專利名稱：一種冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖提取的方法。
背景技術：
多糖是由多個單糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物，經(jīng)藥理研究與臨 床應用確認具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗輻射、降血糖、降血脂等生物 學活性。多糖正逐漸成為當今新藥開發(fā)的重要方向之一，目前國內(nèi)外香菇多糖、豬 苓多糖、枸杞多糖等已應用于臨床。
冬蟲夏草[Cw辦ce;w Wwm^ (Berk.) Sacc.]是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (le/ /fifo; fera)蝙蝠蛾科(//ep/a/Wae)幼蟲尤其是蟲草蝠蛾[77z/torat/es (Oberthiir)]上形成的蟲菌復合體，是我國特產(chǎn)的一種名貴中藥和高級滋補品。冬蟲 夏草含有豐富的生理活性物質(zhì)，具有獨特的藥用價值和廣泛的藥理作用，是值得挖 掘的一大生物寶庫。
作為青藏高原特有的菌物，冬蟲夏草分布地域局限，天然產(chǎn)量非常有限，并被 國家相關部門列為了二級保護物種[《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》，1999]。 針對天然冬蟲夏草資源緊缺的現(xiàn)狀，全國先后有多個科研單位進行了冬蟲夏草的深 層發(fā)酵研究，有的進入了工業(yè)化生產(chǎn)。
然而，目前市場上有關冬蟲夏草產(chǎn)品多為一次性直接利用的菌絲粗制品，不利 于與國際市場接軌，不利于參與國際市場的激烈競爭。因此冬蟲夏草的二次性甚至 于更高層次產(chǎn)品的研究開發(fā)刻不容緩。多糖類作為冬蟲夏草所含的生理活性物質(zhì)中 最重要最豐富的類群之一，將是冬蟲夏草開發(fā)研究的一個重要突破口，具有良好的 應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法。
本發(fā)明所提供的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法，包括以下步驟
(1) 將粒徑小于83(Him (相當于能通過20目篩得到的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的 粒徑)的冬蟲夏草菌絲體進行脫脂處理，得到脫脂的冬蟲夏草菌絲體；
(2) 用水對步驟(1)得到的脫脂冬蟲夏草菌絲體進行提取，收集提取液；(3)將步驟(2)得到的提取液用無水乙醇進行沉淀，然后將所述沉淀依次用
乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌，得到冬蟲夏草菌絲體粗多糖。
所述方法還包括以下純化的步驟
(a) 脫蛋白采用Sevag法對步驟(3)制備的冬蟲夏草菌絲體粗多糖進行脫蛋 白，得到脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體多糖；
(b) 脫色將步驟(a)得到的脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體多糖用過氧化氫進行脫 色，得到脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖；
(c) 離子交換層析采用DEAE-52離子交換層析柱對步驟(b)得到的脫色的冬 蟲夏草菌絲體多糖進行分離，先用pH值為6-8、 10mM Tris-HCl緩沖液進行洗脫， 再用pH值為6-8含有0.1 M-0.5M NaCl和10 mM Tris-HCl的水溶液進行洗脫，收 集糖峰，得到純化的冬蟲夏草菌絲體多糖。
其中，步驟(1)所述脫脂處理所用的試劑是體積百分含量為90-100%的乙醇， 脫脂時間為12-24小時。
步驟(2)中所述提取為回流提取。所述提取的溫度為70-9(TC;所述提取中， 至少提取一次，每次提取的時間可為l-3小時。
步驟(a)脫蛋白的具體方法是將步驟(3)得到的冬蟲夏草菌絲體粗多糖用水 溶解，形成所述冬蟲夏草菌絲體多糖的水溶液，將所述水溶液與Sevag試劑按體積 比5:1混和，進行萃取，收集上層液體，得到脫蛋白的冬蟲夏草多糖。
所述脫蛋白中，至少脫一次蛋白。
