【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及可口革囊星蟲多糖的制作方法和應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種可口革囊星蟲多糖的制備方法及可口革囊星蟲多糖在降血脂、抗氧化、保護(hù)肝臟等藥物與保健產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂飲食的攝入過量導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。大量流行病學(xué)及研究表明，心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化，而高脂血癥是動脈粥樣硬化的誘因。高脂血癥具有全身性、逐漸性和隱匿性，本身危害雖不大，但由此引發(fā)的心肌梗塞、腦卒中、出血性腦中風(fēng)等心腦血管疾病嚴(yán)重危及人類生命，已成為全球面臨的嚴(yán)重公眾健康問題。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，高脂血癥主要表現(xiàn)為血漿或血清總膽固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)水平升高和/或高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)水平降低。目前市場上常見的降脂藥多為化學(xué)合成藥物，雖降脂效果好，但均有不同程度的毒副作用，如引起橫紋肌溶解癥等嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此從自然界中尋找具有高效、低毒的天然活性物質(zhì)用于治療高脂血癥，從而預(yù)防動脈粥樣硬化及血栓等相關(guān)疾病已成為近年來醫(yī)藥界關(guān)注的熱點(diǎn)。

可口革囊星蟲(phascolosomaesculenta)俗稱“泥蒜”、海蛆、沙蟲、海丁、土筍，隸屬于星蟲動物門(sipunculoidea)星蟲綱(sipuncula)革囊星蟲屬(phascolosoma)，該種為我國特有種，分布于我國東南沿海廣西、廣東、海南、福建和浙江等地的潮間帶、高潮區(qū)的泥灘內(nèi)，產(chǎn)量豐富?？煽诟锬倚窍x是高蛋白低脂肪的海洋生物。我國多種本草中記載了其食用和藥用價值，是我國民間傳統(tǒng)藥食滋補(bǔ)佳品,有些地區(qū)用其代替中藥冬蟲夏草。有研究發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲具有抗疲勞(中國專利cn102153666b)和抗敗血癥的作用(中國專利cn103483462b)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，可口革囊星蟲具有明顯的降血脂作用，且沒有化學(xué)降血脂藥物的毒副作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，可口革囊星蟲多糖具有顯著的抗氧化、降血脂和保護(hù)肝臟的作用，推測可口革囊星蟲可能是通過抗氧化、保護(hù)肝臟起到降血脂作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種原材料豐富、制作工藝簡單、制作過程無化學(xué)試劑添加的可口革囊星蟲多糖的制備方法，以及其在制備降血脂、抗氧化、保護(hù)肝臟等藥物與保健產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的可口革囊星蟲多糖沒有化學(xué)降血脂藥物具有的毒副作用問題，且原材料豐富、制作工藝簡單、制作過程無化學(xué)試劑添加。

本發(fā)明的實現(xiàn)步驟為：

1、原料：選取天然優(yōu)質(zhì)的可口革囊星蟲；

2、清洗：先用清水洗去泥沙，再用鹽水多次清洗干凈；

3、風(fēng)干：白天于室外太陽晾曬及自然風(fēng)干；

4、烘干：夜間置于干燥箱內(nèi)28℃烘干，直至恒重；

5、研磨：經(jīng)干粉研磨機(jī)間歇研磨；

6、分級篩選：依次過20目、40目、60目篩網(wǎng)，制得可口革囊星蟲干粉；

7、提取：將可口革囊星蟲干粉，加20倍雙蒸水，100℃加熱煮沸提取1小時；

8、酶解：冷卻至50℃，加入用量分別為可口革囊星蟲干粉質(zhì)量比為2％的胃蛋白酶和10％的纖維素酶，置恒溫培養(yǎng)箱50℃，130rpm，震蕩3小時；

9、滅酶：100℃加熱煮沸10分鐘；

10、離心：4℃，5000rpm離心5分鐘；

11、過濾：上清液過0.22μm濾膜；

12、冷凍干燥：濾液于-20℃預(yù)凍一天，-80℃預(yù)凍一天，冷凍干燥3天，即得可口革囊星蟲多糖。

制得的可口革囊星蟲多糖應(yīng)用在降血脂、抗氧化、保護(hù)肝臟等藥物與保健產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用的可口革囊星蟲屬于天然食物，且加工過程中無任何化學(xué)試劑添加，對服用者無毒副作用；本發(fā)明還具有原材料豐富、制作工藝簡單的優(yōu)點(diǎn)，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明的工藝流程示意圖；

