本發(fā)明屬于整體柱制備領(lǐng)域，具體涉及一種銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。

背景技術(shù)：

整體柱是通過在管內(nèi)原位聚合的方法，一步制備而成的一種棒狀整體，故又稱棒柱。這種柱型具有雙孔結(jié)構(gòu)，在交聯(lián)網(wǎng)狀骨架中既有彼此連通的微米級(jí)穿透孔，又有納米級(jí)骨架孔，致使柱子持有高通透性和大的比表面積，用作分析柱時(shí)能達(dá)到高效、快速、高通量和低柱壓。整體柱由于其具有易制備、多種多樣的表面功能化、多孔性和快速傳質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在分析科學(xué)領(lǐng)域吸引了持續(xù)的關(guān)注。除了傳統(tǒng)地作為高效液相色譜(hplc)和毛細(xì)管電色譜(cec)的分離固定相外，整體柱也被用于固相萃取(spe)或固相微萃取(spme)在復(fù)雜樣品前處理領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛能。

銀納米粒，因其具有高的導(dǎo)電率、強(qiáng)的抑菌作用以及良好的光催化能力等出眾的性能在許多領(lǐng)域都受到了大家的廣泛關(guān)注。銀納米粒與不飽和化合物所帶有的碳碳雙鍵之間存在著特殊的作用力，這種作用力隨著雙鍵數(shù)量的增加而提高，隨著碳鏈的增長(zhǎng)而變小，同時(shí)順式不飽和化合物的作用力要強(qiáng)于反式不飽和化合物。在分離科學(xué)領(lǐng)域，尤其是整體柱制備領(lǐng)域中僅有屈指可數(shù)的幾篇文獻(xiàn)報(bào)道了銀納米粒功能化整體柱在色譜分離中的應(yīng)用。zhu等人（y.zhu,etal.j.sep.sci.,2015,38,2841-2847）將銀納米粒衍生到孔徑結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化的大孔/介孔硅膠整體柱中，并用于多環(huán)芳烴以及帶有碳碳雙鍵不飽和化合物的順反異構(gòu)體的高效液相色譜分離。navarro-pascual-ahuir等人（m.navarro-pascual-ahuir,etal.electrophoresis,2013,34,925-934）通過紫外光引發(fā)原位還原和反應(yīng)液直接摻雜銀納米粒溶液的方式制備了兩種摻雜銀納米粒的十二烷基甲基丙烯酸酯整體柱，并將其應(yīng)用于中性化合物（包括帶有碳碳雙鍵的不飽和化合物）毛細(xì)管電色譜分離。然而，迄今為止尚未有銀納米粒功能化整體柱在固相微萃取領(lǐng)域中應(yīng)用的報(bào)道。本發(fā)明基于本課題組之前研發(fā)的粘多糖功能化整體柱，通過其表面的活性作用位點(diǎn)直接實(shí)現(xiàn)銀納米粒在整體柱表面的固定化，提供一種銀納米粒固定化固相微萃取整體柱制備新技術(shù)，對(duì)銀納米粒固定化整體柱的推廣和應(yīng)用將帶來(lái)很大的幫助。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。本發(fā)明以本課題組之前研發(fā)的粘多糖功能化整體柱作為基質(zhì)整體柱（申請(qǐng)?zhí)枺?01610816758.1，專利名稱：一種粘多糖功能化親水固相微萃取整體柱），并制備性能穩(wěn)定、分散性良好的球形銀納米粒溶液，通過微泵輔助下將銀納米粒溶液通入基質(zhì)整體柱，實(shí)現(xiàn)銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備。得益于負(fù)載的銀納米粒與帶有碳碳雙鍵的不飽和化合物之間的作用力實(shí)現(xiàn)該類化合物的富集，并利用該類化合物順反異構(gòu)體作用力強(qiáng)度的不同，實(shí)現(xiàn)該類化合物順反異構(gòu)體的順序洗脫。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

首先，將粘多糖與尿素溶液、甲醛溶液、催化劑溶液均勻混合，通過原位一步脫水縮聚制備粘多糖功能化整體柱，并將其作為基質(zhì)整體柱；制備平均粒徑在30nm左右、粒子尺寸分布區(qū)間狹窄、性能穩(wěn)定、分散性良好的球形銀納米顆粒；利用微泵將銀納米粒溶液通入基質(zhì)整體柱，利用基質(zhì)整體柱表面的羧基、氨基等活性位點(diǎn)與銀納米粒的相互作用，實(shí)現(xiàn)銀納米粒的固定化；制得銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。

其中，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)之和為100%計(jì)，各組分占基質(zhì)整體柱制備配方組成總質(zhì)量的百分比為：粘多糖0.1~1%、尿素溶液38~52%、甲醛溶液34~47%、催化劑7.5~9.5%。

