本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法。

背景技術(shù)：

我們知道，海參具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被人們視為重要的海珍品。近年來(lái)，海參消費(fèi)需求量的逐年增加導(dǎo)致了海參自然資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)和種群數(shù)量的急劇下降，因此，海參的人工養(yǎng)殖也隨之發(fā)展起來(lái)。餌料是海參生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著海參大規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展，天然餌料已不能滿足海參養(yǎng)殖的需要，因此需要人工投喂餌料。目前，人工投喂餌料存在著人工成本高、投放的餌料利用率低、人工投放餌料的量和時(shí)間不易掌握等問(wèn)題。

魚(yú)類是我國(guó)沿海豐富的海產(chǎn)資源，魚(yú)類加工后的下腳料（魚(yú)碎肉和內(nèi)臟）成本低、蛋白質(zhì)、?；撬岷扛?，是海參理想的天然餌料，但是使用未加工的魚(yú)下腳料，又存在海參無(wú)法消化利用的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中魚(yú)類下腳料直接投喂海參無(wú)法消化利用的不足，本發(fā)明提供一種工藝合理、海參餌料的腸道利用率高的利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟：

（a）魚(yú)類下腳料發(fā)酵處理

（a1）發(fā)酵種子液的培養(yǎng)

在DAE培養(yǎng)基中接入W2菌種，控制溫度20～25℃，在150～180r/min條件下，培養(yǎng)2～3d，得種子菌液，所述的種子菌液OD600為1.0～1.2；其中，所述的DAE培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨0.4～0.8g，酵母膏0.05～0.2g，磷酸鐵0.01～0.02g，海水90～100ml；所述的W2菌種為魚(yú)腸道中分離篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株，該W2菌種與所述的DAE培養(yǎng)基的接種比例為1:300～500；

（a2）魚(yú)類下腳料發(fā)酵液的制備

選取魚(yú)下腳料為原料，研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚(yú)類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，控制溫度20～25℃，在150～180r/min條件下，培養(yǎng)2～3d，取發(fā)酵液，得魚(yú)類下腳料發(fā)酵液；其中，所述的肉糜狀魚(yú)類下腳料與種子菌液的料液比為1:20～25；

（b）固定化酶的制備

（b1）載體制備

稱取殼聚糖溶解于濃度為20～30%的鹽酸溶液中，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結(jié)成中空球形殼聚糖；其中，所述的殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:3～5，所述的殼聚糖的脫乙酰度為80%～85%；

（b2）載體活化

將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為4～8%的戊二醛水溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)4～6h，然后4℃靜置過(guò)夜，去上清液后用水清洗2～3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；其中，所述的中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2～3；

（b3）酶的包埋

將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入不同pH 值緩沖液配置的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應(yīng)2～3h ，于4℃靜置過(guò)夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；其中，所述的中性蛋白酶的緩沖液pH 值為6.8～7.5；所述的堿性蛋白酶的緩沖液pH 值為8.5～10.5；所述的酸性蛋白酶的緩沖液pH 值為4.0～4.5；

（c）投放

將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚(yú)類下腳料發(fā)酵液按料液比為1:50～100投入海參養(yǎng)殖水域中。

本發(fā)明是在培養(yǎng)基中接種魚(yú)腸道中分離篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株，培養(yǎng)出種子菌液；將魚(yú)類下腳料肉糜放入種子菌液中發(fā)酵，形成富含蛋白質(zhì)的發(fā)酵液；將殼聚糖溶液注射到氫氧化鈉和甲醇混合溶液中，凝結(jié)成中空球形殼聚糖載體；載體放入戊二醛水溶液中活化；利用固定化酶技術(shù)，將酶包裹在空心球殼聚糖載體中，形成固定化酶；將固定化酶與發(fā)酵液一起投放到海參養(yǎng)殖水域，即可。固定化酶的穩(wěn)定性高，半衰周期長(zhǎng)，魚(yú)類下腳料發(fā)酵液與其一起投入海參飼養(yǎng)水域中，底物可以透過(guò)孔道與酶接觸反應(yīng)，將魚(yú)下腳料廢液中的蛋白進(jìn)行酶解，不僅提高了海參餌料的腸道利用率，減少代謝產(chǎn)物的排出，提高海參的生長(zhǎng)速率、飼料轉(zhuǎn)化率，而且還能對(duì)沉積在海底或池底的殘餌起到一定的降解作用，減少養(yǎng)殖業(yè)中氮、磷的排放，保護(hù)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明工藝合理，其中，所采用的蛋白酶為模擬海參體內(nèi)從前腸到后腸的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶；所采用的殼聚糖，投入飼養(yǎng)海參水域后，還可以起到凈化水質(zhì)的作用。因?yàn)槊傅淖饔玫孜锸怯邢薜?，一次性投放的魚(yú)下腳料發(fā)酵液并不能立刻被完全消化完，魚(yú)類下腳料發(fā)酵液與固定化的蛋白酶配合緩慢又源源不斷地為海參供給養(yǎng)料。兩者一次性投放可以減少投放餌料的次數(shù)，降低人工成本。本發(fā)明充分利用海產(chǎn)廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環(huán)境污染，增加海參養(yǎng)殖餌料種類，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟：

（a）魚(yú)類下腳料發(fā)酵處理

（a1）發(fā)酵種子液的培養(yǎng)

在DAE培養(yǎng)基中接入W2菌種，控制溫度22℃，在160r/min條件下，培養(yǎng)3d，得種子菌液，該種子菌液OD600為1.1；其中， DAE培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸鐵0.015g，海水95ml； W2菌種為魚(yú)腸道中分離篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養(yǎng)基的接種比例為1:400；