圖2是可口革囊星蟲多糖對dpph自由基的清除作用；

圖3是可口革囊星蟲多糖對亞鐵離子的螯合作用；

圖4是可口革囊星蟲多糖對超氧陰離子自由基的清除作用；

圖5是可口革囊星蟲多糖對羥自由基的清除作用；

圖6是福林-酚法測總多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7是本發(fā)明應(yīng)用過程中小鼠體重變化圖；

圖8是小鼠肝臟變化圖；

圖9是bca法測蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實施例1：可口革囊星蟲多糖的制備

如圖1所示，制備步驟為：

(1)原料選?。罕景l(fā)明所用可口革囊星蟲購于福建省晉江市安海鎮(zhèn)，是天然的星蟲；

(2)清洗：先用清水洗去泥沙，再用鹽水浸泡，并反復(fù)清洗，這一清洗過程具一定的消毒作用，且效果好，成本低；

(3)風(fēng)干：白天于室外太陽晾曬及自然風(fēng)干；

(4)烘干：夜間置于干燥箱內(nèi)28℃烘干，直至恒重；

(5)研磨：經(jīng)干粉研磨機(jī)間歇研磨多次，形成較粗的星蟲粉末；

(6)分級篩選：依次過20目、40目、60目篩網(wǎng)，篩得的60目以上細(xì)小粉末即為可口革囊星蟲干粉。

(7)提取：將可口革囊星蟲干粉，加20倍雙蒸水，100℃加熱煮沸提取1小時，此步驟提取可口革囊星蟲中的粗多糖等水溶性成分；

(8)酶解：冷卻至50℃，加入用量分別為可口革囊星蟲干粉質(zhì)量比為2％的胃蛋白酶和10％的纖維素酶，置恒溫培養(yǎng)箱50℃，130rpm，震蕩3小時，進(jìn)行酶解，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾；

(9)滅酶：100℃加熱煮沸10分鐘，滅活蛋白酶和纖維素酶；

(10)離心：4℃，5000rpm離心5分鐘，使可口革囊星蟲粉殘渣沉淀；

(11)過濾：上清液過0.22μm濾膜，去除水不溶性雜質(zhì)；

(12)冷凍干燥：濾液于-20℃預(yù)凍一天，-80℃預(yù)凍一天，冷凍干燥3天，即得可口革囊星蟲多糖。

采取上述方法制作的可口革囊星蟲多糖，其特征在于過程無任何化學(xué)添加劑，無污染，純天然、環(huán)保，供后期星蟲應(yīng)用使用。

實施例2：可口革囊星蟲多糖體外抗氧化能力的評價

1、試驗材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

電子天平、微量移液器、多功能酶標(biāo)儀(tecan，infinitem2000)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)、乙二胺四乙酸(edta)、抗壞血酸(vitc)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(nbt)、吩嗪硫酸甲酯(pms)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、福林酚、沒食子酸、氯化亞鐵、菲咯嗪、甲醇：購自美國sigma公司；羥自由基試劑盒：購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑：均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2實驗方法

(1)dpph自由基清除能力的測定：將可口革囊星蟲多糖用雙蒸水溶解配制成1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖溶液，隨后用雙蒸水依次稀釋成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/ml。分別取100μl多糖溶液加到96孔板，再加入0.1mmol/ldpph甲醇溶液100μl，混勻，室溫避光反應(yīng)30min，在517nm處測吸光度值，同時以vitc作為陽性對照，雙蒸水作為空白對照，每個樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)公式計算樣品對dpph自由基的清除率：dpph清除率(％)＝(1-樣品吸光度值/空白對照的吸光度值)*100％，用半數(shù)有效濃度(ec50)值表示清除50％dpph自由基所需樣品的有效濃度。圖2為不同濃度的可口革囊星蟲多糖對dpph自由基的清除作用。

