diào)、豐富，原因可能是溫度的升高促進了酶解反應(yīng)的進行，風(fēng)味產(chǎn)物也隨之增加。當(dāng)溫度達到40℃時，所得到的奶香基料的感官評分最高，此時的奶香基料是偏奶酪的奶香，奶香較強，香氣較純正圓潤，留香時間長，所測得酸價是1.58mg/g。當(dāng)酶解溫度達到45℃時，酶解產(chǎn)物的酸價最高，酸價是3.58mg/g，感官評分降低，可能是因為酶解過度產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)。酶解溫度超過45℃時，可能是由于酶解溫度高于最適溫度導(dǎo)致酶變性而減弱甚至失去催化活性，或者是因為共固定化酶外層的海藻酸鈣因為溫度的升高而軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來，使酶活力開始下降導(dǎo)致酸價和感官評分降低。綜上所述，適宜酶解溫度是40℃。

2.6游離酶與共固定化酶制備奶香基料的比較

雖然固定化酶技術(shù)解決了游離酶的生產(chǎn)成本高等問題，但由于酶分子從游離態(tài)變成牢固態(tài)結(jié)合于載體時，酶分子的微觀環(huán)境發(fā)生了變化。因此游離酶和共固定化酶制備的奶香基料在工藝條件和感官評分方面還是存在一些差別。

表8游離酶與共固定化酶制備奶香基料的比較

由表8可知，雖然在共固定化過程中游離酶和海藻酸鈉的使用和共固定化過程中產(chǎn)生了生產(chǎn)成本，但由于固定化酶能重復(fù)使用，且酶解工藝更簡單，利用固定化酶制備奶香基料可以達到節(jié)約生產(chǎn)成本的目的。而游離酶和海藻酸鈉制備的奶香基料都是偏奶酪香型奶香，香氣較純正圓潤，留香情況較好，感官評分相近，但是游離酶制備的奶香基料的香氣比固定化酶制備的奶香基料的香氣稍微濃郁一些。可能是海藻酸鈉凝膠顆粒在一定程度上妨礙了酶和底物的接觸，使某些呈味物質(zhì)生成較少或無法生成，造成香氣強度稍弱。又可能是因為海藻酸鈉凝膠顆粒妨礙了某些呈味物質(zhì)的擴散，使制得的奶香香基的香氣較弱。

實驗結(jié)果表明，制備奶香基料的最佳工藝條件是：以黃油為底物，加水量為黃油重量的60.0％，以乳清粉為輔底物，輔底物添加量為黃油重量的12.5％，共固定化酶的添加量與底物黃油的質(zhì)量比為1:1，酶解時間是2h，酶解溫度是40℃。本發(fā)明所得的奶香基料奶香味濃厚、奶香純正、愉悅度好，可用于制作餅干。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。