步驟(b)脫色的具體方法是將所述步驟(a)得到的脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體 多糖配成溶液，將所述溶液的pH值調(diào)至7—8，在溫度為45-6(TC的條件下，在所 述溶液中加入體積為所述溶液體積20%的30% (體積百分含量)的過氧化氫溶液， 進行脫色，得到脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖溶液；將所述脫色的冬蟲夏草菌絲體多 糖溶液用無水乙醇進行沉淀，將所述沉淀依次用乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌，得到 脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖。
本發(fā)明的優(yōu)點在于通過脫脂，水提、濃縮、醇沉、脫蛋白脫色及層析法得到 冬蟲夏草純化多糖，經(jīng)紫外吸收光譜和凝膠層析鑒定MPS2為均一多糖，總糖含量 達到98.26%，步驟簡便，成本低廉，不需要特殊設備。


圖1為本發(fā)明的冬蟲夏草菌絲體多糖的提取純化流程圖。圖2為實施例1的冬蟲夏草菌絲體多糖的DEAE-52柱層析洗脫曲線。
圖3為實施例1的冬蟲夏草菌絲體多糖的紫外吸收光譜，(A)為MPS1的紫外
吸收光譜，(B)為MPS2的紫外吸收光譜。
圖4為實施例1的冬蟲夏草菌絲體多糖的凝膠層析洗脫圖譜，(A)為MPS1的
洗脫圖譜，(B)為MPS2的洗脫圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明提取冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的方法，包括以下步驟
本發(fā)明所用原材料為發(fā)酵得到的冬蟲夏草菌絲體。發(fā)酵所用培養(yǎng)基為半合成培
養(yǎng)基[姚一建，董彩虹(2004) —種冬蟲夏草半合成培養(yǎng)基.專利號ZL 200410090875.1]或合成培養(yǎng)基[姚一建，董彩虹，王波，謝雪欽(2005) 一種冬蟲 夏草復合培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基.專利號ZL200510137457.8.]。所用培養(yǎng)方法見 專利姚一建，董彩虹，王波，謝雪欽(2005) —種冬蟲夏草復合培養(yǎng)方法及其專 用培養(yǎng)基.專利號ZL200510137457.8.
(1 )將粒徑小于830pm的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體中加入體積百分含量為90-100% 的乙醇，室溫脫脂12-24小時，得到脫脂的冬蟲夏草菌絲體；并將所述脫脂的冬蟲 夏草菌絲體室溫風干除去乙醇；
(2) 在步驟(1)得到的菌絲體中加入10-20倍體積的水，于70-90。C進行回 流提取，提取結(jié)束后，抽濾，得到濾渣和濾液；在所述濾渣中再加入10-20倍體積 的蒸餾水重復所述1-3次回流提取和抽濾的步驟，收集濾液；
(3) 合并所述濾液，將濾液濃縮至原體積的三分之一，得濃縮液；在所述濃 縮液中加入三倍體積的無水乙醇，4。C放置過夜，8000g離心30分鐘，收集沉淀， 將所述沉淀依次用乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌，得冬蟲夏草粗多糖。
所述方法還包括以下純化的步驟
(a) 脫蛋白采用Sevag法脫蛋白，將步驟(3)冬蟲夏草菌絲體粗多糖用水溶 解，形成所述冬蟲夏草多糖的水溶液(室溫高于25。C，所述冬蟲夏草多糖的水溶液 中需加入甲苯)，將所述水溶液與Sevag試劑按體積比5 : 1混和，裝入分液漏斗 中，劇烈振蕩，靜置30-60min，上清液按上述方法反復脫蛋白直至兩相間沒有明顯 的蛋白層為止，得到脫蛋白的冬蟲夏草多糖；
(b) 脫色將步驟(a)得到的脫蛋白的冬蟲夏草多糖配成溶液，將所述溶液的 pH值調(diào)至7—8，在45-60 T在所述溶液中按20 %體積比加入30 %(體積百分含量)的過氧化氫溶液，氧化脫色至冬蟲夏草多糖溶液由棕色變?yōu)闇\黃色為止；將脫色后 的冬蟲夏草多糖溶液對蒸餾水透析24h，每3h換水一次；將透析后的溶液濃縮， 加3倍體積無水乙醇沉淀多糖，4t:靜置過夜，離心，沉淀分別以乙醚，丙酮和無 水乙醇洗滌干燥得脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖；