(2)亞鐵離子螯合能力的測定：將可口革囊星蟲多糖用雙蒸水溶解配制成1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖溶液，隨后用雙蒸水依次稀釋成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/ml。分別取150μl多糖溶液加到96孔板，再加入亞鐵溶液4μl，反應(yīng)30秒，再加入菲咯嗪溶液8μl，反應(yīng)10min，在562nm處測吸光度值。同時以edta為陽性對照，以雙蒸水作為空白對照，每個樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)公式計算樣品對亞鐵離子的螯合率：亞鐵離子螯合率(％)＝(1-樣品吸光度值/空白對照的吸光度值)*100％，用半數(shù)有效濃度(ec50)值表示螯合50％亞鐵離子所需樣品的有效濃度。圖3為不同濃度的可口革囊星蟲多糖對亞鐵離子的螯合作用。

(3)超氧陰離子自由基清除能力的測定：將可口革囊星蟲多糖用雙蒸水溶解配制成1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖溶液，隨后用雙蒸水依次稀釋成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/ml。分別取50μl多糖溶液加到96孔板，再依次分別加入pms溶液50μl、nadh溶液50μl和nbt溶液50μl，混勻，室溫反應(yīng)5min，在560nm處測吸光度值，同時以沒食子酸為陽性對照，以雙蒸水作為空白對照，每個樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)公式計算樣品對超氧陰離子的清除率：超氧陰離子清除率(％)＝(1-樣品吸光度值/空白對照的吸光度值)*100％。圖4為不同濃度的可口革囊星蟲多糖對超氧陰離子自由基的清除作用。

(4)羥自由基清除能力的測定：采用江蘇凱基生物技術(shù)有限公司的羥自由基試劑盒測定。將可口革囊星蟲多糖用雙蒸水溶解配制成1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖溶液，隨后用雙蒸水依次稀釋成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/ml，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在550nm處測吸光度值，同時以vitc為陽性對照，以雙蒸水作為空白對照，每個樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)公式計算樣品對羥自由基的清除率：羥自由基清除率(％)＝(1-樣品吸光度值/空白對照的吸光度值)*100％。用半數(shù)有效濃度(ec50)值表示清除50％羥自由基所需樣品的有效濃度。圖5是不同濃度的可口革囊星蟲多糖對羥自由基的清除作用。

(5)總多酚的測定：采用福林-酚法測定，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，待測樣品的總多酚含量用每1g樣品中沒食子酸相當(dāng)量來表示。將沒食子酸用雙蒸水溶解配制成1.0mg/ml的沒食子酸溶液，隨后用雙蒸水依次稀釋成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.01mg/ml。分別取100μl加至1.5ml離心管，再分別加入福林酚溶液250μl，混勻，靜置3min，再分別加入2％碳酸鈉溶液300μl，避光反應(yīng)2小時，分別取200μl置96孔板，在760nm處測吸光度值。以沒食子酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。同法測定1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖溶液的吸光度值，根據(jù)回歸方程計算樣品的沒食子酸當(dāng)量。

2、結(jié)果分析

表1為可口革囊星蟲多糖體外抗氧化作用數(shù)據(jù)，表2為可口革囊星蟲多糖體外抗氧化作用的半數(shù)有效濃度(ec50)：

表1可口革囊星蟲多糖的體外抗氧化作用

表2可口革囊星蟲多糖體外抗氧化作用的半數(shù)有效濃度(ec50)

(1)可口革囊星蟲多糖對dpph自由基的清除率呈劑量依賴性，1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖對dpph自由基的清除率為56.51％，當(dāng)清除率為50％時，1.16mg/ml星蟲多糖溶液對dpph自由基的清除能力與5.18μg/ml的vitc相當(dāng)。

(2)可口革囊星蟲多糖對亞鐵離子的螯合率呈劑量依賴性，1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖對亞鐵離子的螯合率為18.59％，當(dāng)螯合率為50％時，6.41mg/ml星蟲多糖溶液對亞鐵離子的螯合能力與9.32μg/ml的edta相當(dāng)。

(3)1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖對超氧陰離子自由基的清除率為43.30％。

(4)可口革囊星蟲多糖對羥自由基的清除率呈劑量依賴性，1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖對羥自由基的清除率為23.75％，當(dāng)清除率為50％時，2.30mg/ml星蟲多糖溶液對羥自由基的清除能力與0.15mg/ml的vitc相當(dāng)。