所述粘多糖為透明質(zhì)酸鈉或硫酸軟骨素；

所述尿素溶液，其濃度為1g/ml；

所述甲醛溶液，其中甲醛的質(zhì)量濃度為33%~37%；

所述催化劑為鹽酸，其濃度為0.20mol/l；

所述銀納米粒溶液，其平均粒徑在30nm左右，濃度為1mmol/l。

所述的銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備方法，包括以下步驟：

1）粘多糖功能化整體柱的制備：1.特氟龍（ptfe）管或聚醚醚酮（peek）管空管的清洗：將ptfe管（或peek管）接上液相泵，用色譜純甲醇在0.5ml/min流速下沖洗10min，然后通氮?dú)猓⒅糜?0℃的烘箱中烘干10min。2.管內(nèi)快速縮聚：將基質(zhì)整體柱制備配方中的各組分按適當(dāng)?shù)谋壤鶆蚧旌?，快速超聲振?~2min，然后將混合物快速注滿經(jīng)清洗干燥的ptfe管（或peek管）中，兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱10min；待反應(yīng)完成后，以水為流動(dòng)相，在液相色譜泵上沖洗ptfe管（或peek管）整體色譜柱約1h，沖去床層內(nèi)殘留的溶劑和反應(yīng)殘留試劑，即得到粘多糖功能化整體柱（基質(zhì)整體柱）。

2）銀納米粒溶液的制備：將1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸鉀鈉溶液、2mmol/l檸檬酸鈉溶液等體積混合，振蕩超聲，調(diào)節(jié)混合溶液ph值為10，即得到平均粒徑在30nm左右、紫外-可見光吸收光譜350~450nm區(qū)段有明顯吸收峰、尺寸分布區(qū)間狹窄、性能穩(wěn)定、分散性良好的1mmol/l球形銀納米粒溶液。

3）銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備：固定化銀納米粒前，先用乙腈沖洗基質(zhì)整體柱，利用微泵將1ml銀納米粒溶液通入基質(zhì)整體柱，然后兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱2h。完成后，以乙腈為流動(dòng)相，在液相色譜泵上沖洗該整體柱約1h，即得到銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

1）本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)揮了粘多糖功能化整體柱的獨(dú)特性能，只需簡(jiǎn)單地將銀納米粒溶液通入粘多糖功能化整體柱，巧妙地利用了粘多糖功能化整體柱表面的活性作用位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了銀納米粒的固定化。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、易于操作、不需要昂貴的儀器。

2）在之前其他工作報(bào)道的使用原位還原法或直接摻雜法制備的銀納米粒功能化整體柱中，絕大多數(shù)銀納米粒都是被包埋在整體柱基質(zhì)中，因此銀納米粒的性能無(wú)法得到充分展示。而本發(fā)明提出的表面直接固定化法，可以確保固定化的銀納米粒都在整體柱表面，有利于充分發(fā)揮銀納米粒的獨(dú)特性能。

3）本發(fā)明將基質(zhì)整體柱制備和銀納米粒固定化分步進(jìn)行，可以分別實(shí)現(xiàn)整體材料的孔結(jié)構(gòu)控制和表面化學(xué)性能改良，避免了原位還原法或直接摻雜法中銀納米粒溶液對(duì)整體柱結(jié)構(gòu)造成的影響。

4）本發(fā)明提供的銀納米粒固定化固相微萃取整體柱應(yīng)用于固相微萃取時(shí)，在載樣過程中利用銀納米粒與帶有碳碳雙鍵之間的特殊作用力實(shí)現(xiàn)不飽和化合物的富集，而在洗脫過程中，利用不飽和化合物順反異構(gòu)體與銀納米粒之間作用力強(qiáng)度的不同，實(shí)現(xiàn)不飽和化合物順反異構(gòu)體的順序洗脫。

附圖說(shuō)明

圖1是銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖。

圖2是粘多糖功能化整體材料（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體材料（b）的紫外-可見光吸收光譜圖。

圖3是以不同整體柱作為固相微萃取整體柱，建立管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)二苯乙烯順反異構(gòu)體的色譜分離圖；

圖中a是以粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱，b是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱。

圖4是以不同整體柱作為固相微萃取整體柱，建立in-tubespme-hplc聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯）的色譜分離圖；

圖中a是以粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱，b是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明不僅限于此。

（1）粘多糖功能化整體柱（基質(zhì)整體柱）的制備：1.ptfe管或peek管空柱的清洗：將內(nèi)徑為750μmptfe管（或peek管）接上液相泵，用色譜純甲醇在0.5ml/min流速下沖洗10min，除去ptfe管（或peek管）內(nèi)壁殘留的有機(jī)物雜質(zhì)等，然后通氮?dú)?，并置?0℃的烘箱中烘干10min。2.管內(nèi)快速縮聚：將8mg透明質(zhì)酸鈉，550mg1g/ml尿素溶液，450mg甲醛溶液，100mg0.2mol/l鹽酸溶液均勻混合，快速超聲振蕩1~2min，然后將混合物快速注滿經(jīng)清洗干燥的ptfe管（或peek管）中，兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱10min；待反應(yīng)完成后，以水為流動(dòng)相，在液相色譜泵上沖洗ptfe管（或peek管）整體色譜柱約1h，沖去床層內(nèi)殘留的溶劑和反應(yīng)殘留試劑，即得到粘多糖功能化固相微萃取整體柱。