(C)離子交換層析將步驟(b)所述脫色的冬蟲夏草多糖進行陰離子交換柱層 析，先用lOmMTris-HCl緩沖液洗脫，再依次用pH值為7.4的含有0.1 MNaCl和 lOmMTris-HCl的水溶液，以部分收集器收集，硫酸-蒽酮法檢測，得到兩個糖峰， 分別收集，透析，濃縮后干燥得冬蟲夏草菌絲體多糖MPS1和MPS2兩個組分。
實施例1、冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的提取、純化
1) 冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的制備
將從天然冬蟲夏草上分離純化，并經(jīng)分子生物學鑒定為真正冬蟲夏草菌種的菌 株接入冬蟲夏草半合成培養(yǎng)基，按常規(guī)方法進行發(fā)酵，收集菌絲體。該冬蟲夏草半 合成培養(yǎng)基按照如下方法配制取蔗糖50.0克，蛋白胨10.0克，酵母提取物3.0 克，磷酸二氫鉀1.0克，硫酸鎂0.5克，用蒸餾水定容至1000毫升。
2) 冬蟲夏草菌絲體粗多糖的提取 冬蟲夏草菌絲體多糖的提取純化流程圖，如圖1所示。 以步驟l)得到的冬蟲夏草菌絲體為原料，提取方法包括如下步驟 將冬蟲夏草菌絲體粉碎成粒徑小于830pm菌絲體(相當于能通過20目篩得到
的冬蟲夏草菌絲體的粒徑)。在100g粉碎的冬蟲夏草菌絲體中加入500ml無水乙 醇(體積百分含量為100%)，室溫脫脂12小時，并將脫脂后的菌絲體室溫風干。 精確稱取菌絲體加入20倍體積的蒸餾水，于9(TC水浴回流提取2小時，抽濾后得 到濾液和濾渣，在濾渣中再加入20倍體積的蒸餾水重復上述操作3次。合并濾液， 濃縮，55'C濃縮至原體積的三分之一。在得到的濃縮液中邊攪拌邊加入三倍體積的 無水乙醇，置4。C過夜，離心(8000 g) 30分鐘，沉淀分別以乙醚、丙酮和無水乙 醇洗滌并干燥，即得16.1g冬蟲夏草粗多糖。
3) 冬蟲夏草粗多糖的純化
取10g步驟2)的冬蟲夏草粗多糖加入500ml蒸餾水，磁力攪拌溶解過夜(室 溫高于25。C時，加入幾滴甲苯防腐)，與Sevag試劑(氯仿與正丁醇按體積比為4 : 1 配成的混合液)按體積比5: l混合，裝入分液漏斗中，劇烈振蕩，靜置30min， 上清液按上述方法反復脫蛋白直至兩相間沒有明顯的蛋白層為止，得到脫蛋白的冬蟲夏草多糖溶液。
取脫蛋白的冬蟲夏草多糖溶液將pH值調(diào)為8，在50 °。時按20%體積比加入 30% (體積百分含量)的過氧化氫(H202)溶液，氧化脫色至糖溶液由棕色變?yōu)闇\ 黃色為止。將脫色后的溶液對蒸餾水透析24h，每3h換水一次。將透析后的溶液 濃縮至原體積的三分之一，加3倍體積無水乙醇沉淀多糖，4t:靜置過夜，12000g 離心15分鐘，收集沉淀，然后將沉淀分別以乙醚，丙酮和無水乙醇洗滌干燥得脫 色的多糖。
取脫色多糖用lOmllOmMTris-HCl緩沖液(pH值7.4)溶解，平衡過夜，離 心去除可能有的微量沉淀，將1%柱體積的上清液加到平衡的DEAE-52陰離子交換 層析柱(離子交換柱的柱長度為30cm，柱的內(nèi)徑為2.6cm)上，先以2倍柱體積的 10mMTris-HCl ( pH值7.4)緩沖液洗脫，再用2倍柱體積的0.1M NaCl-lO mM Tris-HCl緩沖液(pH值7.4)洗脫，流速為16ml/h，以部分收集器收集，每管收集 4毫升，硫酸-蒽酮法檢測，得到兩個糖峰，分別收集第8-21管的組分和第61-73 管的組分，用蒸餾水水進行透析，濃縮后干燥得2.8gMPSl和1.5gMPS2兩個組分 (DEAE-52柱層析洗脫曲線如圖2所示)。
最后用紫外吸收光譜和Sephadex G-100凝膠層析鑒定多糖純度。
凝膠層析的具體方法
稱取12gSephadexG-100經(jīng)蒸餾水充分溶漲后，用O.lMNaCl溶液洗滌數(shù)次， 裝柱(1.6x80cm)，以0.1MNaCl溶液平衡后備用。稱取離子交換層析得到的胞 內(nèi)多糖MPS1和MPS2各20mg，分別按照下述方法進行凝膠層析用2 ml 0.1 M NaCl溶液溶解多糖，上柱，以0.1MNaCl溶液洗脫，流速為9 ml/h，部分收集器 收集，每40min—管。硫酸-蒽酮法檢測。
結(jié)果表明，MPS1組分為混合多糖，MPS2組分為均一多糖。MPS1和MPS2 的紫外吸收圖譜和凝膠層析洗脫圖譜分別如圖3、圖4所示。
用硫酸-蒽酮法(張惟杰主編復合多糖生化研究技術，上?？茖W技術出版社， 1987)測定MPS1含糖量為94.30%， MPS2總糖含量為98.26%。
權(quán)利要求