(5)當(dāng)沒食子酸濃度在0-0.1mg/ml范圍時，回歸方程如圖6所示?；貧w方程為y＝8.9659x+0.0132，r²＝0.9993。根據(jù)回歸方程計算可口革囊星蟲多糖的總多酚含量，用沒食子酸當(dāng)量表示，可口革囊星蟲多糖的總多酚含量用沒食子酸當(dāng)量表示為36.63±5.08(mg/g)，即1.0g可口革囊星蟲多糖的總多酚含量相當(dāng)于36.63±5.08mg的沒食子酸。

以上結(jié)果顯示，1.0mg/ml的可口革囊星蟲多糖對dpph自由基的清除率為56.51％(ec50為1.16mg/ml)、對超氧陰離子自由基的清除率為43.30％、對羥自由基的清除率為23.75％(ec50為2.30mg/ml)、對亞鐵離子的螯合率為18.59％(ec50為6.41mg/ml)，總多酚用沒食子酸當(dāng)量表示為36.63±5.08mg/g，表明可口革囊星蟲多糖具有良好的體外抗氧化能力。

實施例3：可口革囊星蟲多糖降血脂作用的評價

1、試驗材料與方法

1.1實驗材料：選用雄性昆明種小鼠，購于福州大學(xué)吳氏動物中心。

1.2高脂飼料配方(w/w)：78.8％基礎(chǔ)飼料、1％膽固醇、10％蛋黃粉、10％豬油、0.2％膽鹽，購于福州大學(xué)吳氏動物中心。

1.3主要儀器和試劑

電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、干粉研磨機(jī)、多功能酶標(biāo)儀(tecan，infinitem2000)、臺式離心機(jī)(xiangyi，h1650-w)；陽性對照品為湯臣倍健大豆磷脂軟膠囊(湯臣倍健股份有限公司，國食健字g20070415)；甘油三酯(tg)試劑盒、總膽固醇(tc)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)試劑盒、丙二醛(mda)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast/got)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt/gpt)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(sod)試劑盒和二喹啉甲酸(bca)蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為化學(xué)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4實驗方法：

(1)適應(yīng)環(huán)境：全部動物以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)觀察，飼養(yǎng)溫度為25±2℃，適應(yīng)環(huán)境7天；

(2)隨機(jī)分組：隨機(jī)分為七組，每組10只：第一組為正常組，第二組為陰性對照組，第三組為陽性對照組(給予大豆磷脂軟膠囊)，第四組為可口革囊星蟲干粉組，第五組為低劑量星蟲多糖組，第六組為中劑量星蟲多糖組，第七組為高劑量星蟲多糖組；

(3)高脂飼料造模：除正常組給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)外，其余6組動物改為高脂飼料飼養(yǎng)進(jìn)行實驗性高脂血癥造模，喂飼40-50天，測定血清tc、tg水平以確定形成高脂血癥；

(4)給藥處理：造模結(jié)束后，小鼠給藥劑量按照成人用藥劑量的9倍進(jìn)行換算，陽性對照組給予大豆磷脂0.6g/kg(體質(zhì)量)，可口革囊星蟲干粉組給予可口革囊星蟲干粉生理鹽水懸液1.35g/kg(體質(zhì)量)，低劑量星蟲多糖組給予可口革囊星蟲多糖溶液0.2g/kg(體質(zhì)量)，中劑量星蟲多糖組給予可口革囊星蟲多糖溶液0.4g/kg(體質(zhì)量)，高劑量星蟲多糖組給予可口革囊星蟲多糖溶液0.8g/kg(體質(zhì)量)，陰性對照組給予相同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃25天；