（a2）魚(yú)類下腳料發(fā)酵液的制備

選取魚(yú)下腳料為原料，送入研磨機(jī)中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚(yú)類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚(yú)類下腳料與種子菌液的料液比為1:22；控制溫度23℃，在160r/min條件下，培養(yǎng)3d，取發(fā)酵液，得魚(yú)類下腳料發(fā)酵液；

（b）固定化酶的制備

（b1）載體制備

稱取脫乙酰度為82%的殼聚糖溶解于濃度為25%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:4，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結(jié)成中空球形殼聚糖；

（b2）載體活化

將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為6%的戊二醛水溶液中，其中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2.5；于室溫下攪拌反應(yīng)5h，然后4℃靜置過(guò)夜，去上清液后用水清洗3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；

（b3）酶的包埋

將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為7.0緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為9.0緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.2緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應(yīng)3h ，于4℃靜置過(guò)夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚(yú)類下腳料發(fā)酵液按料液比為1:80投入海參養(yǎng)殖水域中。

本實(shí)施例所提供的利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩(wěn)定性高，半衰周期長(zhǎng)，對(duì)魚(yú)類下腳料發(fā)酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時(shí)對(duì)沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，減少養(yǎng)殖業(yè)中氮、磷的排放，所采用的殼聚糖還起到凈化水質(zhì)的作用，保護(hù)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。其減少投放餌料的次數(shù)，降低人工成本。本發(fā)明充分利用海產(chǎn)廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環(huán)境污染。

實(shí)施例2

利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟：

（a）魚(yú)類下腳料發(fā)酵處理

（a1）發(fā)酵種子液的培養(yǎng)

在DAE培養(yǎng)基中接入W2菌種，控制溫度25℃，在150r/min條件下，培養(yǎng)2d，得種子菌液；該種子菌液OD600為1.2；其中， DAE培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨0.8g，酵母膏0.05g，磷酸鐵0.02g，海水100ml； W2菌種為魚(yú)腸道中分離篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養(yǎng)基的接種比例為1:500；

（a2）魚(yú)類下腳料發(fā)酵液的制備

選取魚(yú)下腳料為原料，送入研磨機(jī)中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚(yú)類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚(yú)類下腳料與種子菌液的料液比為1: 25；控制溫度20℃，在180r/min條件下，培養(yǎng)2d，取發(fā)酵液，得魚(yú)類下腳料發(fā)酵液；

（b）固定化酶的制備

（b1）載體制備

稱取脫乙酰度為85%的殼聚糖溶解于濃度為20%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1: 5，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結(jié)成中空球形殼聚糖；

（b2）載體活化

將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為8%的戊二醛水溶液中，中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2；于室溫下攪拌反應(yīng)4h，然后4℃靜置過(guò)夜，去上清液后用水清洗3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；

（b3）酶的包埋

將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為6.8緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為10.5緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.0緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應(yīng)2.5h ，于4℃靜置過(guò)夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚(yú)類下腳料發(fā)酵液按料液比為1:50投入海參養(yǎng)殖水域中。

本實(shí)施例所提供的利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩(wěn)定性高，半衰周期長(zhǎng)，對(duì)魚(yú)類下腳料發(fā)酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時(shí)對(duì)沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，其減少投放餌料的次數(shù)，降低人工成本。本發(fā)明充分利用海產(chǎn)廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環(huán)境污染。

實(shí)施例3

利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟：

（a）魚(yú)類下腳料發(fā)酵處理

（a1）發(fā)酵種子液的培養(yǎng)

在DAE培養(yǎng)基中接入W2菌種，控制溫度20℃，在180r/min條件下，培養(yǎng)3d，得種子菌液；該種子菌液OD600為1.0；其中，DAE培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨0.4g，酵母膏0.2g，磷酸鐵0.01g，海水90ml； W2菌種為魚(yú)腸道中分離篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養(yǎng)基的接種比例為1:300；

（a2）魚(yú)類下腳料發(fā)酵液的制備

選取魚(yú)下腳料為原料，送入研磨機(jī)中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚(yú)類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚(yú)類下腳料與種子菌液的料液比為1:20；控制溫度25℃，在150r/min條件下，培養(yǎng)2.5d，取發(fā)酵液，得魚(yú)類下腳料發(fā)酵液；

（b）固定化酶的制備

（b1）載體制備

稱取脫乙酰度為80%的殼聚糖溶解于濃度為30%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:3，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結(jié)成中空球形殼聚糖；

（b2）載體活化

將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為4%的戊二醛水溶液中，中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1: 3；于室溫下攪拌反應(yīng)6h，然后4℃靜置過(guò)夜，去上清液后用水清洗2次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；

（b3）酶的包埋

將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為7.5緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為8.5緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.5緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應(yīng)2h ，于4℃靜置過(guò)夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚(yú)類下腳料發(fā)酵液按料液比為1:100投入海參養(yǎng)殖水域中。

本實(shí)施例所提供的利用魚(yú)類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩(wěn)定性高，半衰周期長(zhǎng)，對(duì)魚(yú)類下腳料發(fā)酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時(shí)對(duì)沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，減少養(yǎng)殖業(yè)中氮、磷的排放，所采用的殼聚糖還起到凈化水質(zhì)的作用，保護(hù)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。其減少投放餌料的次數(shù)，降低人工成本。本發(fā)明充分利用海產(chǎn)廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環(huán)境污染。