（2）銀納米粒溶液的制備：將1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸鉀鈉溶液、2mmol/l檸檬酸鈉溶液等體積混合，振蕩超聲，用5wt%naoh溶液調(diào)節(jié)混合溶液ph值為10，即制備得到平均粒徑在30nm左右、紫外-可見光吸收光譜350~450nm區(qū)段有明顯吸收峰、尺寸分布區(qū)間狹窄、性能穩(wěn)定、分散性良好的1mmol/l球形銀納米粒溶液。

（3）銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備：固定化銀納米粒前，先用乙腈沖洗基質(zhì)整體柱，利用微泵將1ml銀納米粒溶液通入基質(zhì)整體柱，然后整體柱兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱2h。完成后，以乙腈為流動(dòng)相，在液相色譜泵上沖洗該整體柱約1h，即得到銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。

應(yīng)用實(shí)施例1

按上述具體實(shí)施方式所述制備粘多糖功能化整體材料（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體材料（b），并分別進(jìn)行紫外-可見光吸收光譜測(cè)試。如圖2所示，曲線a在紫外-可見光吸收光譜350~450nm區(qū)段沒有吸收峰，曲線b在420nm左右有明顯吸收峰，這一吸收峰是由于銀納米粒的橫斷面等離子體共振，說(shuō)明銀納米粒很好地固定化到了粘多糖功能化整體材料上。

應(yīng)用實(shí)施例2

按上述具體實(shí)施方式所述制備粘多糖功能化整體柱（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體柱（b），并以這兩種整體柱作為固相微萃取整體柱，建立管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)，考察二苯乙烯順反異構(gòu)體的固相微萃取行為（圖3）。

具體分離條件：載樣液組成：正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；樣品溶劑：100%正己烷；進(jìn)樣流速：0.1ml/min；進(jìn)樣體積：500μl；洗脫液組成：100%正己烷；洗脫流速：0.1ml/min；洗脫體積：150μl；分離流動(dòng)相：100%正己烷；分離流速：1.0ml/min；柱溫箱溫度：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm。圖3-b中，檢測(cè)峰1是順式二苯乙烯，檢測(cè)峰2是反式二苯乙烯。

如圖3所示，使用粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線a）時(shí)，檢測(cè)峰強(qiáng)度較低，且二苯乙烯順反異構(gòu)體無(wú)法得到分離；而使用銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線b）時(shí)，檢測(cè)峰強(qiáng)度得到增強(qiáng)，且二苯乙烯順反異構(gòu)體得到分離，說(shuō)明了作為固相微萃取整體柱，銀納米粒固定化整體柱對(duì)不飽和化合物二苯乙烯表現(xiàn)出明顯的富集能力，同時(shí)由于反式二苯乙烯與銀納米粒的作用力強(qiáng)于順式二苯乙烯，二苯乙烯順反式異構(gòu)體按照作用力強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)順序洗脫，并得以有效分離分析，表明了銀納米粒固定化固相微萃取整體柱具有實(shí)現(xiàn)不飽和化合物順反異構(gòu)體順序洗脫的能力。

應(yīng)用實(shí)施例3

按上述具體實(shí)施方式所述制備粘多糖功能化整體柱（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體柱（b），并以這兩種整體柱作為固相微萃取整體柱，建立管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)，考察亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯）的固相微萃取行為（圖4）。

具體分離條件：載樣液組成：正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；樣品溶劑：100%正己烷；進(jìn)樣流速：0.1ml/min；進(jìn)樣體積：500μl；洗脫液組成：100%正己烷；洗脫流速：0.1ml/min；洗脫體積：150μl；分離流動(dòng)相：100%正己烷；分離流速：1.0ml/min；柱溫箱溫度：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。圖4-b中，檢測(cè)峰1是反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯，檢測(cè)峰2、3分別是順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯，檢測(cè)峰4是順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯。

如圖4所示，使用粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線a）時(shí)，檢測(cè)峰強(qiáng)度較低，且亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體無(wú)法得到分離；而使用銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線b）時(shí)，檢測(cè)峰強(qiáng)度得到增強(qiáng)，且亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體得到分離，說(shuō)明了作為固相微萃取整體柱，銀納米粒固定化整體柱對(duì)不飽和化合物亞油酸甲酯表現(xiàn)出明顯的富集能力，同時(shí)由于亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體與銀納米粒的作用力不同，碳碳雙鍵的順式結(jié)構(gòu)作用力強(qiáng)于反式結(jié)構(gòu)，亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體按照作用力強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)順序洗脫，并得以有效分離分析，表明了銀納米粒固定化固相微萃取整體柱具有實(shí)現(xiàn)不飽和化合物順反異構(gòu)體順序洗脫的能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。