(5)小鼠檢測材料的取得及檢測：

a、血清血脂指標(biāo)的檢測：實驗性高脂血癥小鼠給藥25天后，禁食16h，摘眼球取血檢測其血清指標(biāo)，包括tg、tc、hdl-c、ldl-c，并計算動脈硬化指數(shù)ai(ai＝(tc-hdl-c)/hdl-c)；

b、肝臟血脂指標(biāo)的檢測：小鼠摘眼球取血后，頸椎脫臼處死，摘取完整肝臟，用生理鹽水漂洗干凈后用濾紙吸干，稱量其重量，計算肝臟系數(shù)(肝臟系數(shù)(％)＝肝臟重(g)/體重(g)×100)，取小鼠肝臟組織，按體積比1:9加入pbs緩沖液，組織研磨離心后測定肝組織蛋白濃度，用試劑盒檢測肝組織tg和tc含量；

c、血清和肝組織ast和alt活性的檢測：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)是醫(yī)學(xué)臨床上肝功能檢查的指標(biāo)，用來判斷肝臟是否受到損害。用試劑盒檢測血清和肝組織ast和alt活性；

d、血清sod活性和mda含量的檢測：用試劑盒檢測血清sod活性和mda含量。

(6)實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計：測試結(jié)果采用spss進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，各組之間采用t檢驗進(jìn)行組間比較。p<0.05(*)說明具有顯著性差異，p<0.01(**)說明具有極顯著性差異。

2、結(jié)果

2.1對小鼠體重的影響：

給藥前后小鼠體重變化如圖7所示，從圖中可知隨著飼養(yǎng)時間的增加，各組小鼠的體重均有所增加，增加趨勢與正常組相似，各組小鼠的體重增長率沒有顯著性差異(p＞0.05)，且各組小鼠均生長良好，無不良反應(yīng)，說明可口革囊星蟲干粉及多糖對小鼠生長無不良影響。

2.2對小鼠血脂指標(biāo)的影響：

表3小鼠血清中tg、tc、ldl-c、hdl-c及ai值(n＝10，)

注：(**p<0.01表示相對陰性對照組具有極顯著性差異，*p<0.05表示相對陰性對照組具有顯著性差異)

表3為可口革囊星蟲干粉及多糖對高脂血癥模型小鼠血脂水平的影響：結(jié)果顯示，與正常組相比，陰性對照組中小鼠血清中tg、tc、ldl-c含量都明顯升高，hdl-c含量明顯降低，說明高脂血癥模型成功建立。給予可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖治療后，tg、tc、ldl-c含量均有所下降，hdl-c含量有所升高。其中，(1)tg：陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和中、高劑量星蟲多糖組的tg含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，低劑量星蟲多糖組的tg含量較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組間無顯著性差異(p>0.05)；(2)tc：陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組的tc含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組間無顯著性差異(p>0.05)；(3)ldl-c：陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組的ldl-c含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組間無顯著性差異(p>0.05)；(4)hdl-c：陰性對照組的hdl-c含量最低，陽性對照組和中、高劑量星蟲多糖組的hdl-c含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組和低劑量星蟲多糖組的hdl-c含量均較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組間無顯著性差異(p>0.05)；(5)ai：根據(jù)公式ai＝(tc-hdl-c)/hdl-c可計算得到動脈硬化指數(shù)ai。陰性對照組的ai較正常組極顯著增加，陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組均可以明顯降低ai，均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組間無顯著性差異(p>0.05)。

以上結(jié)果說明，給予可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖均能顯著降低高脂血癥小鼠血清的tg、tc、ldl-c含量和ai，顯著升高h(yuǎn)dl-c含量，說明可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠具有顯著的降血脂作用，可以改善脂質(zhì)代謝紊亂，降低動脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險。

2.3對小鼠肝臟的影響：

表4小鼠肝臟重量、體重及肝臟系數(shù)(n＝10，)

注：(**p<0.01表示相對陰性對照組具有極顯著性差異，*p<0.05表示相對陰性對照組具有顯著性差異)

表4為可口革囊星蟲干粉及多糖對小鼠肝臟的影響：小鼠摘眼球取血后，頸椎脫臼處死，摘取完整肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗干凈，去除多余組織后用濾紙吸干，稱量其重量，根據(jù)公式(肝臟系數(shù)(％)＝肝臟重(g)/體重(g)×100)計算肝臟系數(shù)。與正常組相比，陰性對照組的肝臟系數(shù)明顯增加，說明高脂飼料對小鼠肝臟造成損傷；給藥后各組的肝臟系數(shù)均有所降低，陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和中、高劑量星蟲多糖組的肝臟系數(shù)均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，低劑量星蟲多糖組的肝臟系數(shù)較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，說明可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖能顯著改善高脂飼料造成的肝損傷。