1、一種冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法，包括以下步驟(1)將粒徑小于830μm的冬蟲夏草菌絲體進行脫脂處理，得到脫脂的冬蟲夏草菌絲體；(2)用水對步驟(1)得到的脫脂冬蟲夏草菌絲體進行提取，收集提取液；(3)對步驟(2)得到的提取液用無水乙醇進行沉淀，將所述沉淀依次用乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌，得到冬蟲夏草菌絲體多糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述脫脂處理中所用 的試劑是體積百分含量為90-100%的乙醇，脫脂時間為12-24小時。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述提取為回 流提取。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述提取的溫度為 70-90°C;所述提取中，至少提取一次，每次提取的時間為1-3小時。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下純化的步驟(a) 脫蛋白采用Sevag法對權(quán)利要求1-4所制備的冬蟲夏草菌絲體多糖進行脫 蛋白，得到脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體多糖；(b) 脫色將步驟(a)所述脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體多糖用過氧化氫進行脫色， 得到脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖；(c) 離子交換層析采用DEAE-52離子交換層析柱對步驟(b)所述脫色的冬蟲 夏草菌絲體多糖進行分離，先用pH值為6-8、 lOmMTris-HCl緩沖液進行洗脫，再 用pH值為6-8含有0.1 M-0.5MNaCl和10 mMTris-HCl的水溶液進行洗脫，收集糖 峰，得到純化的冬蟲夏草菌絲體多糖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(a)脫蛋白的方法是將權(quán) 利要求l-4所制備的冬蟲夏草菌絲體多糖用水溶解，形成所述冬蟲夏草菌絲體多糖 的水溶液，將所述水溶液與Sevag試劑按體積比5 : l混和，進行萃取，收集上層 液體得到脫蛋白的冬蟲夏草多糖。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述脫蛋白中，至少脫一 次蛋白。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(b)脫色的方法是將所述步驟(a)得到的脫蛋白的冬蟲夏草菌絲體多糖配成溶液，將所述溶液的pH值調(diào)至 7—8，在溫度為45-60 "C的條件下，在所述溶液中加入體積為所述溶液體積20%的 體積百分含量為30 %的過氧化氫溶液，進行脫色，得到脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖 溶液；將所述脫色的冬蟲夏草菌絲體多糖溶液用無水乙醇進行沉淀，將所述沉淀依 次用乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌，得到脫色的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體中提取和純化多糖的方法。該方法以冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體為原料，經(jīng)過脫脂，水提、濃縮、醇沉得到冬蟲夏草粗多糖。粗多糖用蒸餾水復溶，Sevag脫蛋白、H₂O₂脫色、透析、醇沉得到初步純化多糖；最后用離子交換層析進行純化，分步收集得到不同的組分，透析、醇沉，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚等洗滌后，干燥得冬蟲夏草多糖。本發(fā)明得到的冬蟲夏草純化多糖，經(jīng)紫外吸收光譜和凝膠層析鑒定MPS2為均一多糖，總糖含量高，提取步驟簡便，成本低廉。
文檔編號C08B37/00GK101307112SQ200810116219
公開日2008年11月19日 申請日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日
發(fā)明者姚一建, 董彩虹 申請人:中國科學院微生物研究所