給藥前后肝臟外觀如圖8所示，從圖中可以看出正常組小鼠肝臟顏色為深紅色，表面光滑，質(zhì)地較軟，而陰性對照組小鼠肝臟腫脹，顏色較淺，表面有顆粒，有黃色脂滴滲出，質(zhì)地較脆。說明喂飼高脂飼料導(dǎo)致實驗小鼠肝臟脂肪堆積，造成一定程度的脂肪肝。給藥后各組較陰性對照組肝臟顏色都有所加深，且表面無顆粒，較為光滑。其中，可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量可口革囊星蟲多糖組的肝臟情況均較陰性對照組有所改善，說明可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠因脂肪攝入過高導(dǎo)致的肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.4對小鼠肝組織血脂指標(biāo)的影響：

取適量肝組織按1:9質(zhì)量體積比加入pbs緩沖液后經(jīng)組織研磨機(jī)研磨，3500rpm離心10min，取上清液，通過bca法測定肝組織蛋白含量，通過不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度值建立回歸方程，其中0.1-0.5mg/ml蛋白濃度與562nm吸光度值具有良好的線性關(guān)系，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖9所示)，其回歸方程為y＝0.7776x+0.0734，r²＝0.9991。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組小鼠的肝組織蛋白濃度。

表5小鼠肝臟tg、tc含量(n＝10，)

注：(**p<0.01表示相對陰性對照組具有極顯著性差異，*p<0.05表示相對陰性對照組具有顯著性差異)

表5為可口革囊星蟲干粉及多糖對小鼠肝組織tg、tc含量的影響：根據(jù)肝組織的蛋白濃度，將小鼠肝組織tg、tc含量用mmol/g蛋白表示。與正常組相比，陰性對照組小鼠肝組織的tg、tc含量明顯增加，說明給予高脂飼料后小鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)脂肪肝現(xiàn)象；給藥后各組小鼠肝組織tg、tc含量均有所降低。其中，(1)tg：陽性對照組和中劑量星蟲多糖組的tg含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組的tg含量較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，低、高劑量星蟲多糖組的tg含量較陰性對照組無顯著性差異(p>0.05)；(2)tc：陽性對照組和低、中劑量星蟲多糖組的tc含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組和高劑量星蟲多糖組的tc含量均較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，但可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組之間無顯著性差異(p>0.05)。

以上結(jié)果說明可口革囊星蟲干粉和中劑量可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠具有顯著的降低肝組織tg、tc含量的作用，對高脂血癥誘發(fā)的脂肪肝有良好的改善作用。

2.5對小鼠血清和肝組織ast和alt活性的影響：

表6小鼠血清和肝組織ast和alt活性(n＝10，)

注：(**p<0.01表示相對陰性對照組具有極顯著性差異，*p<0.05表示相對陰性對照組具有顯著性差異)

表6為可口革囊星蟲干粉及多糖對小鼠血清和肝組織中ast和alt活性的影響：與正常組相比，陰性對照組的ast和alt均明顯升高，說明給予高脂飼料對小鼠的肝臟造成損害。給藥后，各組小鼠的ast和alt活性均有所下降。其中，(1)血清ast：陰性對照組小鼠血清的ast活性最高，約為正常組的兩倍，說明肝臟損傷嚴(yán)重；給藥后各組的ast活性均有所下降，其中陽性對照組血清的ast活性較陰性對照組有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組和中、高劑量星蟲多糖組血清的ast均較陰性對照組有顯著性差異(p<0.05)，低劑量星蟲多糖組血清的ast較陰性對照組無顯著性差異(p>0.05)；(2)血清alt：陰性對照組小鼠血清的alt活性最高，約為正常組的三倍，說明肝臟損傷嚴(yán)重；給藥后各組的alt活性均有所下降，陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組血清的alt均較陰性對照組有極顯著性差異(p<0.01)，但各給藥組之間無顯著性差異(p>0.05)；(3)肝臟ast：陰性對照組小鼠肝組織的ast活性最高，約為正常組的四倍，說明肝臟損傷嚴(yán)重；給藥后各組的ast活性均有所下降，陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低、中、高劑量星蟲多糖組肝組織的ast均較陰性對照組有極顯著性差異(p<0.01)，但各給藥組之間無顯著性差異(p>0.05)；(4)肝臟alt：陰性對照組小鼠肝組織的alt活性最高，約為正常組的五倍，說明肝臟損傷嚴(yán)重；給藥后各組的alt活性均有所下降，其中，陽性對照組肝組織的alt較陰性對照組有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組和中、高劑量星蟲多糖組的alt均較陰性對照組有顯著性差異(p<0.05)，低劑量星蟲多糖組肝組織的alt活性較陰性對照組無顯著性差異(p>0.05)。

以上結(jié)果說明可口革囊星蟲干粉和中、高劑量的可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠的肝損傷具有良好的改善作用。

2.6對小鼠血清sod活性和mda含量的影響：

表7小鼠血清sod活性和mda含量(n＝10，)

注：(**p<0.01表示相對陰性對照組具有極顯著性差異，*p<0.05表示相對陰性對照組具有顯著性差異)

表7為可口革囊星蟲干粉及多糖對小鼠血清sod活性和mda含量的影響：(1)sod活性高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。正常組血清sod活性最高，陰性對照組的sod活性最低，說明高脂飼料對小鼠機(jī)體造成氧化損傷，給藥后各組小鼠血清的sod活性均有所升高。其中，中、高劑量星蟲多糖組血清的sod活性均較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，陽性對照組、可口革囊星蟲干粉組和低劑量星蟲多糖組的sod活性均較陰性對照組有所提高，但無顯著性差異(p>0.05)。說明中、高劑量的可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠具有顯著提高血清sod活性的作用，能提高機(jī)體抗氧化能力。(2)mda在血清和組織中含量的高低可間接反映出機(jī)體受自由基攻擊的程度，是衡量機(jī)體氧化損傷的指標(biāo)。與正常組相比，陰性對照組血清的mda含量明顯增高，說明高脂飼料對小鼠體內(nèi)造成脂質(zhì)過氧化損傷。給藥后，血清的mda含量均有所降低。其中，陽性對照組和中、高劑量星蟲多糖組的mda含量均較陰性對照組具有極顯著性差異(p<0.01)，可口革囊星蟲干粉組和低劑量星蟲多糖組的mda含量均較陰性對照組具有顯著性差異(p<0.05)，但各給藥組間無顯著性差異(p>0.05)。說明可口革囊星蟲干粉和不同劑量的可口革囊星蟲多糖均對實驗性高脂血癥小鼠的脂質(zhì)過氧化損傷具有改善作用。

上述結(jié)果可以看出：與給予生理鹽水的陰性對照組相比，給予可口革囊星蟲干粉和低、中、高三個劑量的可口革囊星蟲多糖均能夠顯著降低實驗性高脂血癥小鼠血清tc、tg、ldl-c水平和ai，升高血清hdl-c水平，以及降低肝組織tg和tc水平，具有顯著的降血脂作用；均能夠顯著降低血清和肝臟ast和alt活性，對肝臟具有保護(hù)作用；均能夠顯著升高血清sod活性和降低血清mda含量，具有提高機(jī)體抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化的作用。提示可口革囊星蟲干粉及多糖可能是通過提高機(jī)體抗氧化能力及保護(hù)肝臟來起到降血脂作用。

以上實施例說明采用熱水提取、復(fù)合酶酶解獲得可口革囊星蟲多糖，操作簡單，方便易得。體外抗氧化實驗表明，可口革囊星蟲多糖具有良好的抗氧化作用。體內(nèi)降血脂實驗表明，可口革囊星蟲干粉及可口革囊星蟲多糖對高脂血癥小鼠均具有良好的降血脂作用，且作用與已知臨床使用的保健品大豆磷脂軟膠囊相一致，并且對肝臟具有一定的保護(hù)作用，對防治動脈粥樣硬化及由其所致的動脈血栓、缺血性心腦血管疾病有積極的意義，可口革囊星蟲多糖可以應(yīng)用在降血脂、抗氧化、保護(hù)肝臟等藥物與保健產(chǎn)品中，具有廣泛的應(yīng)用前景。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實施方式，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明所描述的具體實施例只是說明性的，而不是用于對本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護(hù)的范圍內(nèi)。